..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HỒI

PHÂN TÍCH ðA HÌNH DI TRUYỀN TẬP ðỒN
DỊNG NGƠ NẾP VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
TRONG TẠO GIỐNG NGÔ NẾP LAI
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Bùi Mạnh Cường

HÀ NỘI – 2011


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Mạnh Cường,
người ñã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình
cơng tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh ñạo Viện nghiên cứu ngô và
tập thể cán bộ Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu ngơ đã giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ công tác
tại Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Viện ñào tạo sau ñại học –

Trường ðại học Bách khoa Hà Nội ñã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tơi trong suốt q trình học tập tại trường.
Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt
tình động viên, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày tháng năm 2011
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hoài

i


LỜI CAM ðOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo
của thầy hướng dẫn và giúp ñỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Công
nghệ sinh học - Viện nghiên cứu ngô. Các số liệu và kết quả nêu trong luận
văn là trung thực và chưa từng được cơng bố.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Nguyễn Thị Thu Hoài

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn


i

Lời cam ñoan

ii

Mục lục

iii

Danh mục các chữ viết tắt

v

Danh mục các bảng

vi

Danh mục các hình

vii

MỞ ðẦU..............................................................................................................

1

1. Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài.........................................................................

2


2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñể tài..........................................................

3

3. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu....................................................................

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................

4

1.1. Một số nét khái quát về cây ngô................................................................

4

1.1.1. Phân loại thực vật và đặc điểm của cây ngơ......................................

4

1.1.2. Nguồn gốc..........................................................................................

4

1.1.3. ðặc tính và nguồn gốc phát sinh ngơ nếp..........................................

5

1.2. Vai trị của cây ngơ trong nền kinh tế.........................................................


9

1.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng ngơ nếp...................................

9

1.3.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng ngô nếp trên thế giới......

9

1.3.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng ngơ nếp ở Việt Nam......

11

1.4. Sự đa dạng di truyền cây ngô......................................................................

13

1.5. Các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu ña dạng di truyền…………………

14

1.5.1. Chỉ thị hình thái……………………………………………………..

15

1.5.2. Chỉ thị sinh hóa……………………………………………………..

15


1.5.3. Chỉ thị phân tử ADN………………………………………………..

16

iii


1.6. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên ñối tượng cây ngô…………

21

1.6.1. Nghiên cứu ña dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái kết hợp chỉ
thị phân tử…………….................................................................................

21

1.6.2. Nghiên cứu ña dạng di truyền dựa vào chỉ thị phân tử ADN……….

23

1.7. Dòng thuần và ưu thế lai………………………………………………….

27

1.7.1.Dòng thuần…………………………………………………………..

27

1.7.2. Ưu thế lai……………………………………………………………


28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................

29

2.1. Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….

29

2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………

31

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu trên ñồng ruộng………………………….

31

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm………………….

32

2.3. Các phương pháp phân tích và xử lý số liệu……………………………...

35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.........................

36


3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm nơng sinh học tập đồn dịng ngơ nếp.............

36

3.1.1. Thời gian sinh trưởng, đặc điểm hình thái của các dịng ngơ nếp......

36

3.1.2. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dịng ngơ nếp...

45

3.2. Kết quả nghiên cứu đa hình di truyền tập đồn dịng ngơ nếp ở mức phân tử...

48

3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số.........................................................

48

3.2.2. Kết quả đánh giá đa hình di truyền các dịng ngơ nếp ở mức phân
tử bằng chỉ thị SSR ......................................................................................

49

3.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dịng ngơ nếp
bằng chỉ thị SSR...........................................................................................

54


3.3. Khả năng ứng dụng các dịng trong tạo giống ngơ nếp lai.........................

59

3.4. Mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền (GD) với năng suất hạt (F1), ưu
thế lai trung bình (Hmp) và ưu thế lai chuẩn (Hs).............................................

63

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ.................................................................................

68

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................

69

PHỤ LỤC

iv


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
AFLP

Axit Deoxyribonucleic
Amplified Fragment Length Polymorphism (ða hình chiều dài ñoạn
nhân bản)
AMBIONET Asian Maize Biotechnology Network (Mạng lưới công nghệ sinh học

cây ngô vùng châu Á)
bp
base pair
CIMMYT Trung tâm cải tiến ngô và lúa mỳ quốc tế
cs
Cộng sự
CTAB
Cetyl trimethylamonium bromide
CV
Coefficient of variation (Hệ số biến động)
ðB
ðóng bắp
ð/c
ðối chứng
ðK
ðường kính
GBSS
Granule-bound starch synthase
GD
Genetic distance (Khoảng cách di truyền)
GS
Genetic similarity (ðộ tương đồng di truyền)
Hmp
Ưu thế lai trung bình
Hs
Ưu thế lai chuẩn
h.hạt
hàng hạt
h/hàng
hạt/hàng

LSD0.05
Least significant difference (Sự sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức
0,05)
NST
Nhiễm sắc thể
NSTT
Năng suất thực thu
NTSYS
Numerical Taxonomy System (Hệ thống phân loại)
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
PIC
Polymorphic Information Content (Chỉ số thơng tin đa hình của mồi)
RAPD
Randomly Amplified Polymorphic DNA (ða hình các đoạn ADN
được khuếch đại ngẫu nhiên)
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism (ða hình chiều dài đoạn
cắt giới hạn)
SNP
Single Nucleotide Polymorphism (ða hình nucleotide đơn)
SSR
Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản)
TB
Trung bình
TGST
Thời gian sinh trưởng
THL
Tổ hợp lai
Wx

waxy

v


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1: So sánh các hệ thống chỉ thị phân tử ADN ñược sử dụng phổ biến
nhất trong nghiên cứu ña dạng di truyền ngũ cốc

16

Bảng 2.1: Danh sách 30 dịng ngơ tham gia thí nghiệm

29

Bảng 2.2: Danh sách 22 mồi SSR tham gia nghiên cứu

30

Bảng 2.3: Thành phần của một phản ứng PCR

33

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

34

Bảng 3.1: Thời gian sinh trưởng, số lá và màu cờ, râu của 30 dịng ngơ nếp


39-40

Bảng 3.2: Một số đặc điểm hình thái của 30 dịng ngơ nếp

41-42

Bảng 3.3: Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của 30 dịng ngơ nếp

43-44

Bảng 3.4: ðánh giá ñộ tinh sạch và nồng ñộ ADN của các dịng ngơ nếp

48

Bảng 3.5: Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của các dịng ngơ

51

Bảng 3.6: Kết quả đánh giá hệ số PIC, số băng ADN và số alen xuất hiện

52

Bảng 3.7: Mức độ tương đồng di truyền (GS) của 30 dịng ngơ nếp
Bảng 3.8: Khoảng cách di truyền trung bình của 1 dịng đối với 29 dịng cịn lại

