N G H IÊN C Ứ U T

NG H

P V À T H Ử H O Ạ T TÍN H SINH H Ọ C

CÁC DẪN CH T CỦA ACID (+) ƯSNIC
Ths. N guyễn T h ị H ư n g G iang*
T Ó M TẲ T

H ư ớ n g dẫn: PG S.TS. N guyễn N gọc V in h*

Acid (+) usnic là một trong những hợp chất tự nhiên phong phú nhất được chiết xuất từ địa y. VỚI mong muốn tiếp
tục nghiên cửu các dân chất từ acid (+) usnic, nghiên cứu thực hiện nhằm mục tiếu t m ra các đẫn chất mới có tiềm năng
vể hoạt tính sinh học.
ĐỔI tuợng và phương pháp nghiên cứu: acid (+) usnỉc và các dẫn chất của acid (+) usnic.
Các dẫn chất được tổng hợp dựa trên phản ứng amin hóa. Các amin phản ứng bao gồm: amoniac, ethylendiamin
2­amino benzotrifluorid, 3­amino benzottifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­cloro 2­methylanilin, 5­cIoro 2­mefhylanilin
hyđroxylamin.
Thử hoạt tính sinh học:
­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng.
­ Khảo sát hoạt tính kháng ung thư trên địng tế bào ung thư não người Ư87MG: phương pháp MTT.
Kết luận:
­ Đã tổng hợp đirợc 10 dẫn chất của acid (+) usnic, trong đó có 9 đẫn chất chua thấy cơng bố trong các tài liệu tham
khảo được. Xác định cấu trúc 10 dẫn chất tổng hợp được.
­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cho kết quả các dẫn chất có tác đụng chủ yểu trên dịng vi khuẩn
gram +, ít có tác đụng trên vi khuẩn Gram ­ và nấm men.
­ Khảo sát hoạt tính kháng ung thư trên đòng tế bào ung thư não người Ư87MG. Kết quả cho thấy dẫn chất .9 có tác
đụng mạnh trên dịng tế bào này với LDso là 44,17
sau thời gian 24 giờ. Đây là những kết quả rất đáng quan tâm.
*Từ khóa: Acid (+) usnic; Các dẫn chất của acid (+) usnic; Hoạt tính sinh học.

Synthesừ and biological activity evaluation of(+)-usnw aciđ derivatives
Summ ary
(+) Usnic acid is a metabolite uniquely found in ỉichens. Since its first isolation in 1844[4], (+) usnic acid have been
interested in synthesis research The aim of this thesis keeps researching new (+) usnic acid derivatives with potential
biological activities.
Materials and methods: (­f) usnic acid and (+) usnic acid derivatives. (+)­usnic acid derivatives are synthesized by
amine reaction.
General procedure for (+) usnic acid derivatives synthesis (A). To a solution of amine was added dropwise (+) usnic
acid in alcohol under reflux. After stirring for 4 hours, the mixture was concentrated under reduced pressure. The
obtained residue was purified by preparative chromatography.
Procedure of (+) usnic acid with Hydroxylamine Hydrochloride (B). A solution of (+) usnic acid and hyđroxyỉamine
hydrochloride in 5% methanolic potassium hydroxide and distilled water was heated at 50°c under a nitrogen
atmosphere for 2h. The resulting solution was added with IN hydrochloric acid. The residue was purified by
preparative chromatography.
In thesis, we used the amines including ammonia, ethylenediamine, 2­aminobenzotrifluoride, 3Taminobenzotrifluoride
4­aminobenzotrifluoride, 3­chloro 2­methyianiline, 5­chloro 2­methylaniiine, and hydroxylamine;
Ten (+) usnic acid­amine conjugates were evaluated on antibacterial, antifungal activities with the agar dilution
method. In addition, the cytotoxicity of the derivatives against human glioblastoma­astrocytoma cell line (Ư87MG) was
evaluated using the MTT3assay.

*

Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hầ C hí M inh

626


Conclusion: In this study, we synthesized ten (+) usnic acid derivatives and of which, nine compounds have not
been in any official publications. The structures of all derivatives are confirmed by spectral and analytical data.

In biological activity, it showed that (+) usnic acid and derivatives affect almost in gram­positive bacteria and
compound 9 shows better activity in human cancer cell line U87MG than (+) usnic acid.
* Key words: Acid (+) usnic; (+) usnic acid derivatives; Biological activity.
I. Đ ẶT VẤN Đ
Acid usnic là một trong những hợp chất tự nhiên phong phú nhất được t m thấy từ địa y. Acid usnic có
cơng thức phân tử là C 18H 1607, tên hóa học là 2,6­diacetyI­7,9­đihyđroxy­8,9b~đimethyl~l,3(2H, 9bH)­
dibenzo­furandion, là một sắc tổ màu vàng, trong tự nhiên tồn tại hai đồng phấn R+ và S­, tùy thuộc vào
nhóm methyl tại vị trí 9b. Kể từ khi được Knop phân lập từ địa y năm 1844 [4], cho tới những năm gần đây,
aciđ usnic đã và đang được các nhà khoa học tổng hợp, sàng lọc được nhiều dẫn chất với những hoạt tính
sinh học đa dạng như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng dị ứng, chất ức chế tăng trưởng thực vật, kháng
đơn bào, và ức chế enzyme [ 5 ,6 ,1 0 ,1 1 , 14].
Các tác dụng kể trên mở ra triển vọng có thể nghiên cứu phát triển đẫn chất từ acid usnic thành thuốc điều
trị, kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm ... Trong lĩnh vực hóa sinh, việc tổng hợp acid usnic và các dẫn
chất di từ aciđ usnic cũng không ngừng được quan tâm phát triển, không chỉ trong lĩnh vực thiết kế tổng hợp
những dẫn chất mới, m à còn nghiên cứu cơ chế phản ứng, cải thiện đặc tính lý hóa với mục tiêu làm tăng các
tác dụng sinh học của các hợp chất này.
Các dẫn chất amin của acid (+) usnic bắt đầu được nghiên cứu từ những năm 1950, đến hiện nay vẫn tiếp
tục được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu (1, 2, 3, 7, 8, 9, 10). Tuy nhiên, trong nước chưa có nghiên
cứu nào về tổng hợp cũng như tác dụng sinh học của các dẫn chất này.
V thế, mục tiêu của nghiên cứu: Tổng hợp các đẫn c h ầ am in của acid (+) U S Ì Ú C xác định cấu trúc và
th ử hoạt tính sin h hoc cửa các dẫn chẩt trên các ch ủn g vị sin h vật gram (+), gram (-) và th ử tác dạng
khá ng u n g th ư trên dòng tế bào un g th ư não ngườ i U87MG.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên li u và trang thiết b ị
2.1.1. N guyên li u

