Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

..

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này được tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS.
Huỳnh Quang Phước, Trường Đại học Cơng Nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án tốt nghiệp này là hồn tồn khơng sao
chép đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích
dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Tơi xin chịu trách nhiệm hồn
tồn về đồ án tốt nghiệp của mình.
Tp.HCM, ngày 17 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện đề tài

Đoái Nhật Phương

i


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

LỜI CẢM ƠN
Qua bốn năm học tập tại Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh em đã
được các thầy cơ trong Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Mơi trường hết
lịng hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tại trường cũng như trong quá
trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến q thầy cơ đã
trang bị cho chúng em những kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời với những
ước mơ riêng.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS. Huỳnh Quang Phước, thầy là người
trực tiếp hướng dẫn tận tình, hết lịng cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án
tốt nghiệp này. Cảm ơn thầy đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích, động

viên em để em hồn thành đồ án tốt nghiệp này
Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy cơ quản lí phịng thí nghiệm đã quan tâm
giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp nảy.
Sau cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm,
động viên, giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn.

ii


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ .....................................................................viii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
Chương 1.

1.1.

TỔNG QUAN ................................................................................................. 6

Tổng quan về chế phẩm koji ..........................................................................6

1.1.1. Lịch sử và phương pháp tạo koji .............................................................6
1.1.2. Giống vi sinh vật ứng dụng trong sản xuất koji ......................................7
1.1.3. Quy trình tạo koji truyền thống .............................................................12

1.1.4. Ứng dụng của koji..................................................................................14
1.2.

Tổng quan về huyết heo................................................................................15

1.2.1. Thành phần hóa học của huyết ..............................................................15
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng của huyết .................................................................17
1.2.3. Quá trình đông huyết .............................................................................19
1.2.4. Ứng dụng của huyết heo trong công nghệ thực phẩm ..........................20
1.3.

Tổng quan về nước mắm ..............................................................................20

1.3.1. Giá trị dinh dưỡng ..................................................................................22
1.3.2. Phương pháp chế biến nước mắm .........................................................23
Chương 2.

2.1.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 29

Vật liệu và thiết bị sử dụng...........................................................................29

2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................29
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................30
2.2.

Quy trình nghiên cứu ....................................................................................31

2.2.1 Quy trình lên men tạo chế phẩm koji ..........................................................32

2.2.1.1.

Quy trình lên men tạo chế phẩm koji ...........................................32

2.2.1.2.

Thuyết minh quy trình tạo chế phẩm koji ....................................32

2.2.2. Quy trình tạo nước mắm giàu sắt từ huyết heo đông ............................35

iii


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

2.2.2.1. Quy trình tạo nước mắm giàu sắt từ huyết heo đơng ............................35
2.2.2.2. Thuyết minh quy trình ...........................................................................36
2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................39

2.3.1. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi .............39
2.3.2. Xác định hàm lượng đạm tổng theo phương pháp Kjeldahl .................40
2.3.3. Xác định hàm lượng đạm ammoniac theo phương pháp chưng cất hơi
nước…. ................................................................................................................42
2.3.4. Xác định hàm lượng nitơ amino acid theo phương pháp Sorensen ......43
2.3.5. Xác định hàm lượng muối theo phương pháp Mohr .............................45
2.3.6. Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp Anson ..............47
2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ Fe2+ của huyết nguyên liệu và nước
mắm lên men .......................................................................................................49

2.3.8. Phương pháp vi sinh ..............................................................................50
2.3.9. Phân tích cảm quan – phương pháp so hàng thị hiếu ............................51
2.4.

Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................54

2.4.1. Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa của huyết heo đơng .........................54
2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm koji .........54
2.4.2.1.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh tổng hợp

protease ...............................................................................................................54
2.4.2.2.
2.4.3.

Xác định pH tối thích của mơi trường tối ưu ...............................55

Đánh giá các chỉ tiêu chế phẩm koji ....................................................55

2.4.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo nước mắm .56
2.4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cho muối trong quá trình lên
men……………………………………………………………………………56
2.4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn bã mắm/ hỗn hợp ...................57
2.5.

Đánh giá chất lượng của nước mắm thành phẩm.........................................58

Chương 3.


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 60

3.1.

Khảo sát một số chỉ tiêu hóa sinh của huyết heo đông ................................60

3.2.

Khảo sát một số chỉ tiêu của chế phẩm koji .................................................61

iv


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến sinh tổng hợp
protease ...............................................................................................................61
3.2.2. Ảnh hưởng của của pH ban đầu đến hoạt độ enzyme protease ............62
3.3.

Khảo sát yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men tạo nước mắm .....................64

3.3.1. Ảnh hưởng của chế độ cho muối vào hỗn hợp......................................64
3.3.2.
3.4.

Ảnh hưởng của tỷ lệ bã mắm/ hỗn hợp…………..………….…...…..69

Đánh giá chỉ tiêu chất lượng nước mắm ......................................................74


3.4.1. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng của nước mắm .........................................74
3.4.2. Đánh giá cảm quan nước mắm thành phẩm ..........................................75
Chương 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 79

4.1.

Kết luận .........................................................................................................79

4.2.

