BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC TIẾN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM
α- GLUCOSIDAZA TỪ Aspergillus oryzae
VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. HỒNG ĐÌNH HỊA
2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ

Hà Nội - 2015


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1
2. Nội dung ............................................................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 3
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án ................................ 4
5. Bố cục luận án ...................................................................................................................... 4
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 5
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) .............................................................................................. 5
1.1.1. Khái niệm bệnh đái tháo đường ................................................................................. 5

1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ ................................................................................ 6
1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể.......... 7
1.2.1. Enzyme α-glucosidase ............................................................................................... 7
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme .............................................................................................. 7
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase ................................................................. 7
1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ ................................................ 8
1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) ............................... 10
1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp .............................................................................................. 11
1.3.2. Chất kìm hãm α-glucosidase từ động vật................................................................. 11
1.3.3. Chất kìm hãm α-glucosidase từ thực vật ................................................................. 11
1.3.4. Chất kìm hãm α-glucosidase từ vi sinh vật .............................................................. 13
1.3.5. Chất kìm hãm α-glucosidase từ A. oryzae ............................................................... 14
1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men từ đậu đỗ .................................................................... 15
1.4.1. Đỗ đen ...................................................................................................................... 15
1.4.2. Sản phẩm đậu đỗ lên men rắn .................................................................................. 16
1.5. Aspergillus oryzae và lên men rắn ................................................................................... 18
1.5.1. Đặc điểm hình thái A. oryzae ................................................................................... 18
1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.
oryzae ................................................................................................................................. 20
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon .......................................................................... 21
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ............................................................................... 22
1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng ...................................................... 22
1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A. oryzae23


1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy..................................................................... 23
1.5.3.2. Độ ẩm mơi trường ............................................................................................ 23
1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thống khí ................................................................................. 24
1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường ............................................................. 24
1.5.3.5. Tỷ lệ giống ........................................................................................................ 25

1.5.3.6. Thời gian lên men............................................................................................. 26
1.6. Thu nhận AGIs ................................................................................................................ 26
1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men............................................ 26
1.6.2. Tinh sạch AGIs ........................................................................................................ 28
1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất ......................................................................... 29
1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới ................. 34
1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam .................................................................... 37
Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 40
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 40
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu ............................................................................. 40
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................... 40
2.1.3. Mơi trường ............................................................................................................... 41
2.1.3.1. Mơi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống .................................................... 41
2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus .................................................. 41
2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn ......................................................................... 41
2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống ................................................................ 41
2.1.3.5. Đỗ đen lên men................................................................................................. 42
2.1.4. Thiết bị ..................................................................................................................... 42
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 42
2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 42
2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu ....................................................................................... 42
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc .................................................................................... 43
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc ....................................................... 43
2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.............................................................. 43
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo
phương pháp của Yamaki và Mori (2006) .................................................................... 43
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung
mơi................................................................................................................................. 44



2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và
cộng sự, (1999).............................................................................................................. 44
2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm
thực phẩm .......................................................................................................................... 45
2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan ............................................................................ 45
2.2.5. Phương pháp tính tốn, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật ....... 46
2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an tồn thực phẩm........................................... 46
2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................................... 46
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................. 47
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ..................................................................................... 47
2.3.2. Tuyển chọn A. oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .............................. 48
2.3.2.1. Phân lập A. oryzae ........................................................................................... 48
2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .................... 49
2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng
ITS1 - 5,8S - ITS2 .......................................................................................................... 49
2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A. oryzae T6 trong nhân
giống trên môi trường rắn .................................................................................................. 51
2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ....................................................................................................................... 51
2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng
của A. oryzae T6 ............................................................................................................ 51
2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ....................................................................................................................... 51
2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ....................................................................................................................... 51
2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae T6.......... 51
2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ....................................................................................................................... 52
2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae T6 ........ 52
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 ......... 52

2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A. oryzae T6 ................................................................................................ 52
2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến
khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 .............................................................. 52