55-56
58

Bảng 3.9: ðặc điểm hình thái, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của

các tổ hợp lai

60-61

Bảng 3.10: Khoảng cách di truyền của các cặp dòng, năng suất hạt F1, ưu thế lai
trung bình (Hmp) và ưu thế lai chuẩn (Hs) của các THL với cây thử N6 và N22

64

Bảng 3.11: Hệ số tương quan (r) giữa khoảng cách di truyền (GD) với năng
suất hạt (F1), ưu thế lai trung bình (Hm) và ưu thế lai chuẩn (Hs)

vi

65


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1: Cấu trúc gen waxy của ngơ và các vị trí đột biến trong gen waxy

6

Hình 3.1: Hình thái một số dịng ngơ nếp

38

Hình 3.2: Biểu đồ năng suất của 30 dịng ngơ nếp vụ Xn và vụ Thu 2010


46

Hình 3.3: Hình ảnh một số dịng ngơ nếp ưu tú

46

Hình 3.4 : Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm ADN tổng số

49

Hình 3.5: ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi phi108411

53

Hình 3.6: ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi phi 374118

53

Hình 3.7: ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi phi 032

53

Hình 3.8: Sơ đồ về mối quan hệ di truyền của 30 dịng ngơ nếp dựa vào chỉ thị
phân tử SSR

56

Hình 3.9: Hình ảnh một số tổ hợp lai triển vọng.

62


Hình 3.10: ðồ thị tương quan giữa khoảng cách di truyền (GD) với ưu thế lai
chuẩn (Hs) (19 tổ hợp lai với cây thử N6 và 19 tổ hợp lai với cây thử N22)

vii

65


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

MỞ ðẦU
Ngơ (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng của thế giới (lúa
mì, lúa nước, ngơ), có tốc độ tăng trưởng cao nhất về năng suất cũng như sản lượng.
Với vai trị đảm bảo an ninh lương thực cho người, thức ăn cho chăn nuôi, nguyên
liệu cho công nghiệp, ñặc biệt là nguyên liệu lý tưởng cho nhiên liệu sinh học, ngơ
cịn là mặt hàng nơng sản xuất khẩu có giá trị, ngơ đã được hầu hết các nước và
vùng lãnh thổ trên thế giới gieo trồng và phát triển liên tục. Tính đến năm 2009,
diện tích trồng ngơ trên thế giới khoảng 159,5 triệu ha với năng suất trung bình 51,3
tạ/ha và sản lượng ước đạt 817,1 triệu tấn [42].
Ở Việt Nam, cây ngơ đứng vị trí thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan
trọng nhất, ñược trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, ña dạng về mùa vụ gieo
trồng và hệ thống canh tác. Năm 2009, diện tích trồng ngơ đạt 1086,8 nghìn ha,
năng suất ñạt 40,3 tạ/ha, sản lượng 4,38 triệu tấn [17].
Những năm gần đây, nhu cầu ngơ thực phẩm (ngơ nếp, ngơ đường) để ăn
tươi, phục vụ cơng nghiệp chế biến ngày càng tăng. Với ngơ nếp, nhờ tinh bột có
tính chất ñặc biệt, gần như 100% là amylopectin, giàu lyzin và tryptophan nên trở
thành nguồn thực phẩm tươi sạch, có giá trị dinh dưỡng cao. Ở nước ta, diện tích

ngơ nếp chiếm khoảng 10% trong tổng số hơn 1 triệu ha trồng ngơ của cả nước, chủ
yếu là giống địa phương và giống thụ phấn tự do, có chất lượng ngon nhưng năng
suất thấp. Gần ñây, một vài giống lai đơn của các cơng ty nước ngồi đã được trồng
ở Việt Nam mặc dù giá giống rất cao (khoảng trên 10-15 USD/kg), nhưng do có
một số ưu điểm so với giống địa phương và giống thụ phấn tự do (có ñộ ñồng ñều,
năng suất cao, chất lượng tốt) và mang lại hiệu quả kinh tế nên người tiêu dùng vẫn
chấp nhận. Chính vì vậy, để giảm bớt giá thành và ñáp ứng nhu cầu sản xuất, ñặt ra
cho các nhà tạo giống ngơ Việt Nam phải nghiên cứu, nhanh chóng tạo ra các giống
ngơ nếp lai có độ đồng đều cao, năng suất cao, chất lượng tốt thích nghi với các
vùng sinh thái. Nhưng ñể tạo ra ñược một giống ngơ nếp lai với các ưu điểm trên thì
các nhà chọn tạo giống ngô phải tiến hành nghiên cứu qua nhiều giai đoạn: tạo dịng

1


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

thuần, đánh giá dịng, thử nghiệm các tổ hợp lai… Trong đó, giai đoạn đánh giá dịng
và tìm hiểu mối tương quan di truyền giữa các dịng là một trong những bước đầu tiên
rất quan trọng cho chương trình tạo giống ngơ lai.
Những thơng tin về ña dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn nguyên
liệu di truyền là rất cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống cây trồng nói
chung [49]. Ở cây ngô, nguồn thông tin di truyền ở mức hình thái (kiểu hình) và
mức phân tử (kiểu gen) của các nguồn vật liệu là rất hữu ích để ñánh giá nguồn gen
phục vụ cho công tác chọn lọc, bảo tồn và ñặc biệt là khả năng ứng dụng trong các
chương trình chọn tạo giống [29]. Từ những thơng tin về đa dạng di truyền của các
dịng sẽ giúp các nhà chọn tạo giống có thể phân nhóm ưu thế lai, thiết kế sơ đồ lai
tạo và nhanh chóng xác ñịnh các tổ hợp lai triển vọng.

Cho ñến nay, việc nghiên cứu ñánh giá ña dạng di truyền tập đồn ngun
liệu và khả năng ứng dụng cho cơng tác chọn tạo giống ngô chỉ tập chung chủ yếu ở
ngô tẻ, đối với ngơ nếp cịn rất hạn chế. ðiều này là do tập đồn ngun liệu ngơ
nếp cịn nghèo, hơn nữa cơng tác chọn tạo giống nếp lai có năng suất cao chất lượng
tốt chưa ñược quan tâm ñúng mức. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa hình di truyền tập đồn dịng ngơ nếp và
khả năng ứng dụng trong tạo giống ngô nếp lai”.
1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
ðánh giá đặc điểm nơng sinh học và đa hình di truyền ở mức phân tử của tập
đồn dịng ngơ nếp.
Phân nhóm ưu thế lai, thiết kế sơ ñồ lai tạo.
Tìm hiểu mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền với năng suất hạt lai F1,
ưu thế lai trung bình (Hmp), ưu thế lai chuẩn (Hs).

