NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN
KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN
BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM
ThS. Đinh Thị Thu Hằng, ThS. Nguyên Thanh Việt
T - , í

~

*1^*

IP A

ì t u n y ta m A rt* i f is ờ ỉiiti r Lsurvx*

V

n . ỉ Ị Ị M A w . ' jS m , /

risjK* V /C Í I W u c m y

ThS. Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q uâtiy 1Ó3, Học viện Quân ý)
Hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thái sớ n
BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y
TÓM TẮT
Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là
Bacillus anthracis đang được quan tẩm. Trong công trình này, gen vrrA trên nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA,
cya, lef (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX02) từ các chủng B. anthracis Việt Nam được tách dòng
và giải trình tự hồn chỉnh. Đã xác đính được 1 đột biến thêm nucleotide A trên gen vrrA, 1 đột biến đồng nghĩa, 2
đột biến sai nghĩa trên gen pagA và 1 đột biến đồng nghĩa trên gen cya. Đặc biệt, 1 đột biến sai nghĩa lần đấu tiên
được phát hiện trên gen capA chủng B. anthracis Ba1. Cốc gen còn lại tương đồng 100% so với chủng tham
chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đồng thời, một phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội tại được thiết kế để phát

hiện chính xác B. anthracis. Đày là công bố đấy đủ chi tiết đầu tiên trong nước về trình tự các gen tiêu biểu của B.
anthracis cũng như phát triển một cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đoán nhanh B. anthracis gây bệnh.
Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam,
SUMMARY
COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND
DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN
VIETNAM
Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet
Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University
Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University
Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially
Bacillus anthracis is interest in recent years. In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome),
pagA, cya, lef genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX02) o f ten B.
anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed. One insertion mutation at
nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA
gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4). Interestingly, one missense mutation was first
identified in the capA gene o f B. anthracis strain Ba1. The remaining genes had 100% similarity in comparison to
the B. anthracis references. In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1,
capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed for detection o f virulent B.
anthracis strains. This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some
typical genes on virvlence plasmids pX 01 and pX 02 as well as develops a useful molecular tool for rapid
detection o f virvlent B. anthracis in Vietnam.
Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam.
ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU
Bacillus anthracỉs, tác nhân gây bệnh than được
tim thấy ờ nhiều quốc gia trên thế giới. Khả năng gây
bệnh của B, anthracis chủ yếu nhờ sự có mặt của các
gẽn nằm trên hai plasmid !ớn là pX01 (182 kb) và
pX02 {95 kb) - được gọi íà các plasmid độc lực.
Plasmid pX01 chứa các gen sảrì xuất độc tố, trong khi

pX02 chứa các gen liên quan đển quá trình tổng hợp
vị poiy-D-g!utamic acid [9]. Chì những chùng có đầy
đù hai píasmid này mới có khả năng gây bệnh nguy
hiểm. Trên pX01, có ba gen quan trọng nhất lần lượt
ià gen pagẢ mẵ hóa cho kháng nguyền bảo vệ, cya
mã hóa cho yếu tố gây phù nề (edema factor - EF) một adenylyl cyciase dẫn đến phù nề da trong cơ thể
và let mã hóa cho yếu tố gây chết (lethal factor - LF)
[11]. Plasmid pX02 chứa các operon capBCADE [5]
với các gen quan trọng là capA, capB, capị.

Bởi tính chất cếp tính, khả năng gây chết người
qua đường hơ hấp kết hợp vởi khả năng phục hồi của
bào tử sau khi tiếp xúc với nhiệt và phóng xạ khiến B.
anthracis được sử dụng là vũ khí sinh học. ở Việt
Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải rác ở các tĩnh
miền núi phía Bắc như Sơn La, Điện Biên, Lai Châu,...
[1]. Gần đây (10/2014) ờ Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi
nhận 9 ca nhiêm bệnh than do ăn thịt gia súc chết vì
bệnh than. Sự xuất hiện trở lại cùa B. anthracỉs một
íần nữa cảnh báo mầm bệnh nguy hiềm này cần được
quan tâm đúng mức và có phương án phòng chống
hiệu quả, tránh để dịch bùng phát. Trong cơng trinh
này, nhóm nghiên cứu giới thiệu q trình phân lập,
xác định trình tự đầy đù gen đặc trưng trên nhiễm sẳc
thể vrrA và các gen độc lực pagA, cya, ief (pXOỊ),
capA, capB, capC (pX02). Điều này góp phần làm
phong phú thêm những kết quả về phân tử cũng như