2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào mơi trường
lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 .......................................... 52
2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A. oryzae T6 ................................................................................................ 53
2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành
AGIs bằng A. oryzae T6 ................................................................................................ 53
2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A. oryzae T6 ......................................................................................................... 53
2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A. oryzae T6 ......................................................................................................... 53
2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.
oryzae T6 ....................................................................................................................... 54
2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A. oryzae T6 ...................... 54
2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm ............................. 54
2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ... 54
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên
men ................................................................................................................................ 54
2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết
xuất AGIs ....................................................................................................................... 55
2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen
lên men: ......................................................................................................................... 55
2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ đỗ đen lên men ................................................................................................. 55
2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ................................................... 55

2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs .................................................. 55
2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs ....................................... 56
2.3.6.3. Thu nhận AGIs ................................................................................................. 56
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC .................................................................... 56
2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ..... 57
2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC ..................................................... 57
2.3.7. Ứng dụng AGIs ........................................................................................................ 58
2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ... 58
2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm
AGIs .............................................................................................................................. 58


2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs .................. 59
2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.
oryzae T6. .......................................................................................................................... 60
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 62
3.1. Tuyển chọn A. oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ..................................... 62
3.1.1. Phân lập A. oryzae ................................................................................................... 62
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ........................... 64
3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S ITS2 ................................................................................................................................... 65
3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A. oryzae T6 trong nhân giống trên môi
trường rắn ............................................................................................................................... 67
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A. oryzae
T6 ....................................................................................................................................... 67
3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ........................................................................................................................... 69
3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.
oryzae T6 ........................................................................................................................... 70
3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae
T6 ....................................................................................................................................... 71

3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae T6.................. 72
3.2.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae
T6 ....................................................................................................................................... 73
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A. oryzae T6 ................ 75
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 ................. 76
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A. oryzae T6 .............................................................................................................. 76
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào mơi trường lên men đến khả
năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 .......................................................................... 78
3.3.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên
men đến khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 .................................................... 79
3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của mơi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A. oryzae T6 .............................................................................................................. 81
3.3.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của mơi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs
bằng A. oryzae T6 .............................................................................................................. 82


3.3.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.
oryzae T6 ........................................................................................................................... 83
3.3.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng
A. oryzae T6 ....................................................................................................................... 85
3.3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae T6 ..... 86
3.3.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men rắn, xốp bằng A. oryzae T6 ............... 87
3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A. oryzae T6 (đỗ đen lên men) bằng
sử dụng sóng siêu âm.............................................................................................................. 89
3.4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men .......... 89
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men 90
3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất
AGIs ................................................................................................................................... 92
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ............ 94

3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs
từ đỗ đen lên men............................................................................................................... 96
3.5. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................... 102
3.5.1 Khảo sát dung môi để tinh sạch sơ bộ AGIs ........................................................... 102
3.5.2. Khảo sát nồng độ ethanol để tinh sạch sơ bộ AGIs ............................................... 103
3.5.3. Tinh sạch AGIs ...................................................................................................... 104
3.5.4. Xác định khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên
men bằng khối phổ ........................................................................................................... 107
3.5.5. Định lượng peptide AGIs của đỗ đen lên men bằng A. oryzae T6 ........................ 108
3.6. Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng
A. oryzae T6 và ứng dụng AGIs ........................................................................................... 109
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs .... 109
3.6.2. Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men
A. oryzae T6 ..................................................................................................................... 110
3.6.3. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs .. 112
3.6.4. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm AGIs cho sản xuất thử nghiệm bột uống liền AGIs
cho người bệnh ĐTĐ ....................................................................................................... 116
3.6.4.1. Xác định hàm lượng chế phẩm AGIs cho bột uống liền................................. 116
3.6.4.2. Xác định cơ chất phù hợp phối chế với chế phẩm AGIs cho công thức tạo sản
phẩm bột uống liền. ..................................................................................................... 116
3.6.4.3. Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền ............................................ 118


KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 120
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO..................................................... 121
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ................................ 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 123
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 139



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AGIs

Tên đầy đủ
alpha-Glucosidase inhibitor (chất kìm hãm α-glucosidaza ) ( chất kìm
hãm α-glucosidase) (chất ức chế α-glucosidase)

Bp

Base pair (cặp bazơ)

CFU

Colony forming unit (số đơn vị khuẩn lạc)