Nguyên liệu tổng hợp hóa học: acid (+) usnic (Sigma, Mỹ); ethylendiamin, 2­amino benzotrifluorid, 3­amino
benzotrifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­c oro 2­methylanilin, 5­cloro 2­methyIanilin, ethylendiamin,
2­amino benzotrifluorid, 3­amino benzotrifluorid, 4­amino benzotrifluorid, 3­cloro 2­methylaniỉin, 5­cloro

2­methylanilin, hydroxyỉamin, amoniac đậm đặc, tetrahydrofuran, đicloromethan, toluen, acid hydroclorid 37%,
kali hydroxyd, natri sulfat, n­hexan, dimethyl sulfoxid, aceton, methanol, ethanol, cloroform, acid acetic băng đạt
tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức).
Nguyên liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học: Sabouraud dexưose agar (Merck, Đức), Mueller­Hinton agar
(Oxoiđ, Thermo), Trypticasein Soy Agar (Merck, Đức), Dulbecco’s modified Eagle's medium (Gibco BRL,
Grand Island, New York, M ỹ), huyết thanh thai nhi bò (FBS,Hyclone Laboratories, Thermo), Penicillin
(Gibco BRL, Grand Island, New York, Mỹ), Streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, New York, Mỹ)
2.1.2. T ra n g thiết bị

Máy cơ quay dưới áp suất giảm BƯCHĨ Ravapor R­200 (Thụy Sĩ). Máy đo nhiệt độ nóng chày BUCHI
(Thụy Sĩ). M áy đo phổ hồng ngoại Nicolet 760 (Mỹ), sắ c ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC­20A (Nhật),
cột Gemini Nx C18 (75*4,6 mm; 2,1 |im). sắ c ký lỏng điều chế Shimadzu (Nhật), cột HiQ C18 (250 * 21,2
mm; 10 ịim ), cột Agilent Prep SIL (250 *21,2 mm; 10 (im), sắc ký lỏng ghép khối phổ Shimadzu LCMS­IT­
TOF (Nhật). M áy đo phổ công hưởng từ hạt nhân Bruker AC­500 M Hz (Mỹ), Trường đại học Khoa học Tự
nhiên. M áy đo phổ công hường từ hạt nhân Bruker AC­500 M Hz (Mỹ), Viện Hóa học ­ V iện Khoa Học và
công nghệ Việt Nam.

627


2.2. Phư ơng pháp tồng họ p hóa học

tơng hợp theo các sơ đố
Có 10 dẫn chất của acid (4­) usnic đã được tổng
đồ sau:
/p
? íí;ĩ' V ' 0H

Ifu HO—(v


k

A [í A y
°

r ­n h , .

\

ỉ

Ị

/~ = \

/

Q

\

ỉ )ĨJ r \)—. Nlt
j

011 °*

*

rt/l il I A K C 44
/ “ì Ỉ-J / Ạ

F A ^ ll IW£ị\
I iị i.&^ii.ieiiUADj
R,. 44I1 l / w IIu iíírỉvỉmruivii
2 wvQ­'"
(diclorometantth. 25sCj
Hi
1

l/w u
II

rt/lil IAK C /“ì u M 'W ik FAfll (W£ị\
^ íír ỉv ỉm r u iv ii I
í .c .^ ^ r iif io iiU A D ^

4 ặ 6 A­W­'^ ^(ElOI l/Bh, rluttỊ)
Í4 :2 -0 F;j; 5: -C F j. 6 ; 4 -CF-J ì
Fac

7

.M* /

Ẩ ........... ..

4- iQ OH /2h. ratluxa)

>7­^:1

HsC


sl'wlmuiartyt

THF-FtOH;1 :)
B0”C>'Sh

(7: 2 ­CH3. 3*­Cl; ô; 2‘­CHa. 5'­Cl)

CI

/N ^ v
HO

>
>­­­­ /

í

N
;

) l iv A Nn

/

\

/«
o


)

NH

HỌ

)_ ỵ ° ' y ^ Y =°
H 0~ ~ s

/—

/

1S

/H \..x
* .7

- U

OH

o

N Ỹ 1^

1' t .

N


Ị
I

. I*

6’

^­r*

*R
^“ ỊJ ịI .R

5'

4

HVDROOTIAM IN

­­­­­­­­­­­*

Hn

K O H f i i i . fM
. M fe0H>H
l O H V H E0
r O (2
f ? :1)1
-1 ìn
K0H5%


fXfiCJ2NN?

X

s ­ / ° > , ‘* ' v

y .x

ỵ. ỷ

\

V-.

/

15

\___i

\

OH

/

ị 7 xy

0


*0

*S v.

,

I

1

..­ s ,

II

U -R

9: R - 3'-CF,

10:R=2’GH3; 5‘Cl

Sơ đồ 1. Sơ đồ tổng hợp các đẫn chất 1, 2 ,4 , 5 , 6 , 7 , 8 amin hóa cùa acid (+) usnic
Sơ đồ 2. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 3 của acid (+) usnic
Nhóm tạo dẫn chất với hydroxylamin tại vị trí nhóm ceton của carbon C13 theo sơ đồ sau:
Sơ đồ3. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 9, 10 của acid (+) usnic
2.3.Tách các dẫn chất bằng sắc k ý đi u chể và xác định cấu trúc

Các đẫn chất amin tổng hợp được tách và làm sạch trên hệ thống sắc ký lỏng điều chế Shimadzu đầu
đò PDA.
Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc bằng nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng,
phương pháp phổ hồng ngoại, phương pháp đo phổ khối, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân.