Kiến nghị.......................................................................................................80

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 81
PHỤ LỤC A .......................................................................................................................... 1

PHỤ LỤC B.................................................................................................................2
PHỤ LỤC C ........................................................................................................................ 10
PHỤ LỤC D ........................................................................................................................ 10

v


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Asp. oryzae: Aspergllus oryzae
Asp.: Aspergillus
MT: Môi trường

CT: Công thức

vi


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của nấm mốc Asp. oryzae ...................................................... 7
Bảng 1.2. Thành phần trung bình của huyết, huyết thanh và huyết cầu của bò................... 16
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của huyết heo đông trên 100g ăn được ........................ 18
Bảng 1.4. Tên các loại nước mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở các nước khác nhau . 21
Bảng 2.1. Tên các loại thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .................................................... 30
Bảng 2.2. Trình tự thí nghiệm dựng đường chuẩn ............................................................... 47
Bảng 2.3. Trình tự xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ............................ 48
Bảng 2.4. Trình tự thí nghiệm dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Fe2+ ...................... 50
Bảng 2.5. Thành phần môi trường chế phẩm koji – MT1 ................................................... 54
Bảng 2.6. Thành phần môi trường chế phẩm koji – MT2 ................................................... 54
Bảng 2.7. Các giá trị pH ban đầu của môi trường được khảo sát hoạt độ ........................... 55
Bảng 2.8. Các chỉ tiêu của chế phẩm koji khô ..................................................................... 56
Bảng 2.9. Ảnh hưởng chế độ cho muối đến quá trình lên men ........................................... 56
Bảng 2.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ bã mắm/ hỗn hợp đến quá trình lên men ......................... 58
Bảng 2.11. Chỉ tiêu nước mắm ............................................................................................ 59
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu hóa sinh của huyết heo đơng ...................................................... 60
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt độ protease............................. 61
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến hoạt độ protease ..................... 62
Bảng 3.4. Chỉ tiêu chế phẩm koji......................................................................................... 63
Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) nitơ amoniac so với nitơ toàn phần ..................................................... 67
Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) nitơ amino acid so với nitơ toàn phần ................................................. 68
Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) nitơ amoniac so với nitơ toàn phần ..................................................... 72

Bảng 3.8. Tỷ lệ (%) nitơ amino acid so với nitơ toàn phần ................................................. 74
Bảng 3.9. Bảng chỉ tiêu chất lượng nước mắm.................................................................... 75
Bảng 3.10. Tổng kết quả xếp dãy cho 3 sản phẩm nước mắm ............................................ 76

vii


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Chế phẩm koji thương mại..................................................................................... 6
Hình 1.2. Hình thái học nấm mốc Aspergillus oryzae ........................................................... 8
Hình 1.3. Phân loại protease ................................................................................................ 10
Hình 1.4. Quy trình tạo koji truyền thống............................................................................ 13
Hình 1.5. Huyết heo đơng .................................................................................................... 18
Hình 1.6. Quy trình chế biến nước mắm truyền thống ........................................................ 24
Hình 1.7. Quy trình chế biến nước mắm theo phương pháp vi sinh .................................... 27
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu ........................................................................................... 31
Hình 2.2. Quy trình tạo chế phẩm koji ................................................................................ 32
Hình 2.3. Quy trình lên men tạo nước mắm giàu sắt ........................................................... 35
Hình 3.1. Chế phẩm koji khơ ............................................................................................... 63
Hình 3.2. Hàm lượng nitơ tồn phần theo thời gian lên men .............................................. 64
Hình 3.3. Hàm lượng nitơ amoniac theo thời gian lên men................................................. 66
Hình 3.4. Hàm lượng nitơ amino acid theo thời gian lên men ............................................ 67
Hình 3.5. Hàm lượng nitơ toàn phần thay đổi theo tỷ lệ bã mắm/hỗn hợp ......................... 69
Hình 3.6. Hàm lượng nitơ amoniac thay đổi theo tỷ lệ bã mắm/hỗn hợp............................ 71
Hình 3.7. Hàm lượng nitơ amino acid thay đổi theo tỷ lệ bã mắm/hỗn hợp ....................... 73
Hình 3.8. Nước mắm huyết thành phẩm .............................................................................. 76
Hình 3.9. Quy trình hồn chỉnh lên men tạo nước mắm giàu sắt ........................................ 78


viii


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

ix


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

MỞ ĐẦU
❖ Tính cấp thiết của để tài
Việt Nam là một quốc gia nổi tiếng về các làng nghề nước mắm truyền thống
từ bao đời với nguồn nguyên liệu cá dồi dào. Nước mắm là một loại gia vị và cũng
là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thường xuất hiện trong các bữa ăn
hàng ngày của người dân Việt. Hàng năm có hơn 200 triệu lít nước mắm được bán
ra trên thị trường, nhưng trong đó có tới 75% là nước mắm sản xuất theo dạng công
nghiệp (Tổng cục Thống kê, 2014).
Nước mắm được chế biến theo phương pháp truyền thống có mùi vị thơm
ngon đặc trưng, nhưng bên cạnh đó cũng tồn tại nhiều nhược điểm như thời gian lên
men quá lâu, năng suất thấp, giá thành sản phẩm cao và nguồn nguyên liệu cá sản
xuất đang dần càng kiệt.
Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thơn, ước tính tổng sản lượng thịt
hơi các loại đạt 4,47 triệu tấn (2014), mỗi tháng cả nước sản xuất và tiêu thụ từ 350
– 370 ngàn tấn, tương ứng có khoảng 16,5 tấn huyết heo được xuất ra thị trường.
Nhưng chỉ có 15% lượng huyết được sử dụng làm nguồn cung cấp thực phẩm, và có
tới 50% lượng phế thải từ công nghiệp giết mổ gia súc so với nguồn nguyên liệu
đầu vào, gây ô nhiễm môi trường và giảm hiệu quả kinh tế. Huyết heo là loại phụ
phẩm trong quá trình giết mổ mà hiện nay chưa được quan tâm nhiều cho việc sử
dụng làm thức ăn cũng như chế biến thành thực phẩm cho con người. Là một loại

