Luận văn thạc sỹ khoa học

NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYM NATTOKINAZA SINH RA
BỞI CHỦNG BACILLUS SUBTILIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2009-2011
Hà Nội – 2011

Nguyễn Thị Hồng Ngân

1

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

---------------------------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NGÂN

TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYM NATTOKINAZA SINH RA
BỞI CHỦNG BACILLUS SUBTILIS

Chuyên ngành :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN LAN HƯƠNG

Hà Nội – 2011

LỜI CẢM ƠN
Nguyễn Thị Hồng Ngân

2

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học


Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lan Hương – Giảng viên Bộ mơn
Cơng nghệ sinh học, người đã có nhiều cơng sức tận tình hướng dẫn, theo dõi sát sao và
đóng góp những ý kiến q báu cho tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội, tập thể cán bộ Viện Đào tạo và Bồi dưỡng Sau Đại học, Viện công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách Khoa Hà nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn đúng tiến độ.
Tôi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè đã ln cổ vũ, động viện và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, ngày 29 tháng 11

năm

2011
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Ngân

Nguyễn Thị Hồng Ngân

3

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khóa học mà bản thân tôi đã trực
tiếp thực hiện. Tất cả các số liệu kết quả trình bầy trong luận văn là trung thực khách quan

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
``````````````````````
Hà Nội, ngày 29

tháng 11

năm 2011

Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Hồng Ngân

Nguyễn Thị Hồng Ngân

4

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ............................................................. 7
CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 11
T
2
3

32T


T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

32T

T
2
3

1.1. Bệnh tim mạch .................................................................................................... 11
1.2. Đậu tương............................................................................................................ 12
1.3. Natto .................................................................................................................... 14
1.3.1 Hiệu quả dinh dưỡng của Natto-thực phẩm chức năng .............................. 14
1.3.2 Ngăn ngừa chứng tim mạch bằng Natto: an toàn và rẻ nhất ...................... 15
1.4. Enzym Nattokinaza............................................................................................. 16
1.4.1 Cấu trúc của Nattokinaza ............................................................................. 16
1.4.2 Cơ chất của enzym nattokinaza.................................................................... 16
1.4.3 Cơ chế tác dụng của enzym nattokinaza ...................................................... 17

1.4.3.1 Q trình đơng máu và hịa tan các cục máu đơng ............................... 17
1.4.3.2 Cơ chế tác dụng của nattokinaza [23].................................................... 19
1.4.4. Nguồn vi sinh vật tổng hợp enzym Nattokinaza ......................................... 19
1.4.5 Đặc điểm hóa sinh của enzym thủy phân fibrin từ vi sinh vật [63] ............. 22
1.5. Sản xuất các enzym thủy phân fibrin từ nguồn vi sinh vật ............................... 24
1.5.1 Các phương pháp lên men thu nhận Nattokinaza ....................................... 25
1.5.1.1 Phương pháp lên men bề mặt ................................................................ 25
1.5.1.2 Phương pháp len men lỏng .................................................................... 26
1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym nattokinaza ...... 27
1.5.3 Đặc điểm của chế phẩm natto tạo ra từ các phương pháp lên men ............ 31
1.5.4 Các phương pháp tách chiết và thu nhận enzym ......................................... 33
1.5.4.1. Phương pháp chiết enzym từ canh trường lên men bề mặt ................. 33
1.5.4.2 Phương pháp ly tâm ............................................................................... 34
1.5.4.3 Phương pháp thu nhận enzym ............................................................... 34
1.5.4.3.1 Phương pháp kết tủa ....................................................................... 35
1.5.4.3.2 Phương pháp lọc .............................................................................. 36
1.5.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu nhận enzym nattokinaza.............. 37
1.6. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nattokinaza trên thế giới và ở Việt
Nam ............................................................................................................................ 38
T
2
3

32T

T
2
3

32T


T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T

2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T
2
3

32T


T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T

2
3

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3


T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3


32T

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 42
T
2

3

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất................................................................................. 42
2.1.1 Nguyên liệu .................................................................................................... 42
2.1.2 Hóa chất......................................................................................................... 42
2.2 Thiết bị sử dung ................................................................................................... 42
2.3 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 42
2.3.1 Phương pháp vi sinh ..................................................................................... 42
2.3.2 Phương pháp hóa sinh .................................................................................. 43
2.3.2.1 Định tính hoạt tính nattokinaza bằng phương pháp đo vịng thủy phân
