..

Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi với sự hướng dẫn của
TS. Nguyễn Thị Hai khoa CNSH-TP-MT trường Đại học Cơng Nghệ thành phố Hồ
Chí Minh.
Mọi số liệu cũng như hình ảnh trong đồ án đều là những số liệu và hình ảnh của
riêng tơi, khơng sao chép của ai dưới bất cứ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong
đồ án này đều hồn tồn trung thực. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đồ án của
tơi.
Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016
Sinh viên thực hiện

Phan Thị Gìn

____________________________________________________________________


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai, người đã tận tình giúp
đỡ, chỉ bảo em hồn thành tốt bài đồ án tốt nghiệp. Em cũng chân thành cảm ơn thầy
Huỳnh Văn Thành đã hỗ trợ hết mình trong quá trình em làm đồ án tại phịng thí
nghiệm của trường Đại học Công Nghệ Tp HCM.
Đồng thời em cũng xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh
Học-Thực Phẩm - Môi Trường của trường đại học Cơng Nghệ thành phố Hồ Chí Mnh

đã truyền tải kiến thức cho em trong quá trình học tập ở trường để em có những kiến
thức để hồn thành đồ án tốt nghiệp của minh. Kiến thức đó khơng những giúp em
hồn thành đồ án tốt nghiệp mà nó cịn là nền tảng hữu ích cho cơng việc của em sau
này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đinh của em, những người luôn là chỗ dựa
tinh thần quý báo của em giúp em vượt qua mọi khó khăn trong công việc hoc hành
cũng như trong cuộc sống.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn trong phịng thí nghiệm đã giúp đỡ, hỗ
trợ em trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Và cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn của mình đến Hộ đồng phản biện đã giành
thời gian theo đọc và nhận xét đối với đồ án tốt nghiệp của em. Em xin kính chúc q
Thầy Cơ nhiều sức khỏe.
Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm2016
Sinh Viên thực hiện

Phan Thị Gìn

____________________________________________________________________


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1.Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1
2.Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 2
3.Mục đích nghiên cứu .................................................................................................. 2
4.Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 2
5.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.............................................................................. 4

6.Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................................... 4
7.Các kết quả của đề tài ................................................................................................. 4
8.Kết cấu đồ án tốt nghiệp............................................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 6
1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic ..................................... 6
Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 6
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................................. 6
1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon .................................................................... 6
1.1.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ ......................................................................... 7
1.1.2.3. Nhu cầu dinh dưỡng về vitamin .............................................................. 8
1.1.2.4. Nhu cầu về các muối khoáng ................................................................... 8
1.2. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic ................................................................. 9
1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Lactic ......... 10
Ảnh hưởng của oxy ....................................................................................... 10
Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 11
Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 12
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl ..................................................................... 13
Ảnh hưởng của nồng độ glucose .................................................................. 13
1.4. Lên men lactic ở vi khuẩn lactic .......................................................................... 13
1.5. Sự phân bố vi khuẩn lactic trong tự nhiên ........................................................... 14
1.6. Môt số ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................... 14
____________________________________________________________
i


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Trong công nghiệp thực phẩm ...................................................................... 14
Trong công nghiệp ........................................................................................ 15

Trong nông nghiệp và môi trường ................................................................ 16
Trong chăn ni ............................................................................................ 16
1.7. Tình hình nghiên cứu của thế giới ....................................................................... 16
1.8. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................... 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 20
Nguồn vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 20
Thời gian nghiên cứu: ................................................................................... 20
Chủng vi khuẩn đối chứng ............................................................................ 20
Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 21
Phương pháp thu mẫu ................................................................................... 21
Phương pháp phân lập mẫu ........................................................................... 21
Phương pháp làm thuần ................................................................................ 21
Thử nghiệm sinh hóa..................................................................................... 22
2.2.4.1. Thử nghiệm khả năng tiết enzyme catalse............................................. 22
2.2.4.2. Phương pháp nhuộm Gram .................................................................... 23
2.2.4.3. Phương pháp nhuộm bào tử ................................................................... 24
2.2.4.4. Phương pháp thử khả năng phân giải CaCO3 ........................................ 25
2.2.4.5. Phương pháp thử khả năng di động ....................................................... 25
2.2.4.6. Khảo sát khả năng lên men các loại đường khác nhau ......................... 26
2.2.4.7. Thử nghiệm idole ................................................................................... 27
2.2.4.8. Thử nghiệm methyl red .......................................................................... 28
2.2.4.9. Thử nghiệm voges proskauer ................................................................. 29
2.2.4.10. Thử nghiệm Simmon citrate ................................................................ 29
2.3. Sơ đồ quy trình phân lập mẫu .............................................................................. 31