628


Bảng 1. Điều kiện chạy sắc ký điều chế
Dẩn chất
2
3

Pha động

Cột

AcCN ­ A.acetic 0,1 %

H ĨQ C18

(75: 25)

(2 50 * 21,2 mm; 10 ịxm)

AcCN ­ A.acetic 0,1 %

H ÌQ C Ỉ8

(40:60)

Agilent Prep SIL

Tốc độ dòng


Detector

15 ml/phút

254 nm

10 ml/phút

254 nm

13 ml/phứt

254 nm

4

EA ­ n­hexan (5:5)

5

EA ­ n­hexart (5:5)

Agilent Prep SIL

15 ml/phút

254 nm

6


EA ­ n­hexan (3:7)

Agilent Prep SIL

15 ml/phút

254 nm

7

EA ­ n­hexan (4:6)

Agilent Prep SIL

14 ml/phút

254 nm

9

EA ­ n­hexan (5:5)

Agilent Prep SIL

15 ml/phút

254 nm

10


EA ­ n­hexan (5:5)

Agilent Prep SIL

15 ml/phút

254 nm

(250 * 21,2mm; 10 fim)

2.4.Thử hoạt tín h sin h học in vitro
2.4.1. Phương pháp thửhoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng [12]. Vi sinh vật dùng cho thử nghiệm bao gồm
Staphylococcus aur us ATCC 29737, Bacillus subtiỉis ATCC 6633, Esch richia coỉi ATCC 10536, Ps udomonas
a ruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231.
2.4.2. T h ử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Thí nghiệm được thực hiện tại khoa Dược, Đại học Quốc gia Kangwon, Chuncheon Gangwon, Hàn Quốc.
Các tế bào Ư87MG glioblastoma (tế bào ung thư não người) được lấy từ Ngân hàng Cell Line Hàn Quốc.
Khảo sát hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào ung thư não người U87M G trong khoảng thời gian 24 giờ
và 48 giờ. Tién hành định lượng theo phương pháp M TT(13), trên đòng tế bào ung thư não người U87MG.
III. K Ế T QUẢ
3.1. Tổn g hợp hóa học
31.1. (R,E)-4-acetyl-2-(l--anim(>hylídene)-7,9-dihydroxy-8,9b-dimethyIdibenzo ỊỊM]fíiran-l,3(2H^bH)-dỉoii1:

từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu sản phẩm (1)

dạng tinh thể màu vàng nhạt (295 mg, 85 %); tone ss 252­254 oC; R f = 0,25 (etyl acetat ­ n­hexan ­

MeOH, 5:5:0,1). IR (KBr), V (cm ­ ) 3272, 3200­2500, 1697, 1625, 1548. ƯV Xmax (nm, CH 30H ) 289, 223.
ESI­MS (m/z) C18H17N06 lý thuyết: 343,1056, thực tế: 343,Ỉ033. 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) s
(ppm), J (Hz) 1,612 (s, 3H, CH3­10); 1,947 (s, 3H, CH3­15); 2,504 (s, 3H, CH3­12); 2,611 (s’ 3H, CH3­14);
5,796 (s, 1H, C4­H); 9,781 (s, 1H, N­H); 11,538 (s, 1H, C9­OH); 12,232 (s, 1H, N­H); 13,353 (s, 1H, C7­
OH). Ỉ3C­NM R (125 MHz, DMSO­CỈ6) 5 (ppm) 7,384 (CH3­15); 24,397 (CH3­Ỉ2); 30,875 (CH3­14);
31,609 (CH3­10); 56,001 (C­9b); 100,778 (C­4); 101,220 (C­6); 102,442 (C­9a); 105,034 (C­2); 106,262
(C­8); 155,589 (C­4b); 157,620 (C~9); 162,484 (C­7); 172,886 (C­11); 175,779 (C­4a); 188,413 (C­3);
197,532 (C~l); 200,713 (C­13).
3.1^. (R,E)-6-aceíyl-2-(l-(2-ammoethylamino)ethylidene)-7,9“díhydroxy-8,9b- đim ethyỉdibenzo[b,d]furan-

l,3(2H,9bH)­dion 2: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu sản phẩm (2) dạng bột màu trắng (177 mg, 51 %);
tone = 186­188 oC; Rf = 0,51 (CH2CỈ2 ­ MeOH ­ NH3, 95:5:1); IR (KBr), V (cm­1) 3270 (vN­H); 3200­2500
(vN~H, vO­H); 1696 (vC =0); 1635 (vC =0, vC=C); 1545 (vC=0). ư v Xmax (nm, 3C H 30H ) 291; 222. ESI­
MS (m/z) C20H 22N206, iý thuyết: 386,1478; thực tế: 386,1428. 1H­ NM R (500 M Hz, DMSO­d6) s (ppm),