............................................................................................................................ 43
2.3.2.2 Định lượng nattokinaza bằng phương pháp so mầu ............................. 43
2.3.2.3 Phương pháp điện di SDS-PAGE .......................................................... 44
2.3.2.4 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.................. 45
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu............................................................................. 46
T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T

2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3


T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

T

2
3

T
2
3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 48
T
2
3

Nguyễn Thị Hồng Ngân

T
2
3

5

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học
3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinaza cao .............................. 48
3.2 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến khả năng sinh tổng hợp nattokinaza... 49
3.2.1 Lựa chọn nguyên liệu đậu thích hợp cho q trình sinh tổng hợp
nattokinaza............................................................................................................. 49
3.2.2 Phân tích thành phần hóa học của đậu tương ............................................. 51
3.2.3 Ảnh hưởng của vỏ đậu và phương pháp lên men đến khả năng sinh tổng

hợp NK ................................................................................................................... 51
3.4. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp NK
của chủng D. .............................................................................................................. 54
3.4.1 Ảnh hưởng của lượng dịch và hàm lượng đậu tương .................................. 54
3.4.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên khả năng sinh tổng hợp NK. ................... 55
3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp NK........ 56
3.4.4 Ảnh hưởng của các muối khoáng lên khả năng sinh tổng hợp NK. ............ 57
3.4.4.1 Ảnh hưởng của CaCl 2 lên khả năng sinh tổng hợp NK của chủng D... 57
3.4.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 ....................................................... 58
3.4.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 .......................................................... 59
3.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ................................................................................ 59
3.4.6 Ảnh hưởng của phương pháp xử lý nhiệt bột đậu tương ............................ 60
3.5 Lên men chìm sinh tổng hợp nattokinaza ở quy mơ phịng thí nghiệm ..................... 60
3.5.1 Động thái sinh sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp nattokinaza của chủng
Bacillus subtilis natto D quy mơ bình tam giác ........................................................... 60
3.5.2 Lên men ở quy mơ 2 lít ................................................................................. 62
3.6 Tách chiết và thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp bởi chủng D theo
phương pháp lên men chìm. ...................................................................................... 62
3.6.1. Thu dịch enzym thơ...................................................................................... 62
3.6.2 Kết tủa enzym ............................................................................................... 62
3.6.3 Thu nhận chế phẩm kỹ thuật........................................................................ 63
3.7 Tách chiết và thu nhận enzym nattokinaza sinh tổng hợp bởi chủng M1 theo
phương pháp lên men bề mặt. ................................................................................... 64
3.7.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất enzyn ............................................. 64
3.7.2 Tối ưu điều kiện tách chiết ........................................................................... 65
3.7.3 Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ phương pháp lên men bề mặt bởi
chủng M1 ............................................................................................................... 72
3.8. Một số đặc điểm của chế phẩm nattokinaza ...................................................... 72
3.8.1 pH thích hợp cho enzyme hoạt động ............................................................ 72
3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động ................................................... 73

3. 8.3. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm thu được bằng SDS-gel. .................. 74
KẾT LUẬN ................................................................................................................ 75
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 75
T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T
2
3

T

2
3

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3


T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

R

R

T
2
3

32T

R


32T

R

T
2
3

R

R

R3
T
2

R3
T
2

T
2
3

T
2
3

T

2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3


32T

T
2
3

32T

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3


T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T

T
2
3

T
2
3


T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

T
2
3

32T


T
2
3

32T

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 76
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 83
T
2
3

T
2
3

32T

32T

Nguyễn Thị Hồng Ngân

6

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ

Bảng 1.1 Mối nguy hiểm của bệnh tim mạch ................................................................... 11
Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng của 100 g đậu tương ............................................................ 13
Bảng 1.4.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzym fibrinaza ........................................ 20
Bảng 1.4.4.2 Các chủng thuộc loài Bacillis phân lập từ các nguồn thực phẩm.................. 21