____________________________________________________________
ii



Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

2.4. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ
ruột cá .......................................................................................................................... 31
Khảo sát khả năng kháng khuẩn ................................................................... 31
Phương pháp nghiên cứu tính kháng giữa các lồi vi khuẩn lactic với những
chủng Bacillus phân lập từ ruột cá .......................................................................... 32
Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mối liên hệ với mật độ tế bào .......... 33
Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào............ 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 35
3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn lactic phân lập
từ ruột cá ...................................................................................................................... 35
Hình thái khuẩn lạc ....................................................................................... 35
Kết quả nhuộm Gram .................................................................................... 35
Kết quả nhuộm bào tử ................................................................................... 35
Kết quả test sinh hóa ..................................................................................... 38
3.1.4.1. Kết quả thử catalase ............................................................................... 38
3.1.4.2. Kết quả thử indole .................................................................................. 39
3.1.4.3. Kết quả thử nghiệm Methyl Red ........................................................... 40
3.1.4.4. Kêt quả thử nghiệm Voges Proskauer (VP) .......................................... 41
3.1.4.5. Kết quả thử nghiệmsimmon citrate....................................................... 41
3.1.4.6. Kết quả khả năng di động ...................................................................... 42
3.1.4.7. Kết quả lên men cacbohydrate ............................................................... 43
3.1.4.8. Kết quả lên men Glucose ....................................................................... 43
3.1.4.9. Kết quả lên men Lactose ........................................................................ 44
3.1.4.10. Lên men Sucrose .................................................................................. 45
3.1.4.11. Lên men Arabinose .............................................................................. 45
3.1.4.12. Kết quả khả năng phân giải CaCO3 ..................................................... 46

3.2. Mối liên hệ giữa mật độ tế bào và khả năng sinh acid tổng ................................ 49
3.3. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập được ................................. 50
kháng E.coli ................................................................................................... 50
Kết quả đối kháng với Salmonella ................................................................ 52
____________________________________________________________
iii


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

3.4. Kết quả khả năng đối kháng với vi khuẩn Staphylococcus ................................. 53
3.5. Kết quả khả năng đối kháng đối với chủng Bacillus ........................................... 55
3.6. Kết quả ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào vi khuẩn latic
..................................................................................................................................... 57
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................... 60
4.1. Kết luận ................................................................................................................ 60
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 60
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1
PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG
THỬ SINH HĨA TRONG CÁC THÍ NGHIỆM ......................................................... 1
PHỤ LỤC B: ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA 5 CHỦNG VI KHUẨN
LACTIC PHÂN LẬP ĐƯỢC ....................................................................................... 4
PHỤ LỤC C. KẾT QUẢ MẬT ĐỘ TẾ BÀO TRONG CÁC ĐỘ MẶN KHÁC
NHAU ............................................................................................................................ 7
PHỤ LỤC D. KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ........................................................... 8
PHỤ LỤC E: HÌNH ẢNH ........................................................................................... 21

____________________________________________________________

iv


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khuẩn lactic ........................................ 11
Bảng 1.2. Khoảng pH thích hợp của các vi khuẩn lactic ................................................ 12
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và tế bào của vi khuẩn lactic nghi ngờ là vi khuẩn lactic ..
.......................................................................................................................................... 36
Bảng 3.2. Đặc điểm vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá ............. 37
Bảng 3.3: khả năng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS ........................................ 46
Bảng 3.4. Kết quả test sinh hóa của các loại vi khuẩn lactic .......................................... 47
Bảng 3.5. Hàm lượng acid tổng có trong vi khuẩn phân lập từ ruột cá ........................ 49
Bảng 3.6. Bảng kết quả đối kháng E.coli ....................................................................... 51
Bảng 3.7. Kết quả đối kháng Salmonella ...................................................................... 52
Bảng 3.8: Kết quả đối kháng của vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá với vi khuẩn
Staphylococcus ............................................................................................................... 54
Bảng 3.9: Kết quả đối kháng của chủng vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus phân lập
từ ruột cá……………………………………………………………………………….54