629


J (Hz) 1,645 (s, 3H, CH3­10); 1,943 (s, 3H, CH3­15); 2,511 (s, 3H, CH3­12); 2,622 (s, 3H, CH3­14); 3,305
(t, 4H, J = 5 Hz, CH2­2’, 3’); 3,947 (t, 2H, J = 3 Hz, NH2); 5,873 (s, 1H, C4­H); 12,129 (s, 1H, C9­OH);
13.055 (s, ÍH , K­H); 13,371 (m, III, C7­OH). 13C­NMR (125 MHz, DM SO­d6) Ỗ (ppm) 7,390 (CH3­15);
18,100 (CH3­12); 30,94 (CH3­14); 31,62 (CH3­10); 39,03 (CH2­2’); 42,42 (CH2­1’); 56,30 (C­9b); 100,83
(C­4); 102,04 (C­6); 102,32 (C­9a); 105,00 (C~2); 106,31 (C­8); 155,68 (C~4b); 157,55 (C­9); 162,48 (C­7);
172,96 (C ­11); 175,73 (C~4a); 188,70 (C­3); 19737 (C ­l); 200,83 (C­13),
3.1.3. (R)-10-acetyI-7,9-dihydroxy-5,6a,8-trimethyI-3,4-dihydrO “2 H “ }enzo[2,3] benzofuro[6,5-e][l,4]

diazem n­6(6aH )­on 3: từ 344 me (1 mmoli acid í+ usnic thu sản phẩm
dạng bột màu vàng ( 145 mơ
42 %); tone = 175­177 oC; R f ­ 0,31 (CH2C12 ­ M eOH ­ NH3, 95:5:1). IR (KBr), 7(cm~1) 3450 (vN­ H);
3200­2500 (vN­H, vO­H); 1699 (vC =0); 1628 (vC =0, vC ­C ); 1551 (vC=0).ƯV Xmax (nm, CH3ỜH) 324,

248, 225. ESI­MS (m/z) C20H20N 205; ý thuyết: 368,1372; thực tế: 368,1313. 1H­NMR (500 MHz,
DMSO­d6) ổ (ppm), J (Hz) (phụ lục 3­4): 1,645 (s, 3H, CH3­10); 1,841 (s, 3H, CH3­15); 2,517 (s, 3H, CH3­12);
2,528 (s, 3H, CH3­14); 3,631 (dđ, 2H, J = 13,5 Hz, CH2); 3,745 (dd, 2H, J = 13,5 Hz, CH2); 5,873 (s, 1H,
C4­H); 13,556 (s, 1H .N ­ H), 13C­NMR (125 MHz, D M SO đó) 5 (ppm) 7,390 (CH3­15); 18,100 (CH3­12);
30,94 (CH3­14); 31,62 (CH3­10); 39,03 (CH2­2’); 42,42 (C H 2­Í1); 56,30 (C­9b); 100,83 (C­4); 102,04
(C­6); 102,32 (C­9a); 105,00 (C­2); 106,31 (C­8); 155,68 (C­4b); 157,55 (C­9); 162,48 (C­7); 172,96 (0­11);
175,73 (C­4a); 188,70 (C­3); 197,37 (C ­l); 200,83 (0­13).
3.1.4. (E)-6-acetyl-7ỷ9 -dih ydroxy -8,9b-dim eth yl-2-(l-(2-(trifluo ro m ethyl) phenylam ino)ethylidene)

dibenzo[b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dion4: từ 344 mg ( ỉ mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu trắng
ngà (204 mg, 42 %); tone = 144­146 oC; R f “ 0,36 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1). IR (KBr), V (cm­1) 1693
(vC=0); 1635 (vC = 0, vC=C); 1548 (vC =0). ư v Xmax (nm, C H 30H ) 294; 223. ESI­MS (m/z)
C25H20F3N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1175. 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm), J (Hz)
1 761 (s, 3H, CH3­10); 2,025 (s, 3H, CH3­15); 2,478 (s, 3H, CH3­12); 2,689 (s, 3H, CH3­14); 6,019 (s, 1H,
C4­H); 7,706 (t, 2H, J = 7,5 Hz, C 4’ ,C5’); 7,861 (t, 1H, J = 7,5 Hz, C 6’); 7,928 (d, 2H, B \ 4 ’= 7,5 Hz, C3’);
11,915 (s, ÌH, C9­OH); 13,399 (s, 1H, C7­ OH); 14,844 (s, 1H, N­H). 13C­NMR (125 M Hz, DMSO­d6) 5
(ppm) 7,45 (CH3­15); 20,37 (CH3­12); 30,99 (CH3­Í4); 31,51 (CH3­10); 56,92 (C­9b); 101,00 (C­4);
102,07 (C~6); 102,59 (C­9a); 104,88 (C­2); 106,60 (C­8); 122,03 (C­6’); 126,94 (C~4’); 129,21 (C­5*);

129.55 (C­3’); 133,69 (C~2’); 133,93 (C­D; 155,64 (G­4b); 157,34 (C~9); 162,57 (C­7); 174,11 (C­1I);
175,06 (C­4a), 1 8 9 ,8 6 (0 3 ); 198,44 (C ­I); 200,92 (0­13).

3.1.5. (E)-6-acetyI-7,9-dihydroxy-8,9b-dim ethyI-2-(l-(3-(trifluorom ethyI) phenylam ino)ethyliđene)

dỉbenzoíb,d]fiiran~l,3(2H ,9bH )­dion5: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu vàng
nhạt (326,3 mg, 67 %); tone = 158­160 oC ; R f = 0,43 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1). IR (KBr), V(cm ­l)

1698 (vC=0); 1628 (vC=0, vC=C); 1549 (vOO). ưv Xmax (nm, CH30H) 295; 223. ESI­MS (m/z)

C25H 20F3N 06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1164. IH­NMR (500 MHz, DMSO­dó) ô (ppm), J (Hz)

1,710 (s, 3H, CH3­10); 1,977 (s, 3H, CH3­15); 2,532 (s, 3H, CH3­12); 2,650 (s, 3H, CH3­14); 6,011 (s, 1H,
C4­H); 7,753 (t, ÌH, J = 5,5 Hz, C 4’ ,c& ); 7,801 (d, 2H, J ạ 5,5 Hz, C 4’ ,C 6’); 7,856 (s, 1H, C2’); 11,915 (s

1H, C9“OH); 13,399 (s, ĨH, C7­OH); 14,844 (Sí 1H, N­H) 13C­NMR (125 MHz, DMSO­d6) s (ppm) 7,48