480



có thêm dữ liệu tương đối hồn chình về một số gen
tiêu biểu của các chủng B. anthracis phân iập tại Việt
Nam. Trên cơ sở kếỉ quả phân tích trinh tự này, kết
hợp với các nghiên cứu trên thế giới để phát triển một
kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu
với ba gen đích lần lượt trên nhiễm sắc thể, pX01,
pX02 cùng chứng nội tại tái tổ hợp (IC) xác định chính
xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Như vậy,
cơng trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau:
Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên
nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagẤ, cya, lef
(plasmid pX01) và capA, capẻ, capC (plasmid pX02)
của các chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam.
Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại
tái tổ hợp xác định nhanh, chính xác B. anthracis gây
bệnh trong tự nhiên.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứu
Vậỉ liệu
Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B.
anỉhracis được phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết vì
bệnh than và mơi trường được cung cấp bởi Học viện
Quân y và Viện Y học Dự phịng Qn đội, Cục Qn
y (Ba1-Ba10). Trong đó, có 3 chủng B. aníhracis đầy
đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng B. anỉhracis chỉ
có pX01 (Ba6), 6 chủng cịn lại là B. anthracis khơng
độc. Chủng B. cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi
chứng ắm.
Cac cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân toàn
bộ gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) và

capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm
primer3pius. Ba cặp mồi phát hiện qen vrrA, pagA,
capA trong phản ứng mPCR được the hiện chi tiết ở
bảng 1 .
Chứng nội tại (internal amplification conirol-IC):
Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 đã được thiết lập
trong nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả [3] và
đăng ký sáng chế (Phụ lục 2). Plasmid này được thiết
kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán
là capAF1/R1 (Bảng 1)7
Bảng 1. Các moi sử dụng trong phản ứng mPCR
chứa IC
Kích
Gen đích
Trình tự (5'-3’)
thước
(bp)
vrrA
(nhiễm vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA
222
sắc thể) vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT
pagA
(plasmid pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA 751
pX01) pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT
capA
(plasmid capAFI :TGACGATGACGATGGTTGGT
610
pX02)
capARI:
1000

PJET1.2GCTTCCTGTCTAGGACTCGG
capA-ICI
Phương pháp
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực
nghiệm mơ tả, phân tích phịng thí nghiêm và trên thực
địa, sử dụng các kỹ thuậí vi sinh kinh điển và sinh tìọc
phân tử.
Các kỹ thuậỉ chính được tóm tắt như sau:

Tách dòng và giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than
được bấí hoạt ờ đieu kiện 121°C/20 phút sau đó tách
DNA tổng số theo quy trình của nhà sản xuất (QIAamp
DNA Mini Kit). Phản ứng PCR có độ chính xác cao
được thực hiện trên máy PCR Eppendorf Mastercycíer
pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity
(Thermo scientific). Sản phẩm PCR được tinh sạch
bằng kií GeneJet PCR purification và dịng hóa vào
vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific). Các piasmid
tái tổ hợp sau khỉ được kiểm tra có chứa gen mong
muốn được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên
máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit và
Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự tồn bộ các
gen đích, so sánh và phân tích trinh tự thu được với
các trình tự tham chiếu trên Genbank.
Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết quả giải
trình tự, một phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội tại
ổược thiết kế đề phát hiện chính xác các chủng B.
anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Chứng nội tại này
được bồ suríg vào mẫu trong q trình tách chiết DNA
với các nồng độ khác nhau để xác định lượng tối thiểu

