tên đề tài.txt
Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch Enzyme Glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus
Kawasaki trên môi trường lên men bán rắn, Ứng dụng Enzyne cố định trên chất mang
Alginate và Chitosan
(Giảng viên hướng dẫn: Cn Đỗ Thị Tuyên)
SV: Nguyễn Quốc Đạt
Lớp: 06DSH
MSSV:106111019

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu sơ lược về enzyme:
1.1.1. Khái quát chung về enzyme:
Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc
biệt xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay fecment ( ferment ). Enzyme là những
protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trị xúc tác sinh học. Dưới tác dụng của enzyme
các phản ứng hóa sinh trong cơ thể xảy ra rất nhanh không cần các điều kiện nhiệt độ,
áp suất cao và nồng độ acid hay kiềm đặc.
Enzyme có trong mọi tế bào sống, vì vậy cũng được gọi là chất xúc tác sinh học
(nhằm phân biệt với chất xúc tác có nguồn gốc từ hóa học). Trong tế bào sinh vật,
enzyme chiếm 80 % - 90 % thành phần protein tế bào.
Tuy nhiên, không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà
sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ở ngồi
tế bào (invitro).
Tóm lại, có thể nói enzyme là là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho

các phản ứng hóa học, là chất xúc tác sinh học.
1.1.2.Tính chất ưu việt của enzyme:
 Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ thường trong
khoảng 20 – 45oC, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
 Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn hẳn các xúc tác khác chỉ tác dụng lên những
cơ chất nhất định và xúc tác theo một kiểu nhất định.
 Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể dễ dàng điều chỉnh thậm chí ngừng
phản ứng bằng các yếu tố tác động như: nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm, chất hoạt
hóa…

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 3


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Enzyme thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme
có thể chuyển hóa thành một lượng lớn cơ chất, trong khoảng thời gian ngắn.
1.1.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme:
Hiện nay người ta khai thác và thu nhận enzyme từ ba nguồn cơ bản:
 Từ động vật: đã từ lâu, loài người đã biết sừ dụng renin của dạ dày bê (nghé) để
sản xuất phô mai hoặc thu nhận pepsin từ dạ dày của động vật. Tuy nhiên, các enzyme
từ nguồn động vật ít được khai thác vì bị hạn chế về số lượng nguyên liệu.
 Từ thực vật: ta có thể khai thác và thu nhận enzyme amylase từ malt, papain từ
nhựa cây đu đủ hoặc bromelin từ trái dứa hay thân dứa.
Tuy nhiên, trong cơ thể động vật và thực vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme gắn
liền với sự trao đổi chất của tế bào. Số lượng enzyme cần tổng hợp gắn liền với nhu

cầu sống của tế bào, hơn nữa các bộ phận sống trong cơ thể có số lượng enzyme khơng
đồng nhất. Vì vậy, chỉ có một số bộ phận mới có thể sản xuất enzyme được. Muốn thu
nhận enzyme phải phá bỏ cơ quan chiết rút. Như vậy việc dùng động vật, thực vật làm
nguồn nguyên liệu sản xuất enzyme là rất hạn chế, không kinh tế và không thể đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao về enzyme.
Nguồn vi sinh vật được khai thác và thu nhận nhiều nhất vì ưu điểm vượt trội
sau:
 Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn.
 Hệ enzyme của vi sinh vật vơ cùng phong phú, trong đó có những enzyme mà
động vật, thực vật không tổng hợp được.
 Vi sinh vật có cường độ sinh sản cực kỳ mạnh, hoạt tính enzyme rất cao, do vậy
chỉ cần sử dụng một lượng rất nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn.
 So với động vật và thực vật, thì việc cải tạo giống vi sinh vật dễ dàng hơn, thời
gian ngắn hơn .

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 4


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Vi sinh vật khơng địi hỏi nghiêm ngặt về mơi trường dinh dưỡng.
 Có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong q trình ni cấy để có thể thu
được hiệu suất cao trong sản xuất..
1.2. Enzyme Amylase
1.2.1. Lịch sử
Enzyme amylase hay cịn gọi là diastase là enzyme sinh lý, có ý nghĩa trong

thương mại và có lịch sử lâu đời. Nó được tìm thấy ở cả thực vật và động vật.
Năm 1811 – 1814, nhà bác học người Nga - Viện sỹ K.Skirhof là người đầu tiên
nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột dưới mầm chiết đại mạch nảy mầm (malt) và
nhận thấy trong malt có chứa các chất phân giải thành đường.
Năm 1835, Anselme và Jean Persoz đã tinh chế được amylase có từ đại mạch, đồng
thời đặt tên là diastase ( xuất phát từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “ phân giải ” ).
Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được đặt tên là amylase.
Amylase đầu tiên được sản xuất ở qui mơ cơng nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc
từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh tiêu hóa.
1.2.2. Giới thiệu chung về enzyme amylase
 Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
công nghiệp, y học và lĩnh vực kinh tế quốc dân khác.
 Amylase thủy phân tinh bột, glycogen, và dextrin thành glucose, maltose, và
dextrin giới hạn.
 Hệ enzyme này có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người, động vật và trong
hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
 Hiện nay, amylase được thu chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm mốc và một
số loài như nấm men.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 5