ĐTĐ

Đái tháo đường

đỗ đen lên đỗ đen xanh lòng lên men bằng A. oryzae T6
men
Da

Dalton

DNJ

1 – deoxynojirimycin


PCR

polymerase chain reaction

GABA

Gamma-Aminobutyric acid

GLP

Glucagon peptide

GLP-1

peptide-1 dạng glucagon

GLP-2

peptide-2 dạng glucagon

HDL

High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

IC50


Nồng độ kìm hãm 50% (Haft maximal inhibitory concentration)

ITS

Inter-Transcribed Spacer

KDa

Kilodalton

LC-MS/MS Sắc ký lỏng – song song khối phổ (Liquid Chromatography-tandem
Mass Spectrometry)
TE

10M Tris, - pH 8,0 - HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid

TPCN

Thực phẩm chức năng

WHO

World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới

p NPG

p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside

RP - HPLC


Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (Reverse phase-high performance
liquid chromatography)


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm α-glucosidase thu nhận từ vi sinh vật ............................... 14
Bảng 1.2 Một số sản phẩm đậu tương lên men và tác nhân vi sinh vật.............................. 17
Bảng 1.3 Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với
tế bào nấm mốc Aspergillus spp ......................................................................... 21
Bảng 1.4 Các ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực phẩm ......... 32
Bảng 2.1 Hàm lượng một số chất khống trong mơi trường lên men ................................ 53
Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền............................ 59
Bảng 2.3 Mười trật tự trình bày mẫu tn theo ngun tắc hình vng Williams tương
ứng với 5 mẫu khảo sát ....................................................................................... 60
Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus spp từ các nguồn khác nhau ................................. 62
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST ................ 66
Bảng 3.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng
siêu âm và khơng sử dụng sóng siêu âm ........................................................... 101
Bảng 3.4 Đánh giá sản phẩm sau các bước tinh sạch AGIs từ đỗ đen lên men................ 108
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không đến chất lượng cảm quan, hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase và thời gian cơ đến chất lượng chế phẩm AGIs... 109
Bảng 3.6 Kết quả phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng và các chỉ
tiêu lý hóa của chế phẩm AGIs ......................................................................... 113
Bảng 3.7 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, kim loại nặng và các chất không
mong muốn trong sản phẩm chế phẩm AGIs .................................................... 114
Bảng 3.8 Số liệu thử độc tính cấp của chế phẩm AGIs .................................................... 115
Bảng 3.9 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu của sản phẩm bột uống
liền ..................................................................................................................... 118



DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Mơ phỏng tiêu hóa Carbohydrate (tinh bột và đường sucrose) trong cơ thể ........ 9

Hình 1.2

Cấu trúc bộ gen của A. oryzae ............................................................................. 20

Hình 1.3

Quá trình hình thành, phát triển và vỡ tung của bọt khí ...................................... 30

Hình 2.1

Thang thị hiếu chín điểm ..................................................................................... 45

Hình 2.2

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................. 47

Hình 3.1

Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của một số A. oryzae phân lập được ............. 64

Hình 3.2

Sản phẩm PCR của chủng T6 .............................................................................. 65

Hình 3.3


Ảnh hưởng của thành phần cơ chất mơi trường rắn đến mật độ tế bào của A.
oryzae T6............................................................................................................. 68

Hình 3.4

Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến mật độ tế bào
của A. oryzae T6................................................................................................... 69

Hình 3.5

Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của mơi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.
oryzae T6 ............................................................................................................. 71

Hình 3.6

Ảnh hưởng pH ban đầu của mơi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.
oryzae T6............................................................................................................. 72

Hình 3.7

Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến mật độ tế bào của A. oryzae T6 .......... 73

Hình 3.8

Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.
oryzae T6............................................................................................................. 74

Hình 3.9


Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến mật độ tế bào của A. oryzae T6 ........ 75

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men bằng A. oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α – glucosidase và mật độ tế bào của A. oryzae T6 .............. 77
Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men
bằng A. oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................... 79
Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4, KCL và MgSO4 bổ sung vào môi
trường lên men bằng A. oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase .......... 80
Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men bằng A. oryzae T6 đến hoạt
tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................................ 81
Hình 3.14 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men bằng A. oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ........................................................................ 83
Hình 3.15 Ảnh hưởng độ đầy của khối khối mơi trường lên men bằng A. oryzae T6 đến
hoạt tính kìm hãm α - glucosidase ...................................................................... 84