Bảng 1.4.5 Đặc điểm hóa sinh của các enzym thủy phân fibrin có nguồn gốc từ vi sinh vật
[47] ................................................................................................................................. 23
Bảng 1.5.2 Thành phần và điều điện lên men của một số chủng ....................................... 28
Bảng 1.6 Giá một số chế phẩm nattokinaza trên thị trường .............................................. 41
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn ........................ 48
Bảng 3.2.2 Một số thành phần hóa học cơ bản của đậu tương .......................................... 51
Bảng 3.6 Thu hồi enzym nattokinaza thô bằng phương pháp kết tủa bằng muối amon sulfat
........................................................................................................................................ 63
Bảng 3.7.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng thu nhân enzym nattokinaza ............. 65
Bảng 3.7.2.1 Giá trị mã hóa và thực nghiêm .................................................................... 66
Bảng 3.7.2.2 Thiết kết và kết quả thí nghiệm ................................................................... 67
Bảng 3.7.2.3 Bảng phân tích hồi quy hoạt lực nattokinaza sau kết tủa .............................. 68
U
T
2
3

T
2
3
U

U
T

2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T

2
3

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2

3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T

2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

Hình 1.3 Natto lên men từ đậu tương ............................................................................... 14
Hình 1.4.1 Cấu trúc tâm hoạt động của enzym nattokinaza .............................................. 16

Hình 1.4.3.2 Có chế tác dụng của enzym nattokinaza lên fibrin ....................................... 19
Hình 2.1 Bố trí các điểm trên mơ hình CCD .................................................................... 46
Hình 2.2 Bố trí các điểm trên các loại CCD trong RSM ................................................... 47
Hình 3.1 Khả năng sinh tổng hợp enzym nattokinaza của các chủng vi khuẩn ................. 49
Hình 3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp NK của các chủng vi khuẩn trên các loại đậu khác nhau
........................................................................................................................................ 50
Hình 3.2 Ảnh hưởng của vỏ và phương pháp lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzym
nattokinaza của hai chủng M1, D. .................................................................................... 52
Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của chủng D trên mơi trường nhân giống.................... 53
Hình 3.4 Ảnh hưởng của lượng dịch và lượng đậu lên khả năng sinh tổng hợp NK......... 54
Hình 3.4.1 Ảnh hưởng của lượng dịch đến khả năng sinh tổng hợp enzym NK ................ 55
Hình 3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzym NK ............................ 56
Hình 3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ bổ sung ............................................................. 57
Hình 3.4.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng CaCl 2 ................................................................ 58
Hình 3.4.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 ............................................................. 58
Hình 3.4.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng K 2 HPO 4 ........................................................... 59
Hình 3.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung ............................................................... 59
Hình 3.4.6 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt bột đậu tương ....................................................... 60
Hình 3.5.1 Đường cong sinh trưởng và sinh tổng hợp nattokinaza của chủng D trong bình
tam giác........................................................................................................................... 61
Hình 3.7.2.1 Biến mã hóa ................................................................................................ 69
Hình 3.7.2.2 Đường đồng mức của hoạt lực..................................................................... 70
Hình 3.7.2.3 Bề mặt đáp ứng của hoạt lực ....................................................................... 70
Hình 3.8.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt lực nattokinaza của chế phẩm ............................ 73
Hình 3.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho chế phẩm nattokinaza hoạt động ................................ 73
Hình 3.8.3 Hình ảnh điện di của các enzyme ................................................................... 74
U
T
2
3


T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3


T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3


T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

U
T
2
3

T
2
3
U


U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U


U
T
2
3

R
U

R3
T
2

U
T
2
3

R
U

U
T
2
3

R
U

RU


R3
T
2

R
U

U
T
2
3

R3
T
2

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3

U

U
T
2
3

U
T
2
3

32T
U

U
T
2
3

U
T
2
3

T
2
3
U


T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3

T
2
3
U

U
T
2
3


Nguyễn Thị Hồng Ngân

T
2
3
U

7

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
NK

Nattokinaza

WHO

World health organization

CVDs

Cardiovascular deaseas

t-PA

Tissue plasminogen activator


SDS

Sodium dodecyl sulfate

Tris-HCl
SDS-PAGE

Tris(hydroxymethyl)aminomethane
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Ser

Serin

His

Histidin

Asp

Aspartic

pI

Point isoelectric

FU

Fibrin degradation unit


TCA
EDTA

Triclorua axetat
Ethylenediaminetetraacetic acit

Nguyễn Thị Hồng Ngân

8

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

MỞ ĐẦU
Công nghệ enzym đang hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho nhiều ngành như
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y tế, dược… Trên thế giới, việc nghiên cứu