vừa đủ có thể phát hiện được. Các thử nghiệm đều
được tiến hành song song với mẫu không chứa IC để
so sánh và mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm
soát ngoại nhiễm cũng như nhiễm chéo.
Phản ứng mPCR có thành phần như sau: 1X
Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases;
dNTPs 0,25 mM mỗi ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi
ngược mỗi loại, khoảng 10 ng DNA khuôn, điều chỉnh
H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific). Chu trinh
mPCR được thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, tiếp theo
!à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40
giây), sau đó hồn thành keo dài chuỗi ở 72° trong 6
phút. Sản phẩm mPCR được điện dí kiểm tra trên gel
agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide và
chụp ảnh dưới ánh sáng u v (UVP Eppendorf).
Cơng trình được thực hiện tại Trung tâm Nghiên
cứu ứng dụng Sinh Y Dược học và Bộ môn Khoa Vi
sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ
tháng 05/2014 đến tháng 02/2015.

KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1.
Nghiên cứu trình tự gen đặc trưng và gen
độc lực của B. anthracis
Gen vrrA (chromosome): Kết quả phân tích tồn bộ
gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis nghiên cứu cho
thấy gen vrrA giống nhau hoàn tồn về trình tự
nucleotide giữa các chủng B. arìthracis này và tương
đồng từ 99-100% so vởi các chủng tham chiếu. So với
chủng B. anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA của

các chủng phân lập ở Việt Nam chỉ sai khác 1
nucleotide (thêm nucleotide A ờ vị trí 346).
Gen pagA, cya, !ef (pX01): Ket quả phân tích tồn
bộ trình tự gen pagA các chủng than gây bệnh đã xác
định được 3 đột biến điểm (T-»C), gồm 1 đột biến
đồng nghĩa (T-»C)195 và 2 đột biến sai nghĩa
(T~>C)1693, (T ^ C )Í7 9 9 khi so sánh với trình tự tham
chiếu B. anthracĩs Volium-USA. Chỉ xác định được 1
đột biến đồng nghĩa (T~»C)600 trên gen cya chủng B.
anthracis Ba3 và Ba4. Đột biến này trước đó cũng đã
được tìm thấy ở các chủng như B. aníhracis A2012,

481


Ames Ancestor, BFV. Trong khi đó, gen ief có trình tự
giống nhau và tương đồng 100% so vởỉ chủng tham
chiếu.
Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, một
đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới (A->G)1048 được
xác định ở gen capA chủng B. anthràcis Ba1 làm thay
đồi amino acid lysine íhành aiuíamic. Đây !à đột biến

1010

.... 1.... í

1020

trước đó chưa được tìm thấy trong các nghiên cứu

trên thế giới và có thể khẳng định đay ià đột biến mới,
phát hiện đầu tiên trên 1 chủng của Việt Nam (Ba1)
(Hình 1). Hai gen cịn lại capB, capC cổ tính bảo tồn
cao, khong xảy ra đột biến ờ bất cứ điềm nào trên các
chùng nghiên cứu.

Í0 3 0

1040

-.0 5 0

1060

1070

1080

. - . . I ------ 1 . . . . I . . . . I . . . . 1 . . . . I

1050

. . . . I ------ 1 • • • • ! • • • • !

1100

-•••!■■'•
C P 0 07 S S 4 V o llu m

T M W T A T T C A RGM JGGJ.TCA C C M LÃSC C aÕ T T ÃC C AG TC C A T T G C A T Ằ A A 7J.T C G TG T G T f.T C G T C M T T W .C A A W kC R ? A C M JC C W G G GTG C TC TATG

A A E B 0 1 0 Ũ 0 0 4 4 HHR U SA
B C 0 1 2 5 7 7 CDC Ể 8 4
KZ- K N 0 5 0 6 5 3 A . B r . 0 0 3

.....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................................................................................................................... ..........................................................