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.2.3. Đặc điểm và cơ chế tác dụng
 Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này

thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác sự phân giải các liên kết 0 - glucoside nội
phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước:
R-R’ + H-OH 

RH

+

R’OH

 Phương trình thủy phân tinh bột là:
( C6H12O6 ) n



n (C6H12O6)

 Hiện nay, người ta biết rõ có 6 loại enzyme amylase:
1.

-amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid

đồng loại.
2.

-amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid

đồng loại.
3.


-amylase ( hay glucoamylase ) thủy phân liên kết  -1,4 glucoside và

các polysaccharid đồng loại.
4.

Dextrin – 6 - glucanhydrolase thủy phân các liên kết  - 1,6 - glucoside

trong polysaccharide và các dextrin cuối.
5.

Amylasepectin - 6- glucanhydrolase thủy phân các liên kết  - 1,6 -

glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
6.

Oligodextrin - 6- glucan hydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên

kết  - 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Trong đó,  - amylase và glucoamylase là hai loại enzyme được tạo ra nhiều chủ
yếu ở nấm mốc và được sử dụng hiệu quả trong công nghệ sản xuất rượu, sử dụng làm
thức ăn gia súc....

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 6


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến


Hình 1.1 :Sự thủy phân tinh bột bởi enzym amylase
1.2.4. Vi sinh vật tổng hợp amylase
Nhóm enzyme amylase, đa phần được tổng hợp bởi nấm mốc và vi khuẩn, một số ít
từ nấm men.
 Từ nấm mốc như : Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamorri, Asp. usamii;
Rhizopusneveus, Asp. patatae, Rhizopus delemar, Rhizopus javamicus; Mucor sp, và
một số loài vi sinh vật khác như: Endomycopsis fibuliger, Endomycopsis bifubuliger,
Endomymycopsis bispora; Endomyces. sp; Saccharomyces diastaticus… tạo amylase,
glucoamylase, glucozil transferase.
 Từ vi khuẩn: Bac. distaticus; Bac. subtilis; Bac. mesentercus; Bac.
amylosolvens… thường để thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt
để tách hồ tinh bột trên vải.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 7


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.2.5. Ứng dụng enzyme amylase
Chế phẩm amylase (dạng thô hay tinh khiết ) được ứng dụng khá rộng rãi trong
công nghiệp - đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Sau đây là một số ứng dụng
của nó:
 Trong cơng nghệ sản xuất rượu – bia
 Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose
 Trong công nghiệp nhẹ ( rũ hồ ), ngành dệt, công nghiệp giấy

 Trong sản xuất bánh mỳ
 Trong y học, chăn nuôi
 Trong công nghiệp thực phẩm khác như: bánh kẹo, nước giải khát, đồ
hộp và nước ép trái cây, sản xuất tương, chao…
1.2.6. Phân loại enzyme amylase
1.2.6.1. Enzyme -amylase (  - 1,4 glucan – 4 – glucanhydrolase, EC
3.2.1.1)
 Đặc điểm:
Tính chất -amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của  - amylase có tính chất acid yếu và tính chất cua globulin. Điểm đẳng điện
nằm trong vùng pH 4.2 – 5.7 ( Bernfeld.P.1951).
 - amylase là một metaloenzyme ( enzyme kim loại ). Các  - amylase đều chứa từ
1 đến 30 nguyên tử gam Ca / mol, song không ít hơn 1 đến 6. Khi tách hoàn toàn Ca
khỏi phân tử enzyme thì  - amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất.
Đối với tác dụng của acid thì  - amylase của nấm mốc bền vững đối hơn là  amylase của malt và vi khuẩn.
Đối với nhiệt thì  - amylase bền nhiệt hơn các amylase khác.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 8