2


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñể tài
Ý nghĩa khoa học của đề tài
ða dạng di truyền có tầm quan trọng rất lớn trong cơng tác chọn tạo giống,
đặc biệt là trong chương trình chọn tạo giống ngơ nếp lai. Sự ña dạng của các cá thể
ñược xác ñịnh thông qua các đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, những đánh giá này
thường bị tác động mạnh mẽ của mơi trường, số lượng các chỉ thị hình thái được xét
tới và tính phức tạp của các tính trạng đa gen. Mặt khác, ñể ñạt ñược giá trị thống kê
có ý nghĩa, cần phải ñược thực hiện trên số lượng lớn cá thể với nhiều lần nhắc lại
nên cơng việc này địi hỏi rất nhiều cơng sức, chi phí tốn kém và thời gian kéo dài.

Chính vì vậy, đề tài kết hợp với phương pháp đánh giá truyền thống, phân tích đa
hình di truyền tập đồn dịng ngơ nếp dựa vào chỉ thị phân tử SSR sẽ cho kết quả
đánh giá chính xác hơn về thơng tin phả hệ của tập đồn dịng nghiên cứu và khả
năng ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngơ nếp lai trong điều kiện cụ thể ở
Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài
- Cung cấp thêm thơng tin về mức đa hình di truyền của tập đồn dịng ngơ
nếp hiện có dựa vào chỉ thị phân tử SSR.
- Thiết lập nhóm ưu thế lai, thiết kết sơ ñồ lai tạo.
- Giảm bớt một số lượng các cặp lai thử trên ñồng ruộng.
- Kết hợp với ñánh giá trên ñồng ruộng, chọn lọc ñược tổ hợp nếp lai ưu tú.
3. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu
ðối tượng nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành trên 30 dịng ngơ nếp có
nguồn gốc khác nhau trong tập đồn ngun liệu của Viện nghiên cứu Ngơ.
Phạm vi nghiên cứu: Bao gồm thí nghiệm đánh giá dịng trên đồng ruộng;
ðánh giá đa hình di truyền của tập đồn dịng ngơ nếp bằng chỉ thị phân tử
SSR; Thí nghiệm khảo sát tổ hợp lai.

3


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ NÉT KHÁI QUÁT VỀ CÂY NGÔ
1.1.1. Phân loại thực vật và đặc điểm của cây ngơ
Cây ngơ có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hịa thảo
Gramineae, có bộ nhiễm sắc thể 2n=20.

Dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt ngơ được phân thành 7 lồi phụ: Ngơ đá,
ngơ răng ngựa, ngơ nếp, ngơ đường, ngơ nổ, ngơ bột, ngơ bọc. Phân bố ở 4 vùng
sinh thái khác nhau: ơn đới, nhiệt đới thấp, nhiệt đới cao và cận nhiệt đới.
Cây ngơ quang hợp theo chu trình C4, có cường độ quang hợp cao, dẫn ñến
tiềm năng sinh khối và năng suất hạt cao hơn các cây trồng khác. ðặc ñiểm là cây
thụ phấn chéo, đã góp phần làm tăng tính đa dạng hình thái, di truyền và khả năng
thích ứng rộng.
1.1.2. Nguồn gốc
Nguồn gốc ñịa lý
Những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng, Vavilov (1926) và các nhà khoa
học trên thế giới ñã chứng minh rằng: Mexico và Peru là những trung tâm phát sinh
và đa dạng di truyền của ngơ. Mexico là trung tâm thứ nhất (trung tâm phát sinh) và
vùng Andes (Peru) là trung tâm phát sinh thứ hai. Từ hai trung tâm phát sinh này
cây ngơ được lan truyền ra các nước của Châu Mỹ. Cây ngô phát triển sang các
châu lục khác nhờ sự di cư của người Châu Âu. Ngơ được du nhập sang Châu Âu từ
thế kỷ thứ 15, sau đó phát triển sang bán đảo phía ðơng Ấn ðộ, Indonesia, Châu
Phi và ðơng Nam Châu Á. Trải qua hàng triệu năm phát triển, dưới tác ñộng của
chọn lọc tự nhiên và nhân tạo ñã hình thành nên các chủng ñặc trưng cho mỗi vùng
sinh thái [16].
Theo Lê Q ðơn thì cây ngơ được nhập vào nước ta từ thế kỷ 17 theo 2 con
ñường từ Trung Quốc và Indonesia. Ngày nay, cây ngơ được trồng ở khắp các vùng,

4


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

miền trong cả nước với nguồn gen hiện ñang ñược bảo tồn khá phong phú và ña

dạng [4].
Nguồn gốc di truyền
Nguồn gốc di truyền của cây ngơ là một đề tài được các nhà khoa học quan
tâm và tranh luận rất nhiều, có các giả thuyết như sau: (1) là con lai giữa Teosinte
và thành viên không rõ thuộc chi Andropogoneae. (2) là con lai nhị bội tự nhiên
giữa các loài Á châu thuộc chi Maydeae và Andropogonea. (3) là con lai giữa ngô
bọc, teosinte và tripsacum. (4) là con lai của ngô bọc Nam Mỹ và tripsacum Trung
Mỹ với Teosinte. (5) Ngô, teosinte và tripsacum bắt nguồn riêng rẽ từ một dạng tổ
tiên chung. (6) Teosinte là nguồn gốc của ngô sau một hoặc nhiều đột biến... Trong
đó, giả thuyết teosinte là nguồn gốc của ngơ được các nhà khoa học ủng hộ. Gần
đây, các bằng chứng phân tích ADN đã khẳng định thêm sự chắc chắn của giả
thuyết này. ðó là sự thay đổi từ thích nghi sinh tồn trong điều kiện hoang dại sang
thích nghi trồng trọt với sự can thiệp của con người [15, 16].
1.1.3. ðặc tính và nguồn gốc phát sinh ngô nếp
Ngô nếp (Zea mays L. subsp. ceratina kulesh) là một trong những loài phụ
của Zea mays L. Hạt ngơ nếp có bề mặt ngồi bóng hơn ngơ tẻ, lớp ngồi cùng của
mặt cắt nội nhũ khơng có lớp sừng như ngơ tẻ, xuất hiện nội nhũ bóng giống như
sáp và được gọi là ngơ sáp (nhưng nó khơng chứa sáp), khi nấu chín có độ dẻo, mùi
vị thơm ngon. Tinh bột nội nhũ của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong
khi ngô thường chứa 75% amylopectin và 25% amylose, (amylose có cấu trúc
khơng phân nhánh, do các gốc ñường glucose liên kết với nhau theo liên kết α-1,4
glucoside; amylopectin có cấu trúc phân nhánh do các gốc glucose liên kết với nhau
theo α-1,4 glucoside và α-1,6 glucoside). Khi nhuộm tinh bột ngô nếp với dung dịch
I2/KI 2% thì chuyển thành màu nâu đỏ, trong khi tinh bột ngơ thường chuyển thành
màu xanh tím. Ngơ nếp có biểu hiện gen opaque (waxy opaque-2) nên rất giàu axit
amin khơng thay thế là lyzin và tryptophan, do đó, nó có giá trị dinh dưỡng cao [25,
28, 73, 76, 85].