(CH3­Í5); 20,36 (CH3­12); 31,02 (CH3­14); 31,54 (CH3­10); 56,83 (C­9b); 100,95 (C­4); 102,19 (C­6);
102,60 (C­9a); 104,91 (C­2); 106,53 (C­8); 122,95 (C­6’); 124,75 (C­2’)í 130,17 (C­4­); 130,29 (C­
5’);4 Í3 0 ,7 4 (C­3’); 1 3 6 ,7 2 (C ­r); 155,65 (C­4b); 157,39(C­9); 162,60(0­7); 173,72(C ­U ); 174,30(C­4a),
189.56 (C­3); 198,33 (C ­l); 200,92 (C­13).
3.1.6. (E)-6"acetyI-7,9-dihydroxy-8,9b-dim ethyl-2> (l-(4-(trittuorom ethyI) phenylam ino)ethy idene)

dsbenzo[b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dion6: từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể h nh kim, màu trắng
ngà (31.6,5 rag, 65 %); tone = 169­171 oC ; R f = 0,48 (EA ­ n­hexan ­ M eOH, 3:7:0,1). IR (KBr), V (cm­1)

1699 (vOO); 1635 (vC=0, vC=C); 1545 (vC­O). u v Xmax (nm, CH30H) 294; 223. ESĨ­MS (m/z)

C25H20F3N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế: 487,1138. 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm), J (Hz)

630


1,720 (s, 3H, CH3­10); 1,995 (s, 3H, CH3­15); 2,562 (s, 3H, CH3­12); 2,658 (s, 3H, CH3­14); 6,029 (s, 1H,
C4“H); 7,651 (d, 2H, J = 7 Hz, C T ,C6’); 7,889 (đ, 2H, J = 7 Hz, C 3 \ C51); 11,887 (s, 1H, C9­OH); 13,404
(s, 1H, C7­OH); 14,937 (s, 1H, N­H). 13C­ NMR (125 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm) 7,49 (CH3­15); 20,46
(CH3­12); 31,02 (CH3­14); 31,51 (CH3­10); 56,89 (C­9b); 100,95 (C­4); 102,18 (C­6); 102,75 (C­9a);
104,91 (C­2); 106,55 (C­8); 112,96 (C4’­CF3); 124,75 (C­61); 126,61 (C­2’); 126,63 (C­5*); 126,72 (C­ 3’);
128,32 (C­4 ); 139,51 ( C ­ l’); 155,64 (C­4b); 157,37 (C­9); 162,59 (C­7); 173,83 (C­ 11); 173,99 (C­4a),
189,64 (C­3); 198,39 (C ­l); 200,95 (C­13).
3.1.7. (E)-6-acetyl-2-(l-(3-chloro-2-m ethylphenylam ino)ethylidene)-7,9-dihydroxj-8,9b-im ethyldibenzo


[b,d]fu ran ­l,3(2H ,9b H )­dion7 : từ 344 mg (1 mmol) acid (+) usnic thu tinh thể, m àu trắng ngà (379,9 mg,
78 %); tone == 172­173 oC; R f = 0,47 (EA ­ n­hexan ­ MeOH, 3:7:0,1). IR (KBr), V (cm­1) 1699 (vC =0);
1635 (vC=0, vC=C); Ỉ542 (vC = 0). u v Xmax (nm, C H 30H ) 296; 222. ESI­MS (m/z) C25H22CỈNOÓ; lý
thuyết: 467,1136; thực tế: 487,1143. 1H­NMR (500 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm), J (Hz) 1,727 (s, 3H, CH3­
10); 1,992 (d, 3H, CH3­15); 2,270 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,449 (s, 3H, CH3­12); 2,662 (s, 3H, C H 34 4); 6,005
(s, 1H, C4­H); 7,379 (t, 2H, J = 5 Hz, C 4 \C 6 ’); 7,547 (t, 1H, J ==5 Hz, C 5 ’); 11,980 (s, 1H, C9­OH); 13,397
(s, 1H, C7­OH); 14,688 (s, 1H, N­H). 13C­NMR (Ỉ25 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm) 7,46 (CH3­15); 14,97
(C6H4­CH3); 20,26 (CH3­12); 30,99 (CH3­14); 31,58 (CH3­10); 56,73 (C­9b); 100,93 (C­ 4); Ỉ02,16 (C­6);
102,37 (C­9a); 104,95 (C­2); 106,50 (C­8); 125,82 (C­6’); 127,72 ( 0 4 ); 129,10 (C­5*); 132,08 (C­3’);
134.46 (C -T); 136,42 (C -V); 155,62 (C­4b); 157,43 ( 0 9 ) ; 162,55 (C­7); 173,79 ( C ­ ll); 174,67 (C 4 a);
189,63 (C­3); 198,09 (C ­i); 200,88 (C­13).
3.1.8. (E)‘ 6-acetyI-2-(l-(5-chioro-2-rahyIphenylammo)etìiylidene)-7,9-dihydroxy-8,9b-dlmethyldibenzo

[b,d]furan­l,3(2H ,9bH )­dio n8: từ 344 mg (I mmol) acid (+) usnic Ehu sản phẩm (418,8 mg, 86 %); tone ~
234­236 oC; Rf = 0,46 (EA ­ n­hexan ­ MeOH, 3:7:0,1). ]R (KBr), V(cm­1) 1698 (vC=0); 1629 (vC=0, vC=C);
1553 (vC=0). ƯV Xmax (nm, C H 30H ) 295; 220. ESI­MS (m/z) C25H22C1N06; lý thuyết: 487,1243; thực tế:
487,1149. 1H­NMR (500 MHz, ĐMSO­đ6) 5 (ppm), J (Hz) 1,736 (s, 3H, CH3­10); 2,002 (d, 3H, CH3­15);
2,220 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,474 (s, 3H, CH3­12); 2,678 (s,
3H, CH3­14); 6,032 (s, 1H, C4­H); 7,441 (d, 2H, J3 ’~ 4 ’= 8,5 Hz, C3’ ,C4’); 1,552 (s, 1H, C6’); 12,012
(s, 1H, C9­OH); 13,414 (s, ỈH, C7­OH); 14,648 (s, 1H, N­H). 13C­NMR (125 M Hz, DMSO­d6) 5 (ppm)
7,48 (CH3­15); 16,92 (C6H4­CH3); 20,24(C H342); 31,03 (CH3­14); 31,55 (CH3­10); 56,74 (C­9b); 100,97
(C­4); 102,21 (C­6); 102,39 (C­9a); 104,98 (C­2); Ỉ06.50 (C­8); 126,40 (C­6’); 128,31 (CM’); 130,76 (C­3’);
132.47 (C­5*); 132,82 (C­2’); 136,22 (C ­ r) ; 155,68 (C­4b); 157,45 (C­9); 162,54 (C­7); 173,81 (C­Ỉ1);
174,68 (C~4a); 189,62 (C­3); 198,12 (C ­l); 200,96 (C­13).
3.1.9. (E )-7 ,9 -d ih yd ro xy-6 -((Z )-l-(h yd ro x yim in o )eth yI)-8 ,9 b -d im ethy l-2 -(l-(3 (triflu o ro m e th yl)
phenyiam ino)ethyUdene)đỉbenzo[b,đ]furan-Ì,3(2H,9bH)-đỉon9: từ 100 mg (0,2 mmol) dẫn chất V thu s n