và ứng dụng enzym trong sản xuất đã được triển khai từ lâu. Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu công nghệ Enzym tuy đã được triển khai ở nhiều nơi, nhưng nhìn chung,
những nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mơ phịng thí nghiệm, số ít ở quy mô thử
nghiệm. Về ứng dụng, nhiều doanh nghiệp vẫn chưa mặn mà với việc ứng dụng
công nghệ enzym. Nguyên nhân là khi thay đổi công nghệ nghĩa là địi hỏi đầu tư về
vốn - điều mà khơng phải doanh nghiệp nào cũng đáp ứng được. Để công nghệ này
được ứng dụng rộng rãi, địi hỏi cần phải có sự liên kết giữa các trường, các viện
nghiên cứu và doanh nghiệp trong nước để cho ra đời những sản phẩm công nghệ
giá thành phù hợp với doanh nghiệp Việt Nam.
Nattokinaza là một enzym hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền
thống của Nhật Bản đã hàng nghìn năm nay có tên là Natto (có nghĩa là đậu nành

lên men). Đây là một loại gia vị dân gian và là một phương thuốc cổ truyền chữa
bệnh tim mạch. Hạt đậu nành nấu chín được ủ ấm với Bacillus subtillius sau khi lên
men sẽ tạo enzym Nattokinaza. Bác sỹ Hyroyuki Sumi đã nghiên cứu trong thời
gian dài các Enzym hoạt huyết và khám phá ra Nattokinaza vào năm 1980 khi ơng
đang giảng dạy tại khoa Hóa Sinh trường Đại học Chicago. Ông nghiên cứu 173
loại thực phẩm tự nhiên có hoạt tính hoạt huyết trên thế giới, chỉ Nattokinaza mới
có tác dụng kép vừa phịng vừa làm tan huyết khối (cục máu đơng) đã hình thành
với hiệu quả mạnh và kéo dài, hơn nữa lại khơng có bất cứ tác dụng phụ nào. Hiện
nay ở một số nước như Nhật, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng ở nhiều thực phẩm lên men truyền thống khơng chỉ natto như Tofuyo,
Chungcook-jang, Douchi cũng có khả năng phịng và chữa bệnh tim mạch vì chúng
chứa các vi khuẩn sinh enzym nattokinaza.
Trên thế giới, nattokinaza đã được đưa vào sản xuất thương mại và mang lại lợi
ích kinh tế rất đáng kể. Vào năm 1998, công ty Japan Bio Science laboratory Co.
Ltd là công ty đầu tiên trên thế giới tách chiết và tung ra thị trường sản phẩm
Nguyễn Thị Hồng Ngân

9

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Nattokinaza NSK SD và sau đó mở rộng và phát triển sang các thị trường Mỹ, châu
Âu, Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc. NSK SD chiếm tổng lượng và thị phần
nattokinaza lớn nhất thế giới. Công ty Contex Life Science (Đài loan) cũng đã sản
xuất với năng suất 30 tấn/năm đã bán cho 24 quốc gia và lãnh thổ. Ở trong nước
hiện nay, nhu cầu và mức độ tiêu thụ đang ngày càng tăng do các bệnh tim mạch có
xu hướng tăng cao, theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm có khoảng trên 100 nghìn

người mắc phải vấn đề về tim mạch. Tuy nhiên nguồn nattokinaza chủ yếu nhập
khẩu của nước ngoài nên giá thành tương đối cao.
Để đáp ứng nhu cầu đặt ra là tìm ra một quy trình tách chiết và thu hồi tối ưu
enzym này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách chiết và tinh sạch enzym
nattokinaza sinh ra bởi chủng Bacillus subtilis”.

Nguyễn Thị Hồng Ngân

10

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh tim mạch
Các bệnh tim mạch do sự dối loạn về tim và mạch máu, bao gồm: bệnh tim mạch
vành - bệnh của các mạch máu cung cấp cho cơ tim; bệnh mạch máu não - bệnh của
các mạch máu cung cấp cho não; bệnh động mạch ngoại biên - bệnh của các mạch
máu cung cấp các cánh tay và chân; bệnh tim thấp khớp - thiệt hại cho cơ tim và
van tim do sốt thấp khớp, gây ra do vi khuẩn liên cầu khuẩn; bệnh tim bẩm sinh - dị
tật tim cấu trúc hiện tại khi sinh; huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc phổi - cục
máu đông trong các tĩnh mạch ở chân, có thể đánh bật và di chuyển đến tim và phổi.
Theo báo cáo mới đây nhất năm 01/2011 của tổ chức WHO [29], Các bệnh
đường tim mạch (Cardiovascular deaseas (CVDs)) là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên thế giới, ước tính khoảng 17,1 triệu người chết vì bệnh CVDs vào

năm 2004, chiếm 29% các ca tử vong trên thế giới. Trong đó, ước tính khoảng 7,2
triệu người là là do bệnh vành tim và 5,7 triệu do đột quỵ. Trong đó 82% các ca tử
vong do bệnh tim mạch diễn ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình và xuất
hiện cân bằng ở cả nam giới và nữ giới. Tính đến năm 2030, sẽ có khoảng 23,6 triệu
người bị chết vì bệnh tim mạch, chủ yếu do bệnh tim và đột quỵ. Số lượng ca lớn
nhất xuất hiện ở vùng Đông Nam Á.
Ở Việt Nam, theo điều tra của Viện tim mạch - bệnh viện Bạch Mai, bệnh tim
mạch là bệnh có nguy cơ gây tử vong cao. Năm 1980, bệnh tim mạch là bệnh gây tử
vong cao đứng hàng thứ tư, cịn từ năm 2000 thì bệnh này gây tử vong hàng đầu.
Bảng 1.1 Mối nguy hiểm của bệnh tim mạch [13]
0T

T
0

T
0

Theo các năm

Hàng đầu

Thứ hai

Thứ ba

Thứ tư

1980


Nhiễm khuẩn

Sơ sinh

Ung thư

Tim mạch

1990

Nhiễm khuẩn

Tim mạch

Ung thư

Sơ sinh

2000

Tim mạch

Ung thư

Các nguyên nhân khác

Nhiễm khuẩn

Trong thập kỷ gần đây nhất, các biến chứng của bệnh tăng huyết áp và các bệnh
có liên quan đã trở thành nổi bật, thường ở lứa tuổi 50 trở lên, và xu hướng trẻ dưới

lứa tuổi đó ngày càng rõ (30-40 tuổi).
Nguyễn Thị Hồng Ngân

11

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Nguyên nhân của các bệnh tim mạch phần lớn do sự mất cân bằng giữa hai q
trình: q trình đơng tụ máu và q trình hịa tan các cục máu đơng. Trong đó, tác
nhân gây đơng tụ máu chính là các khối fibrin hình thành từ fibrinogen dưới tác
dụng của thrombin. Quá trình làm tan các cục máu đông phụ thuộc vào hoạt động
của plasmin duy nhất trong cơ thể có tác dụng này và nó được hoạt hóa bởi nhân tố
hoạt hóa plasminogen của mơ [65]. Trong điều kiện sức khỏe bình thường, lượng
enzym plasmin sinh ra có khả năng làm tan hết các cục máu đông trong mạch máu
hoặc trong tim. Ngược lại, khi lượng plasin sinh ra không đủ để làm tan hồn tồn
các cục máu đơng, các cục máu này sẽ tích tụ dần trong tim và mạch máu, làm cho
kích thích lưu thơng của máu trong mạch giảm, giảm sự troa đối O 2 và CO 2 giữa
R

R

R

R

máu và các bộ phận khác dẫn tới cao huyết áp và hàng loạt bệnh tim mạch khác [65].
Đứng trước sự nguy hiểm của căn bệnh này, trong suốt các thập niên gần đây,

các nhà khoa học đã thực hiện nhiều cơng trình nghiên cứu để tìm ra giải pháp