5



Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

Về nguồn gốc địa lý chính xác của ngơ nếp cho đến nay vẫn chưa ñược xác
ñịnh. Tuy nhiên, theo nhà thực vật học Collins, ngơ nếp được phát hiện ở Trung
Quốc vào đầu những năm 1900. Kể từ khi phát hiện ra nó ở Trung Quốc, loại này
cũng đã được tìm thấy nhiều nơi khác ở ðông Nam Á như Miến ðiện, Philipin [35,
36, 59].
Về nguồn gốc di truyền, hiện nay các nhà khoa học đã xác định rằng ngơ nếp
bắt nguồn từ ñột biến ñơn gen từ ngô thường, do ñột biến gen trội Wx thành gen lặn
wx cho nên ngô nếp có thể xuất hiện ở nhiều vùng khác nhau của trái đất [50]. Ngơ
nếp là kết quả đột biến từ dạng ngơ răng ngựa, được tìm thấy và thuần hóa ở Mỹ
vào những năm 1930 [54]. Gần ñây, các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng
ngơ nếp cịn được thuần hóa từ dạng ngơ đá ở Trung Quốc [41, 63, 87].
ðặc tính ngơ nếp được quy định bởi gen lặn, đó là gen wx do đột biến từ gen
trội Wx. Gen Waxy ñịnh vị trên cánh tay ngắn ở nhiễm sắc thể số 9. Cấu trúc gen
Waxy có kích thước 3718 bp bao gồm 14 exons kích thước từ 64-392 bp và 13
introns có kích thước 81-139 bp, ở các exons và vùng promoter rất giàu G/C (chiếm
trung bình khoảng 60%, thậm chí lên đến 75-85%) [50, 57, 98].

Hình 1.1: Cấu trúc gen waxy của ngơ
và các vị trí ñột biến trong gen waxy
(Kích thước các Exon: e1- 180 bp; e2- 334 bp; e3 - 81 bp; e4 -99 bp; e5-90 bp; e664 bp; e7- 101 bp; e8-110 bp; e9-244 bp; e10-183 bp; e11- 192 bp; e12- 87 bp;
e13- 129 bp; e14 - 369bp. Kích thước các Intron: i1 (vị trí giữa e1 và e2) - 139bp;
i2- 131bp; i3- 94bp; i4 - 96bp; i5- 81bp; i6-123bp; i7- 137bp; i8-97bp; i9-110bp;
i10-95bp; i11-111bp; i12-97bp; i13-121bp. Các ñột biến: ↓ chèn ñoạn; - mất ñoạn)
6



Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

Gen Waxy mã hóa cho enzyme granule-bound starch synthase (GBSS =
protein waxy), ñây là một trong những isoenzyme chính xúc tác sự tổng hợp
amylose từ ADP glucose, ñược biểu hiện ở nội nhũ [91] và hạt phấn [38]. Ở ngơ
thường, isoenzyme GBSS có hoạt tính mạnh và sản phẩm của nó là amylose, khi đó
trong con đường chuyển hóa tinh bột thì ADP glucose khơng thể được chuyển hóa
hồn tồn thành amylopectin. Vì vậy sẽ cịn khoảng ¼ tinh bột trong nội nhũ cịn lại
là amylose và có kiểu hình là ngơ thường. Ở ngơ nếp, gen trội Wx bị đột biến thành
gen lặn wx và hoạt ñộng của enzyme GBSS bị ức chế ñồng thời tất cả isoenzyme
khác tổng hợp amylose cũng hoạt ñộng rất yếu và ADP glucose sẽ ñược chuyển
thành amylopectin bởi enzyme starch branching (SBE). Khi đó thì chỉ có
amylopectin là được tích lũy trong nội nhũ và có kiểu hình là ngơ nếp. Tuy nhiên,
trong thực tế con đường sinh tổng hợp tinh bột ở nội nhũ ngô là rất phức tạp, q
trình này có sự tương tác giữa nhiều enzyme sinh tổng hợp tinh bột khác nhau như:
Granule-bound starch synthase (GBSS), starch branching enzyme (SBE),
debranching enzyme (DBE) [44, 88, 94].
Nhiều ñột biến tác ñộng ñến sự biểu hiện của locus waxy ñã ñược xác ñịnh.
Cho ñến nay, các nhà khoa học ñã xác ñịnh ñược khoảng hơn 50 ñột biến từ Wx →
wx. Phân tích cấu trúc các allen ñã cho thấy cơ chế của ñột biến waxy là do sự thay
thế base ñơn (ñột biến ñiểm) liên kết với chèn ñoạn/mất ñoạn ADN [50]. Hầu hết,
cơ sở của ñột biến waxy là do chèn các hệ thống yếu tố chuyển vị Ac/Ds
(activator/dissociation); Spm/En (suppressor-mutator/enhancer) và retrotransposon
vào vị trí khác nhau của locus Waxy. Chẳng hạn, sự hình thành ñột biến wx-m1,
wx-m5, wx-m6, wx-m7 và wx-m9 là kết quả chèn hệ thống Ac/Ds, wx-m8 là do
chèn một phần thụ thể của Spm, đó là Spm-I8; wx-844 là kết quả chèn yếu tố En-I
[43,71,72,81]; ðột biến wx-stonor, wx-B5, wx-G là do chèn yếu tố retrotransponson

[89, 93]. Ngoài ra, hiện tượng mất ñoạn ADN trên locus Waxy cũng dẫn ñến kết
quả trong một vài kiểu hình đột biến. Sự hình thành ñột biến wx1-B1, wx-B, wx1B6 và wx1-C4 là do mất đoạn ADN với cấu trúc khơng bình thường. ðột biến
wx1240, wx-C, wx-BL2 bao gồm cả mất ñoạn ADN và thay thế base ñơn [67].
7