A Á ẼS01000049 A u s t r a lia
NZ C P 0 0 7 7 0 2 B F V OSA
J B IC 0 1 0 0 0 0 8 2 C a rb o s a p
C P 008848 H Y001

9«

....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
................................................................... .................................................................................................................................................................................................................................................
......... ............... .....................................................................................................................................................................................................................................................................................
.................................................................................................. c ..................................................................................................... ................................................................. .......................................

NZ ABDH02000062 T s t a n k o v s

.......... ................................ ....................................................................................................................................................................................................................................

« 2 ~ K M 0 5 0 S 5 0 Z im b a b w o 8 9
H C ~0Ũ 398I A 2012
HC~ 0 0 7 3 2 3 A m e s A n c e s t o r

.................... ............................................................................. G .............................................................................. .................................................................................................................................
........................................................................................................................................................ .........................................................................................................................................................
....................... .. .................................................................................................................. + T ...........................................................................................................................................................

B o l V ie tn a m

................................................................................... ................... .. ....................................<5.................................................................................... ............................................................................

B&3 V i e t n a m

......................................... ...................................................................................................................................................

B a 4 V ie tn a m

........................................................................ ................................. ..........................................................................................................................* ......................... ...................................................

1030
C P007664

KKA Ư 3A

.........................
1

HC_012S77 coc 684

L

"

J P IG 0 1 0 0 0 0 8 Z
C P008848
sz

1050

1060

...............................................................................

5070

! 080

1090

1100

.................................................. ............... .......................
! i ..
s
!>
K
iV
ý:

.
..........................................................
...............................................
I . i>

K
R
V
< Si
iỉ
T.
T K
Í!

..............................................
!•'. K
Vi

~ V

E

-X

-

K

V

t

>>

!i

-

£

u> s

w

R

V

V

R

•;

i

T

K

D

•;

K

Ĩ,

w

.................. ................................. ................................................................................. .......................................................... - ....................................................................................................
1.
K
••
~
V
K
'■
V
r
'•
!,
15 K
::
R
V
1
a
T
X
a
:
*
K
t

I.
.............
......................... .. .............................................................................................................................. .....................
......................................................................... ........................

Ĩ ■} s ;;
!' K ?■ V V Ũ I. o K s B V ■/ p. c- - T K '•> ■'
K ~ «
ro K
s p K Ĩ V :■ E
>. o K i: R V V H Q
T K !j 1 K K ■;
Si
.............
, - ..................... ........................................................ ...............................................................................................................................................................................................
L
r 5 K c :: !• K f- 9 •; c
T. - K X- s V P- ’2 L T K & T n K a A
;i
.........................- .................................................................................................................................................................................................................................................................................

C ir b o s a p

HYOOl

“
N Z_KN 050650
KC 0 0 3 9 8 1
NC 0 0 7 3 2 3

9«

B FV ƯSA

AB DN 02000062

10' 10

....... .............. ............................................................... ...........................................

NZ K S 0506S 3 A .B r.0 0 3
AA ES01000049 A u s tr a lia
NZ C Ẽ 007702

1030

_____I . . . . I . . . . 1 . . . . i . . . . I . . . . 1 . . . . I ---------- Ì ----------I . . . . I . . . . 1 . « > . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . - - I . . . . i
T A iO ^ ÌA IT T C Ã A G A C G G A T C A C C A A A A C C a G ĨĨA C O A G T C C X T T C C A T A A A A A T C O T C T C T A T C G T C A A T T S A C A a A A G Ís T A C A T C C A A C G C T C C T C T A T C
i,
I
E
~ p
K
!■ V
-i L'
Ì-.
0 K
>f
R
V V

R
s
i,
~ K
r>
f
a is
> f.
«

V o llo tt

A A ER 01000044

lOXO

.................. ................................. ..........................................G .................................................................................................. - ....................................................................................................
V
ớ
Q
K
s
!
K
t>
V
s
ft
i . Ir
K

t
K
V
T ô
(,1
r,
V K
r.
Ơ K
-V
T o la n k o v s

2 ii B b a b w a

89

AZ012
JU ubs A n c a s t o r

............................................................................................................ ...............................................................................................................................................................................................
L
X'
£
•: s r
K
;■
V
T
n
<\

o K
R V
R cT
K D
■'
ri
K
ft
V
.............................................................................................. G ..........................................................................................................................................................................................................
V
T.
Vr.
::
e
?;
r
V
i! h
i
c K
R
1>
V
R Í
•- 1’ K 0
y
K
A
2.

n
............... ................................. ................................................................................................................................................ - ......................................................... ....................................
;i
I
0
15
ÍỈ
p
K
fV
r
s
T.
o
K
!í
s
V
'ỉ
s
Q
~
K
2
■
s
K
•:
, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.................