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Tất cả  - amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng ( Cu2+, Ag+, Hg2+…)  amylase có nguồn gốc khác nhau thì có thành phần acid amin khác nhau.
 Cơ chế tác dụng:
 - amylase của nấm mốc cắt đút được tất cả liên kết  -1,4 glucoside nằm phía
trong mạch polysaccharid một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Vì thế,

người ta gọi nó là enzyme nội phân (endoamylase), trừ điểm phân nhánh trong
amylopectin để tạo thành maltose và dextrin giới hạn. Như vậy, chúng có khả năng
chuyển 80-82% tinh bột thành maltose.
 - amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột nguyên thủy mà còn thủy phân
hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ chậm.
Phản ứng thủy phân tinh bột bằng  - amylase thường xảy ra hai giai đọan:
-

Giai đoạn đầu (giai đoạn dextin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử bị thủy

phân, tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( - dextrin ) và độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh.
-

Giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa ): các dextrin phân tử thấp vừa được

tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các mantotriose, mantose, glucose và cịn lại một
phần dextrin phân tử thấp khơng cho màu với Iốt
-

Tính chất đặc trưng của  - amylase là khả năng dextrin hóa cao, do đó làm cho

phản ứng màu của tinh bột với Iốt bị biến đổi nhanh chóng. Vì vậy, người ta gọi  amylase là  - amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
 Điều kiện hoạt động:
-

Ở 70oC,  - amylase của nấm mốc bị mất 50% hoạt lực. Trong dung dịch đệm

pH 4.7, -amylase của Asp. oryzae rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC
trong 3h, hoạt động dextrin hóa của nó chỉ cịn 22 - 29 % và hoạt lực đường hóa cịn 27

- 85 % Ở 500C trong 2h, amylase của Asp. oryzae bị vơ hoạt hồn tồn

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 9


Đồ án tốt nghiệp

-

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

PH tối thích cho hoạt động của  - amylase nấm mốc là 4,5 – 4,8 ( có thể tốt

trong vùng pH 4,5 – 5,8 )
-

Nhiệt độ tối thích cho  - amylase nấm mốc là 50 0C
1.2.6.2. Enzyme  - amylase ( - 1,4 glucan – 4 – maltohydrolase )(EC
3.2.1.2)

 Đặc điểm:
Đa số, - amylase có nguồn gốc từ thực vật. Một số vi sinh vật có khả năng tổng
hợp  - amylase bền nhiệt cao hơn so với enzym có nguồn gốc thực vật.
 - amylase khác  - amylase ở một số điểm: nó hầu như khơng thủy phân hạt tinh
bột sống mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.
 - amylase có pH tối ưu cao hơn của  - amylase và nó khơng cần Ca2+ để ổn định
và tăng hoạt tính. Việc chứng minh sự tồn tại của  - amylase ở nấm mốc vẫn chưa
được khẳng định.

 Cơ chế tác dụng:
 - amylase là một exo -  - amylase, nó xúc tác thủy phân từ đầu không khử của
mạch amylose và amylopectin và glucogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside
tạo ra maltose ( dạng  - anomeric ). Do enzym này không thủy phân được liên kết  1,6 - glucoside ở amylose nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 – 60 %
maltose dạng  - anomeric và  - detrin giới hạn, cho màu tím đỏ với iốt.
1.2.6.3. Enzyme glucoamylase (1,4 -  - D – glucan glucohydrolase
(EC.3.2.1.3)
 Tên gọi:
Glucoamylase có các tên gọi khác nhau:  - amylase, amyloglucosidase, taka amylase Bac, maltulase,  - 1,4:1,6 - glucan - 4:6 – glucohydrolase,….

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 10


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Tính đặc hiệu:
- Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết  - 1,4 - glucoside lẫn  - 1,6 glucoside, đồng thời cả liên kết và  -1,3 - glucoside đã đưa glucoamylase lên vị trí
hàng đầu về sự thủy phân tinh bột.
- Glucoamylase là enzyme ngoại phân
( exoenzyme ) có khả năng thủy phân khá
mạnh. Nó thủy phân hồn tồn tinh bột,
glycogen,

amylodextrin

cuối,


panose,

isomaltose, bắt đầu từ đầu không khử của
amylose, và tách dần từng đơn vị phân tử
đường

glucose.

Sản

phẩm

cuối

của

glucoamylase có thể là glucose, maltose và

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử

một lượng nhỏ dextrin.

glucoamylase

- Điểm đẳng điện của glucoamylase từ

các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, nhưng theo số liệu thống kê thì nằm
trong khoảng 6.5 – 7.5.