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

Wessler và cs (1985) ñã sử dụng kỹ thuật phân tử ñể xác ñịnh cấu trúc của
gen Wx trong các dạng ñột biến wx. Trong nghiên cứu này ñã xác ñịnh 13 trường
hợp di truyền khác nhau có thể làm tăng kiểu hình ngơ nếp ở ngơ, bao gồm đột biến
mất đoạn và chèn đoạn. Những đoạn chèn vào có kích thước thay đổi từ 150bp ñến
6,1kb. Và ñã xác ñịnh ñược 4 ñột biến do mất ñoạn, 2 ñột biến ñiểm trong gen Wx
[93]. ðột biến do chèn các ñơn vị lặp lại cũng được tìm thấy ở allen của Wx-lineC,
wx1240 và wx-c. Trình tự lặp lại TCCA ở vị trí exon thứ 7 tìm thấy 2 lần trong
dạng đột biến Wx-lineC, ba lần ñối với wx1240 và wx-c [67]. Theo Bhattramakki
và cs (2002) các ñột biến chèn/mất ñoạn xảy ra thường xuyên ở locus waxy cũng có
thể được sử dụng là chỉ thị di truyền thông tin cao [30]. Liu và cs (2007) cũng xác
ñịnh ñược một loại ñột biến gen waxy do sự chuyển vị của gen aldehyde
dehydrogenase rf2 vào ñầu 3’ của locus waxy [64].
Những ñột biến ñiểm, chèn ñoạn hoặc mất đoạn tại các vị trí khác nhau trên
locus waxy dẫn ñến thay ñổi cấu trúc protein GBSS, do ñó sẽ ức chế sinh tổng hợp
amylose. Trong số hơn 50 đột biến locus waxy được tìm thấy cho đến nay, sẽ làm
cho hoạt tính của enzyme granule-bound starch synthase (GBSS) bị giảm từ 5-95%.
Trong đó, một vài đột biến là có ý nghĩa, làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme
GBSS và kết quả là mang kiểu hình ngơ nếp [44, 50].
Trong q trình chọn lọc tự nhiên đã tạo ra một số ñột biến gen lặn làm thay
ñổi chất lượng và hàm lượng tinh bột trong nội nhũ như: ðột biến gen amyloseextender1 (ae1) làm tăng hàm lượng amylose trong nội nhũ lên từ 50-80% [33]; ðột

biến sugary1 (su1) làm tăng hàm lượng ñường sucrose gấp 3 lần ngơ thường, giảm
hàm lượng amylopectin, tăng sự tích lũy của glucopolysaccaride phytoglycogen cao
gấp 10 lần ngô thường [44, 53]; ðột biến gen waxy (wx) ức chế sinh tổng hợp
amylose, làm cho tinh bột trong nội nhũ và hạt phấn cấu tạo bởi gần như là 100%
amylopectin [44, 50]. Giống như các loại rau thực phẩm khác, chất lượng ngô ngọt
và ngô nếp cũng bị ảnh hưởng bởi hàm lượng protein, thành phần axitamin, ñộ dày
vỏ hạt và một số ñặc tính khác.

8


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

1.2. VAI TRỊ CỦA CÂY NGÔ TRONG NỀN KINH TẾ
Trải qua hàng ngàn năm tiến hóa và phát triển thơng qua q trình chọn lọc
tự nhiên và nhân tạo, với đặc tính đa dạng di truyền rộng và khả năng thích nghi với
nhiều loại hình sinh thái, cho đến nay cây ngơ được trồng ở các châu lục trên thế
giới với vai trò là một trong những cây ngũ cốc quan trọng của loài người.
Ngô là cây lương thực nuôi sống 1/3 dân số thế giới. Tồn thế giới sử dụng
21% sản lượng ngơ làm lương thực. ðặc biệt nhiều nước ở Châu Phi, Châu Mỹ...
ngơ được làm lương thực chính (khoảng 85% sản lượng ngơ). Ngơ có chứa các chất
dinh dưỡng phong phú hơn lúa mì và gạo, ngồi ra ngơ cịn chứa hàm lượng
axitamin khơng thay thế tương đối cao: tryptophan, threonine, leucine,
tyrosine...[15, 16].
Những năm gần đây, ngơ cịn được sử dụng làm thực phẩm (ngơ rau, ngơ
nếp, ngơ đường...). Ngơ rau là một loại rau sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao.
Sản xuất ngô rau phát triển rất mạnh, mang lại hiệu quả cao ở Thái Lan, ðài Loan.
Các loại ngơ đường, ngơ nếp được dùng để ăn tươi như luộc, nướng hoặc đóng hộp

làm thực phẩm xuất khẩu [16].
Cây ngơ được dùng làm thức chăn ni quan trọng, hầu như 70% chất tinh
trong thức ăn tổng hợp là từ ngơ. Ngồi việc cung cấp chất tinh, cây ngơ cịn là thức
ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho ñại gia súc, đặc biệt là bị sữa [4].
Cùng với cơng dụng trên, ngơ cịn cung cấp ngun liệu cho các nhà máy sản
xuất các mặt hàng của ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm - dược phẩm và
công nghiệp nhẹ, ñặc biệt là nguyên liệu lý tưởng ñể sản xuất nhiên liệu sinh học.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG NGƠ NẾP
1.3.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng ngơ nếp trên thế giới
Tình hình nghiên cứu ngơ nếp trên thế giới
ðể tạo dịng thuần ngơ nếp, đa dạng về mặt di truyền các nhà khoa học ñã
dùng nguyên liệu ban ñầu là các giống nếp địa phương và nhập nội, sau đó bằng
9


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

phương pháp truyền thống thông qua tự phối và chọn lọc cá thể dựa vào nội nhũ và
các đặc tính nơng học. Ngồi ra, dịng ngơ nếp có thể được cải tạo từ các dạng ngô
thường bằng cách cho lai ngô nếp với ngô thường, sau đó trải qua q trình tự phối
và lai ngược (backross) ñược thực hiện luân phiên nhau. Sử dụng phương pháp này
sẽ tích lũy được tính trạng tốt của bố mẹ ñồng thời nâng cao tần suất gen quy định
tính trạng ngơ nếp (tránh mất đi gen lặn wx từ bố mẹ). Các gen lặn wx ñược xác
ñịnh bằng ñánh giá bề mặt bóng của hạt ở thế hệ tự thụ và xác định bằng phân tích
hạt phấn qua phản ứng với dung dịch KI/I2 [44]. Quá trình tạo dịng ngơ nếp có thể
được rút ngắn bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử (chỉ thị chọn lọc trong gen) ñể xác
ñịnh ngay ñược các cá thể mang kiểu gen dị hợp tử hay ñồng hợp tử (WxWx,
Wxwx và wxwx) từ quần thể phân ly của thế hệ F2 khi lai giữa dịng ngơ nếp và