nguyên liệu tươi khó bảo quản, rất dễ bị hư hỏng và thối rữa, nhưng huyết heo lại có
giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng đạm trong huyết heo đơng chiếm 10,7%. Ngồi
ra, huyết cịn là nguồn thực phẩm giàu sắt, trong 100g huyết tươi có chứa đến 25,9
mg sắt và thêm nhiều thành phần vi lượng khác có ích cho sức khỏe con người.
Đề tài nghiên cứu ứng dụng chế phẩm koji từ cám, đậu nành, trấu để lên men
huyết heo tạo loại nước mắm mới giàu dinh dưỡng, đặc biệt có sẵn hàm lượng sắt
trong huyết mà khơng cần bổ sung từ bên ngồi. Vào năm 2008, Viện Dinh dưỡng
Việt Nam triển khai dự án "Bổ sung sắt vào nước mắm" nhằm cung cấp nước mắm
bổ sung sắt (liều bổ sung 0,4 mg sắt NaFeEDTA/1 ml nước mắm) với giá cả phù
hợp cho mọi người dân nhằm giảm tỷ lệ thiếu máu, thiếu sắt trong cộng đồng. Năm
1


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

2014, dự án đã bước đầu thành công với sản lượng nước mắm có bổ sung chất sắt
đạt 105.000 lít, chiếm 20% tổng sản lượng nước mắm.
Nguồn nguyên liệu cá biển chế biến nước mắm không ổn định, phụ thuộc vào
điều kiện thời tiết. Việc bảo quản cá từ lúc đánh bắt đến khi vào đất liền rất dễ làm
mất đi độ tươi của cá, tốn kém chi phí bảo quản. Với nguồn nguyên liệu mới dồi
dào là huyết heo, một phụ phẩm của ngành giết mổ gia súc, đảm bảo mạch sản xuất
liên tục và giá thành thấp, chi phí vận chuyển, bảo quản thấp sẽ thay thế tốt nguồn
nguyên liệu cá.
Ở một số quốc gia trên thế giới, huyết được sử dụng làm thực phẩm rất đa
dạng và phong phú. Tại Trung Quốc, món “đậu hũ huyết” thường sử dụng huyết
của bò, heo, gà, huyết sau khi lấy sẽ được cho đông tụ lại và cắt thành từng khối
vuông nhỏ và nấu chín. Tại Ireland vào thế kỉ 19, việc trộn huyết lỏng với bơ, thảo
mộc, yến mạch được coi là một loại thực phẩm bồi bổ. Xúc xích morcilla của Tây
Ban Nha là một loại bánh màu đen chủ yếu được thực hiện với huyết heo (gà), gia
vị, chất béo, và rau. Ở các quốc gia thuộc Mỹ Latin như Mexico (moronga), Peru

(relleno), Chile (ñache), Argentina, Uruguay và Puerto Rico (morcilla), cũng rất phổ
biến các loại xúc xích huyết.
Tình hình nghiên cứu
Đề tài lên men nước mắm từ huyết heo có sử dụng chế phẩm koji tạo nước
mắm giàu sắt là một hướng đi mới chưa từng được nghiên cứu trước đây. Nhưng đã
có nhiều các cơng trình nghiên cứu trong và ngoài nước về việc đưa nấm mốc
Aspergillus oryzae vào trong lên men tạo nước mắm, rút ngắn thời gian, nâng cao
chất lượng sản phẩm.
Koji – là một loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản, được sử
dụng rộng rãi ở Đông Á và Đông Nam Á. Koji thường sử dụng loại Aspergillus
oryzae (Asp. oryzae) và cho phát triển trên các môi trường giàu đạm như gạo, lúa
mì, đậu nành, cám,...[9] Koji chứa nhiều hệ enzyme thủy phân các cơ chất thành
những hợp chất đơn giản như enzyme amylase thủy phân tinh bột, hệ enzyme
protease thủy phân protein thành acid amin, và enzyme lipase thủy phân lipid [9].
• Nước ngồi
2