____________________________________________________________
v


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn lactic .................................................................. 31
Hình 3.1. Kết quả thử catalase của 5 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá ..................... 39
Hình 3.2. kết quả thử nghiệm indole ............................................................................... 40
Hình 3.4. kết quả thử nghiệm VP .................................................................................... 41
Hình 3.5. Kết qua thử nghiệm simon citrate ................................................................... 42
Hình 3.6. Kết quả thử khả năng di động ......................................................................... 43
Hình 3.7 Kết quả thử nghiệm lên men Glucose .............................................................. 44
Hình 3.8. Kết quả thử nghiệm lên men Lactose ............................................................. 44
Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm lên men Sucrose ............................................................. 45
Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm lên men Arabinose ....................................................... 44
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa hàm lượng % ai tổng và OD hiệu chỉnh
..........................................................................................................................................48
Hình 3.12. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn E. coli .............................. 51
Hình 3.13. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Salmonella ...................... 53
Hình 3.14. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus ............... 54
Hình 3.15. Biểu đồ ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật ...... 58

____________________________________________________________
vi


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU: Colony forming unit
FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và Nông nghiệp
Liên Hợp Quốc
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth

OD: Optical Density
VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red
VASEP: Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam (Vietnam
Association of Seafood Exporters and Producers)

____________________________________________________________
vii


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn lactic là một trong những vi khuẩn được sử dụng nhiều ở quy mơ cơng
nghiệp. Chúng có khả năng sinh ra acid lactic và các sản phẩm phụ khác (Wood và
Holzapfel, 1995). Sản phẩm của những vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, môi trường và trong nông nghiệp. Nghiên cứu của
Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ
dạ dày – ruột của một số loài cá có khả năng ức chế mạnh một số lồi vi khuẩn gây
bệnh phổ biến ở cá và một số loài vi khuẩn gây bệnh khác (Schillinger và Lucke, 1989;
Lewus et al., 1991; Karthikeyan và Santosh, 2009). Vì vậy, vi khuẩn lactic được sử
dụng rộng rãi trong sản xuất probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn lactic lại có tác dụng hổ trợ rất tốt
trong việc sản xuất phân bón giàu đạm từ cá, Patrix và ctv (2013) đã khuyến cáo sử
dụng lactobacillus recipe và lactobacillus recipe để sản xuất phân bón dạng lỏng từ
cá. Phân bón dạng lỏng từ cá được cho biết có hiệu quả tốt kích thích sự tăng trưởng
của cây trồng (Murray and Anderson 2004)
Việt Nam có một hệ thống sơng ngịi dày đặc và có đường bờ biển dài 3260km,
với địa hình như vậy rất thuận lợi cho việc đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản

Hiện nay thì nghề đánh bắt và ni trồng thủy hải sản của nước ta phát triển rất
mạnh. Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy hải sản đạt
1,67 triệu tấn, xếp thứ 6 Châu Á
Ngày nay thì ý thức của người dân về sức khỏe đã được nâng lên, người tiêu
dùng đã chuyển sang dùng cá thay vì thịt cho các bữa ăn hằng ngày, vì trong cá có
chứa các acid béo khơng no, rất tốt cho sức khỏe. vì vậy mà lượng cá trong được tiêu
thụ rất lớn
____________________________________________________________
1