CH2OH
O
H
OH
H

H

OH

_

H2O
CH2OH

OH

OH

amylase
_

H

H
O

OH

H2O


+

O

H
O

H+

CH2OH

+

H

H

amylase
O

H2O

O
H
H

OH

H


OH

H

O

OH
H

H+
O

OH

H

H

OH

H

O

OH

Hình 1.3. Enzyme glucoamylase thủy phân liên kết
 - 1,4 - glucoside và  - 1,6 – glucoside
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt


Trang 11

O


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Cơ chế tác dụng:
Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân tinh bột một số oligosaccharide và
polysacchaide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng tác viên cho thấy
rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “ đa mạch ” mà không theo
cơ chế “ đơn mạch ” ( Barker et al. 1957 ) như là Kerr và đồng sự giả định:
Sơ đồ thủy phân glucid bởi glucoamylase có thể biểu diễn như sau:
Glucoamylase
kiểu Rh. delemar

Tinh bột hay oligosaccharid

100% glucose
Glucoamylase
kiểu Asp. niger

80-85% glucose + ligosaccharide khác

Tinh bột hay oligosaccharid
nhau.


Sơ đồ 1.1: Khả năng thủy phân glucid của enzyme glucoamylase
Điều kiện hoạt động:
-

pH hoạt động tối thích của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không

giống nhau. Đa số các glucoamylase đã biết đều thuộc loại glucoamylase “ acid ”, thể
hiện hoạt lực ở vùng pH 3.5 – 5.5. Nếu phân loại glucoamylase theo pH tối ưu thì chỉ
gồm 2 loại là: glucoamylase “acid” và glucoamylase “ trung tính ”.
Glucoamylase “ acid” có pH tối ưu là 4.0 –5.0.
Glucoamylase “ trung tính ” có pH tối ưu là 6.0 –7,5.
Tuy nhiên, pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi theo nhiệt độ và
thời gian tác dụng..
-

Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase loại bền acid là 500C

-

Có lẽ glucoamylase là enzyme duy nhất có khả năng chuyển hóa hồn tồn tinh

bột thành glucose. Tuy nhiên, khi nồng độ  - glucose trong môi trường tăng lên do sự
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 12


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến


thủy phân các mạch  - glucan thì amyloseglucoside có thể xúc tác ngưng tụ nhiều đối
với glucose ( tác động transglucodase ) để tạo ra maltose và isomaltose.
-

So với  - amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn

dưới tác dụng của rượu etylic, aceton.
-

Fukumoto đề nghị chia glucoamylase của vi sinh vật làm hai loại theo khả năng

thủy phân tinh bột của chúng.
 Vi sinh vật sản xuất glucoamylase:

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 13


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Bảng 1.1 Glucoamylase từ các loài nấm mốc khác nhau:
%
Kiểu
enzyme

Tên gọi


Nguồn enzyme

tinh bột
thủy
phân

Rhizopus
delemar

Rh. delemar

Glucoamylase

92

Rh. delemar

Glucoamylase

100

Asp. awamori

Amylase “deebraanding”

100

Asp. niger


Amyloglucosidase

100

-

Glucoamylase

100

Asp. usamii
Rh. tokinensis

-amylase “glucogenase”

70
80

Asp. niger

Amyloglucosidase
80

Asp. niger
Aspergillu
s. niger

Amyloglucosidase
78


Asp. oryzae

Taka - amylase
78

Asp. awamori

Amylase - sacarogenase
80

Neurospora

Amyloglucosidase
75

Monaseus

Amyloglucosidase
74

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 14


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Các chế phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau tuy có những tính chung, song

cũng khác nhau ở nhiều điểm. Ngay cả các chế phẩm tách ra từ các Aspergillus cũng
khác nhau về một loạt các tính chất lý hóa học như phân tử lượng, thành phần acid
amin, tính đặc hiệu cơ chất và điều kiện họat động …. Glucoamylase vi sinh vật thuộc
các lồi khác nhau thì khác nhau mức độ thủy phân tinh bột.
1.3. Cơ chất của enzyme amylase:
Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột và glycogen
1.3.1. Tinh bột :
1.3.1.1. Đặc điểm
Tinh bột là polysaccharid tiêu biểu, được dự trữ và có nhiều trong thực vật (ngũ
cốc) 60 – 80 %, có chủ yếu ở các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mỳ… là chất
dinh dưỡng chủ yếu của con người.
Mặc dù tinh bột lấy từ các nguồn khác nhau khơng hồn tồn giống nhau, song
ngay từ năm 1940, Meyer đã cho biết rằng tinh bột mọi nguồn đều cấu tao từ amymo
và amylopectin.
Tinh bột, ngũ cốc, tồn tại dạng hạt kích thước khác nhau: 0.02-0.12 mm, có hình
dạng khác nhau.
Khi tác dụng với Iốt, tinh bột cho màu tím xanh đặc trưng.
1.3.1.2. Cấu tạo
Tinh bột là một loại polysachaide bậc hai, đồng thề ( homopolysaccharide hay
homoglucan )
Công thức tổng quát là (C6H12O6), cấu tạo từ những đơn vị cơ sở là  - D - glucose.
Liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 - O - glucoside và liên kết 1,6 - O - glucoside.
Tinh bột tồn tại 2 cấu tử: amylose và amylopectin có cấu tạo và tính chất khác
nhau.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 15



Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Tỉ phần của amylose và amylopectin trong các loại tinh bột khác nhau thì khơng
giống nhau. Tuy nhiên, đa phần các loại tinh bột đều gồm 20 – 30% amylose và 70 –
80 % amylopectin.


Amylose:


Cấu tạo mạch thẳng, chiều dài cực đại 7.000  gồm những đơn vị  -

glucose ( 300 – 1000 gốc ) liên kết với nhau qua liên kết 1,4 – O – glucoside tạo
xoắn theo kiểu lò xo được ổn định nhờ liên kết hydrogen nối giữa các nhóm OH tự do, mỗi vịng xoắn gồm 3 gốc glucose và có chiều dài 10,6 .


Nhưng trong dung dịch, mạch xoắn co lại, vòng xoắn lớn lên và gồm 6

gốc glucose


Amylose tạo màu xanh khi kết hợp với iốt ( I2 ).



Dễ tan trong nước ấm tạo độ nhớt không cao. M = 3 x 105 – 1 x 106.




Nó hầu như khơng có khả năng khử vì trong mỗi phân tử amylose chỉ có

một nhóm andehit tự do

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 16


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Hình 1.4 Cấu tử Amylose và Amylopectin
Khác amylase, amylasepectin không tan trong nước sơi, nhưng trương lên và tạo
thành hồ, cho màu tím với iốt.


Amylosepectin:

Amylopectin có cấu trúc phân nhánh. Ở điểm phân nhánh, có mặt liên kết  - 1,6 glucoside. Có nghĩa là nó có cả liên kết  - 1,4 glucoside và  - 1,6 – glucoside, tạo
thành một mạch có nhiều nhánh.
Cấu trúc của nó gồm 1 mạch thẳng trung tâm, chứa liên kết  - 1,4 - glucoside, từ
mạch này phát ra các nhánh phụ dài chừng vài chục gốc glucose, (21 – 27 gốc hoặc
những trường hợp chỉ có 15 – 18 gốc )

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 17



Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.3.2. Glycogen:
Glycogen là polysaccharid, dạng dự trữ chính có ở động vật và người.
Đăc điểm :
Phân tử có cấu tạo mạch nhánh giống như amylopectin.
Các đoạn mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn amylopectin. Chiều
dài trung bình của các đọan mạch nhánh chỉ có 12 – 14 gốc glucose.
Khác với tinh bột, nó dễ tan trong nước nóng, trong nước nóng cho màu từ đỏ đến
tím, tím nâu với iốt.
Ở động vật và người, glycogen chủ yếu tập trung ở gan và hàm lượng của nó phụ
thuộc vào chế độ dinh dưỡng.
1.4 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus Kawasaki:
1.4.1 Phân loại:
Sử dụng chủng thương mại do phòng vi sinh ứng dụng viện sinh học nhiệt đới cung
cấp.
Giới: nấm
Ngành: Ascomycote
Bộ: Eurotiales
Họ: Trichocomaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus kawasaki
Nấm kawasaki là loại nấm mốc phát triển rất nhanh, khả năng tồn tại trong môi
trường cao.nhưng hiện tại rất ít được biết đến ở Việt Nam, chỉ những năm gần đây do
đặc tính tạo glucoamylase với hiệu suất cao nên đang được nghiên cứu ở các viện
nghiên cứu.