phịng và chữa các loại bệnh tim mạch. Một trong những nghiên cứu đó đã chỉ ra
rằng các thực phẩm lên men truyền thống ở châu Á như natto, Tofuyo của Nhật và
Chungcook-jang của Hàn Quốc… khơng chỉ có giá trị dinh dưỡng mà cịn có tác
dụng phịng và chữa bệnh. Đây cũng là một trong những nguyên nhân làm cho tuổi
thọ trung bình của người dân ở những nước này khá cao.
1.2. Đậu tương
Trong hạt đậu tương có các thành phần hóa học sau: protein (40%), lipip (1225%), glucid (10-15%), các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A,
B1, D, E, F, các enzym, sáp, nhựa, xellulose [5, 7]. Hàm lượng protein cao trong
đậu tương cũng như nhiều hợp chất có giá trị khiến đậu tương trở thành một trong
những thực phẩm quan trọng trên thế giới.
Hạt họ đậu nói chung chưa hồn tồn cân đối về axit amin, trong đó, glutamic,
cystein và methionie thường thiều, tuy nhiên trong đậu có đủ các axit amin cơ bản
như isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu
tương được coi là một nguồn cung cấp protein hồn chỉnh vì chứa một lượng đáng
kể các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể.

Nguyễn Thị Hồng Ngân

12

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Bảng 1.2 Giá trị dinh dưỡng của 100 g đậu tương [Cơ sở dữ liệu USDA]
0T

T

0

Năng lượng

1,866 kJ (446

Protein

36,49 g

kcal)
Các bon hyđrát

30,16 g

Tryptophan

0,591 g

Đường

7,33 g

Threonine

1,766 g

Chất xơ thực phẩm

9,3 g


Isoleucine

1,971 g

Chất béo

19,94 g

Leucine

3,309 g

Chất béo no

2,884 g

Lysine

2,706 g

Chất béo không no

4,404 g

Methionine

0,547 g

Chất béo không no đa


11,255 g

Cystine

0,655 g

Vitamin A equiv,

1 μg (0%)

Phenylalanine 2,122 g

Vitamin B6

0,377 mg (29%)

Tyrosine

1,539 g

Vitamin B12

0 μg (0%)

Valine

2,029 g

Vitamin C


6,0 mg (10%)

Arginine

3,153 g

Vitamin K

47 μg (45%)

Histidine

1,097 g

Can xi

277 mg (28%)

Alanine

1,915 g

Sắt

15,70 mg (126%)

Axít aspartic

5,112 g


Ma giê

280 mg (76%)

Axít glutamic 7,874 g

Phốt pho

704 mg (101%)

Glycine

1,880 g

Ka li

1797 mg (38%)

Proline

2,379 g

Muối ăn

2 mg (0%)

Serine

2,357 g


Thiếc

4,89 mg (49%)

Nước

8,54 g

đơn

Chính vì thành phần dinh đưỡng dồi dào mà đậu tương được chọn làm môi trường
để nuôi cấy vi sinh vật và không cần bổ sung thêm bất kỳ chất nào nữa. Môi trường
đậu tương thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzym.
Vỏ của hạt đậu tương là một thành phần đáng quan tâm vì nó chứa nhiều chất
khống mà theo nhiều nghiên cứu thì các chất này đóng vai trị quan trọng trong

Nguyễn Thị Hồng Ngân

13

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

hiệu quả tổng hợp nattokinaza của chủng Bacillus subtilis khi lên men trên môi
trường đậu tương [6, 58]
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của đậu tương (% chất khơ) [5]
Chất khơ


Protein

Xơ

Khống

Lipit

Hạt có vỏ

91.2

26.4

19

7.2

11

Hạt khơng vỏ

95.8

42.9

4.9

5.2


20.4

Vỏ

89.8

7.8

44

7

0.8

1.3. Natto
Natto là chữ ghép của Nat (nộp) và To (đậu) với nghĩa là “đậu nành lên men" đã
xuất hiện ở Nhật vào năm 1068. “Natto” là những hạt đậu nành đã luộc chín được ủ
với vi khuẩn (Bacillus natto). Là một món ăn dân dã rất phổ biến ở nơng thôn Nhật
bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương với rong biển phơi khô (Nori)
và trứng gà sống. Natto có mùi, nhớt, ẩm bao phủ bởi các sợi tơ màu trắng. Từ
trước đến nay, có nhiều thức ăn từ đậu nành lên men như các loại Tương (miso),
Chao .. . bằng những chủng nấm mốc như Aspergillus, Rhozipus hay Actinomucos
nhưng chỉ có Natto là lên men từ vi khuẩn Bacillus subtilis có trong rơm rạ và được
gọi phổ biến là Bacillus
Natto

Hình 1.3 Natto lên men từ đậu tương
1.3.1 Hiệu quả dinh dưỡng của Natto-thực phẩm chức năng
Khuynh hướng ngày càng tiêu thụ sản phẩm Natto vì tin rằng Natto không

những là thức ăn rẽ tiền dễ tiêu, nhiều protein và không gây hại như các loại thực
phẩm chế biến công nghiệp (ăn liền) mặc dù mùi “hương” của natto vẫn gây khó
chịu, cực kỳ khó ngửi. Đây cũng là điểm yếu mà các nhà sản xuất thực phẩm ra sức
Nguyễn Thị Hồng Ngân

14

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

khắc phục bằng cách pha trộn với hạt dẻ (1) hun khói, sấy khơ với cám lúa mạch
(2), thêm calci (3) Natto với loại rong tảo giàu Vitamin B-12 hay (5) Pha trộn Natto
và gạo lức. [27]
Đã có những phát biểu đánh giá khá tích cực của giới chuyên môn vào những
năm cuối và thập kỷ 1970 như nghiên cứu của GS Kameda - ĐH Y khoa Kanazawa
về hiệu quả ngăn ngừa nhiễm độc, tế bào ung thư, kim loại nặng của natto trên cơ
thể chuột hay như tổng kết của GS Ohta thuộc viện nghiên cứu Thực phẩm quốc gia
(Nhật Bản) rằng” có nhiều chứng cớ qua nghiên cứu cơ bản cho thấy hiệu quả của
natto như ngăn ngừa bệnh kiết lỵ, tiêu chảy và nhiễm độc đường ruột hay giảm béo
…giữa các nhà chun mơn mặc dù cho dến nay vẫn cịn nhiều tranh cãi” nhưng rõ
ràng là người ăn natto không bị đầy hơi, trướng bụng như khi ăn các loại đậu khác,
có nghĩa là enzym natto có khả năng là một hoạt chất có ích khơng thể phủ nhận. [27]
1.3.2 Ngăn ngừa chứng tim mạch bằng Natto: an toàn và rẻ nhất
Giá 1 liều Urokinaza, thuốc làm tan vón máu rất đắt tiền, khoảng 1,500
USD/liều và chỉ hữu hiệu trong vòng 30 phút hay sử dụng thuốc t-PA có hiệu quả
trong 3-6 giờ và có giá lên đến 2,200 USD/liều , rẻ nhất cũng là 200USD/liều nếu
dùng Streptokinaza hiệu quả trong vòng 12 tiếng trong khi 100 gr Natto chỉ là 1
USD có cùng hiệu quả tương đương kéo dài 8-12 tiếng dồng hồ và an tồn vì Natto

ít có phản ứng phụ như Urokinaza [27].
Những thành quả của TS. Sumi Hiroyuki cũng đã được hai vị chuyên gia ở hai
khu vực khác nhau phối hợp nghiên cứu, đó là BS. Martin Milner ở Trung tâm Y
khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa kỳ) và TS. Kouhei Makise thuộc bệnh
viện Makise ở Kyoto, cùng công bố kết quả qua bài viết trên tạp chí chun mơn kết
luận rằng “là chun gia lâu năm về tim mạch và hô hấp chúng tôi nhất trí khẳng
định rằng Nattokinaza là một phát hiện đầy phấn chấn trong việc ngăn ngừa và điều
trị các chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, và “chúng tôi xác định Nattokinaza là
một hoạt chất thiên nhiên có thể làm tan các huyết khối hữu hiệu, không gây dị ứng