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Enzyme protease đóng vai trị rất quan trọng trong q trình thủy phân cá tạo
ra nước mắm. Quá trình thủy phân tự nhiên sẽ diễn ra rất chậm và yếu trong thời
gian dài (từ 12 -24 tháng), chủ yếu nhờ hệ enzyme protease trong nội tạng cá. Trước
đây nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu việc thúc đẩy quá trình lên men tạo nước
mắm bằng nhiều cách khác nhau như bổ sung acid và alkaline (Gilberg và Shi,
1984; Thong Thai và Suntinanalert, 1991) [15], tăng nhiệt độ quá trình lên men
(Mabesa và cộng sự, 1989; Lopetcharat và Park, 2002) [12], hay bổ sung enzyme từ
ngoài vào như sử dụng protease thực vật từ dứa (bromelain); đu đủ (papain)
(Ooshira và cộng sự 1982), hoặc sử dụng koji vào quá trình lên men tạo nước mắm
(Chae và cộng sự 1989) [13]. Tuy nhiên, các phương pháp trên đều tồn tại những

giới hạn nhất định như việc sử dụng chất hóa học (acid hydrochloric) cần điều kiện
làm việc khắt khe, nghiêm ngặt và cho kết quả nước mắm có giá trị cảm quan
(hương vị, màu sắc) khơng tốt như nước mắm truyền thống.
Cơng trình nghiên cứu sử dụng các enzyme thủy phân protein là trypsin và
chymotrypsin để thúc đẩy nhanh quá trình lên men tạo nước mắm. Kết quả cho thấy
việc bổ sung 2 loại enzyme này làm tăng đáng kể quá trình lên men, hàm lượng nitơ
toàn phần, nitơ amino acid cũng tăng đáng kể (Ravipim Chaveesuk, 1991) [16].
Nghiên cứu sử dụng koji và enzyme protease của hãng Nagase Enzyme được tách
chiết từ nấm Asp. oryzae làm rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm. Nước mắm thu
được có chất lượng đạm cao hơn, năng suất cao hơn,… tận dụng được tối đa nguồn
nguyên liệu cá có giá trị kinh tế thấp và giá trị dinh dưỡng không cao (Hariono I,
2006) [14]. Việc nghiên cứu, sử dụng các loại protease khác nhau như protease A,
aroase và papain W40 trong lên men nước mắm, để tìm ra enzyme thích hợp tạo
nước mắm chất lượng cao. Kết quả cho thấy sử dụng enzyme protease A từ nấm
Asp. oryzae thích hợp nhất, rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm (Taniguchi,
2003) [16].
• Trong nước
Các làng nghề nước mắm trải đều theo chiều dài của đất nước, chế biến nước
mắm được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nước mắm ở Phú Quốc, Nha
Trang, Phan Thiết là một trong những nơi sản xuất nước mắm nổi tiếng nhất. Đất
3


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

nước ngày càng hội nhập, phát triển thì việc sản xuất nước mắm cũng có những cải
tiến vượt bậc cả về cơng nghệ lẫn chất lượng. Những nghiên cứu trong nước về việc
ứng dụng enzyme vào sản xuất nước mắm đã đạt được một số thành quả nhất định.
Cơng trình nghiên cứu “Khảo sát một số tính chất của chế phẩm enzyme protease từ
canh trường nuôi cấy bề mặt Aspergillus oryzae và ứng dụng của enzyme trong sản

xuất nước mắm”, chứng minh rằng việc bổ sung muối và chế phẩm protease nhiều
lần vào chượp sẽ làm rút ngắn đáng kể thời gian thủy phân trong chượp (Lê Văn
Việt Mẫn và Trần Thị Ánh Tuyết, 2006). Nghiên cứu “Sử dụng koji trong sản xuất
nước mắm từ các chất thải của nhà máy chế biến thủy sản”, sử dụng koji để đẩy
nhanh quá trình lên men trong sản xuất nước mắm với nguyên liệu là cá thải sau phi
lê như đầu, xương sống, đuôi, nội tạng,... Dịch nước mắm sau 12 ngày lên men có
18 loại acid amin, việc loại bỏ chất béo trong nguyên liệu nhằm giảm đi hương xấu
(Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự, 2012). Ngồi ra, cịn có nhiều nghiên cứu tập
trung phát triển nước mắm có chất lượng cao, thỏa mãn nhu cầu của người tiêu
dùng với sản phẩm độ đạm cao, “Nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme bromelain và
nồng độ muối đến quá trình sản xuất nước mắm” (Trần Cơng Thắng, 2010).
Mục đích nghiên cứu
• Ứng dụng chế phẩm koji vào việc lên men tạo nước mắm.
• Tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, giàu dinh dưỡng.
• Tạo ra loại nước mắm có hàm lượng sắt cao.
Nhiệm vụ nghiên cứu
• Kiểm tra một số chỉ tiêu hóa sinh của nguồn nguyên liệu huyết heo.
• Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo chế phẩm koji.
• Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo nước mắm giàu
sắt.
Phương pháp nghiên cứu
• Hàm lượng đạm tổng được xác định bằng phương pháp Kjeldahl.
• Hàm lượng nitơ acid amin được xác định bằng phương pháp Sorensen.