Kawasaki có màu vàng nâu, màu hoa cau…hệ sợi, khuẩn ty có vách ngăn, sinh sản
bằng bào tử, trên đầu mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử đính xỏa ra như

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 18


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

những bông hoa, khơng có diệp lục tố, khả năng sinh độc tố chưa được biết tới nhưng
cũng như bao loài mốc khác nó cũng gây hư hỏng các sản phẩm nơng nghiệp.
1.4.2 Đặc điểm sinh học:
Kawasaki sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu 30 – 35oC, nhiệt độ tối đa 60 – 650C, tối
thiểu 6 – 80C.
pH tối ưu 5,0.
Độ ẩm tối ưu 40 – 45%, sinh trưởng và phát triển trong mơi trường cần có oxy.
Phát triển rất tốt trong mơi trường khống Czapeck, có mặt của ion Mn2+, Cu2+ sẽ
sinh glucoamylase rất tốt.
1.4.3 Đặc điểm sinh hóa:
Kawasaki có khả năng đồng hóa tốt đường glucose và maltose.
Có khả năng tổng hợp các enzyme amylase ngoại bào nhưng nhiều nhất là
glucoamylase để thủy phân rất tốt tinh bột thành dextrin và từ dextrin ra glucose.
Nếu pH < 6 thì glucoamylase bị mất hoạt tính.
1.4.4 Mơi trường phát triển tối ưu:
Kawasaki phát triển tốt nhất trên môi trường chứa nhiều tinh bột mà nổi bật nhất là
môi trường cám bắp : cám mì (tỉ lệ 6:4). Độ ẩm mơi trường 40 – 45%, cần oxy (thống
khí), pH = 5, mơi trường khống Czapeak.

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp glucoamylase:
Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan chặt chẽ tới môi trường, các vi
sinh vật không chỉ có nhu cầu về thành phần và số lượng các chất dinh dưỡng mà còn
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… của mơi
trường xung quanh. Các yếu tố này có thể kích thích hoặc ức chế sinh tổng hợp thậm
chí cịn làm vi sinh vật bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản cả khi sử dụng.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 19


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.5.1 Ảnh hưởng của pH:
Mỗi lồi vi sinh vật thích hợp với một giá trị nhất định của mơi trường ni cấy.
Thậm chí cùng một chủng vi sinh vật thì pH thích hợp cho sự sinh trưởng cũng khác
với pH cần cho sự sinh tổng hợp sản phẩm.
Trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính
acid hay kiềm làm pH của mơi trường khơng thích hợp cho hoạt động sống. Vì vậy
việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt q
trình lên men là điều cần thiết.
1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và
hiệu quả lên men, nhiệt độ cao ảnh hưởng rất mạnh và trực tiếp đối với vi sinh vật,
nhiệt độ từ 60 – 700C kéo dài trong 30phút có thể gây biến tính protein hoặc có thể làm
hệ enzyme không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt. khi hạ nhiệt độ
xuống thấp không tác động mạnh lên vi sinh vật như khi tăng nhiệt độ lên cao, tuy

không gây tiêu diệt nhưng sẽ ức chế mọi hoạt động sống của chúng.
1.5.3 Ảnh hưởng của oxygen:
Phần lớn vi sinh vật tạo ra amylase là những vi sinh vật hiếu khí. Khi ni cấy vi
sinh vật hiếu khí cần phải có tiếp xúc giữa chúng và oxy. Oxy là một trong những yếu
tố cơ bản ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí, cũng như
q trình trao đổi chất trong tế bào. Thiếu oxy ở một khu vực nào đó trong mơi trường
ni cấy sẽ đưa đến phá vỡ sự trao đổi chất trong tế bào. Tuy nhiên nhu cầu oxy đối
với sự sinh trưởng và tạo ra những sản phẩm trao đổi chất ở các vi sinh vật hiếu khí
khơng phải bao giờ cũng giống nhau.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 20


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.5.4 Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng:
Enzyme chia làm 2 nhóm:
 Nhóm 1: Là enzyme cảm ứng có nghĩa là sự tồn tại cơ chất của môi trường sẽ
kéo theo sự tăng lên của enzyme trương ứng để thủy phân cơ chất đó. Cơ chất ni
kawasaki để tổng hợp glucoamylase là tinh bột.
 Nhóm 2: Là enzyme bản thể, được tạo thành trong cơ thể khơng phụ thuộc cơ
chất có hay khơng có trong mơi trường.
Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Nếu thiếu thành phần này sẽ có
ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi enzyme amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng hợp
α – amylase bị ức chế hồn tồn, cịn hàm lượng glucoamylase bị giảm xuống hàng
chục lần.