và có độ an tồn cao” hơn cả Tỏi, Nhân sâm Triều tiên hay Bromelain (từ quả Dứa)
thúc đẩy sản sinh ra Plasmin trong quá trình thủy phân sợi Fibrin [27].
Nguyễn Thị Hồng Ngân

15

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

1.4. Enzym Nattokinaza
1.4.1 Cấu trúc của Nattokinaza
Nattokinaza (NK) là enzym phân hủy fibrin do Bacillus natto tạo ra. Tương tự
như plasmin, NK có khả năng hịa tan trực tiếp fibrin. Ngồi ra, nó cũng làm tăng
cường khả năng tạo cả plasmin và các chất hòa tan máu cục khác như urokinaza.
NK có cấu trúc chuỗi đơn gồm 275 amino axit và khơng có liên kết disulfid
trong phân tử [67] Thuộc vào họ proteaza serine subtilisin, NK có tam giác xúc tác
bảo thủ giống nhau ((D32, H64, S221) và vị trí oxyanion (N155). Vị trí gắn cơ chất
của nó (S125, L126, G127) gồm những lỗ gắn S1 và S4 của subtilisin NK giữ đặc
điểm tương đồng cao với hầu hết các subtilisin và cấu trúc 3D của nhiều subtilisin

được tạo ra bằng phương pháp nhiễm xạ tia X và NMR (Nuclear magnetic
resonance spectroscopy – khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân).

Hình 1.4.1 Cấu trúc tâm hoạt động của enzym nattokinaza [67]
2T

T
2

1.4.2 Cơ chất của enzym nattokinaza
Fibrin là một protein dạng sợ được polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao
quanh vết thương có tác dụng cầm máu. Và nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết
hay còn gọi là fibrinogen nhờ sự hoạt động của thrombin. Khi đó, fibrin được tạo
thành sẽ liên kết với nhau bởi nhân tố VIII để tạo thành các cục máu. Ngồi ra,
Fibrin cịn tham gia vào một số q trình sinh học trong cơ thể như: truyền tín hiệu,
đơng tụ máu trong mạch máu và polyme hóa protein [2].
Fibrinogen là một loại glycoprotein 340-HD được sinh tổng hợp ở gan và có
nồng độ khảng 1,5-4,0 g/l trong huyết tương. Do đó đối với những người bệnh suy
gan hoặc mắc các bệnh về di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 có thể
dẫn đến việc giảm nồng độ và chất lượng fibrinogen gây ra bệnh trầm kha về máu.
Nguyễn Thị Hồng Ngân

16

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Fibrinogen đóng vai trị chính trong việc tạo cầu nối các sợi tơ huyết bằng việc kết hợp các

protein bề mặt GbIIb/Iia của chúng lại với nhau và hình thành fibrin để cầm máu [2].
Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuối polypeptit (chuỗi alpha, beta và
gramma). Trên chuối alpha và beta có một trình tự peptid ngắn được gọi là
fibrinopeptid. Chính các chối peptit ngắn này cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa
bởi chính nó một cách tùy tiện.
Thrombin cắt các fibrinogen của chuối alpha và để lộ ra một mặt của vùng
domain E, nó mà có thể được kết hợp với đầu cacsbon cuối của chuỗi gamma. Việc
cắt chuỗi beta diễn ra từ từ hơn và tạo ra các sợi của fibrinogen. Đây chính là q
trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin [48].
1.4.3 Cơ chế tác dụng của enzym nattokinaza
1.4.3.1 Q trình đơng máu và hịa tan các cục máu đơng
Q trình đơng máu và hịa tan các cục máu đơng là hai quá trình tồn tại song
song đồng thời trong cơ thể con người. Khi một cục máu đông bắt đầu được hình
thành thì một loạt các bước sau diễn ra nhằm ngăn cản sự hồn thành việc hình
thành các cục máu đông. Điều này giúp bảo vệ cơ thể ngăn chặn các cuộc tấn công
tim và các sự cố tim mạch. Nhưng một khi hai quá trình này bị rối loạn thì dẫn đến
tồn bộ các q trình sẽ rối loạn theo. Ví dụ, khi mà các cục máu đơng hình thành
và chưa được làm tan hết, chúng sẽ bàm vào thành mạch máu và tích tụ dần gây ra
nghẽn mạch. Điều đó là rất nguy hiểm khi khơng có thuốc điều trị kịp thời [2].
* Q trình đơng máu
Khi cơ thể con người bị tổn thương hoặc do những biến đổi bên trong cơ thể sẽ
dẫn đến hình thành các tiền thrombin rất phức tạp. Rồi sau đó sẽ hình thành nên
thrombin, thrombin sẽ tác dụng với fibrinogen để tạo thành fibrin. Cơ chế này được
thể hiện rõ nét nhất ở hình dưới [45]
Trong q trình đơng máu, ion Ca2+ có ảnh hưởng lớn đến q trình hình thành
P

P

tiền thrombin và thrombin. Do đó, khi cơ thể thiếu Ca2+ là rất nguy hiểm bởi nó dẫn

P

P

đến sự rối loạn trong hệ thống cân bằng kéo theo nhiều nguy cơ bệnh về máu và
bệnh tim mạch.
* Q trình hịa tan máu đông
Nguyễn Thị Hồng Ngân

17

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Trong huyết thương có một euglobulin gọi là plasminogen hoặc fibrinolysin, khi
được hoạt hóa sẽ chuyển thành plasmin (hay fibrinogen). Plasmin là một enzym
phân hủy protein, chúng có tác dụng làm tan các sợi fibrin và làm tan các chất khác
trong máu ở xung quanh như fibrinogen, yếu tố V, VII, prothrombin. Do đó, khi
plasmin được hình thành bên trong cục máu đơng nó có thể làm tan cục máu đông
đồng thời làm giảm khả năng đơng máu. Vì vậy, q trình này cho phép làm sạch
những cục máu đơng hình thành ở các mơ trong một số ngày. Tuy nhiên làm cũng
làm cho vết thương của mạch máu đã được bịt bằng cục máu đông lại mở miêng.
Một chức năng đặc biệt quan trọng của hệ thống plasmin là lấy đi những cục máu
đông rất nhỏ từ hàng ngàn mạch máu ngoại vi có thể gây tắc mạch máu nếu khơng
có cơ chế dọn sạch chúng.
Tuy nhiên trong cơ thể người có hơn 20 loại enzym gây đơng máu những chỉ có
một loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đơng plasmin. Ngồi ra với sự
có mặt của vi khuẩn, virus, nấm mốc và các độc tố trong máu cũng tạo ra những

liên kết chồng chéo quá tải của fibrin. Khi khơng có những hiện tượng mất máu
hoặc là vết thương hở, các sợi fibrin liên kết chéo này sẽ luân chuyển trong máu và
dính vào thành mạch máu. Điều này góp phần tạo nên các cục máu làm giản sự vận
chuyển lưu thông máu đồng thời làm tăng độ nhớt của máu gây ra huyết áp cao. Các
cục máu đông trong tim người làm cản trở vận chuyển máu tới các mơ cơ tim. Nếu
dịng máu bị chặn lại, khả năng cung cấp oxy tới các mô này sẽ giảm một cách cục
bộ gây ra thiếu máu cục bộ, gây ra các cơn đau thắt tim hoặc nhồi máu cơ tim. Nếu
hiện tượng này kéo dài có thể dẫn tới tử vong [8,9].
Như vậy, quá trình chuyển đổi fibrin trong cơ thể người thành các sản phẩm
phân hủy fibrin phụ thuộc rất nhiều vào khả năng tạo ra các chất kích thích tố như tPA và u-PA trong gan. Do những chất này làn nhân tố chính kích thích sự tạo nên