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Bên cạnh việc lượng cá thành phẩm tăng mạnh ( cá fillet, cá viên,…) thì lượng
phụ phế phẩm của cá cũng tăng lên không kém. Đây là một bài tốn được đặc ra vì
lượng phụ phế phẩm này được thải vào mơi trường thì sẽ gây ra ô nhiễm môi trường rất
nặng nề. Trong khi đó, phụ phế phẩm cá là nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất phân
bón dạng lỏng, phun qua lá cho cây trồng ở nhiều nước trên thế giới (El-Tarabily et al.
2003; Murray and Anderson 2004; Eric Weinert et al. (2014). Tuy nhiên ở Viêt Nam,
vấn đề này vẫn chưa được quan tâm.
Chính vì vậy, sinh viên tiến hành đề tài” Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá” để
làm vật liệu cho sản xuất phân amino acid từ phụ phẩm cá, thay thế phân hoá học và
giúp làm giảm nguồn gây ô nhiễm môi trường.
2. Nội dung nghiên cứu:
 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic.
 Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic.
 Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được.
 Đánh giá một số đặc tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic trong điều kiện
invitro.

3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong ruột cá.
4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tổng hợp tài liệu:
 Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài.
 Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài.
 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

____________________________________________________________
2


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

 Thực hiện một số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh lý sinh hóa từ đó tuyển
chọn chủng vi khuẩn mong muốn.

____________________________________________________________
3


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
 Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm.
 Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm Statistical Analysis
Systems (SAS).
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: những vi khuẩn lactic có trong ruột cá.
 Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu những chủng vi sinh vật có trong ruột cá.
6. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Phân lập được chủng vi khuẩn Lactic từ ruột cá để làm nguồn
nguyên liệu cho những nghiên cứu tiếp theo.
Ý nghĩa thực tiễn: Chủng vi khuẩn Lactic được sử dụng để phối hợp với những
chủng vi sinh vật khác trong các chế phẩm xử lý môi trường. Vì vậy việc phân lập các
chủng này sẽ gớp phần tạo ra chế phẩm để xử lý nguồn phế phẩm của thủy hải sản,
giảm thiểu việc ô nhiễm môi trường.
7. Các kết quả của đề tài
Phân lập được 5 chủng vi sinh vật có khả năng tiết acid lactic và bacteriocine có
trong ruột cá. Từ kết quả phân lập và định danh sơ bộ cho thấy 5 chủng vi sinh vật
phân lập được đều là vi khuẩn lactic.
Thu được kết quả khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của 5 chủng vi sinh vật
phân lập được.
8. Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.

____________________________________________________________
4


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.

Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

____________________________________________________________
5


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacilaceae, thuộc bộ Eubacteriales.
Nhóm này khơng đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý chúng tương đối
đồng nhất. Tấc cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử,
không di động. Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển hóa hydrate cacbon và sinh
các acid lactic. Khác với một số vi khuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh acid
lactic, tất cả vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa các
cytocrom và enzyme catalase, sinh trưởng tùy tiện. Hình dạng của vi khuẩn lactic có
thể hình cầu hay hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng lồi khác nhau. Tất
cả sự khác nhau về hình thái tế bào mày phụ thuộc vào môi trường, thời gian, sự có
mặt của oxy cũng như các điều kiện ni cấy khác. [12]
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Cacbon là thành tố chính trong hộp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể người của
mọi loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất dinh
dưỡng cần thiết cho tế bào sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong q trình dinh dưỡng
của tế bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như glucose,

fructose, manose, galactose, các loại đường đôi như saccarose, lactose, maltose cho đến
các polysacrit nhu tinh bột, dextrin.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và
disaccait. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như các acid glutamid và galacturonic tạo thành
____________________________________________________________
6


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

CO2, acid acetic và acid lacti như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium
hassice fermentatae. Trong quá trình lên men các cơ chất như cacbon, vi khuẩn lactic
có thể sử dụng cả các acidamine như acid glutamic, arginine, tirozin làm nguồn cung
cấp năng lượng. Khi đó tạo ra các q trình decacboxyl và tạo ra CO2. Các loài vi
khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển của vi khuẩn lactic
trên các loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác
nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước trước những áp lực
của các quá trình sử lý sau này. Khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy
đơng khơ phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình ni cấy và thu hồi
chế phẩm, nếu lên men tử maltose thì tỷ lệ tế bào chết sẽ nhiều hơn hẳn so với lên men
từ fructose và lactose. Tuy nhiên việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến
vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào.[12]
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật. Những vật chất
cơ bản của tế bào như protein, acid nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trị
hết sức quan trọng trong quá trình sinh trường và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn
lactic đòi hỏi rất nhiều acid amine khác nhau do đó chúng cần mơi trường có sẵn nitơ
nhằm đảm bảo sự phát triển của mình. Acid amine có thể dược đồng hóa dưới dạng