Thành phần môi trường cũng cần chứa các chất khống như: P, S, Mn2+, K, Na…
Nếu khơng sẽ làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật nhưng chỉ
cần lượng cần thiết nhất định.
1.5.5 Ảnh hưởng của độ ẩm:
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đàu của môi trường là 35 – 60% đối với các
chủng nấm mốc như Aps. Niger, Asp.awamori, Asp.flavus, Asp.oryzae và phải giữ cho
mơi trường có độ ẩm đó trong suốt thời gian ni cấy, tùy vào đặc tính sinh lý của từng
chủng. Độ ẩm vượt quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thống khí, cịn thấp hơn 40 – 55%
thì kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và tạo enzyme của nấm mốc. Khi nuôi trong
điều kiện khơng được vơ trùng tuyệt đối, thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống
không vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dể bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ
ẩm tối ưu (phòng ngừa và hạn chế sự hỏng khô canh trường) trong suốt quá trình sinh
trưởng của nấm sợi lại cịn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành enzyme.
Môi trường được chuẩn bị với các thông số về điều kiện ni cấy tương tự như
trong các thí nghiệm nêu trên.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 21


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.5.6 Ảnh hưởng của thời gian thu nhận:
Thời gian ni cấy để có lượng amylaza cực lớn được xác định bằng thực nghiệm.
Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme mà thể
ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào cần thiết. Đối với đa số nấm mốc sự
tạo bào tử là hiện tượng khơng mong muốn vì như thế thường làm giảm hoạt lực

enzyme. Trong điều kiện sản xuất thống khí tốt, thời gian ni cấy để có thể tích lũy
amylaza cực đại đối với từng loại nấm sợi khác nhau cũng khác nhau.
1.6 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme:
Hiện nay có 2 phương pháp đang được áp dụng để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận
enzyme gồm: Ni cấy bề mặt và ni cấy chìm.
1.6.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt:
Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt của môi trường, môi
trường thường dùng là các nguyên liệu tự nhiên như: Cám mì, cám gạo, cám bắp…Tùy
theo đối tượng vi sinh vật và mục đích ni cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất
cảm ứng và một số thành phần khác cho thích hợp.
 Ưu điểm:
Ni cấy vi sinh vật bằng phương pháp này enzyme thu được có nồng độ và hoạt
tính cao, chế phẩm dễ sấy khơ, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, khơng
cần thiết bị phức tạp, tiêu thụ năng lượng ít nên thích hợp với nhiều vùng sản xuất.
 Nhược điểm:
Tuy nhiên, phương pháp này lại cần mặt bằng lớn và chi phí lao động cao cơ giới
hóa trong sản xuất khó.
1.6.2 Phương pháp ni cấy chìm:
Khác với phương pháp ni cấy bề mặt, phương pháp ni cấy chìm ta cho vi sinh
vật phát triển trong môi trường lỏng. Thành phần dinh dưỡng của mơi trường lỏng
thích hợp với mỗi chủng vi sinh khác nhau là khác nhau.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 22


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến


 Ưu điểm:
Phương pháp này được sử dụng phổ biến nhất trong lên men cơng nghiệp. Vì có
những ưu điểm sau: phương pháp lên men chim ít chống mặt bằng, dễ cơ giới hóa và
tự động hóa trong q trình theo dõi.
 Nhược điểm:
Tuy nhiên phương pháp này lại đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho thiết bị.
1.7 Phương pháp thu nhận enzyme từ mơi trường lên men bán rắn:
1.7.1Q trình trích ly:
Enzyme có trong tế bào vi sinh vật số lượng không nhiều so với các thành phẩn
khác. Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được khơng chỉ có enzyme hòa tan
trong nước mà thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất môi trường và cả chất
màu của chính nấm mốc tạo ra.
Enzyme có bản chất là protein, rất dễ bị biến tính khi bị tác động bởi các yếu tố
bên ngoài như nhiệt độ. Do đó, việc thu nhận enzyme là khơng dễ dàng.
Để tách chiết enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước cất hoặc các
dung dịch đệm thích hợp hoặc các muối trung tính. Trong đó, nước cất thường được sử
dụng nhất vì sự thuận tiện và kết quả của nó mang lại cao.
Enzyme từ môi trường khuếch tán vào nước do sự chênh lệch nồng độ. Nước có thể
tách từ 90 – 95% enzyme trong môi trường. nước dùng để chiết thường có nhiệt độ từ
25 – 280C.
Trong q trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy, các vật chất khơ
trong mơi trường sẽ hịa tan và có tới 33 – 35% tinh bột được thủy phân hoàn tồn,
phần đường khơng được vi sinh vật sử dụng sẽ cịn lại trong mơi trường này.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 23