phẩm (9) tinh thể h nh kim, màu trắng ngà (67,3 mg, 67 %); tone = 120­122 oC; R f = 0,35 (HA ­ n­hexan ­
MeOH, 3:7:0,1). ĨR (KBr), V (cm­1) 1692 (vC=0); 1630 (vC= 0, v€=C ); 1546 (vC =0). ư v Ằmax (nm,
CH3ỎH) 313; 275; 226. 5 ESI­MS (m ỉz) C25H21F3N206; lý thuyết: 502,1352; thực tế: 50 2,1 251.1H­NMR

(500 MHz, DMSO~d6) 5 (ppm), J (Hz) 1,682 (s, 3H, CH3­10); 1,999 (sf 3H, CH3­15); 2,349 (s, 3H, O B ­
12); 2,526 (s, 3H, CH3­14); 5,888 (s, 1H, C4­H); 7,753 (t, 2H, J2’~6 ’= 5,5 Hz, C 2’ ,C6’); 7,791 (d, 2H, J2 ’~
6 ’= 5,5 Hz, C2’ ,C6’); 7,851 (s, 2H, C2f); 11,178 (s, 1H, C9­OH); 11,497 (s, 1H, N­OH); 12,105 (s’ 1H, C7­
OH); 14,906 (s, ỈH , N~H). 13C­NMR (125 MHz, DMSO­d6) 5 (ppm) 8,27 (CH3­15); 20,27 (CH3­12);
3 ỉ ,64 (CH3­14); 31,67 (CH3­10); 57,00 (C­9b); 101,28 (C­4); 102,69 ( 0 6 ) ; 103,97 (C­9a); 104,33 (C­2);
106,75 (C­8); 122,95 (C­6’); 124,64 (C­2’); 129,70 (C A '); 130,22 (C­5’); 130,36 (C­3’); 136,83 (C­1*);
154,97 (C­4b); 157,36 (C­9); 157,40 (C­7); 173,95 (CM ỉ); 174,42 (C­4a), 189,79 (C­3); 198,68 (C­1);
201,08 (C­13).
631


3.1.10.

(E)-2-(l-(5-chloro-2-m ethylphenylam ino)ethylidene)-7,9-dihydroxy-6-((Z)-l- (hydroxyim ino)

ethyI)­8,9b­tU m eth ykpenzo[b,d ]furan­l,3(2 H ,9bH )­dio nlO : từ dẫn chất V (122 fil; 0,25 mmol) thu tinh
thể h nh kim, màu trắng ngà (87,9 mg, 70 %); tone = 175­177 oC; R f = 0,37 (EA ­ 11­hexan ­ MeOH,
3:7:0 I), m (KBr), V(cm ­I) 1698 (vC = 0); 1630 (vC=0, vC=C); 1556 (vC= 0). u v Xmax (nm, CH 30H ) 279;
223. ESI­MS (m/z) C25H23C1N206; lý thuyết: 482,1245; thực tể: 482,1226. 1H­NMR (500 MHz, ĐMSO­
d6) ã (ppm), J (Hz) 1,982 (s, 3H, CH3­10); 2,002 (d, 3H, CH3­15); 2,202 (s, 3H,C6H4­CH3); 2,452 (s, 3H,
CH3­12); 2,656 (s, 3H, CH3­14); 6,000 (s, 1H, C4­H); 7,431 (d, 2H, J3*­4 ’= 8 Hz, C 3’ ,C4’); 7,527 (s, 1H,
C6’); 11,490 (s, 1H, N­OH); 12,088 (s, 1H, C9­OH); 13,400 (s, 1H, C7­OH); 14,646 (s, 1H, N­H). Ỉ3C­
NM R (125 MHz, DMSO­d6) 6 (ppm) 7,47 (CH3­15); 16,93 (C6H4­CH3); 20,14 (CH3­12); 31,01 (CH3­14);
31,67 (CH3­10); 56,91 (C­9b); 101,26 (CA); 102,17 (C­6); 102,45 (C­9a); 104,35 (C­2); 106,7.0 (C­8);
126,39 (C­6’>; 128,20 (C­ 4 ’); 130,75 (C­3’); 132,43 (C­5’); 132,78 ( 0 2 ’); 136,30 (C­1*); 154,95 157,30 (C­ 9); 162,55 (C­7); 173,78 (C ­l 1); 174,45 (C~4a); 189,82 (C­3); 198,46 (C­1); 200,91 (C­ 13).
3.2. H o ạt tín h sinh học
3.2.1. Phư ơng pháp thử hoạt tín h kháng khuẩn, kháng nấm