dịng ngơ thường mà bỏ qua các thế hệ tự phối phân ly chọn lọc [64].
Như vậy, việc ứng dụng chỉ thị chọn lọc trong gen có ý nghĩa rất lớn trong
q trình chọn lọc từng cá thể mà không mất nhiều thời gian, cơng sức. Từ đó, giúp
cho nhà tạo giống có thể nhanh chóng xác định cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử
lặn ở ngay giai đoạn cây con mà khơng cần sự biểu hiện kiểu hình của nó ở giai
đoạn chín và thậm chí xác định được cá thể mang kiểu gen dị hợp tử. Vì vậy, có thể
loại bỏ cây con không mang gen lặn wx và tất cả các lỗ lực của việc chọn lọc cá thể
qua các giai ñoạn tự phối và lai ngược sẽ ñược dành cho sự đánh giá, chọn lọc các
chỉ tiêu nơng học khác.
Tình hình sản xuất và sử dụng ngơ nếp trên thế giới
Ngơ nếp được trồng ở nhiều nơi trên thế giới phổ biến ở vùng ðông và ðông
Nam Á, nhưng diện tích tập trung lớn nhất ở Mỹ với gần 290 nghìn ha mỗi năm,
chủ yếu là nếp vàng, một diện tích nhỏ là nếp trắng [8].
Ngơ nếp được trồng và phát triển gắn với lịch sử lâu dài của Trung Quốc.
Theo thông tin từ Hội nghị Ngô Châu Á lần thứ 9 tại Bắc Kinh, Trung Quốc ñã tạo
ra khá nhiều giống ngô nếp lai cho năng suất cao và chất lượng ngon như: nếp trắng
JYP101 (năng suất 15 tấn bắp tươi/ha), nếp tím Jingkenou218 (12 tấn bắp tươi/ha),

10


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

nếp trắng Jingkenou2000 (13 tấn bắp tươi/ha), nếp trắng Yahejin2006 (20 tấn bắp
tươi/ha)... [27]. Hiện nay, ở Trung Quốc có khoảng 901 giống ngơ nếp địa phương,
trong đó khoảng 80% được trồng ở Tây Nam Trung Quốc [63].
Nhờ tính chất đặc biệt mà ngơ nếp được sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau như: làm thực phẩm (ăn tươi, đóng hộp…) và chế biến tinh bột cho ngành

công nghiệp, làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Một số thử nghiệm ñã chỉ ra rằng sử
dụng 90% ngơ nếp trong chế độ ăn cho cừu non, bị non đem lại hiệu quả cao hơn
nhiều so với ngơ tẻ. ðối với bị cho con bú nếu sử dụng ngơ nếp trong chế độ ăn sẽ
làm tăng sản lượng sữa, còn khi thử nghiệm trên lợn sẽ làm tăng sản lượng thịt. Một
trong những nguyên nhân dẫn đến hiệu quả là do ngơ nếp biểu hiện gen opacque
nên sẽ có hiệu suất năng lượng và giá trị dinh dưỡng (hàm lượng axitamin không
thay thế lyzin và tryptophan) cao hơn so với ngô thường [37, 40, 76].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng ngơ nếp ở Việt Nam
Tình hình nghiên cứu ngơ nếp ở Việt Nam
Cũng như tình hình chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở nước ta
trước hết ở mức ñộ hình thái và những năm gần ñây ứng dụng chỉ thị phân tử trong
việc phân tích đa hình tập đồn dịng tập trung chủ yếu vào ngơ tẻ [2, 7, 11], cịn đối
với vật liệu ngơ nếp thì ít ñược quan tâm. Cho ñến nay chỉ có một số cơng trình
nghiên cứu về ngơ nếp phục vụ cho chương trình tạo giống ngơ nếp lai được cơng
bố như:
Ngơ Hữu Tình và cs (1990) đã nghiên cứu chọn tạo được giống ngơ nếp
trắng tổng hợp với năng suất trung bình 25-30 tạ/ha, có khả năng thích ứng rộng và
được cơng nhận giống quốc gia [13].
Nguyễn Hữu ðống và cs (1997) ñã nghiên cứu gây tạo ñột biến bằng tia
gamma kết hợp với xử lý diethylsunphat ở ngô nếp. Kết quả thu được một số dịng
biến dị có các đặc tính nơng học q so với giống ban đầu [6].

11


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

Phan Xuân Hào và cs, (2007) tiến hành đánh giá đặc điểm nơng sinh học,

ñánh giá ñộ thuần, ña dạng di truyền và khả năng kết hợp của 30 dịng ngơ nếp. Kết
quả xác định được 5 dịng nếp ưu tú có khả năng kết hợp chung cao và 6 tổ hợp lai
triển vọng phục vụ cho chương trình chọn tạo giống nếp lai Việt Nam [8].
Nguyễn Thị Nhài và cs (2009) ñã nghiên cứu chọn tạo ñược giống nếp lai số
1 ñạt năng suất trung bình 54,88 tạ/ha, có chất lượng ngon và thích ứng với nhiều
vùng sinh thái. Giống nếp lai số 1 đã được cơng nhận cho sản xuất thử [9].
Tình hình sản xuất và sử dụng ngơ nếp ở Việt Nam
Ở nước ta, ngơ nếp được phân bố ở khắp các vùng sinh thái, diện tích chiếm
gần 10% diện tích trồng ngô của cả nước với nhiều dạng màu hạt khác nhau: trắng,
vàng, tím, nâu, đỏ…
Trong thời gian qua, diện tích trồng ngơ nếp khơng ngừng tăng do nhu cầu
sử dụng sản phẩm này ngày càng nhiều, khơng những được dùng làm lương thực,
làm ñồ ăn tươi (nướng, luộc...) mà cịn được chế biến thành các món ăn được nhiều
người ưa chuộng như súp ngơ, snack ngơ,… đồng thời ngơ nếp ñáp ứng ñược nhu
cầu luân canh tăng vụ, mang lại hiệu quả cao cho người sản xuất. Hiện nay, giống
ngơ nếp địa phương có chất lượng ngon nhưng năng suất thấp, cịn giống ngơ nếp
lai nhập nội có độ ñồng ñều, năng suất cao, ñảm bảo chất lượng nhưng giá thành lại
rất cao (khoảng 10-15 USD/kg). Do đó, để ñáp ứng ñược nhu cầu tiêu dùng và giảm
bớt giá thành sản phẩm, ñặt ra cho các nhà chọn tạo giống ngơ Việt Nam nhanh
chóng tạo ra các giống ngơ nếp lai năng suất cao, chất lượng tốt áp dụng vào sản
xuất là rất cần thiết. Chính vì vậy, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học, đặc biệt là sử
dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền là cần thiết ñể hỗ trợ
cho phương pháp truyền thống góp phần rút ngắn được thời gian, cơng sức trong
cơng tác chọn tạo giống nhằm nhanh chóng xác ñịnh ñược các tổ hợp lai triển vọng
phục vụ cho chương trình tạo giống ngơ nếp lai.