Đồ án tốt nghiệp


GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả trích ly:
 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước hoặc đệm để trích ly:
Canh trường khơ cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn canh trường ẩm. Với các tỉ
lệ (đệm : canh trường) nuôi cấy khác nhau sẽ trích ly được lượng enzyme khác nhau.
Thường lượng nước dùng trích ly gấp 3 - 3,5 lần so với canh trường nuôi cấy nấm
mốc. Hoặc tỷ lệ đệm gấp 2 – 2,5 lần canh trường.
 Ảnh hưởng của thời gian trích ly:
Enzyme thủy phân dễ hịa tan vào nước, thời gian trích ly kéo dài thì khả năng trích
ly được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết và làm
giảm hoạt tính của enzyme.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH:
Khi nhiệt độ trích ly tăng dẫn đến vận tốc trích ly tăng và tăng hàm lượng tạp chất
trong dịch chiết nên hiệu suất thu nhận enzyme và hoạt tính enzyme thu được bị giảm
đi. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly là 20 – 300C. Trong cơng nghiệp thường dùng
nước có pH = 7,8 để trích ly enzyme.
1.8 Tinh sạch chế phẩm enzyme:
Việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải enzyme, nước, các
thành phần khác không phải tế bào ra khỏi enzyme. Công việc này hồn tồn khơng dễ
dàng. Để tinh sạch enzyme người ta phải dùng đến nhiều phương pháp khác nhau. Rất
ít khi, với một bước hay một phương pháp duy nhất mà có thể thu được chế phẩm
enzyme tinh khiết. Tùy theo nguồn cho enzyme, loại enzyme, mục đích sử dụng
enzyme và điều kiện phịng thí nghiệm mà ta lựa chọn những phương pháp để đem lại
hiệu quả cao nhất. dưới đây là những phương pháp thường dùng để tinh sạch enzyme.
1.8.1 Phương pháp kết tủa enzyme:
Kết tủa là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong
phịng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mơ sản xuất công nghiệp.


SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 24


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc: enzyme là một phức hợp protein có khả
năng tạo kết tủa với một số dung mơi. Trong q trình kết tủa, người ta phân biệt hai
dạng thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương.
Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch.
Kết tủa dương thì hồn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết
tủa còn prtein tạp nằm trong dung dịch.
 Phương pháp tủa bằng muối: muối nồng độ cao tác dụng với phân tử nước
bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hịa tan của
enzyme.
Có thể dùng các loại muối sau để tủa enzyme: (NH4)2SO4, NaCl, Na2SO4,
MgSO4… Trong công nghiệp enzyme hiện nay, người ta thường sử dụng muối
(NH4)2SO4. Ưu điểm của muối này là do muối này có mức độ hịa tan rất cao trong
nước (có thể đạt tới 720g/l, ở nhiệt độ 250C), ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí
cịn có tác dụng làm bền enzyme. Một ưu điểm nữa của muối (NH4)2SO4 là khả năng
kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong
dịch chiết.
Hạn chế của phương pháp sử dụng muối (NH4)2SO4 là mất nhiều thời gian, ly tâm ở
tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước
tinh sạch khác.
 Phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ:
Thường dùng ethanol, acetone hay izopropanol…Phương pháp này hiện nay được

sử dụng rộng rãi vì dễ tiến hành, hóa chất đơn giản, hiệu suất thu hồi tốt, hoạt tính
enzyme cao.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
50C, làm lạnh cả dung môi hữu cơ và enzyme, do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ
khi có mặt dung mơi hữu cơ.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 25


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng
thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
Khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng tan của
nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của
dung môi, đẩy một lượng nước lớn. Các phân tử nước sắp xếp trật tự xung quanh các
đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu
cơ. Các enzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng tan hồn tồn trong dung mơi
hữu cơ.
 Kết tủa enzyme bằng polymer:
Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong kết
tủa protein enzyme. Nhiều tác giả cho rằng phương pháp lắng của chúng gần giống
dung môi hữu cơ.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể thực hiện quá trình kết tủa ở nhiệt độ
thường và luongj polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều ( khoảng 5 –

15%).
Cơ chế tạo kết tủa của các polymer với enzyme giống như cơ chế tạo kết tủa của
các dung môi hữu cơ với enzyme. Trong công nghiệp, thường sử dụng nồng độ
polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme.
1.8.2 Phương pháp sắc ký:
Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhất để làm sạch enzyme.
Phương pháp sắc ký đã được ứng dụng theo quy mô công nghiệp vào những năm 1960.
Nguyên tắc: chất được tách nhờ tương tác giữa hai pha (pha động và pha tĩnh). Pha
động (ở dạng lỏng hoắc khí) vận chuyển chất càn tách qua pha tĩnh (dạng rắn hoặc
lỏng) cịn gọi là chất hấp phụ. Phase này có khả năng liên kết khác nhau với các thành
phần khác nhau cần tách có mặt trong phase động. các thành phần này sẽ rửa trôi ra

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 26