4


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

• Hàm lượng nitơ amoniac được xác định bằng phương pháp chưng cất hơi

nước.
• Hoạt độ enzyme protease của chế phẩm koji sau khi lên men được xác định
bằng phương pháp Anson.
• Hàm lượng muối được xác định bằng phương pháp Mohr.
• Hàm lượng Fe2+ trong nguyên liệu huyết và nước mắm.
• Kết quả được tính tốn bằng Excel, xử lý và phân tích bằng Stagraphics.
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
• Giới thiệu về chế phẩm koji, nguyên liệu sản xuất. Đặc điểm của giống nấm
mốc Asp. oryzae và enzyme protease.
• Đặc điểm của huyết heo và giá trị dinh dưỡng.
• Giới thiệu về quy trình sản xuất nước mắm cổ truyền.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• Trình bày các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa sinh của ngun
liệu và sản phẩm.
• Quy trình tạo chế phẩm koji, lựa chọn môi trường, và pH thích hợp cho hoạt
tính enzyme protease cao nhất.
• Quy trình nghiên cứu lên men tạo nước mắm từ huyết heo đơng và bố trí thí
nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình: chế độ muối và tỷ lệ
giữa bã mắm và hỗn hợp nguyên liệu.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
• Kết quả từ các khảo sát được tính tốn và xử lý.
• Các mức của yếu tố khảo sát trong các quy trình lên men được chọn để cho
ra sản phẩm nước chấm có giá trị dinh dưỡng cao.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

5



Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Chương 1.

TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về chế phẩm Koji

1.1.1.

Lịch sử và phương pháp tạo Koji

Koji có nguồn gốc từ Trung Quốc – với tên gọi là qu (khoảng 300 năm trước
Công nguyên). Sự xuất hiện của sản phẩm này là bước ngoặc quan trọng của nền
văn hóa ẩm thực Trung Hoa với nền tảng cơ bản của ba loại thực phẩm lên men là
nước tương, miso/jiang và đậu tương. Khoảng đầu thế kỷ XIV theo chân của các
tăng ni koji được truyền bá đến Nhật Bản. Và tại đây cụm từ “koji” dần trở nên phổ
biến với các món ăn truyền thống của Nhật Bản.

Hình 1.1. Chế phẩm koji thương mại
Koji là sản phẩm của q trình ni cấy từ sự phát triển của loại nấm mốc
Aspergillus oryzae hoặc sử dụng một loại men đặc biệt có chứa Monascus
purpureus (dùng để ủ gạo lên men). Koji là một thành phần quan trọng đối với các
loại thực phẩm lên men truyền thống của các quốc gia thuộc Đông Á và Đông Nam
Á [8]. Nấm mốc Asp. oryzae là nguồn cung cấp các hệ enzyme thủy phân amylase,
protease, lipase, và tanninase…phá vỡ các đại phân tử như tinh bột, protein, chất
béo thành các phân tử đơn giản như dextrin, glucose, peptide, acid amin và các acid
béo. Trong đó hệ men protease gồm imertase, asparaginase, glutaminnase,

proteolytic có tác dụng thủy phân protein thành các acid amin [1]. Ngày nay koji
6


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

được sử dụng như là nguyên liệu để làm ra nước tương, miso, sake, amazake, và các
loại thực phẩm lên men khác như giấm gạo, mirin,…[9].
1.1.2.

Giống vi sinh vật ứng dụng trong sản xuất koji

Koji sử dụng các loại ngũ cốc gạo, đậu nành, đậu tương, lúa mì,… đã được
hấp chín có bổ sung hệ nấm mốc qua quá trình lên men để tạo nên sản phẩm. Đối
với việc lên men nước tương, thì thành phần lúa mì rang và bột đậu tương được sử
dụng như môi trường tạo koji (Nhật Bản), hay sử dụng toàn bộ với đậu nành
(Trung Quốc). Vi sinh vật được sử dụng để tạo chế phẩm koji là nấm mốc, một số
loại koji khác sử dụng các loại vi sinh vật như Asp. sojae, Asp. usami, Asp.
awamori, Asp. kawachii, Rhizopus spp., Monascus spp., Mucor spp., và Absidia
spp., riêng koji gạo đỏ sử dụng Monascus purpureus, có tên là beni koji (Nhật Bản)
và hong qu (Trung Quốc). Ngày nay hầu hết các chế phẩm koji chủ yếu chứa nấm
mốc Aspergillus oryzae.
Chủng nấm mốc Asp. oryzae là một vi nấm, hiếu khí bắt buộc, khơng sinh độc
tố aflatoxin, bào tử có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
mạnh thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của nấm mốc Asp. oryzae
Phân loại

Tên gọi


Giới

Fungi

Ngành phụ

Ascomycotina

Lớp

Plectomycetes

Bộ

Eurotiales

Họ

Eurotiaceae

Chi

Aspergillus

Loài

Aspergillus oryzae

7



Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

• Đặc điềm hình thái, cấu trúc
Cơ quan sinh dưỡng của nấm Asp. oryzae có dạng sợi khơng màu, phân nhánh
nhiều và phát triển rất nhanh, các sợi này thường tập hợp thành đám chằng chịt gọi
là hệ sợi nấm hay thể sợi, chiều ngang 5 - 7µm, chia sợi thành nhiều bao tế bào
(nấm đa bào). Asp.oryzae tạo khuẩn lạc, màu sắc và hình thái bào tử rất giống với
Aspergillus flavus – một loại nấm tổng hợp aflatoxin.

Hình 1.2. Hình thái học nấm mốc Aspergillus oryzae
Sợi nấm có vách ngăn ngang thành các sợi đa bào. Hệ sợi nấm thường liên kết
chặt chẽ với nhau tạo thành mơ già, có hình dạng và kích thước khác nhau. Từ
những sợi ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở
đó có cơ quan sinh sản vơ tính. Cuống đính bào tử của Asp. oryzae dài 1 – 2 mm
cho nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên
gọi bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn dài, gọi là những tế
bào hình chai (thể bình). Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử
đính vào nhau nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử Asp. oryzae có màu vàng lục hay
màu vàng hoa cau, khi mới phát triển, hệ sợi nấm có màu trắng, sau đó chuyển sang
màu lục và khi già thì chuyển sang màu vàng.