12


Luận văn thạc sỹ


Nguyễn Thị Thu Hoài

1.4. SỰ ðA DẠNG DI TRUYỀN CÂY NGƠ
Cây ngơ biểu hiện tính đa dạng rất cao về đặc điểm hình thái và sinh lý. Sự
tồn tại lâu dài ñược tác ñộng rất nhiều bởi các thế hệ người gieo trồng ở các vùng
miền trên trái ñất ñã làm tăng mức ñộ khác biệt, tăng biên độ thay đổi các đặc tính
của cây ngơ. ða dạng di truyền của cây ngơ được thể hiện ở tất cả các tính trạng của
cây, bơng cờ và bắp, lồi phụ (ngơ đá, ngơ răng ngựa, ngơ nếp, ngơ ñường, ngô nổ,
ngô bột, ngô bọc). ðặc biệt sự biến ñộng lớn nhất ở cây ngô ñược thể hiện ở cấu
trúc nội nhũ của hạt, vì vậy, việc phân loại thực vật cây trồng này một phần dựa vào
ñặc ñiểm của hạt.
Sự khác biệt địa lý cụ thể là mơi trường sống khác nhau ñã dẫn tới sự biến
ñổi sâu sắc về mặt di truyền, hình thành nên sự khác biệt giữa các quần thể ngô ở
các vùng khác nhau. Sự khác biệt giữa các quần thể ngô biểu hiện qua các tính trạng
của kiểu hình chịu sự chi phối mạnh mẽ của khơng những kiểu gen, mơi trường mà
cịn phụ thuộc vào tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Cây ngơ thích nghi rộng
với nhiều vùng sinh thái khác nhau, dưới tác ñộng của chọn lọc tự nhiên và chọn lọc
nhân tạo trong điều kiện mơi trường biến đổi thì chỉ những kiểu gen thích ứng (biến
dị có lợi) mới tồn tại cịn những kiểu gen khơng thích ứng sẽ bị đào thải. Vì vậy, đã
hình thành nên các dạng ngơ đặc trưng cho mỗi vùng sinh thái. Dạng ngơ đá chiếm
ưu thế vùng Bắc bán cầu cịn dạng ngô răng ngựa lại phân bố chủ yếu ở Nam bán
cầu [26]. ðiều kiện sinh thái và tập quán canh tác khác nhau ở từng vùng đã hình
thành nên các quần thể ngô khác nhau về thời gian sinh trưởng, số lá, dạng hạt, khả
năng chống chịu, khả năng chịu hạn, chống ñổ, khả năng chống chịu với sâu hại
[45].
Ngun nhân chính của tính đa dạng di truyền cây ngơ là nhờ đặc điểm giao
phấn, kết hợp với những tác động của điều kiện sinh thái, thơng qua q trình chọn
lọc tự nhiên và nhân tạo, cây ngơ đã có sự đa dạng di truyền rất lớn và trở thành một
trong những cây trồng phổ biến nhất thế giới [16].


13


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

ða dạng di truyền có tầm quan trọng to lớn trong chọn tạo giống ngơ, đặc
biệt là trong chương trình tạo giống ngơ lai. Chính vì vậy, cây ngơ đã được thu thập,
mơ tả và bảo tồn rất tốt ở các trung tâm ña dạng di truyền. Hiện nay, trên thế giới ñã
thu thập và đang lưu giữ trên 15.000 mẫu giống ngơ, ở Việt Nam nguồn gen ngô tập
trung chủ yếu vào hai loại phụ: ngơ đá rắn và ngơ nếp. Trong tổng số 510 nguồn
ngơ địa phương được bảo tồn tại Viện nghiên cứu Ngơ có 157 nguồn ngơ nếp, trong
đó có 123 nguồn màu trắng, 17 nguồn vàng và 17 nguồn tím [8, 16].
1.5. CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI
TRUYỀN
ða dạng di truyền là kết quả của q trình biến đổi trong vật chất di truyền
sinh vật (sự thay ñổi của nucleotide, gen, nhiễm sắc thể hoặc tồn bộ gen sinh vật)
theo các con đường tự nhiên (lai, phân ly, tái tổ hợp, ñột biến tự nhiên...) hay tác
ñộng của con người (lai - chọn tạo giống, gây đột biến, chuyển gen...). Tất cả các
q trình này tạo nên sự biến ñổi trong gen và tần số allen, dẫn đến những thay đổi
trong kiểu hình của sinh vật.
Những thơng tin về đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn vật liệu
có vai trị, ý nghĩa hết sức quan trọng và là sức mạnh của công tác cải tạo giống cây
trồng. Từ những kết quả ñánh giá ña dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy
hoạch và bảo tồn các nguồn gen q, duy trì tính đa dạng sinh học hoặc khai thác,
hỗ trợ trong các chương trình chọn tạo giống thơng qua lựa chọn các cặp bố mẹ
nhằm thu ñược ưu thế lai cao nhất [29].
Việc nghiên cứu ña dạng di truyền ñã ñược thực hiện từ khá lâu với nhiều

phương pháp tiếp cận khác nhau, thơng qua các đặc điểm kiểu hình (chỉ thị hình
thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt trong ADN
(chỉ thị ADN). Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu - nhược ñiểm cũng như khả năng
ñánh giá mức ñộ ña dạng di truyền khác nhau. Trong ñó, chỉ thị hình thái được sử
dụng sớm nhất và là cơ sở ban ñầu trong ñánh giá phân loại thực vật, còn chỉ thị