ezym plasmin. Tuy nhiên sự có mặt của plasmin chưa đảm bảo cho việc phân giải
fibrin cũng như các cục máu đơng đạt hiệu quả bởi có rất nhiều các chất kìm chế
xung quanh nó. Đặc biệt đối với những người nhiều tuổi, khi các chất kích thích cho
quá trình chuyển hóa tạo thành plasmin thì ít mà các chất ức chế hoạt lực của
plasmin thì nhiều. Điều này cũng giải thích vi sao bệnh tim mạch thường gặp ở
người cao tuổi [16].
Nguyễn Thị Hồng Ngân

18

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

1.4.3.2 Cơ chế tác dụng của nattokinaza [23]
Nattokinaza là một loại proteaza có tác dụng làm tan trực tiếp fibrin trong huyết
thanh người. Enzym nattokinaza tác dụng theo 3 con đường:
Theo con đường A, enzym nattokinaza trực tiếp thủy phân tạo ra các protein có
thể hịa tan trong máu. Ở con đường B, nó kích thích q trình tạo enzym urokinaza

từ tiến tố pro-urokinaza, từ đó hình thành các phân tử plasminogen và hình thành
nên plasmin. Đối với con đường C, nattokinaza có tác dụng kích thích các tiền tố tPA là tác nhân hoạt hóa plasmin.

C

B
Nattokinase

Các sản
phẩm phân
hủy fibrin

A
Fibrin
Plasmin

Prourokinase

Tissue
Plasminogen
Activator (tPA
Plasminogen

Urokinase

Hình 1.4.3.2 Có chế tác dụng của enzym nattokinaza lên fibrin

1.4.4. Nguồn vi sinh vật tổng hợp enzym Nattokinaza
Vi sinh vật là nguồn sản xuất quan trọng để tạo ra các hợp chất có khả năng
phân hủy máu đông. Streptokinaza từ Streptococcus hemolyticus và staphylokinaza

từ Streptococcus aureus đã sớm chứng minh được có hiệu quẩ trong liệu pháp tan
huyết khối [18]. Nhiều năm qua, có thêm nhiều enzym từ các loài vi sinh vật khác
nhau đã được khám phá như nattokinaza (NK) từ Bacillus natto và subtilisin DFE
and subtilisin DJ-4 from Bacillus myloliquefaciens [35, 62]
Các vi sinh vật sản xuất enzym phân hủy fibrin bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn,
nấm mốc và tảo được tóm tắt trong bảng 1.4.4.1.
Nguyễn Thị Hồng Ngân

19

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Bảng 1.4.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzym fibrinaza [63]
0T

T
0

Vi sinh vật

T
0

Tác giả (tài liệu tham khảo)

Bacilli
B. subtilis BK-17


Jeong et al. 2001

B. subtilis A1

Jeong et al. 2004

B. subtilis 168

Kho et al. 2005

Actinomyces thermovulgaris

Egorov et al. 1976

13T

13T

Streptomyces
S. megasporus SD5

Chitte and Dey 2000, 2002

S. spheroids M8-2

Egorov et al. 1985

Streptomyces sp. Y405


Wang et al. 1999

Fungi
A. ochraceus 513

Batomunkueva and Egorov 2001

Cochliobolus lunatus

Abdel-Fattah and Ismail 1984

F. oxysporum

Tao et al. 1997, 1998

Fusariumpallidoroseum

El-Aassar 1995

P. chrysogenum H9

El-Aassar et al. 1990

Pleurotus ostreatus

Choi and Shin 1998

R. chinensis 12

Xiao-Lan et al. 2005


Algae
C. intricatum

Matsubara et al. 1998

C. latum

Matsubara et al. 1999

C. divaricatum

Matsubara et al. 2000

Streptomyces megasporus SD5 được phân lập từ suối nước nóng có khả năng tạo
ra enzym phân hủy fibrin chịu nhiệt [17]. Một số loại nấm cũng có thể tạo ra
proteaza có hoạt tính phân hủy fibrin cao như Aspergillus ochraceus 513 [14],
Fusarium oxysporum [55]. Penicillum chrysogenum [21], Rhizopus chinensis 12
[58] Ngoài ra, Matsubara cùng các cộng sự đã tìm thấy các enzym phân hủy fibrin
Nguyễn Thị Hồng Ngân

20

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

từ loài tảo biển Codium latum, Codium divaricatum, and Codium intricatu. Lee
cùng các cộng sự gần đây đã tinh sạch được enzym phân hủy fibrin từ sợi nấm

Armillaria mell. Trong đó các chủng thuộc chi Bacillus là nguồn vi sinh vật quan
trọng để sản xuất enzym phân hủy fibrin.
Vào năm 1987, B. natto sản xuất nattokinaza lần đầu tiên được khảo sát từ thực
phẩm lên men đậu tương truyền thống của Nhật là Natto [51]. Sau đó, một số lồi
bacilli khác từ các nguồn thực phẩm len men khác nhau đã được khám phá ra có thể
tạo enzym phân hủy fibrin. (Bảng 1.4.4.2)
Bảng 1.4.4.2 Các chủng thuộc loài Bacillis phân lập từ các nguồn thực phẩm [47]
T
0

T
0

T
0

B. natto

Natto, Japan

Nattokinaza, NK

Fujita et al. 1993

B. amyloliquefaciens

Douchi, China

Subtilisin DFE,


Peng et al. 2003

Bacillus sp. CK

Chungkook-jang, Korea

CK

Kim et al. 1996

Bacillus sp. DJ-4

Doen-jang, Korea

Subtilisin DJ-4

Kim and Choi 2000

Bacillus sp. DJ-2

Doen-jang, Korea

bpDJ-2

Choi et al. 2005

Bacillus sp. KA38

Jeot-gal, Korea


Jeot-gal enzym

Kim et al. 1997

B. subtilis QK02

Fermented soybean

QK-1 and QK-2

Ko et al. 2004

Bacillus firmus NA-1

Natto –

Seo and Lee 2004

B. subtilis IMR-NK1

Natto –

Chang et al. 2000

Bacillus sp. KDO-13

Soybean paste, Korea

Lee et al. 2001


DC-4

Những khám phá thú vị này ngụ ý rằng việc tiêu thụ các thực phẩm lên men có
thể ngăn cản được các bệnh tim mạch. Suzuki cùng các cộng sự đã thông báo rằng
thực phẩm chức năng natto có thể rút ngăn thời gian phân hủy các cục máu mà
thường dùng để đánh giá hoạt tính phân hủy fibrin nội tại trong huyết tương. Đồng
thời, dịch chiết natto không kéo dài thời gian chảy máu, điều này xác định độ an
toàn của natto để làm thực phẩm chức năng [47].

Nguyễn Thị Hồng Ngân

21

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

1.4.5 Đặc điểm hóa sinh của enzym thủy phân fibrin từ vi sinh vật [63]
Một số enzym thủy phân fibrin từ vi sinh vật bao gồm các enzym từ
Streptomyces R. chinensis, Armillaria mellea, và loài Bacillus đã được tinh sạch và
xác định đặc điểm. Các đặc tính hóa sinh như là trọng lượng phân tử, pH và nhiệt
độ tối ưu, độ ổn định và cơ chất đặc hiệu được tóm tắt trong bảng …., một số trình
tự đầu N đã được xác định. Theo cơ chế xúc tác của chủng, những enzym này được
phân loại thành serine proteaza và metalloproteaza ngoại trừ enzym từ R.chinensis
12 và Streptomyces sp. Y405 có cả hoạt tính serine và metalloproteaza.
Các enzym phân hủy fibrin thuộc hộ proteaza serine có hoạt tính ở pH trung
tính hoặc kiềm với pH tối ưu từ 8-10. Dải trọng lượng phân tử của chúng từ 27.7-44
kDa, điểm đẳng điện thường 8, trừ bp DJ-2 (pI 3,5–3,7). Nhiệt độ tối ưu có dải
rộng, từ 30-40oC, hầu hết khoảng 50°C. Hầu hết enzym phân hủy fibrin serine thuộc