- ^ - - ............ ........................ ....................................

B al

V ie tn a m

.................................................................................. ...............y

Bo3

V l« tn u m

......................................................................................... .. ................. ................. .............. V ....................... ...................... ...................................
..............................................................
Ỉ.
:i
z
■:> E
r.
r
ỈT
r
V
T
A
—
D
ĨC
R
V

V
B
cT
K
ữ
3
K
vi
A
K
.................................................................................................................................................................................................................. ...........................................................................................
(.
i
V.
<
!■
y.
:•
V
■.
!ì
K
•H
V
V
Fi
i.
■(
K
it

■■■
K
s
Í.
>■

Ba 4 V ie tn a m

'

...............1 '

* p .'. I

' *

V.

..................................................................................... ..................... ’ ’

Hình 1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid cùa gen capA Ờ 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3, Ba4 VỚỈ12 chủng B.
anthracis thạm chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có xẩy ra đột biến điểm). Các chủng tham chiếu được ký hiệu theo
thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, nguồn gốc chủng, dấu chấm biểu thị nucleotide giống nhau, nếu có đọt biển se đưọ-c
biểu thị bằng các nucleotide.
cặp mồi capAF1/R1, cho sản phầm có kích thước 1kb)
Như vậy, qua phân tích trình tự tồn bộ các gen
dề dàng phân biệt tren bản điển di (Hình 2).
vrrA (nhiễm sac thể), pagA, cya, lef (pXÒ1), capA,
capB, capC (pX02) cho thấy: Sự sai khác về trình tự
nucleotide của các gen đích trên giữa chủng nghiên

cứu và các chùng tham chiểu là không nhiều. Trinh tự
đầy đủ của các gen phân ịập đã được đăng ký trên
Genbank với mã sổ: KP2131Ò2, KP213103,
KP213104, KP213105-7, KP759885-7, KP759888-93
(Phụ lục 3 -1 7 ).
2.
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đa mồi
IC 1000 bp
chửa chứng nội tại tái tổ hợp xác định B. anthracis
pagA 751 bp
Để xác định B. anthracis có độc lực, cần chl ra
capA 610 bp
được chủng vi khuẩn than đó có chứa đồng thời cả 2
plasmid độc íực là pX01 và pX02. Phản ứng mPCR
vrrA 222 bp
đã được thiềt kế với 3 cặp mồi ià vrrAF1/R1,
pagAF1/R1 và capAF1/R1 để xác đính sự có mặt cùa
các gen tương ứng đặc trưng cho B. anthracis. Sản
Hình 2. Xác định B. anthracỉs gây bệnh trong tự nhiên
phẩm mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B.
bằng mPCR chứa chứng nội tại
anthracis cỏ kích thước lần lượt là 222, 751 và 610 bp
M: Marker 100 bp (Thermo scientific), ĐC {-): Đối chứng
xảc định các gen tương ứng vrrA, pagA và capA cùng
âm; ĐC(+): Đối chưng dượng sử dụng plasmid chứa cac
với sển phẩm khuếch đại plasmid IC (sử dụng chung
gen pagA, capA, vrrA; B1-3: Các mẫu cần kiểm tra

482

BÀN LUẬN
Việc phân tích trình tự các gen đặc írưng và gen
độc lực của các chủng B. anthracis phân lập ờ Việt
Nam rất quan trọng. Đây là công bố đay đủ nhất trong
nước về trình tự nucleotide gen vrrA và các gen đặc
trưng trên hai plasmid độc lực là pX01, pX02. Kết quả
cho thấy, sự sai khác về trình tự nucleotide của các
gen đích trên giữa chủng nghiên cứu và các chủng
tham chiếu là không nhiều. Mức tương đồng cao phản
ánh tính đa dạng di truyền thấp cùa các chủng B.
anthracis. Một phần kết quả này đã được công bố
trong cơng trình nghiên cửu gần đây của nhóm tác giả
[2], Đột biến xảy ra ít được lý giải do B. anthracis có
khả năng hỉnh thành bào tử, tồn tại írong đất qua
nhiều thập kỷ. Do đó, cơ hội để tích lũy các đột biến
DNA bị hạn chế, dẫn đến sự biến đổi dí truyền tương
đối íỉ [7]. Từ đó, việc thiết kế kỹ thuật PCR chẩn đoán
B. anthracis và thư nghiệm dựa írên các chủng phân
lập trong nước hồn tồn có thể chần đốn với chùng
từ các khu vực khác trên thế giới. Đột biến mới
(A->G)1Q48 được xác định ờ gen capA trên chủng B.
ànthracỉs Ba1 co íhề có ý nghĩa về đa dạng di truyền
gen capA, nên đưực quan tâm khi nghiên cứu, lựa
chọn chủng cho nhiều mục đích khác nhau.
Đến nay, rất ít cơng bố về các phương pháp chẩn
đoán phân tư đề cập đen chứng nội tại IC [6,8]. Chứng
nội tại ià cần thiết và gần như bắt buọc trong các phàn
ứng chẩn đoán dựa trên PCR. Một số cơng trình cũng
đã nghiên cứu IC nhưng thường ià bổ sung trong giài

đoạn phản ứng khuếch đại nên khơng kiểm sốt được
q trỉnh tách chiết acid nucleic [10,12]. Trong cơng
trình này, để kiểm sốt tồn bộ các cơng đoạn xềí
nghiệm, lị được bổ sung vào mấu trong q trinh tách
chiết với một iượng tối thiểu có thể phat hiện được
nhằm loại bổ tối đa anh hưởng đến hiệu quả ỉẩch chiết
cũng như mPCR. Nồng độ ỈC được sử dụng ià
5x104copies/phản ứng (chi tiết quá trinh tối ưu mPCR
chứa IC đã được công bố trong bài báo gần đây cùa
nhóm nghiên cưu [4]). Sản phẩm IC xuấỉ hiện ở tất cả
các mẫu trên bản điện di, điều này chứng tổ quá trinh
tách chiết và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác
định là đáng tin cậy (Hình 2).
Có nhiều phương pháp từ đơn giàn đến phức tạp
được sử dụng để phát hiện B. anthracis. Nuôi cấy,
định danh trên mơi trường thạch máu địi hỏi nghiêm
ngặt về vấn đề an toàn sỉnh học. Một số phương pháp
mien dịch như phát hiện kháng nguyên và độc tố B.
anthracis có ứng dụng hạn chế do đọ nhạy và độ đặc
hiệu thấp. Phản ứng mPỊR trong cơng trình này được
thực hiện đơn giản đã cho phép xác định nhanh, chính
xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Điểm đặc
biệt ờ chỗ, mPCR có chứa ba cặp mồi dùng đề khuếch
đại đồng thời bốn sản phẩm gom ba gen đích vrrA,
pagA, capẠ của B. anthracis và một gen IC. Phản ứng
này đã khắc phục được hiện tượng đương tính gia
trong trường hợp chủng B. anỉhracis không đay đủ độc
lực, giúp giam giá thành và thời gian chẩn đoán so với
việc phai thực hiện các phản ứng đơn. Mặt khác, IC tái
ỉồ hợp được bổ sung vào mẫu trong quá trình tách

chiết ADN và khuếch đại đồng thời trong phản ứng

mPCR tối ưu cho phép xác minh kếí quả chẩn đốn,
loại bỏ hiện tượng am tính giả.
KẾT LUẬN_VA KIẾN NGHỊ
Kết luận: Trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA
(nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagA, ief, cya
(plasmid pX01) và capA, capB, cape (plasmid pX02)
của 10 Chung B. anthracis ở Việt Nam có sự sài khác
không nhiều so vởi thể giới. Một đột biến mới
(A-»G)1048 được xác định ở gen capA trên chủng B.
anihracis Ba1. Địng thời, đã phát triển thành cơng kỹ
thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại tái íổ hợp xác
định nhanh, chính xác B. anthracis gẩy bệnh trong tự
nhiên.
Kiến nghị: Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ
thuật mPCR chứa IC xác định B. anthracis trên thực
địa và chế tạo bộ kit mPCR đa mồi chẩn đốn chính
xác B. anthracis.
Lời cảm ơn: Cơng trinh này được hồn thành nhờ
sự tài trợ kinh phí cùa Chương trình CNSH phục vụ An
ninh, Quốc phỏng do Bộ Quốc phịng chủ quan thơng
qua nhiệm vụ “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác
định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và
dịch hạch”. Mã số: 2013.75.58.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn
Xuân Thanh. Nghiến cứu đặc điểm di truyền phan tư mội
số yếu tố độc lực cùa chủng Baciiỉus anthracis lưu hành ơ
khu vực mien núi phía Bắc Việt Nam. Hội nghị khoa học

Công nghệ Sinh họctọàn quốc 2013. 2013. pp. 594-8.
2. Đinh Thị Thù Hằng, Sơn Nguyễn Thái. Nghiên cứu
tồn bộ trình tự gen pagA trên một số chủng Bacillus
anthracis phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược
học Quân sự. 2015. 40(3), pp. 135-143.
3. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng
Tuyên và c s . Thiết kể chửng nội tại tái tổ hợp trong phản
ứng multiplex PCR chần đoán Bacillus anthracis. Tạp chí
Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26.
4. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thối Sơn, Minh
Nghiêm Ngọc, Phát triền phản ứng multiplex PCR chứa
chứng nội tại ỉái tổ hợp xác định đồng thời vi khuẩn
Bacillus anthracis và Yersinia pesíis. Tạp chí Y học Dự
phịng. 2015. XXV(8 (168)), pp. 239-246.
_
5. Candela, I., Mock M., and Fouet A. CapE, a 47amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis
poiygiutamate capsule synthesis. J Bacterioi. 2005.
187(22), pp. 7765-72.
6. Eíỉerbrok, H., Nattermann H.t Oze! M., et a!. Rapid
and sensitive identification of pathogenic and apathogenic
Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett.
2002. 214(1), pp. 51-9.
7. Hugh-Jones, M. and Blackburn J. The ecology of
Bacillus anthracis. Mol Aspects Med. 2009. 30(6), pp.
356-67.
8. Kiee, s. R., Ozel M., Appel B., et a!.
Characterization of Bacillus anthracis-like bacteria isolated
from wild great apes from Cote d'Ivoire and Cameroon. J
Bacteriol. 2006. 188(15), pp. 5333-44.
9. Letant, s. E., Murphy G. A., Alfaro T. M., et a!.

Rapid-viabiiity PCR method for detection of live, virulent
Baciiius anthracis in environmental samples. Appl Environ
Microbiol. 2011. 77(18), pp. 6570-8.
_
10. Loiez, c., Herwegh s., Wallet F,, et al. Detection of

483


Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR. J Clin
Microbiol. 2003. 41 (10) pp. .4873-5.
_
11. Lovchik, J. A., Drysdale M., Koehler T. M , et aỉ.
Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus
anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of
inhalational anthrax. Infect Immun. 2012. 80(7), pp. 241425.
12. Ngan, G. J „ Ng L. M., Lin R. I ., et a!.
Development of a novel multiplex PCR for the detection
and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi
and Paratyphi A. Res Microbiol. 2010.161(4), pp. 243-8.
PHỤ LỤC

Phụ lục gồm:
Phụ lục 1. Các bài báo đã cơng bố liên quan đến cơng
trình
Đinh Thị Thu Hằng và Nguyễn Thái Sơn. Nghiên cứu
tồn bộ trình tự gen pagA ỉren một số chủng Bacilius
anthracis phân íập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược
học Quân sự. 2015.40(3), pp. 135-143.

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng
Tuyên và CS. Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản
ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis. Tạp chí
Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26.
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc
Minh. Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội
tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus
a n iu ia ^ iS

VO

to r s in ic a

p c ? d ik > .

i
Ỵ

It y is

U Ự fJ iiU n y .

2015. XXV(8 (168)), pp. 239-246.
Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế của Cục Sở hữu Trí tuệ
Việt Nam và Phiếu kết quả phân tích cua Viện Kiểm định
Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế
Phụ lục 3 -17. Trinh tự các gen giải trình tự của các
chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam được đăng ký
trên Genbank.

Phụ lục 18. Giấy xác nhận ứng dụng kết quả đề tài
(Phụ íục có minh chứng kèm íheo trong Báo cáo toàn
văn đầy đu)

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC
KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
Ths. Ngô Thị Minh Châu, TS.Tơn Nữ Phương Anh, CN. Đ ỗ Thị Bích Thảo

Bộ môn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam
TS. Antoneila Santona, TS. Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli

Khoa Vi sinh lâm sàng và thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hịa Ý
TĨM TẮT

Nấm men là tác nhàn gây bệnh quan trọng ờ người, đặc biệt bệnh do nấm Candida sp. là bệnh phị biến.
Nghiên cứu của chúng tơi được tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập ở Bệnh viện Trường Đại học Y
Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế.
Mục tiêu: Định danh loài một so chủng nấm men phân lập được từ câc bệnh nhàn được chẩn đốn nhiễm
nấm nơng hoặc nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với một số thuốc kháng nấm. Phương pháp nghiên cứu:
Chúng tôi âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization
Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tựgen để định danh lồi vi nấm. Kháng nấm đồ được
thụ-c hiền bằng phương pháp khuếch tán trên đa thạch. Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được, trong đó
C.albicans 43,80% và các lồi c. non albicans khàc gồm: C.ỉrópicalis 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata
7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%,
c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83%. Ngoài ra chúng tơi cũng phân lập được 1 số lồi nấm men khác
như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65%. Đânh giá sự nhạy cảm của 6 loài vi nấm Candida
sp. có tần xuất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B và nystatin. Tỷ lệ
đề khàng của C. non albicans yà c. albicans với fluconazole và itraconazole lần lượt là 40,74%, 3,77% và 5,66%,
50%. Kết quả của chúng tôi cũng ghi nhận 20,37% c. non albicans và 18,86% c. albicans đề kháng với 5fluorocystocine. Tỷ lệ đề kháng với caspofungin của c. non albicans và c. albicans lần iưọt là 7,41% và 13,2%.

Kết luận: Giống Candida sp. chiếm ƯU thế với loài c. albicans có tỷ lệ cao nhất. Một số lồi Candida non albicans
biếm gặp được phân lập trong nghiên cứu này: c. orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, và
c.mesorugosa. Ngoài ra cắc loài nấm men khác cũng được định danh gồm Geotríchum capitatum và
Trichosporort asahii. Tất cả loài Candida sp. nhạy càm tot với amphotericin B và nystàtin, nhưng có một tỷ lệ
đáng kề c. non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.
Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.
SUMMARY

APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION
ANTIFUNGAL SUSCEPTIBỈL YTI TESTING BY DISK DIFFUSION METHOD
' _ _ _
_
Ths. Ngo Thi Minh Chau, TS.Ton NuPhuongAnh, CN. Đo Thi Bich Thao
(Parasitology Department- Hue University o f Medicine and Pharmacy, Vietnam)
TS. Antonella Santona, TS. Silvana Sana, GS.Pieró Cappucinelli
(Microbiology laboratory, Department Biomedical Science in Sassari, Italy)
Background: Yeasts are important opportunistic pathogen in human, in which Candida sp. are the most

484