14


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hồi

ADN hiện nay được sử dụng rộng rãi trong ñánh giá ña dạng di truyền, là công cụ
hữu hiệu trong công tác chọn tạo giống cây trồng.
1.5.1. Chỉ thị hình thái
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái là phương pháp đánh
giá thơng qua các đặc điểm về hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ
phận...). Với ưu ñiểm là dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, mà khơng địi hỏi thiết bị
đặc biệt đắt tiền cũng như quy trình thực hiện phức tạp. Hiện nay, phương pháp này
vẫn ñược sử dụng phổ biến và khá hiệu quả trên ñối tượng cây trồng ñể giúp các
nhà nghiên cứu nhận biết và phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường một
cách nhanh chóng. Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị hình thái trong phân tích đa
hình có những hạn chế: (1) Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn lại chịu tác động
rất lớn của mơi trường cũng như phụ thuộc vào giai ñoạn nhất ñịnh của q trình
phát triển cá thể. (2) Việc đánh giá mang tính chất thống kê nên cần phải thực hiện
với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác. (3) Có nhiều tính trạng do đa gen quy
định mà khơng phải tồn bộ các gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá
được. Cùng với sự ra ñời và phát triển mạnh mẽ của ứng dụng chỉ thị phân tử, thì
chỉ thị hình thái vẫn được cho là khơng thể thiếu trong nghiên cứu đa dạng di truyền

và phân loại thực vật, phục vụ cho công tác lưu giữ, bảo tồn sự ña dạng của nguồn
gen thực vật [56].
1.5.2. Chỉ thị sinh hóa
Chỉ thị sinh hóa được phát hiện nhờ phương pháp isozyme, dựa trên cơ sở
gen quy ñịnh sinh tổng hợp protein. Isozyme là các enzyme có trình tự amino acid
khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một kiểu phản ứng hóa học. Về mặt di truyền có
thể chia isozyme thành hai dạng là isozyme đơn gen (các isozyme này chịu sự kiểm
soát của một gen) và isozyme đa gen (các isozyme được mã hóa bởi hai hay nhiều
gen). Do số lượng chỉ thị isozyme không nhiều và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc
vào giai ñoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể nên các chỉ thị isozyme ñược ứng
dụng tương ñối hạn chế trong đánh giá đa dạng di truyền và phân nhóm ưu thế lai.

15


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

1.5.3. Chỉ thị phân tử ADN
Trong những năm gần ñây, hệ thống chỉ thị như RFLP, RAPD, AFLP, SSR,
SNP... ñược phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo giống cây trồng, ñặc biệt
ñược sử dụng phổ biến trong nghiên cứu ña dạng di truyền ngũ cốc (bảng 1.1).
Bảng 1.1: So sánh các hệ thống chỉ thị phân tử ADN ñược sử dụng phổ biến
nhất trong nghiên cứu ña dạng di truyền ngũ cốc [3, 58, 75].
ðặc tính

RFLP

RAPD


AFLP

SSR

SNP

Khơng

Có

Có

Có

Có

10

0,02

0,5-1

0,05

0,05

Cao

Cao


Thay đổi
base đơn,

Thay đổi
base đơn,

TB

Cao

Cao

ðồng trội

Trội

Trội

Mức độ sử dụng

Khó

Dễ

Dễ

Tự động hóa

Thấp


Khả năng lặp lại

Cao

Thấp

Chi phí phát triển

Cao

Chi phí mỗi phân tích

Cao

Dựa trên PCR
Nồng độ ADN (µg)
Chất lượng ADN

Loại đa hình

Mức độ đa hình
Tính di truyền

Trung bình Trung bình

Cao

Thay đổi Khác nhau
base đơn, chiều dài Thay đổi

chèn, mất, chèn, mất, chèn, mất, ñoạn lặp base ñơn
lại
ñảo ñoạn ñảo ñoạn ñảo ñoạn
Cao

Cao

ðồng trội ðồng trội
Dễ

Dễ

Cao

Cao

Cao

Cao

Cao

Thấp

Trung bình

Cao

Cao


Thấp

Trung bình

Thấp

Thấp

Trung bình Trung bình

Các chỉ thị có đặc tính khác nhau, nhưng đều có đặc điểm chung là: Khơng
chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố mơi trường cũng như các giai đoạn sinh trưởng và
phát triển của cá thể; Liên kết với các tính trạng trội và siêu trội; Có tính ổn định
cao, di truyền qua các thế hệ [3].
Chỉ thị phân tử ADN có thể được chia làm 3 nhóm chính: (1) chỉ thị dựa trên
cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP); (2) chỉ thị dựa trên phản ứng PCR (RADP, AFLP...);
(3) chỉ thị dựa trên các trình tự lặp lại (vệ tinh-Satellite, tiểu vệ tinh-minisatellite, vi
vệ tinh-microsatellite).

16


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thị Thu Hoài

Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Sự khác nhau về chiều dài của các phân ñoạn ñược tạo ra bởi enzyme giới
hạn ñối với phân tử ADN của hệ gen. Sự đa hình của ñoạn cắt giới hạn xảy ra nhờ
các ñột biến như: ñột biến ñiểm, ñột biến thêm/mất ñoạn ADN hay sự sắp xếp lại

đoạn trong q trình phân ly-tái tổ hợp. Những biến đổi này làm thay đổi vị trí nhận
biết của các enzyme giới hạn, do đó sẽ tạo ra phân đoạn ADN có kích thước khác
nhau, và có thể nhận biết ñược những phân ñoạn ADN này bằng kỹ thuật lai ADN
với mẫu dị đánh dấu phóng xạ.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội ñược sử dụng phổ biến trong tạo giống cây
trồng với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng
đơn gen, phân tích đa hình di truyền. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là
tốn nhiều thời gian, cơng sức, thực hiện phức tạp, độc hại do sự dụng chất phóng xạ
và địi hỏi ADN chất lượng cao. ðối với cây ngơ, chỉ thị RFLP được sử dụng ñể xây
dựng bản ñồ di truyền tính trạng số lượng cho tính chịu hạn [22]; ðánh giá sự đa
dạng di truyền và xác ñịnh mối quan hệ di truyền giữa các nguồn vật liệu, phân
nhóm ưu thế lai [46].
Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân ngẫu
nhiên. Ngun lý của phương pháp RAPD là sử dụng những ñoạn mồi đơn khoảng
9-10 nucleotide sắp xếp theo trình tự ngẫu nhiên làm mồi cho phản ứng PCR [92,
95]. ðây là một trong những phương pháp tương ñối hiệu quả ñể xác định tính đa
hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể trong cùng lồi. Ưu điểm của phương pháp
này là khơng cần biết trước trình tự sắp xếp của các nucleotide trên đoạn ADN cần
nhân bản, quy trình thực hiện nhanh, phát hiện rõ ràng, giá thành rẻ, tiến hành trên
mẫu lớn. Tuy nhiên do ñặc ñiểm ngẫu nhiên của mồi RAPD, sử dụng mồi gắn (chỉ
10 nucleotite) nên độ chính xác kém, khơng ổn định thường có sự sai khác giữa
những lần nghiên cứu [70]. Mặc dù vậy, một số kết quả nghiên cứu ñã chỉ ra rằng

17