P

P

vào họ subtilisin của lồi Bacillus. Chủng có cùng tam giác xúc tác gồm Ser221,
His64, and Asp32 và không có liên kết disulfide ở trong phân tử. Hoạt tính phân
hủy fibrin của chúng có thể bị kìm hãm thuận nghịch bởi phenylmethysulfonul
fluoride (PMSF), diisopropylfluorophosphate (DFP), hoặc E-64.
Các enzym phân hủy fibrin thuộc họ metalloproteaza đỏi hỏi có các ion kim loại
hóa trị 2 cho hoạt tính xúc tác của nó, ví dụ Zn2+ đối với jeot-gal, Ca2+ and Mg2+
P

P

P

P

P

P

đối với AMMP, Co2+ và Hg2+ đối với các enzym từ Bacillus sp. KDO-13, vì vậy
P

P

P

P


hoạt tính của chủng có thể bị kìm hãm bởi các chất như là EDTA. Những enzym
này có pH tối ưu giữa 6-7, ngoại trừ enzym từ R. chinensis 12 có pH tối ưu từ 10.5
Tất cả các enzym phân hủy fibrin này có tính đặc hiệu cơ chất cao đối với
fibrin, khác với các proteaza khác có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Ví dụ, CK có hoạt
tính phân hủy fibrin cao gấp khoảng 8 lần so với subtilisin Carlsberg, một proteaza
kiềm tính phổ biến với trình tự đầu N đặc trưng. Mặc dù những enzym kiền tính này
có trình tự tương đầu khá cao, tại sao chỉ có các enzym của chủng mới có tính đặc
hiệu có chất như thế. Các thay đổi trong q trình tiến hóa của các axit amin quan
trọng xác định sự khác biệt này.

Nguyễn Thị Hồng Ngân

22

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

Bảng 1.4.5 Đặc điểm hóa sinh của các enzym thủy phân
fibrin có nguồn gốc từ vi sinh vật [47]

Nattokinaza

Trong
lượng phân
tủ, pI, pH,
nhiệt độ tối
ưu

27,7kDa, pI
8.6

Độ ổn định Tính đặc hiệu
pH, nhiệt
cơ chất
độ

pH 7-12,
thấp hơn
50oC
P

Subtilisin
DFE

CK

P

P

P

P

Subtilisin
DJ-4

29 kDa,

pH 10,0,
40°C

Subtilisin
QK-2

28 kDa, pH
8,5, 55°C

31 kDa

Nguyễn Thị Hồng Ngân

Plasmin hoặc
subtilisin

Proteaza huyết
thanh họ
subtilisin

Subtilisin,
không làm suy
giảm các tế
bào máu

Proteaza huyết
thanh họ
subtilisin

Fujita

cùng các
cộng sự,
1993,
Sumi cùng
các cộng
sự, 1987
Peng cùng
các cộng
sự, 2003

P

Proteaza huyết
thanh kiềm tính
chịu nhiệt

Kim cùng
các cộng
sự 1996

Proteaza huyết
thanh giống
Plasmin

Kim và
Choi, 2000

Proteaza huyết
thanh họ
Subtilisin


Ko cùng
các cộng
sự năm
2004
Jeong
cùng các
cộng sự
năm 2001

CK có hoạt lực
phân hủy
fibrin cao gấp
8 lần so với
subtilisin
Carlsberg. Có
chất đặc hiệu
nhất là
plasmin
pH 4-7 ở
Hoạt tính phân
nhiệt độ
hủy fibrin cao
phịng
gaaom 2,2 và
trong 48
4,3 lân so với
giờ
subtilisin BPN
và subtilisin

Cảlsberg
ổn định ở
Có hoạt tính
pH 3-12, ở mạnh
40oC trong
30 phút
Plasmin
P

P

BK-17

Tác giả

P

28 kDa, pI pH 6-10,
8,0, pH 9,0, thấp hơn
48 oC
50 oC
trong 60
phút
28,2 kDa,
pH 7-10,5,
pI 8,0, pH
thấp hơn
9.0, 48 oC
50 oC
trong 60

phút
P

Chú thích

P

P

23

Thủy phân trực
tiếp fibrin hoặc
tạo plasmin từ
plasminogen để
phân hủy fibrin

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

KCK-7

Jeot-gal
Enzym

44 kDa,
pH 8.0,
50°C

41 kDa,
pH 7.0,
40°C

Bacillokinaza 31,4 kDa,
II (BKII)
pH 7,0,
50°C

Ổn định
lên tới
60°C, pH
7-10
Ổn định
lên tới
40oC ở pH
7-9
P

Ổn đinh ở
pH xuống
tớ 4, và
nhiệt độ
lên tới
50oC
P

AMMP

P


P

21 kDa,
pH 6,0,
33°C

Proteaza huyết
thanh, Ca2+ và
Cu2+ tăng cường
hoạt tính của nó.
Metalloproeaza,
Zn2+ tăng cường
hoạt tính của nó
P

P

Dễ phân hủy
fibrin hơn acasein và skim
milk, Khơng
phân hủy các
tế bào hồng
cầu
Hoặt tính
amydolytic
cao nhất trên
cơ chất
Kallikrein


P

P

P

45 kDa,
pH 7,0,
60°C

pH 7-9, và
50oC

R.
chinensis 12

18 kDa, pI
8,5,
pH 10,5,
45°C

Ổn định ở
pH 6,8-8,8
ở 37oC
trong 24
giờ

30 kDa, pI
8,5,
pH 8,0


Ổn định ở
4-37oC,
pH 4-9

SW-1

P

P

P

P

P

P

Paik cùng
các cộng
sự, 2004
Kim cùng
các cộng
sự 1997

Metalloproteaza,
hoạt tính khơng
đáng kế trên
skim milk và

khơng và
gelatin, khơng
hoạt tính trên tế
bào hồng cầu
Thủy phân ưu Metalloproteaza
tiên chuỗi Aα giống
fibrinogen hơn Chymotrypsin,
chuối
Ca2+ và Mg2+
tăng cường hoạt
Bβ và γ
tính của nó
Có giá trị K m
Metalloproteaza,
và hoạt tính
Co2+ và Hg2+
thủy phân
tăng cường hoạt
fibrin thấp
tính của nó
Thủy phân
Tâm hoạt động
fibrin, thủy
có
phân đồng thời Hydrosulfuryl
các chuỗi α, β, và kim loại
γ của
fibrinogen

Jeong

cùng các
cộng sự,
2004

Phân hủy trực
tiếp fibrin

Wang
cùng cộng
sự 1999

P

Bacillus
sp. KDO-13

P

R

P

P

P

RP

P


P

P

Lee cùng
các cộng
sự, 2005

P

P

metalloproteaza
huyết thanh

Lee cùng
cộng sự
2001
Xiau-Lan
cùng các
cộng sự
2005

1.5. Sản xuất các enzym thủy phân fibrin từ nguồn vi sinh vật
Giá thành của quá trình sản xuất và chế biến enzym là một trở ngại lớn cho việc
ứng dụng thành công các proteaza trong công nghiệp. Tựu chung tất cả các phương
Nguyễn Thị Hồng Ngân

24


Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn thạc sỹ khoa học

pháp đều nhắm mục đích chủ yếu là tạo ra được chế phẩm enzym có hoạt lực càng
cao càng tốt với giá thành càng rẻ. Đối với enzym thủy phân fibrin, nhiều nỗ lực
trong các phịng thí nghiệm đã và đang tiến hành để cải thiện sự biểu hiện của
enzym phân hủy fibrin bao gồm:
- Lựa chọn phương pháp lên men thu nhận Nattokinaza:
+ Phương pháp lên men bề mặt
+ Phương pháp len men lỏng
- Lựa chọn được môi trường nuôi cấy lý tưởng
- Tối ưu điều kiện môi trường,
- Biểu hiện quá mức bởi các chủng kỹ thuật gen.
- Phương pháp thu hồi và hoàn thiện sản phẩm:
+ Tách chiết và tinh sạch enzym
+ Đóng gói, bảo quản enzym.
Dựa vào các bước thực hiện chúng tôi nghiên cứu tối ưu từng công đoạn để đưa
ra được quy trình lên men và thu nhận enzym nattokinaza.
1.5.1 Các phương pháp lên men thu nhận Nattokinaza
1.5.1.1 Phương pháp lên men bề mặt
Hạt đậu nành ngâm qua đêm, tuyệt trùng ở 121oC trong 30 phút, trải đều ra khay
P

P

có chiều dày 1,5cm được ủ bào tử Bacillus natto ở một mơi trường 37oC trong vịng
P


P

24 giờ. [4]
Đặc điểm của phương pháp nên men này là tạo thành những hạt đậu có màu
nâu, độ nhớt cao và bền (chứa nhiều Acit Glutamic), có mùi nồng nặc (của
amoniac) [52].
* Ưu điểm:
- Dễ tiến hành
- Tránh bị nhiễm trùng toàn bộ
* Nhược điểm:
- Mang tính gián đoạn, khó cơ giới hóa và tự động hóa
- Tốn nhiều diện tích ni cấy
- Năng suất thấp
- Tốn nhiều lao động thủ công.
Nguyễn Thị Hồng Ngân

25

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội