....

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------NGUYỄN THỊ CÚC

NGUYỄN THỊ CÚC

KỸ THUẬT HÓA HỌC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACRYLAMIDE TRONG MỘT SỐ
THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
…......................................
(Kỹ thuật Hóa học)

KHỐ 2017A
Hà Nội – Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------NGUYỄN THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACRYLAMIDE TRONG MỘT SỐ THỰC
PHẨM

Chuyên ngành : Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

…......................................
(Kỹ thuật Hóa học)

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS. TS Trần Thị Thúy

Hà Nội – Năm 2018


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

MỤC LỤC
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................3
DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG .....................................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................5
PHỤ LỤC ....................................................................................................................6
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
I. TỔNG QUAN CHUNG...........................................................................................2
1.1 Tổng quan về acrylamide...................................................................................2
1.1.1 Tính chất lý, hóa ..........................................................................................2
1.1.2 Nguồn gốc và cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm ...................3
1.1.3 Độc tính của acrylamide đối với con người ................................................7
1.1.4 Các qui định về acrylmide ...........................................................................8
1.1.5 Các phương pháp định lượng acrylamide đã được công bố........................9
1.2. Các nghiên cứu acrylamide trong nền mẫu bánh trung thu đã công bố .........12
1.2.1 Phương pháp HPLC định lượng acrylamide trong thực phẩm nướng và
chiên giòn ở Trung Quốc. ...................................................................................12
1.2.2 Nghiên cứu làm giảm lượng acrylamide trong khoai tây chiên và bánh
Trung thu bằng enzym L-asparaginase. .............................................................13
1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC .................................................................14

1.3.1 Định nghĩa sắc ký ......................................................................................14
1.3.2 Phân loại ....................................................................................................15
1.3.3 Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng ..................................................16
1.3.4 Cấu tạo đầu dị DAD .................................................................................20
1.4 Phương pháp thẩm định ..................................................................................21
1.4.1 Độ thích hợp hệ thống ...............................................................................21
1.4.2 Tính chọn lọc/đặc hiệu ..............................................................................21
1.4.3 Xây dựng đường chuẩn .............................................................................22
1.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi .............................................................................23
1.4.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................................24
1.4.6 Độ tái lặp ..................................................................................................25

Trang 1


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................26
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................26
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................26
2.1.2 Hóa chất và thiết bị ....................................................................................26
2.2 Nội dung nghiên cứu........................................................................................27
2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................28
2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu .........................................................28
2.3.2 Phương pháp phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò
DAD ...................................................................................................................29
2.3.3 Thẩm định phương pháp ...........................................................................29
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..................................................................32
3.1 Kết quả thực nghiệm ........................................................................................32
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng...........................................................32

3.1.2 Thẩm định phương pháp ...........................................................................41
3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của số lần nướng tới hàm lượng AA............47
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................52
PHỤ LỤC ..................................................................................................................56

Trang 2


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
AA

Acrylamide

AND

Axit deoxyribonucleic

CAS

Chemical Abstracts Service

CYP2E1

Cytochrome P4502E1

DAD


Diode-array detector

ECD

Electron capture detector

EPA

Environmental Protection Agency

EtAc

Ethylacetate

GC-MS

Gas chromatography–mass spectrometry

GC-NPD

Gas chromatography- Nitrogen Phosphorous Detector

GSH

Glutathione

HPLC-DAD

High Performance Liquid Chromatography-Detector Diod Array


HPLC-FLD

High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector

HPLC-UV

High Performance Liquid Chromatography -ultraviolet

IARC

International Agency for Research on Cancer

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LC/MS/MS

Liquid chromatography tandem-mass spectrometry

LLE

Liqid-liquid extraction

LOD

Limit of detection

LOQ


Limit of quantitation

MP

Mobile phase

SCF

Uỷ ban khoa học về Thực phẩm Châu Âu

SPE

Solid phase extraction

TCVN

Tiêu chuẩn việt Nam

TEA

Triethylacetic

WHO

World Health Organization

Trang 3


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018


DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG
Sơ đồ 1 Chuyển hóa của AA trong thực phẩm [20] ...................................................5
Sơ đồ 2: Cơ chế hình thành AA trong quá trình xử lý nhiệt thực phẩm [20] .............6
Sơ đồ 3: Cơ chế hình thành của AA từ amino acid và lipit [20] .................................6
Sơ đồ 4: Phân loại các phương pháp sắc ký ..............................................................15
Sơ đồ 5: Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng [1] .............................................16
Sơ đồ 6: Cấu tạo và nguyên lý của detector DAD [33] ............................................20
Sơ đồ 7: Mơ hình thực nghiệm..................................................................................27
Sơ đồ 8: Quy trình làm bánh Trung thu ....................................................................28
Sơ đồ 9: Quy trình chiết số 1.....................................................................................38
Sơ đồ 10: Quy trình chiết số 2..................................................................................40
Sơ đồ 11: Sơ đồ biểu diễn hàm lượng acrylamide thay đổi theo số lần nướng ........50
Bảng 1: Độ tan của acrylamide trong các dung môi ...................................................2
Bảng 2: Hàm lượng AA trong các sản phẩm thực phẩm [12] ....................................4
Bảng 3: Giới hạn nồng độ AA ....................................................................................8
Bảng 4: Độ thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối ở các khoảng nồng độ khác nhau.24
Bảng 5: Cách pha các dung dịch chuẩn ...................................................................30
Bảng 6: Kết quả chọn bước sóng ..............................................................................33
Bảng 7: Kết quả tối ưu cột sắc ký .............................................................................35
Bảng 8: Kết quả tính độ thích hợp hệ thống .............................................................41
Bảng 9: Kết quả xây dựng đường chuẩn ...................................................................43
Bảng 10: Kết quả độ thu hồi ở 400 ppb ....................................................................44
Bảng 11: Kết quả độ thu hồi ở nồng độ 1000 ppb ....................................................44
Bảng 12: Kết quả độ thu hồi ở nồng độ 2000 ppb ....................................................45
Bảng 14: Kết quả tính LOD, LOQ ............................................................................46
Bảng 15: Kết quả độ tái lặp giữa 2 ngày thí nghiệm.................................................47
Bảng 16: Kết quả khảo sát hàm lượng AA trên mẫu bánh ở 3 lần nướng ................48
Bảng 17: Kết quả phân tích hàm lượng AA trong mẫu bánh mua sẵn .....................50


Trang 4


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Mối liên quan nồng độ enzym và hàm lượng acrylamide [26] ....................14
Hình 2: Quá trình tách các sắc tố thực vật ................................................................15
Hình 3: Bơm cao áp kiểu pittong [1] ........................................................................17
Hình 4: Van bơm mẫu ở vị trí load [1] .....................................................................17
Hình 5: Van bơm mẫu ở vị trí inject [1] ...................................................................18
Hình 6: Cột pha đảo [1] .............................................................................................18
Hình 7: Cột pha thuận [1]..........................................................................................19
Hình 8: Đường chuẩn dạng y=a.x+b .........................................................................22
Hình 9: Sắc ký đồ dung mơi nước ở các bước sóng 202, 210, 226 nm ....................32
Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng 202, 210, 226 nm........................33
Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4 ..........................................34
Hình 12: Sắc ký đồ với pha động nước .....................................................................34
Hình 13: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột C8 InertSustain .....................................35
Hình 14: Sắc ký đồ khi phân tích bằng cột Eclipse Plus C18 ..................................35
Hình 15: Sắc ký đồ với tốc độ dịng 0,6 ml/phút ......................................................36
Hình 16: Sắc ký đồ với tốc độ dịng 0,8 ml/phút ......................................................36
Hình 17: Sắc ký đồ với tốc độ dịng 1 ml/phút .........................................................36
Hình 18: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung môi chiết (1) ....................39
Hình 19: Sắc ký đồ dịch chiết mẫu trắng khi dùng dung mơi chiết (2) ....................40
Hình 20: Sắc ký đồ mẫu trắng ...................................................................................42
Hình 21: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 0,2 ppm .................................................42
Hình 22: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 1 ppm ....................................................42
Hình 23: Đường chuẩn AA 0,2 - 2,0 ppm .................................................................43


Trang 5


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.01 ...............................................................................56
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.02 ...............................................................................57
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.03 ...............................................................................58
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.04 ...............................................................................59
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.05 ...............................................................................60
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.06 ...............................................................................61
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.07 ...............................................................................62
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.08 ...............................................................................63
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.09 ...............................................................................64
Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu N1.010 .............................................................................65
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.01 ...............................................................................66
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.02 ...............................................................................67
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.03 ...............................................................................68
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.04 ...............................................................................69
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.05 ...............................................................................70
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.06 ...............................................................................71
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.07 ...............................................................................72
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.08 ...............................................................................73
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.09 ...............................................................................74
Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu N2.010 .............................................................................75
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.01 ...............................................................................76
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.02 ...............................................................................77
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.03 ...............................................................................78
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.04 ...............................................................................79

Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.05 ...............................................................................80
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.06 ...............................................................................81
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.07 ...............................................................................82
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.08 ...............................................................................83
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.09 ...............................................................................84
Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu N3.010 .............................................................................85

Trang 6


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp thực phẩm, rất nhiều
các cơ sở sản xuất bánh Trung thu ra đời cung cấp rất nhiều mẫu bánh với hình thức
đa dạng. Trong đó các loại bánh nướng vẫn là lựa chọn phổ biến của người tiêu
dùng trong dịp lễ Trung thu ở Việt Nam.
Tháng 4 năm 2002 lần đầu tiên acrylamide được công bố trong nghiên cứu của
Tổ chức thực phẩm quốc gia Thụy Điển [6], là chất độc sinh ra trong quá trình chế
biến nhiệt các loại thực phẩm giàu cacbohydrat. Sau đó nhiều nghiên cứu được tiến
hành ở các nước khác như Na Uy, Thụy Sĩ, Anh, Mỹ…trên nền mẫu khoa tây chiên,
bim bim, snack khoai tây, mỳ tôm, cà phê… Tuy nhiên ở Việt Nam cũng như trên
thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng acrylamide có trong bánh Trung
thu. Vì vậy, cần có các công cụ đánh giá hàm lượng acrylamide để bảo vệ sức khỏe
người tiêu dùng.
Tổ chức Y tế thế giới WHO và tổ chức lương thực Liên Hợp Quốc (FAO) cho
rằng acrylamide là nguyên nhân gây ra độc tính với thần kinh, với hệ sinh sản và có
hại cho di truyền. Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu Ung thư xếp (IARC) xếp
acrylamide vào nhóm “có thể gây ung thư cho con người” [14,17]. Vì vậy chúng tơi
chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng acrylamide trong một số thực phẩm” nhằm

đánh giá hàm lượng của acrylamide trong bánh Trung thu và khảo sát ảnh hưởng
của số lần nướng tới hàm lượng acrylamide trong q trình nướng bánh.
Bài luận văn gồm có các phần chính như sau:
- Tổng quan chung
- Xây dựng quy trình định lượng acrylamide bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
- Ứng dụng quy trình đã xây dựng để khảo sát hàm lượng acrylamide trong mẫu
bánh Trung thu theo số lần nướng bánh.

Trang 1


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

I. TỔNG QUAN CHUNG
1.1 Tổng quan về acrylamide
1.1.1 Tính chất lý, hóa
Acrylamide (AA) là chất hóa học có cơng thức phân tử C3H5NO CAS 79-06-1,
phân tử lượng là 71,079 g/mol và tên danh pháp quốc tế IUPAC là prop-2-enamide
[5, 6].

Tính chất vật lý [6]:
+ Là tinh thể màu trắng, khơng mùi
+ Nhiệt độ nóng chảy: 84,5 ± 0,3oC
+ Áp suất hơi: thấp (0,007 mmH
g ở 25oC, 0,03 mmHg ở 40oC, 0,07 mmHg ở 50oC và 0,14 mmHg ở 55oC)
+ Nhiệt độ sôi: 87,2 °C tại 2 mm Hg
+ Ở điều kiện phân hủy không nhiệt tạo thành NH3, dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ
phân hủy thành CO, CO2, NOx…
+ Độ tan của acrylamide trong dung môi phân cực và không phân cực như sau :

Bảng 1: Độ tan của acrylamide trong các dung môi
Tên dung mơi

Độ hịa tan (g/l)

Tên dung mơi

Độ hịa tan (g/l)

Acetone

631

Ethylacetate

162

Ethanol

862

Chloroform

26,6

Methanol

1550

Benzen


3,46

Nước

2550

N-hexan

0,068

Tính chất hóa học [5]: AA là một chất hữu cơ phân tử nhỏ chứa nhóm vinyl
electrophilic dễ phản ứng với các tác nhân nucleophil. AA có thể bị thủy phân đứt

Trang 2


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

liên kết CO-NH2. Nhóm vinyl có thể phản ứng với amoniac, ure, formaldehyd,
amin bậc 2, phosphine, clo, brơm, và dithiocarbamates, cũng như protein.
+ Tính chất của nhóm vinyl CH2=CH-:
Tạo thành polyacrylamide

Tác dụng với hydrohalogenua hoặc halogenua
H-X (X2) + CH2=CH-CO-NH2  CH3-XCH-CO-NH2
Tác dụng với hợp chất chứa hidro hoạt động

(R-H : -S-H, -NH của axit amin và protein.. hoặc -OH)
+ Tính chất của nhóm amide: bị thủy phân trong môi trường kiềm đặc hoặc axit đặc

đứt liên kết CO-NH2.
Ứng dụng [5,14]:
Acrylamide là hóa chất cơng nghiệp tạo thành do phản ứng thủy phân của
acrylonitrile. Acrylamide được sử

dụng để

tổng hợp các polymer như

polyacrylamide ứng dụng làm chất keo tụ: dùng trong xử lý nước uống và nước
thải sinh hoạt, làm môi trường điện di, sử dụng trong công nghiệp làm giấy, bao bì,
nhựa dẻo… Một vài acrylamide được dùng trong sản xuất thuốc nhuộm và sản xuất
các monomer khác.
1.1.2 Nguồn gốc và cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm
a. Nguồn gốc
Tháng 4 năm 2002 cơ quan quản lý thực phẩm của Thụy Điển đã sử dụng máy
sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC/MS/MS) để khảo sát 100 mẫu thực phẩm và
cơng bố khơng tìm thấy AA trong các thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm
luộc [18]. Trong các sản phẩm khoai tây chiên hoặc các sản phẩm từ tinh bột được
chiên hoặc nướng như bánh bích qui, hàm lượng AA nằm trong khoảng từ 50-2300

Trang 3


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

μg/kg. Năm 2003, Australia đã tiến hành khảo sát 112 mẫu thực phẩm giàu tinh bột
cho kết quả hàm lượng AA trung bình trong khoai tây chiên là 501 μg/kg [9]. Năm
2002 tại Hồng Kông K.S.Leung và cộng sự đã sử dụng máy sắc ký lỏng LC-MS/MS
khảo sát 400 mẫu thực phẩm, chủ yếu là thực phẩm truyền thống Châu Á tại Hồng

Kông cho thấy AA được phát hiện chủ yếu trong những nhóm thực phẩm như gạo
và sản phẩm của gạo, mỳ, bánh và những sản phẩm bột nhão dùng làm bánh…[25].
Hàm lượng AA cao nhất được tìm thấy trong khoai tây chiên với hàm lượng từ
1500-1700 μg/kg. Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (European Food Safety
Authority) đưa ra báo cáo ngày 30 tháng 4 năm 2009 khảo sát hàm lượng
acrylamide năm 2007 trong các sản phẩm thực phẩm như sau [12]:
Bảng 2: Hàm lượng AA trong các sản phẩm thực phẩm [12]
Loại thực phẩm

Số lượng mẫu

Trung bình

Hàm lượng tối đa

(μg/kg)

(μg/kg)

Khoai tây chiên

529

348-350

2668

Snack khoai tây

216


626-628

4180

Các sản phẩm khoai

121

310-319

2175

Bánh mỳ

272

226-136

2430

Các loại ngũ cốc

128

135-156

1600

76


52-74

353

Cà phê

208

249-253

1158

Bánh biscuit

227

313-317

4200

tây nấu tại nhà

dùng ăn điểm tâm
Thực phẩm ngũ cốc
dành cho trẻ em

b. Cơ chế hình thành
Có nhiều giả thuyết đặt ra để giải thích cơ chế hình thành acrylamide ở các loại
thực phẩm khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy acrylamide được hình thành chủ

yếu qua 2 cơ chế:

Trang 4


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

Cơ chế thứ nhất: acrylamide được hình thành thơng qua phản ứng Maiilard, là
phản ứng giữa asparagine (một loại axit amin có trong khoai tây và ngũ cốc) và
đường tự nhiên có trong thực vật khi chiên rán ở nhiệt độ cao (>120oC) [5,6,22,19].
Phản ứng tạo thành acrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng asparagine,
lượng đường và nhiệt độ khi chiên, rán, nướng…Nghiên cứu trên các loại đường
cho thấy tạo lượng acrylamide nhiều nhất là đường glucose và fructose. Các axit
amin khác asparagine hầu như không tham gia phản ứng Maiilard hoặc tạo lượng
acrylamide rất thấp [19].

Sơ đồ 1 Chuyển hóa của AA trong thực phẩm [20]
Cơ chế thứ hai: hình thành từ các loại dầu và hợp chất chứa nitrogen có mặt
trong thực phẩm. Do có sự chuyển hóa acrolein thành acrylic acid và phản ứng của
acrylic acid với NH3 sinh ra do nhiệt phân hợp chất nitrogen (amino acid) tạo thành
acrylamide [17,20,28].

Trang 5


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

Sơ đồ 2: Cơ chế hình thành AA trong quá trình xử lý nhiệt thực phẩm [20]

Sơ đồ 3: Cơ chế hình thành của AA từ amino acid và lipit [20]


Trang 6


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

1.1.3 Độc tính của acrylamide đối với con người
Trong 10 năm gần đây đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá độc tính của
acrylamide đối với con người. Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng đầy đủ để kết
luận trên con người nhưng có đầy đủ bằng chứng thực nghiệm trên động vật
[34,35]. WHO/FAO đưa ra khuyến cáo lượng acrylamide trung bình mỗi ngày
(ADI: average daily food intake) cho mọi người là 0,3 – 0,8 μg/kg thể trọng [37].
a. Độc động học
Ramsay và cộng sự [11] đã tính tốn sự hấp thụ của acrylamide qua da là 25%
của liều dùng. Nghiên cứu về độc động học trên người cho thấy thời gian bán hủy
của acrylamide từ 2,4-7 giờ. AA được chuyển hóa bởi Cytochrome P4502E1
(CYP2E1) tạo thành dẫn xuất epoxit như glycidamide, là chất mà phản ứng với
DNA và protein mạnh hơn chất ban đầu. AA và glycidamide (chất chuyển hóa của
nó) liên hợp với glutathione (GSH) sau đó được loại bỏ bởi mercapturic acid qua
đường nước tiểu người.
b. Độc với gen, có thể gây ung thư ở người
Acrylamide được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Cơ quan Quốc tế nghiên cứu
Ung thư (IARC) xếp vào nhóm “có thể gây ung thư cho người”. Uỷ ban khoa học
về Thực phẩm Châu Âu (SCF) đã kết luận acrylamide gây ung thư ở động vật và có
hại cho di truyền, khuyến cáo cần hạn chế tối đa acrylamide trong thực phẩm [17].
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 9776:2013 đưa ra quy phạm thực hành nhằm giảm
acrylamide trong thực phẩm [3].
Trong các nghiên cứu dài hạn trên chuột cho thấy, những con chuột ăn chế độ ăn
nhiều acrylamide tỉ lệ mắc các bệnh u trên cơ thể như u tuyến vú, tuyến gáp, tuyến
thượng thận cao hơn những con chuột không ăn chất này. Ở người các nhà khoa học

đã khẳng định chế độ ăn uống nhiều acrylamide sẽ tăng nguy cơ mắc các bệnh ung
thư vú, ung thư buồng trứng, thực quản và ung thư tế bào thận…[17].
Các nhà khoa học [7,16,21] giải thích cơ chế như sau: AA phản ứng với hợp chất
ái nhân thông qua phản ứng cộng Michael. Tác nhân của phản ứng là –SH của
cystein, homocystein/protein, -NH2 của guanin, adenin/AND và protein…. Đây

Trang 7


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

chính là nguyên nhân dẫn tới tổn hại cho AND và protein. Các nghiên cứu cho thấy
tiêu thụ AA ở liều 10, 20 và 30 mg/kg gây tổn thương DNA đáng kể.
c. Gây độc thần kinh
Acrylamide được chứng minh gây độc với hệ thần kinh khi thí nghiệm trên động
vật với liều dùng 0,5-50 mg/kg thể trọng [14,19]. AA gây thối hóa hệ thần kinh
ngoại vi, gây mất cảm giác tay chân, suy giảm chức năng vận động cơ, giảm khả
năng nhận thức và gây mất trí nhớ. Tác hại của acrylamide khi sử dụng liều thấp
hơn trong thời gian dài vẫn đang được nghiên cứu trên chuột.
d. Độc tính sinh sản
Độc tính với sinh sản được thí nghiệm trên động vật. Nồng độ khơng gây độc
tính sinh sản ở chuột là 2–5 µg/kg/ngày. Liều này cao hơn ít nhất bốn lần so với liều
cần có độc tính thần kinh của acrylamide. Khi sử dụng 0,5-10 mg /kg/ngày AA gây
chậm phát triển của chuột và giảm dự trữ tinh trùng ở chuột so với những con
không sử dụng. Trong một nghiên cứu khác của Wei và cộng sự cho thấy AA gây
độc cho hệ sinh sản của chuột cái. Nếu sử dụng AA sẽ làm giảm trọng lượng cơ thể
đáng kể, giảm nồng độ progesterone huyết thanh một cách đáng kể [11].
1.1.4 Các qui định về acrylmide
Giới hạn nồng độ acrylamide được quy định bởi một số tổ chức như sau:
Bảng 3: Giới hạn nồng độ AA

Nguồn

Giới hạn cho phép

Tổ chức

Nước uống

1,0 μg/l

WHO-World Health
Organization

0,5 μg/l

EPA- Environmental
Protection Agency

0,1 μg/l

EU Commission 1998

Mỹ phẩm chăm sóc cơ thể

0,1 mg/kg

EU Commission 2002a

Khơng khí nơi làm việc


30 μg/m3

AFS 2005:17

Vật liệu bao gói thực phẩm

10 μg/kg

EU Commission, 2002b

Trang 8


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

1.1.5 Các phương pháp định lượng acrylamide đã được cơng bố
Đã có rất nhiều các nghiên cứu đươc đăng tải trong hầu hết các tạp chí khoa học
về phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm từ năm 2002 đến nay. Các
phương pháp xác định acrylamide dựa trên các thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng với
các đầu dò khác nhau (ECD; UV, DAD…) [5].
- Sắc ký khí
Tác giả

Phương

Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

pháp/ nền

mẫu
Pittet

và GC-MS

Chiết với nước được

- Cột ZB-WAX (30 m ×

cộng

sự, Ngũ cốc

axit hóa với axetic acid

0.,25 mm, 0,25 μm)

băng, loại protein với

- El+; SIM, m/z 70, 149, và

dung dịch Carrez I và

151 cho dẫn xuất AA và

II, tạo dẫn xuất với

m/z 110, 154 cho [13C3]-AA

thuốc thử brom hóa


dẫn xuất.

(KBr, HBr, và nước

- LOD: 2 μg/kg;

Br2), bổ sung Na2S2O3,

Độ thu hồi: 93–104%

2004 [8]

LLE với EtAc/ n-hexan
4: 1 (v/v), thổi khô bằng
N2, SPE với Na2SO4
trên cột Florisil được
kích hoạt. Thổi khơ
bằng N2, hòa tan lại, bổ
sung TEA.
Kim

và GC-NPD

cộng

sự, Khoai

2011


chiên

[27]

- Chiết bằng nước, lọc, - Cột DB-WAX fused
tây bão hòa với NaCl, LLE silica capillary column (30
với EtAc, làm khan ×0,32 mm, 0,25 μm)
bằng Na2SO4, bay hơi.

NPD 280◦C
- LOD: 0,15 μg/g;

Trang 9


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

WR: 1–100 ppm;
Độ thu hồi: 106%
Yamazaki GC-MS
và

- Chiết bằng nước, loại

cộng Thực phẩm béo bằng n-hexan, SPE

- Cột DB-5MS (30 m, 0,25
mm, 0,25 mm)

sự, 2012 chế biến


với Sep-pak C18, SPE

- EI, SIM, m/z 251, 234,

[29]

với côt Extrelut cho

206 cho dẫn xuất AA và

mẫu giàu amino acid,

m/z 254, 210 cho d3-AA

tạo dẫn xuất với

- LOD: 0,5–5 μg/kg; LOQ:

xanthydrolin trong môi

5–20 μg/kg;

trường axit,

Độ thu hồi: 85–110%

LLE với EtAc.
- Sắc ký lỏng
Tác giả


Phương

Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

pháp
Cù Hoàng

LC/MS/

Chiết bằng hỗn hợp nước và MP: A

Yến và

MS

ACN, loại béo bằng n-hexan, (HCOOH 0.01%
làm sạch bằng PSA+ MgSO4

cộng sự
2014 [4]

-

ACN: 19‐1),
B (ACN)
Cột C18 Inertsil
ODS 3V, 5 μm, 150

mm, 4.6 mm, cột bảo
vệ C18

Paleologos

Normal

Chiết bằng nước, loại béo bằng Cột Aminex

và

phase

n-hexan

HPX-

87H (300 × 7,8 mm)

Kontominas, HPLC-

MP: H2SO4

2005 [10]

UV,

LOD: 15 μg/L;

Khoai


WR: 45–2000 μg/L

tây

MP: H2SO4 và ACN

chiên,

LOD: 1,5 μg/L;
Trang
10


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

bim

Độ

bim,

105%.

thu

hồi:

95–


bánh
quy,
cafe
Schieberle

HPLC/

Chiết bằng nước, loại béo bằng - Cột: Luna Phenyl-

và cộng sự, fluoresc

n-hexan chứa aceton, bay hơi, Hexyl

2005 [24]

tạo dẫn xuất với DTAF-Cysa

ence
FLD

100Å

(250

×4,6 mm, 0,5 μm)
- Fluorescence: Ex=
480 nm, Em= 520 nm
LOQ: 0,3 μg/L

Wang


và HPLC

Chiết bằng nước, lọc qua màng Cột Alltima C18

cộng

sự, UV

PVDF, SPE với Oasis HLB và LC-MS (150×2,1mm,

Cơm

2008 [15]

Bond Elut-Accucat cartridges

3 μm)
UV 210 và 225 nm

rang

LOD: 6 μg/kg;
WR: 50–2000 μg/L
Độ thu hồi: 78–107%
Khoshnam

HPLC-

Loại béo bằng n-hexan, làm khơ, C18-AQ (2 ×250


và cộng sự, UV

chiết bằng acetone và nước, lọc, mm)