peptide nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào.
Mỗi lồi vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn
vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa ni tơ
nên hung địi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong mơi trường. Chỉ có một số ít lồi vi khuẩn
lacic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguôn nitơ vo cơ như L. helveticus
chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường.
Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngồi ni tơ dưới dạng hỗn hợp các
acid amine, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ như các sản
____________________________________________________________
7


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

phẩm thủy phân protein từ peptone, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiếc thịt,
trypton,…Đây cũng là nguồn ni tơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường
nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn nitơ thích
hợp để giúp giảm giá thành sản phẩm và nâng cao hiệu quả sản xuất. Trong đó nấm
men thủy phân được sử dụng khá nhiều. [12]
Nhu cầu dinh dưỡng về vitamin
Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobaillus, rất cần vitamin co sự sinh
trưởng. Acid nicotinic và acid pantothenic rất cẩn cho sự sinh trưởng của tất cả các loài
vi khuân lactic. Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi
cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của mơi trường. [12], [32]
Các chất hữu cơ cần thiết cho sự phát triển cho sự sinh trưởng của vi khuẩn
lactic
Acid aceric và acid citrate ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic
được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các
chủng vi khuẩn lactic

Acetate có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Acetate được
dùng làm đệm cho môi trường khi ni cấy nhiều lồi vi khuẩn lactic. Một lọa acid hữu
cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic
là acid oleic, một dẫn xuất của oleic được sử dụng là Tween 80 trong thành phần môi
trường phân lập và ni cấy vi khuẩn lactic. Một vài lồi vi khuẩn lactic (Lactobacillus
acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần acid béo không no cho sự phát triển.
[12],[50]
Nhu cầu về các muối khoáng
Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa
lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magie.
____________________________________________________________
8


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Đặc biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần
thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với vi khuẩn lactic thì
mangan, magie và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic. [12],
[45]
1.2. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic
Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s [21] vi khuẩn lactic được phân
loại như sau:
Ngành: Firmicutes
Lớp:

Bacilli

Bộ:


Eubacteriales

Họ:

Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus
Vi khuẩn lactic gồm một số giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc
tính là vi khuẩn Gram dương và lên men cacbohydrate thành năng lượng và acid lactic.
Vi khuẩn lactic rất đa dạng. Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá bằng
hàm lượng G+C trong AND của các loài, thường chiếm 32-53 mol%... Điểm đặc trưng
phổ biến nhằm phân biệt chúng với phân lớn các giống khác là dạng hình que và khả
năng tạo acid lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic
cịn là vi khuẩn Gram dương, khơng hình thành bào tử và hiếm khi di động. người ta
thấy rằng tế bào vi khuẩn lactic điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi
trong khoảng ( 0,5-1,2 )x(1-10)µm, đơi khi trơng chúng có thể gần giống như hình cầu
( coccus) trong điểu kiện nào đó và có thể hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc.
Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trên môi trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ
đục và khơng nhuộm màu. Những tế bào này địi hỏi mơi trường ni cấy phức tạp, có
khả năng lên men và phân hủy sacharose. Ít nhất một nữa sản phẩm lên men từ nguồn
cacbon là lactose. [25]
____________________________________________________________
9


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Về nhu cầu oxy chúng là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển tốt hơn trong