8


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Giống Asp. oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase,
protease, lipase,… ), hay gặp ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột,
gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã

sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc xanh lục, vàng…
Màu do các bào tử già tạo màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào
đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. Lúc bào tử rơi vào một môi
trường thích hợp nó sẽ nảy mầm mọc ra theo cả ba chiều thành một hệ sợi nấm hay
gọi là khuẩn ty thể, bào tử nảy mầm và tạo ra sợi nấm ban đầu ngắn gọi là ống
mầm. Trên khuẩn ty thể ta phân biệt được hai loại khuẩn ty. Khuẩn ty cơ chất hay
khuẩn ty dinh dưỡng, khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất cắm sâu vào mơi trường
cịn khuẩn ty khí sinh phát triển tự do trong khơng khí.
Màu sắc của nấm do các chất màu có thành phần và tính chất khác nhau tạo
nên, mà chủ yếu là các quinon: anthraquinon, naptaquinon, các dẫn xuất carotenoid
và melanin.
• Dinh dưỡng và tăng trưởng
Nấm Asp. oryzae là loại vi nấm hiếu khí bắt buộc, phát triển ở nhiệt độ rất
rộng (15 – 40oC), nhiệt độ tối ưu từ 27 – 36oC, pH tối ưu từ 5,5 – 6,5. Thời gian
sinh trưởng cực đại từ 30 – 42h sau khi cấy. Asp. oryzae có khả năng sinh enzyme
rất mạnh, trong đó chủ yếu là các loại enzyme amylase, protease, maltase…
Ở nấm Asp. oryzae, thời gian nảy mầm khoảng 11h đầu sau khi cấy, tạo sợi
sau 4 – 18h tiếp theo. Hoạt độ của protease trung tính và kiềm của koji tăng lên
nhanh chóng sau 24h lên men. Sau 48h hoạt độ của protease trung tính là cao nhất
trong đó hoạt độ của protease kiềm tăng nhẹ nhưng vẫn thấp hơn hơn protease trung
tính. Hoạt độ amylase cao nhất sau 72h lên men [10]. Những kết quả này cũng
tương tự các nghiên cứu trước đó rằng các protein ngoại bào tử Asp. oryzae trên koji
đậu tương, mức độ chuyển hóa các cơ chất thành các hợp chất hữu cơ đơn giản [1].
Hệ enzyme flavourzyme trong nấm mốc Aspergillus oryzae
Hệ enzyme protease trong nấm mốc Asp. oryzae là một phức hợp enzyme thủy
phân protein có hoạt tính phân cắt nội và ngoại phân tử protein (endopeptidase và
exopeptidase) để chuyển hóa protein tới tận đơn vị cuối cùng.
9



Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Enzyme protease là enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid (CO-NH-) trong phân tử protein và các polipeptide. Sản phẩm của q trình này có
thể là các acid amin, peptide, các chuỗi polypeptide ngắn…
Hệ enzyme protease của Asp. oryzae được chia làm 3 nhóm theo pH tối ưu:
-

Protease acid tính (aspartic protease) có pHopt = 2 – 4 là enzyme thương
mại.

-

Protease trung tính: có khoảng pHopt hẹp, khơng bền với nhiệt độ cao, mất
hoạt tính khi có sự hiện diện của protease kiềm tính.

-

Protease kiềm tính: có pHopt = 9,5 – 10,5 là nhóm enzyme được sử dụng như
là chất phụ gia trong việc giặt tẩy.

Phân loại: Theo IUBMB, protease được chia làm 2 nhóm lớn

Hình 1.3. Phân loại protease
a) Exopeptidase (enzyme phân cắt 2 đầu mạch): enzyme xúc tác thủy phân các
liên kết peptide ở hai đầu mút của mạch polypeptide. Exopeptidase bao gồm
carboxylpeptidase, aminopeptidase và dipeptidase.
-

Carboxylpeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu -C- của mạch
polypeptide.


-

Aminopeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu Nitơ của mạch
polypeptide.

10


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

-

Dipeptidase: xúc tác thủy phân các liên kết peptide của dipeptide.

b) Endopeptidase (enzyme phân cắt nội mạch): enzyme xúc tác thủy phân các
liên kết peptide ở giữa mạch polypeptide, còn được gọi là protease. Endopeptidase
được chia thành 4 nhóm dựa trên cơ chế thủy giải liên kết peptide liên quan đến cấu
trúc của trung tâm hoạt động của enzyme.
• Serin-protease: hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động của enzyme:
serin và histidin, trong đó nhóm -OH của serin có vai trị đặc biệt quan trọng đối với
hoạt động xúc tác của enzyme. Serin-protease gồm 2 họ chính: họ Chymotrypsin
(bao gồm trypsin, elastase…) và họ Substilisin (bao gồm các enzyme của enzyme).
• Cystein-protease (thiol-protease hoặc sullhydryl-protease): tâm hoạt động
gồm 2 acid amin là cystein và histidin, trong đó nhóm thiol (-SH) của cystein có vai
trị đặc biệt quan trọng vì nó có khả năng tham gia trực tiếp nhiều biến đổi hóa học
như: acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa. Nhóm cystein-protease thường được tìm
thấy ở động vật bậc cao như bromelin, papain…
• Metallo-protease: bao gồm các họ protease của vi khuẩn, nấm mốc. Tâm
hoạt động có chứa các ion kim loại (Zn2+, Mg2+…), pH tối thích cho hoạt động

enzyme là pH trung tính hoặc kiềm, thường bị giảm bởi EDTA.
• Aspartic-protease: là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong
trung tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của acid amin hoặc
glutamic hay cũng có thể là nhóm -COOH ở đầu C của chuỗi polypeptide. Hầu hết
các aspartic-proteinase đều thuộc họ pepsin, chymosin và protease của vi mốc.
Cơ chế của quá trình hình thành nước mắm
Trong quá trình ướp muối cá, các thành phần của cơ thịt cá bị biến đổi mà chủ
yếu là protein bị thủy phân dưới tác dụng của protease có trong bản thân cá, thành
các sản phẩm trung gian như polypeptide, peptone, peptide, và cuối cùng là các acid
amin.
Protein

enzyme

enzyme

Polypeptide

Acid amin

Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác
E+S

ES

E+P

Trong đó:
11



Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

-

E: enzyme

-

S: cơ chất (protein)

-

ES: phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất

-

P: sản phẩm chủ yếu trong nước mắm là acid amin và các peptide bậc thấp.

Sự tạo thành và chuyển biến phức chất ES qua 3 bước
Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein,

-

bước này xảy ra khá nhanh, liên tiếp, không bền.
Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ

-

các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức chất ES

đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến
cực hóa các mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của
mối nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trung tâm
hoạt động của enzyme, làm cho quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng hơn.
Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin, peptide bậc thấp, giải phóng

-

enzyme.
1.1.3.

Quy trình tạo koji truyền thống

Sản xuất và lưu giữ các loại koji giống đòi hỏi một kỹ năng đặc biệt được lưu
truyền qua nhiều thế hệ của những người làm nghề truyền thống này. Các kiến thức
và bí quyết được giữ bí mật vơ cùng nghiêm ngặt với mỗi gia tộc làm koji. Do vậy
việc thương mại hóa sản phẩm này rất khó khăn.
Quy trình koji gạo (rice koji) đơn giản sử dụng koji giống, quá trình này chỉ
mất khoảng 3 ngày để tạo sản phẩm [20].

12


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Gạo
Ngâm
Hấp
Mốc


Cấy mốc
Lên men
Đảo trộn

Koji

Hình 1.4. Quy trình tạo koji truyền thống
Nguyên liệu gạo được ngâm qua nước trong đêm và được hấp trong 40 phút.
Sau đó khối cơm phải được làm mát (vì nếu nhiệt độ cao trên 45oC sẽ giết chết nấm
mốc), rắc mốc giống – seed koji lên trên khối nguyên liệu và đưa vào phòng lên
men, được gọi là muro koji. Nhiệt độ của công đoạn ủ/lên men ảnh hưởng đến
phẩm chất của koji, đặc biệt là các hệ enzyme. Amylase hoạt động tốt ở 35 – 40oC,
còn enzyme protease hoạt động tích cực nhất ở mức 30 – 40oC. Việc đảo trộn kết
hợp thêm tro để đảm bảo mốc giống trải đều trong khối cơm và cung cấp các chất
như K, Mg, P giúp tăng sinh bào tử – được gọi là tomokoji. Khối cơm sau trộn sẽ
được tập hợp lại thành đống và bọc vải để giữ nhiệt. Sau 10 – 12h, nhiệt độ và độ
ẩm trong đống cơm phát triển không đồng đều, dùng tay trộn cẩn thận để làm cho
nhiệt độ và độ ẩm đồng nhất trở lại, được gọi là kirikaeshi. Mori là công đoạn nấm
mốc phát triển, tăng nhiệt độ, nên sau công đoạn kirikeaeshi 10h thì chia đống cơm
thành những phần nhỏ – butakoji. Các butakoji được xếp chồng lên nhau trên nhau,
và có hệ thống thống khí. Để đảm bảo mốc phát triển đồng đều nên đảo trộn mỗi
bốn hoặc năm giờ/lần.
13


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Sau 3 ngày (72h) koji hoàn thành. Koji phải đảm bảo bề mặt các hạt được phủ
đầy các sợi nấm và có màu xanh.
1.1.4.