2010

Khoai

bay hơi đến khô, hòa tan lại

[13]

tây

LOD: 2,46 ng/g

chiên

WR: 20–400 ng/g

UV 202 nm

Độ thu hồi:84,53–
98,37%
Geng

và HPLC-

Chiết bằng nước, loại protein Cột ODS-3 C18 (250


cộng

sự. DAD

bằng dung dịch Carrez I , II, loại × 4,6 mm, Intersil)

(2011) [30]

Thực

béo bằng n-hexan, tạo dẫn xuất UV 215 nm

phẩm

với 0,1M KbrO3 và KBr trong LOD: 15 μg/kg;
Trang
11


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

giàu tinh môi trường axit, LLE với EtOAc WR: 50–2000 μg/L;
bôt

Mohammad

đã và n-Hexan 4:1, bỏ lớp trên, bay Độ thu hồi: 89,6–

chế biến


hơi tới khơ, hịa tan lại.

HPLC-

Tạo

Faraji

và DAD

cộng

sự

dẫn

xuất

102,0%
với

2- C18

naphthalenethiol

UV 254nm
WR: 50 -500 μg/L
Độ thu hồi: >90%


2018 [23]

1.2. Các nghiên cứu acrylamide trong nền mẫu bánh trung thu đã công bố
1.2.1 Phương pháp HPLC định lượng acrylamide trong thực phẩm nướng và chiên
giòn ở Trung Quốc.
Năm 2013 Haiyan Wang và cộng sự công bố phương pháp HPLC định lượng
acrylamide trong bánh Trung thu ở Trung Quốc như sau [15]:
Mẫu được mua từ các siêu thị Hualin tại Đại Đồng (tỉnh Sơn Tây, miền bắc
Trung Quốc) đựng trong túi polyethylene giữ ở 4oC.
Mẫu được nghiền nhỏ, 2 gam mẫu cho vào ống 50 ml, sau đó thêm 10 mL nước
chiết trong 30 phút ở 25oC. 50 μL Carrez I và 50 μL Carrez II đã được thêm vào các
ống ly tâm chứa mẫu để kết tủa protein, ly tâm ở 8000 vịng/phút trong 5 phút. Sau
đó, 5 mL phía trên được đưa sang ống thủy tinh, bay hơi đến gần khơ dưới dịng
nitơ. Phần cịn lại sau bay hơi được hòa tan trong 2,0 ml nước, lọc qua bộ lọc ống
tiêm 0,45 μm, làm sạch thêm bằng SPE. Trước khi phân tích bằng HPLC-UV, mẫu
được làm sạch tiếp qua các bộ lọc ống tiêm PVDF 0,2 μm và pha loãng với pha
động nếu cần thiết.
Thiết bị phân tích HPLC HP 1010 được trang bị bộ khử khí, đầu dò mảng diode
(Hewlett Packard, Wilmington, DE, USA) và buồng cột có điều khiển nhiệt độ.
Vịng mẫu 20 μL và cột Hypersil ODS-C18 250 mm 4,6 mm, 5 mm (Thermo
Scientific, Waltham, MA, USA) ở 30oC. Bước sóng phát hiện là 210 nm. Một
chương trình tách rửa gradient với pha động gồm các dung môi A và B ở tốc độ
Trang
12


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

dịng chảy 0,40 mL/phút. Dung mơi A là hỗn hợp của 10% (v/v) acetonitril và 90%
(v/v) nước chứa 0,10% (v/v) axit formic và dung môi B là acetonitril tinh khiết.

Chương trình rửa giải được áp dụng như sau: 100% A (0% B) trong 15 phút, giảm
xuống còn 20% A từ 15 đến 17 phút và giữ ở mức 20% A trong 5,0 phút, tăng lên
100% A từ 22 đến 24 phút và giữ ở mức 100% A trong 16 phút. Dưới các điều kiện
sắc ký, acrylamide và các thành phần thực phẩm khác trong các mẫu đều được tách
riêng và rửa giải.
Nghiên cứu chỉ ra rằng khi dùng soda, banking soda và một vài muối có thể làm
giảm hàm lượng acrylamide 38%. Đây có thể coi như phụ gia thực phẩm làm giảm
tối thiểu lượng acrylamide trong thực phẩm.
1.2.2 Nghiên cứu làm giảm lượng acrylamide trong khoai tây chiên và bánh Trung
thu bằng enzym L-asparaginase.
Một phương pháp can thiệp dựa vào việc tiêu thụ tiền chất (asparagine) làm giảm
lượng acrylamide mà không ảnh hưởng tới diện mạo cũng như mùi vị của thực
phẩm là dùng xúc tác sinh học emzym chuyển hóa asparagine. Năm 2017, Ran Shi
và cộng sự đã công bố enzym L-asparaginase từ Paenibacillus barengoltzii có tác
dụng làm giảm hàm lượng acrylamide trong khoai tây chiên và bánh trung thu [26].
L-asparaginases (EC 3.5.1.1) là một loại enzyme thủy phân chọn lọc xúc tác chuyển
đổi L-asparaginase thành axit L-aspartic và amoniac. Việc bổ sung chế phẩm sinh
học này khơng làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của thực phẩm vì vẫn cịn
những axit amin khác tham gia phản ứng Maillard để tạo lớp vỏ màu vàng mà
không sinh ra các hợp chất gây ung thư như acrylamide.
Sau khi phân lập và tinh chế L-asparaginases, thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của
nó tới giảm acrylamide như sau:
Lớp vỏ bánh trung thu được chuẩn bị từ bột gluten thấp (100g), đường chuyển
hóa (65g), dầu (20g). Các thành phần được trộn với các lượng PbAsnase khác nhau
(0-80 U/g bột) và bột được nhào trộn và để yên trong 60 phút ở 45°C. Sau đó, nhân
bánh (trọng lượng khoảng 1/3 lớp vỏ) được bọc trong lớp bánh trung thu và được

Trang
13



LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

tạo hình bằng khn bánh trung thu. Cuối cùng, bánh trung thu được nướng trong lò
nướng ở 180°C trong 10 phút [26].
Acrylamide trong bánh Trung thu được chiết theo quy trình của Jia và cộng sự
[32]. Dịch chiết được cô đặc bằng cách hút chân không, hòa tan trong nước khử
ion, lọc bằng màng lọc PTFE, sau đó được phân tích HPLC trang bị cột sắc ký C18
(AtlantisTM, 150 mm × 2,1 mm) và detector UV. Để tách sắc ký, nhiệt độ của lò
cột được điều chỉnh đến 30°C, và cột được rửa bằng dung dịch metanol 90% (v/v)
chứa 0,01% axit formic (v/v) ở tốc độ dòng 0,2 mL/phút . Acrylamide được phát
hiện bằng phát hiện tia cực tím ở bước sóng 205 nm.
Việc bổ sung PbAsnase trong bột bánh trung thu làm giảm đáng kể hàm lượng
acrylamide (52%, w/w) trong bánh nướng. Hàm lượng acrylamide giảm từ 654,6
μg/kg xuống còn 390 μg/kg khi liều lượng enzym tăng lên 10 U/g. Tuy nhiên, hàm
lượng đã giảm nhẹ xuống còn 316,2 μg/kg khi liều lượng enzym tiếp tục tăng lên
đến 80 U/g (Hình 1).

Hình 1: Mối liên quan nồng độ enzym và hàm lượng acrylamide [26]
1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC
1.3.1 Định nghĩa sắc ký
Sắc ký (chromatography) lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1903 do nhà thực
vật Michael C.Txvet người Nga [1].
Định nghĩa của IUPAC (1993):

Trang
14


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018


Sắc ký là một phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau
vào hai pha ln tiếp xúc và khơng hịa lẫn vào nhau được gọi là pha tĩnh và pha
động. Trong thí nghiệm của Txvett: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu
hỏa.

Hình 2: Quá trình tách các sắc tố thực vật
1.3.2 Phân loại
Có nhiều cách phân loại

Sơ đồ 4: Phân loại các phương pháp sắc ký
Trang
15


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

1.3.3 Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng
Hệ thống gồm 7 phần chính [1]:
- Hệ thống bơm (Pump system)
- Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
- Buồng cột (Column ovent – điều chỉnh nhiệt độ cột)
- Cột sắc ký (Stationary phase – pha tĩnh)
- Pha động (Mobile phase – pha động (hỗn hợp) dung mơi)
- Đầu dị (Detector)
- Hệ thống xử lý số liệu

Sơ đồ 5: Cấu tạo cơ bản của hệ thống sắc ký lỏng [1]


Trang
16


LUẬN VĂN CAO HỌC 2018

a. Hệ thống bơm cao áp

Hình 3: Bơm cao áp kiểu pittong [1]
Bơm tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định khi
thành phần pha động thay đổi. Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ
nhớt pha động và kích thước pha tĩnh. Gồm 2 chế độ:
- Chế độ đẳng dịng: thành phần pha động khơng thay đổi, thời gian phân tích dài,
độ phân giải kém
- Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay thổi trong q trình phân tích.
b. Hệ thống tiêm mẫu
Dùng đưa mẫu vào hệ thống, bao gồm van 6 cổng, vòng mẫu (loop) cho phép
tiêm một thể tích giống nhau vào thiết bị…

Hình 4: Van bơm mẫu ở vị trí load [1]

Trang
17