ỉ

Kết quả cho thấy acid (+) usnic khơng có tác dụng kháng khuẩn đối với Escherichia coli
ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, có tác đụng ức chế Bacillus subtilis ATCC 6633 ờ
nồng độ 50 fig/ml,có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus ATCC 9027 ở nồng độ 50 ịxg/ml. Từ kết quả
cho thấy acid (+) usnic và các dẫn chất có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram (+), tuy nhiên sau khi thế các
amin mạch thẳng và amin thơm vào oxy tại vị trí nhóm acetyl của C2 và C6 th khơng mang đến kết quả như
dự đốn, các dẫn chất giảm tác dụng ức chế vi khuẩn.
3.2.2. T h ử hoạ t tín h kháng tá bào ung thư In vỉtro

Kết quả thử nghiệm kháng ung thu được tr nh bày trong bảng 1. Theo số liệu thu được, đẫn chất 5, 9 và
acid (+) usnic đều có tác dụng kháng tế bào ung thư não sau 48 giờ. Dẩn chất 5 kháng yếu hơn acid (+) usnic
và dẫn chất 9. Như vậy, có thể thấy việc gắn nhóm hydroxyimin thay nhóm ceton tại C12 làm tăng mạnh
hoạt tính của chất 9. So sánh khả năng kháng dòng tế bào ung thư não th ở nồng độ 100 ỊiM chất 9 kháng
mạnh hơn gấp 5 lần chất 5. Chất 9 có tác dụng ức chế sự sống sót của tế bào khá cao với LD50 là 44,17 |iM
(ng/m l) trong 24 giờ so với LD50 của acid (+) usnic là 46,99 |iM.
Bên cạnh đó, khi thực hiện thí nghiệm, xét về độ tan thí aciđ (+) usnic và các chất 5, 7, 8 khó tan trong
DMSO ở nồng độ cao nhất chỉ ở dạng nhũ tương. Chất 9 tan tốt trong DMSO. V vậy, tuy ở nồng độ 100
|iM , chất 9 có tác đụng yếu hơn acid, nhưng vẫn giảm đáng kể sự tồn tại của các tế bào ung thư, trong khi ờ
nồng độ này acid (­f) usnic khó tan. Nên có thể tăng nồng độ của dẫn chất 9 lên 400 pM , lức này cho thấy
hoạt tính kháng các tế bào ung thư của chất 9 tăng lên rất cao 92% sau 24 giờ và 98,9 % sau 48 giờ.
Bảng 2. Kết quả thử nghiệm kháng ung thư trên dòng tế bào U87MG
24 giờ
Nồng độ QaM)
DMSO
A Usnic

± 10,09

10

113,989

± 14,25

50

34,284

±8,10

100

19,905

±7,77

100
400

632

TB ± RSD (%)
100,954

10
5

48 giờ

102,399 ± 1,43

104,633

± 10,71

75,707 ± 12,00

L D 50

TB ± KMJ
96,274 ±3,55

46,99 fiM

78,025 ±2,23
10,411 ±0,05
3,534 ±0,33
88,897 ±1,20
58,317 ±1,09
29,812 ±0,11

)


7

8

10

87,079

±2,85

99,232 ±0,38

50

79,184

±4,51

90,934 ±0,16

100

86,794

±6,30

89,858 ±0,81

10

96,939

±4,39

101,537 ±0,27

100

99,510

±2,09

84,825 ±2,06

200

9

103,776 ± 2,33

10

83,249

±1,28

100

29,144

±6,58

400

84,326 ±2,66
77,680 ± 0,54
44,17 ịiM

8,046 ± 2,45

12,639 ±0,05
1,114 + 0,05

IV . K ết luận và kiến nghị

Từ những kết quả nghiên cứu đã tr nh bày trên đây có thể rút ra một số kết luận sau:
* v ề tổng hợp và khẳng định cẩu trúc các dẫn chất:
­ Đã tổng hợp được 10 dẫn chất của acid usnic, trong đó, 9 dẫn chất chưa thấy công bố trong các tài liệu
tham khảo, gồm 8 đẫn chất amin hóa và 2 dẫn chất hydroxylamin.
­ Các dẫn chất được khẳng định có cấu trúc đứng với cấu trúc đự kiến bằng các phổ hồng ngoại (IR), khối
phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H­NMR) và phổ cộng hường tùhạt nhân carbon (13C­NMR).
* v ề thửhoạt tính sinh học của các dẫn chất:
- Khả năng kháng khuẩn: các đẫn chất có tác dụng chủ yếu trên dòng vi khuẩn Gram (+), nhưng khả năng
kháng khuân yếu hơn so với acid usnic.
­ Khả năng kháng ung thư trên dịng tế bào ung íhư não người (Ư87MG). Dẫn chất 5 và 9 thể hiện hoạ£
tính kháng tế bào. Đặc biệt đẫn chất 9 thể hiện tác dụng mạnh khi ức chế sống sót của tế bào úng thư
Ư87MG với LD50 là 44,17 |iM sau thời gian 24 giờ. Đây ỉà những kết quà rất đáng quan tâm.
TÀ I L IỆ U TH A M K H Ả O
1. Ingolfsdottir K (2002), Molecules of Interest: Usnic acid, Phytochemistry, 61, 729­ 736.
2. James p. K, Ignacio H. s, (1976), Studies in the usnic acid series. I. The condensation of (+)­usnic acid with
aliphatic and aromatic amines, Can. J. Chem., 54,2795­2803.
3. James p. K, Jeffrey D. L, Phillip J. s, Ignacio H. s and Trevor Y, (1976), Studies in the usnic acid series. VII. The
biodegrađation of (+)­usnic acid by a Pseudomonas species. Isolation, structure determination, and synthesis of (+)­6­
desacetylusnic acid, Can. J. Chem, 55, 2336­2352.
4. Knop.w (1844), Cheraisch­physiologische Ưnĩersuchung uberdie Flechten. Justus Lieb. Ann. Chem, 49,103­124.
5. Kristmundsdottir T, Aradottir RAE, Ingolfsdottir K, and Ogmundsdottir RM (2002), Solubilization of the lichen
metabolite (+ )­usnic acid for testing in tissue culture. J. Pharm. Pharmacol, 54 (11), 1447­1452