Ứng dụng của koji

Koji được nuôi cấy từ hạt gạo, đậu nành, hạt lúa mì, hoặc đậu tương. Đó là
một thành phần quan trọng trong việc sản xuất của các loại thực phẩm truyền thống
của Nhật Bản lên men như sake, miso và shoyu. Các loại mốc koji khác nhau được
sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm khác nhau. Asp. oryzae là nấm mốc được sử
dụng để sản xuất koji rộng rãi nhất. Đối với sản xuất bia, mốc koji cung cấp enzyme
cần thiết để phân hủy các cơ chất cho quá trình lên men.
Sau đây là một số ứng dụng của koji trong sản xuất thực phẩm:
• Natto đậu nành: natto đậu nành cịn có tên địa phương là hama natto (Nhật
Bản), là thực phẩm từ đậu nành và gạo sau khi hấp, được phối trộn với koji,
đem đi phơi nắng để tạo điều kiện lên men và làm chín, thêm các loại gia vị
như gừng, muối tạo thành natto. Natto đậu nành có màu đen và vị rất mặn,
hàm lượng protein cao từ 25 – 29 % [6].
• Miso đậu nành: đậu nành sau khi làm sạch và hấp chín, phối trộn với koji
gạo, bổ sung thêm muối và nước, lên men 4 – 6 tháng tạo sản phẩm miso.
Miso truyền thống ở Nhật có dạng bán rắn, màu vàng đỏ và có vị mặn, mùi
thịt rõ, được sử dụng như 1 loại gia vị [6].
• Sake: sake là tên địa phương ở Nhật, cịn có tên chung là rượu gạo. Gạo nấu
chín được trộn với koji gạo và nấm men, lên men 10 – 15oC trong 25 ngày
được kojimoto. Cơm thêm nước được lên men với kojimoto, sau đó lọc và
pha trộn, thanh trùng, tạo thành dung dịch có nồng độ cồn 15 – 16%, màu
vàng nhạt, sản xuất chủ yếu ở quy mô cơng nghiệp [6].
• Bubju: bubju là một loại nước uống có cồn, có xuất xứ từ Triều Tiên, được
làm từ gạo nếp và gạo tẻ nấu chín, trộn đều với koji, bổ sung thêm nước và
lên men. Hỗn hợp lên men được lọc thành dung dịch, màu trắng, nồng độ
cồn 16%, sản xuất chủ yếu theo quy mô công nghiệp [6].

14



Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

• Mirin: mirin là một dạng thức uống có cồn, được làm từ cơm, cồn và koji.
Hỗn hợp sau khi lên men 30 – 40 ngày, được lọc và thanh trùng. Mirin dạng
dung dịch có màu vàng nhạt, vị ngọt, nồng độ cồn từ 14%, hàm lượng đường
cao từ 43 – 48%. Mirin ở Nhật được sản xuất 100% theo quy mô cơng
nghiệp [6].
• Cá trải qua sự hư hỏng nhanh chóng trong điều kiện nhiệt đới do nhiệt độ và
độ ẩm cao, như ở các nước Đông Nam Á, nơi mà quá trình lên men cá truyền
thống để bảo quản cá là phổ biến nhất vì có chi phí thấp. Tuy nhiên, như
truyền thống, quá trình này kéo dài gần 24 tháng. Để rút ngắn thời gian của
quá trình, koji đã được sử dụng thành cơng để đẩy nhanh q trình lên men
nước mắm [6].
1.2.

Tổng quan về huyết heo

1.2.1.

Thành phần hóa học của huyết

Huyết bao gồm chất lỏng gọi là huyết thanh và các huyết cầu. Người ta có thể
được phân tách huyết thành huyết thanh (chủ yếu chứa các bạch cầu, protein và các
muối) và huyết cầu (gồm các hồng cầu).
Sau khi bổ sung chất chống đông, người ta tiến hành q trình ly tâm và thu
được:
• Huyết thanh: 60 – 65%
• Huyết cầu: 35 – 40%

Huyết là thành phần thông dụng đối với các sinh vật, mặc dù vậy thành phần
của nó biến động tùy thuộc vào nhiều yếu tố: chủng tộc, độ tuổi, chế độ ăn uống,
điều kiện sinh lý… Thành phần trung bình gồm có 80% nước, 18% protein và 2%
carbohydrate, lipid và các khoáng chất.

15


Nghiên cứu lên men tạo nước mắm giàu sắt

Bảng 1.2. Thành phần trung bình của huyết, huyết thanh và huyết cầu của bò
(g/100ml)
Thành phần

Huyết thanh

Huyết cầu

(60%)

(40%)

Huyết

Nước

80 – 85

90 - 92


70 – 78

Protein

15 – 18

6–8

25 – 29

Lipid

0,15

0,5 – 1

0,2

Carbohydrate

0,1

0,08 – 0,12

-

Khoáng chất

1


0,8 – 0,9

Vết

Các thành phần khác

0,55

0,2 – 0,3

-

Khối lượng chất khô

15 – 20

8 – 10

22 – 30

Thành phần của protein huyết thanh gồm: 44% albumin, 14% các α – globulin,
11% các β – globulin, 31% các γ – globulin and 0,6% fibrinogen. Ngồi ra huyết
thanh cịn chứa các chất khác như lipid, carbohydrate, amino acid và khoáng chất,
hầu hết các chất đó là chất dinh dưỡng và các chất thải của các mơ bào vào huyết.
Huyết thanh có thể dùng để sản xuất globin với các tính chất tạo nhũ, tạo bọt và sử
dụng làm thức ăn cho người và gia súc.
Huyết cầu gồm có hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chứa khoảng 30% khối
lượng chất khơ trong đó phần lớn là protein (haemoglobin chiếm ưu thế nhất).
Tính chất chức năng của huyết thanh
Các phụ phẩm từ huyết chủ yếu được sử dụng với vai trò như các phụ gia

protein bởi vì các tính chất chức năng rất tốt của các protein huyết thanh.
• Độ tan

16