điều kiện khơng có oxy. Nhìn chung, các lồi trong giống này sẽ phát triển tốt trong
điều kiện có 5% CO2. [22]
Về nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt, chúng
phát triển tốt trong mơi trường có nhiểu phức chất, nhiệt độ phát triển tối ưu cho chúng
là 30-40oC, nhưng chúng cũng có thể phát triển trong phạm vi từ 5-53oC. Chúng có khả
năng chịu được mơi trường có tính acid, pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 5,8, nhưng
nhìn chung cũng có thể phát triển ở pH < 5.
1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Lactic
Ảnh hưởng của oxy
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hơ hấp tùy tiện, khơng có hệ enzyme hô hấp
cytocrom cũng như hệ catalase. Tuy nhiên cũng có khả năng oxy hóa rất nhiều hệ FAD
(Flavin Adenin Dinucleotic).
Các nghiên cứu cho thấy, một số chất trong mơi trường chỉ có thể được sử dụng
khi có mặt của oxy. Chẳng hạn Pediococcus sp. và L. plantarum có thể đồng hóa được
glycerin trong điều kiện hiếu khí. Một số lồi Leuconostoc có thể cần sự có mặt của
oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase. L. brevis và L. buchneri phát triển tốt ở
30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC chúng phát triển trong điều kiện hiếu
khí hoặc kỵ khí tùy tiện. Hiện tượng tương tự cũng gặp ở một số chủng thuộc loài S.
pyogenes. Các nghiên cứu cho thấy hệ enzyme peroxylase có trong vi khuẩn lactic có
thể thực hiện các chức năng thay thế cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được
sử dụng như chất nhận hydro. Q trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm theo
việc tạo thành H2O. Đồng thời một số vi khuẩn latic (S. brevis, L. mesenteroides) có
thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia cùng một số chất oxy hóa. Như
vậy vi khuẩn lactic có hệ peroxidase sử dụng NADH2 làm chất nhận điện tử và phân
giải H2O2. Phương trình phản ứng như sau:
____________________________________________________________
10


Đồ án tốt nghiệp

_____________________________________________________________________

NADH2 + H+ + H2O2  NAD+ +2H2O
Trong điều kiện hiếu khí năng lượng sinh ra cũng nhiều hơn so với điều kiện
yếm khí (hơn 20 lần khi cùng phân hủy 1 mol glucose). Quan hệ với oxy giữa các lồi
vi khuẩn khác nhau có sự khác nhau.Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các trực
khuân lên men dị hình chậm sinh trưởng. Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên
men agrabinosease đạt tối ưu trong điều kiện kỵ khí, cịn các lồi khác khơng sử dụng
được pentose lại sinh trưởng rất kém trong điều kiện này. Trong quá trình lên men
lactic, lượng oxy vượt quá giới hạn này làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, do vậy
q trình tạo thành acid lactic khơng xảy ra. Trong quá trình lên men bảo quản các loại
thực phẩm tươi sống (tơm, cá thịt…), các vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình
thường được sử dụng nhất là trong bảo quản bằng bao gói chân khơng. Hình thức bảo
quản này, mặt khác tránh sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản
phẩm. Trường hợp này vi khuân lactic sẽ ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ các sản
phẩm trao đổi chất của nó. [12], [18]
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bảng 1.1. Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khuẩn lactic [12]
Nhóm vi khuẩn
lactic

Nhiệt độ sinh trưởng (oC)
Bình thường

Tối ưu

Giống
Enterococcus,

Ưa lạnh


0 – 27

10 – 15

Pediococcus,
Bifidobacterium

Ưa ẩm

5 – 45

20 – 40

Ưa nhiệt

20 – 60

40 – 45

Leuconostoc,
Vogococcus, Lactococus
Streptococcus

____________________________________________________________
11


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________


Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic. Khoảng nhiệt độ
sinh trưởng của vi khuẩn khá rộng, một số lồi có thể sinh trưởng ở 55oC trong khi một
số khác có thể sinh trưởng ở 5oC. Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic thường sinh trưởng
trong khoảng nhiệt độ từ 15-40oC (bảng 1.1)
Ảnh hưởng của pH
Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là hệ enzyme của chúng, chị tác động
mạnh mẽ của sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà
tại đó hoạt tính sinh học cao nhất
Bảng 1.2. Khoảng pH thích hợp của các vi khuẩn lactic [12]
pH tối ưu