6. Kumar s, Muller K (1999), Lichen metabolites 2. Antiproliferative and cytotoxic­ activity of gyrophoric usnic
and diffracticacid on human keratinocyte growth, J Nat. Prod, 62,821­823.
7. Luzina o . A, Polovinka M. p , Salakhutdinov N. F., Toỉstikov G. A (2007), Chemical modification of usnic acid 2.
Reactions of (+)­usnic acid with amino acids, Russian Chemical Bulletin, 56 (6), 1249 ­ 1251.
8. Luzina o . A, Polovinka M. p, Salakhutđinov N. F., Tolstikov GA, (2009), Chemical modification of usnic acid. HI:
Reaction of (+)­usmc acid with substituted phenylhydrazines, Russian Journal of Organic Chemistry, 45 (12), Ỉ783 ­1789.
9. Makoto Takai, Yoshimasa Uehara and John A. Beisler (1979), Usnic Acid Derivation as Potential Antineoplastic
Agents, Journal of Medicinal Chemistry, 22 (11), 1380­ 1384.

633


10. Marc­Antoine Bazin, Anne­Céciỉe Le Lamer, Jean­Guy Delcros, Isabelle Rouaud, Philippe Uriac, Joel Boustie,
Jean­Charles Corbel, Sophie Tomasi, (2008), Synthesis and cytotoxic activities of usnic acid derivatives, Bioorganic &
Medicinal Chemistry, 16 (14), 6860 ­ 6866.
11. Marcela MelgareJo, Olov Sterner, Jose Vila Castrol, Patticia Mollinllo (2008), ore investigations in potent
activity and relationship structure of the lichen antibiotic (+)­ usnic acid and its deritate dibenzoylusnc acid, Revista
BolivianaDe Quimica, 25 (1), 24­29.
12. Moselio Schaechter (2009), EncyclopHia ofMicrobiology, San Diego State University, San Diego, CA, USA, 3,67­77.
13. Mosmann, T., (1983), Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to. Proliferation
and Cytotoxicity Assays, J. Immunol. Methods, 65,55­63.
14. O’Neill, MA., Mayer, M., Murray, KE., Rolim­Santos, HML., Santos­Magalhaes, NS., Thompson, AM., Appleyard,
VCL (2010), Does usnic acid affect microtubules in human cancer cells?, Braz. J. Biol., 70 (3), 659­664.

XÂY DỰNG ĐÁNB GIÁ CÁC MƠ HÌNH TOẤN HỌC NHẰM PHÁT HIỆN
HỢP CHẤT ứ € CH TYROSINASE MỚI CHÌ TỪ CAU TRÚC PHÂN T
TS. ĨẨ T hị T hu H u òng*; TS. G rardo M . Casanola-M artin **
H uớ ng dẫn: GS. TS. Yovani M arr ro Ponc ***
TĨM T T
Xây dựng các mơ h nh biểu điễn mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tinh của các hóa chất (QSAR) để

phát hiện các chất có tiềm năng ửc chể Tyrosinase (UT) chỉ dựa trên cấu trúc phân tử. Đánh giá mô h nh xây dựng được
theo các nguyên tắc của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế thế giới (OECD).
Đối tượng và phương pháp: Cơ sở dữ liệu gồm 701 chất UT và 728 chất không ƯT.
Sử đụng tham số phân tử 2D TOMOCOMD­CARDD để biểu thị cấu trúc các chất. Sử dụng kỹ thuật phân tích cụm
và kỹ thuật phân tích sự khác biệt tuyến tính để xây dựng các mơ h nh phân lóp. Các mơ h nh được đánh giá theo 5 tiêu
chícủaOECĐ.
Kết quả: Ỉ0 mơ h nh QSAR mới được xây dựng. Độ chính xác của các mô h nh đơn trên tập huấn luyện (tập hợp
được đùng để xây dựng mô h nh) và tập kiểm tra (để đánh giá khả năng ngoại suy của mô h nh) lần lượt cao hơn 85,2 %
và 83,1 %. Các mô h nh được xây dựng đều thỏa mãn các tiêu chí đánh giá của OECD.
Kết luận và kiến nghị: Nghiên cứu đã xây đựng thành công 10 mô h nh QSAR nhằm dự đoán khả năng ức chế
Tyrosinase từ cấu trúc phân tử. Dựa trên các nguyên tắc của OECD, chất lượng của các mô h nh này đã được chứng
minh, qua đó phản ánh tính đúng đắn của phương pháp nghiên cứu. Việc sử đụng những các mơ h nh này nói riêng
cũng như các phương pháp trong nghiên cứu này nói chung có thể giúp tiết kiệm thời gian và tiền bạc trong việc sàng
lọc nhằm phát hiện các hợp chất dẫn đường mới để phát triển thành các sản phẩm chống tăng sắc tố da.
* Từ khóa: cấu trúc phân tử; Chất ức chế Tyrosinase; Mơ h nh tốn học.

D v ỉỡpm ntanđmểiíừĩ/íOHỡ/matA maticmođ lstforth ử/ ỉưị/ĩca/ỉứỉĩofn wTỵrỡsinas
inhibitors from molecular structures
Sum m ary
Tyrosinase inhibitors (TIs) are used in the treatment of hyperpigmentation problem and lightening products. So, the
searching of such new compounds always attracts the attention of pharmaceutical/cosmetical inđusửy worldwide.
QSAR (Quantitative Structure­Activity Relationships) model combines the scientific working of chemistry, computer
science and information science. Nowadays, QSAR is applied in many steps of research and development process of
new drugs due to its financial and time advantages. Obj ctiv s: To develop novel QSAR models for the identification of
potential TĨS from molecular structures and to validate developed QSAR models using Organization for Economic
Cooperation and Development (OECD) principles.
* Đại học Quốc gia Hà Nội
** Đại học Valincia, E-46100 Burjassofy Tây Ban Nha
*** Đại học Cartag na Cartag na đ ỉndias, Bolivar, Colombia

634