pH sau lên men

Lactobacillus

6,0 – 6,2

3,2 – 3,5

Lactococcus

5,6 – 6,5

4,0 – 4,5

Leuconostoc

5,6 – 6,5


5,0

Enterococcus

7,0

4,0 – 4,6

Pediococccus

5,6 – 6,5

3,2 – 3,5

Chi

Tuy nhiên pH nội bào của vi khuẩn lactic lại không tương ứng với pH tối ưu của
các enzyme nội bào của chính nó. Giá trị pH tối ưu cho sự sinh trưởng của
Lactobacillus, Pediococccus và Leuconostoc lần lượt là 5,6-6,2; 5,6-6,5 và 5,6-6,5. Giá
trị pH thấp nhất của mỗi loài vi khuẩn lactic chịu được là khác nhau. Chẳng hạn
Lactobacillus chịu được pH= 3,2-3,5, Pediococcus chịu được pH= 3,2- 3,5, trong khi
đó, Leuconostoc chịu được pH=5,0 ( bảng 1.2). Trong quá trình lên men lactic, acid
lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế hoạt động cua các vi sinh vật khác. Sau đó,

____________________________________________________________
12


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________


khi lượng acid tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, sự ức chế, sự
acid hóa tế bào chất gây ra do sự tích lũy nội bào acid lactic. [12]
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất của vi khuẩn. Với nồng độ
NaCl lớn hơn hoặc bằng 5%, sự sinh trưởng của phần lớn vi khuẩn lactic bị ức chế.
Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi
khuẩn lactic tăng lên , đồng thời ức chế hoạt tính enzyme của tế bào. Các vi khuẩn
Gram âm dễ mẫn cảm với nồng độ muối NaCl hơn các vi khuẩn Gram Dương, nguyên
nhân là do các enzyme của vi khuẩn bị ức chế bởi ion Cl-. Một số chủng P. pentosaceus
sinh trưởng ở nồng độ NaCl 9- 10%.[12],[45]
Ảnh hưởng của nồng độ glucose
Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp acid lactic.
Nồng độ đường trong mơi trường càng cao thì lượng acid sinh ra càng nhiều. tuy nhiên
nồng độ đường quá cao làm áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co
nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn lactic do giảm acid
lactic tạo ra. [12],[18]
1.4. Lên men lactic ở vi khuẩn lactic
Lên men lactic là q trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật,
điển hình là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic ncó khả năng lên men nhiều loại đường
đơn và đường đơi nhưng khơng có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh
bột. Sự phát triển của chúng cần sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amon.Vi
khuẩn lactic có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và
khoáng chất. Qúa trình lên men tốt nhất trong mơi trường có pH từ 5,5- 6 , khi pH mà
<5,5, quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men từ
15÷50oC. Tuy nhiên, mỗi loại có khoảng nhiệt độ khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn
80oC vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.
____________________________________________________________
13



Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Quá trình lên men lactic diến ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ được
vi khuẩn đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào.
Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa,
cịn nếu phân tử đường là đường đơi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành
các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó phân tử đường này sẽ đi
vào chu trình chuyển hóa khác nhau và ci cùng là cho sản phẩm là acid lactic, acid
acetic, CO2.
Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra
làm hai nhóm là vi khuẩn lên men đồng hình hay vi khuẩn lên men dị hình.
1.5. Sự phân bố vi khuẩn lactic trong tự nhiên
Vi khuẩn lactic phân bố rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các sản phẩm
lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các sản phẩm chế
biến từ sữa và bia. Người ta có thể tìm thấy Lactobaillus ở cá, động vật và thực vật. Ở
người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo. [12]
1.6. Mơt số ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo
quản thực phẩm. [1], [30]
Trong công nghiệp thực phẩm
Vi khuẩn lactic được tìm thấy trong một số sản phẩm thực phẩm (sữa lên men,
rau củ lên men, phomat...) với vai trò bảo quản, cung cấp chất dinh dưỡng hoặc mùi vị
cho sản phẩm. Trong các sản phẩm từ sữa, chúng có thể hoạt động một mình hoặc kết
hợp với các vi khuẩn lactic khác. Sữa acidophilus là một ví dụ điển hình về các sản
phẩm lên men từ sữa này với sự tham gia của L. acidophilus. Ngoài ra, sự kết hợp L.
bulgaricus với Streptococcus thermophiles có thể tạo nên sản phẩm sữa chua. [1]
____________________________________________________________

14


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Rau củ lên men là một món ăn phổ biến của nhiều nước trên thế giới như: dưa
cải chua, dưa cải bắp và nhiều loại rau củ lên men khác là những món ăn thường ngày
trong các gia đình ở Việt Nam; Kimchi là một sản phẩm lên men lactic khác của hơn
100 loại rau củ và là một món ăn truyền thống nổi tiếng của Hàn Quốc... Trong quá
trình muối chua rau củ, các vi khuẩn Lactobacillus trong rau củ tươi tạo ra một lượng
axid lactic đáng kể góp phần làm chua rau củ và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
gây hư hỏng thực phẩm [30], [48]. Ngồi ra, Lactobacillus cịn đóng vai trị quan trọng
trong q trình làm bánh mì. Nhiều lồi Lactobacillus được tìm thấy trong bột chua
làm bánh mì gồm: L. acidophilus, L. farciminis, L. casei, L. plantarum, L. rhammosus,
L. brevis, L. sanfrancisco và L. fermentum. Vi khuẩn lactic được sử dụng như một chất
bảo quản sinh học vì một số sản phẩm trao đổi chất của các vi khuẩn lactic có hiệu quả
kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít béo, hydrogen peroxide, diacetyl... người ta
đặc biệt chú ý đến các bacterioxin, là các chất tạo bởi một số vi khuẩn lactic có khả
năng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh như: Listeria, Clostridium, Staphylococcus,
Bacillus, Enterococcus... Do đó các bacterioxin được nhận định là có hiệu quả cao và
an tồn trong q trình bảo quản các loại thực phẩm. Các nhà nghiên cứu nhận thấy
Lactobacillus là một trong những vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra nhiều loại
bacterioxin. Các bacterioxin của Lactobacillus có thể đưa vào thực phẩm để ngăn chặn
sự phát triển của nhiều loài vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh [48].
Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axít lactic. Axít lactic là axít hữu
cơ đầu tiên được sản xuất bởi vi sinh vật vào năm 1880. Có vị chua dễ chịu và có đặc
tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả,
mứt. Chúng được dùng để axít hóa rượu vang và hoa quả nghèo axít, ngồi ra cịn được

sử dụng trong cơng nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.

____________________________________________________________
15


Đồ án tốt nghiệp
_____________________________________________________________________

Người ta có thể sử dụng các loài Lactobacillus lên men tự nhiên các loại cơ chất
khác nhau để tạo ra axít lactic, như: L. bulgaricus có thể tạo ra axít lactic bằng cách lên
men nước sữa (whey). Acid lactic là một trong những axít hữu cơ được dùng đầu tiên
trong thực phẩm. Acid lactic được sử dụng theo một số cách như dùng trong đóng gói ô
liu Tây Ban Nha nhằm ngăn chặn sự hư hỏng và sự lên men, giúp bảo quản bột trứng
khô, cải thiện vị của dưa chua khi thêm vào giấm, làm chua nước ép trái cây trong quá
trình làm rượu vang... [1], [58].
Trong nơng nghiệp và mơi trường
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây
bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu và là
cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm
vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic.
Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề
ô nhiễm mơi trường [37].
Trong chăn ni
Vi khuẩn lactic có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế
vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng
trưởng ở thú ni. Ngồi ra, người ta cịn dùng L. casei và L. plantarium để ủ rơm, rau,
cỏ cho gia súc ăn. Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra một số sản phẩm
có giá trị như vitamin, chất thơm, kháng sinh làm cho thức ăn gia súc ủ chua có giá trị

dinh dưỡng cao làm tăng năng suất vật ni [37], [58].
1.7. Tình hình nghiên cứu của thế giới
Hiện nay vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá đã được nghiên cứu rộng rã trên thế
giới. Các nhà khoa học đã ứng dụng các vi sinh vật này trong sản xuất chế phẩm sinh
học.
____________________________________________________________
16