Hình 3.16 Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men bằng A. oryzae T6 đến hoạt
tính kìm hãm α - glucosidase .............................................................................. 85
Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men bằng A. oryzae T6 đến hoạt tính kìm hãm
α-glucosidase ....................................................................................................... 87
Hình 3.18 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase trong quá trình lên men rắn, xốp bằng A.
oryzae T6............................................................................................................. 88
Hình 3.19 Ảnh hưởng của dung môi chiết xuất đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
(%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ......................................................... 89
Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ dung mơi ethanol đến hoạt tính kìm hãm αglucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men ...................................... 91
Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi ethanol và đỗ đen lên men đến hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase (%) của dịch chiết đỗ đen lên men ....................................... 92
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50
của dịch chiết đỗ đen lên men ............................................................................. 95
Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm

α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men .................................. 97
Hình 3.24 So sánh giá trị IC50 của AGIs thu được ở phần kết tủa và phần tan khi sử
dụng methanol, ethanol và isopropyl alcohol ................................................... 102
Hình 3.25 So sánh giá trị IC50 của chất khô ở phần tủa và phần tan khi sử dụng các nồng
độ ethanol khác nhau để làm sạch chế phẩm AGIs chiết xuất từ đỗ đen lên men . 103
Hình 3.26 Sắc ký đồ có píc của AGIs (a). Hình dạng píc của AGIs (b) ............................ 105
Hình 3.27 Sắc ký đồ mơi trường đỗ đen xanh lòng trước khi lên men (a). Sắc ký đồ
dịch sau khi lên men, trước tinh sạch (b). Sắc ký đồ AGIs sau khi tinh sạch
(c) ...................................................................................................................... 106
Hình 3.28 Khối lượng phân tử và trình tự axit amin của peptide AGIs từ đỗ đen lên
men được thực hiện bằng khối phổ. YIYEIAR ................................................ 107
Hình 3.29 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men A.
oryzae T6........................................................................................................... 110


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển với những thành tựu lớn của khoa học công nghệ và sự
nghiệp Cơng nghiệp hóa – Hiện đại hóa. Bên cạnh những thành tựu đạt được là hậu quả
ảnh hưởng tới môi trường sống của nhân loại mà con người là đối tượng trực tiếp gánh
chịu hậu quả đó. Mơi trường ô nhiễm kéo theo sự ảnh hưởng không nhỏ tới lương thực
thực phẩm dẫn tới những căn bệnh hiểm nghèo trong số đó phải kể đến bệnh đái tháo
đường (ĐTĐ).
Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF, trong một thập kỉ trở lại đây,
bệnh ĐTĐ có xu hướng phát triển nhanh chóng. Ước tính năm 2010, thế giới có khoảng
221 triệu người mắc bệnh ĐTĐ và dự báo đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (chiếm
khoảng 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ ở các nước phát triển khoảng
42%, tỷ lệ này tăng lên 170% ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) [1]. Theo Tổ

chức Y tế thế giới WHO (World Health Organization), trong vòng 20 năm tới chỉ tính
riêng châu Á, bệnh ĐTĐ bùng phát với khoảng 330 triệu người mắc bệnh sẽ nguy hiểm
hơn AIDS hay cúm gà. Ở châu Âu, năm 2005 có khoảng 19 triệu người mắc tương đương
với 4% dân số và con số này được dự báo tăng lệ 26 triệu vào năm 2030 [156].
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và thừa cân béo phì đã trở thành căn bệnh phổ biến
khơng chỉ ở các nước phát triển mà còn ở nước đang phát triển, do thay đổi trong lối sống
của người dân và thói quen ăn uống. Chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) thường được sử
dụng để ngừa bệnh ĐTĐ loại II [53]. Với cơ chế tác dụng là AGIs kết hợp với αglucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucose
đường huyết sau ăn [87]. AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:
Chiết xuất từ thực vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh học
nhờ các vi sinh vật. Các AGIs có nguồn gốc tự nhiên được đặc biệt quan tâm vì khơng gây
phản ứng phụ, do đó AGIs tự nhiên là một trong những liệu pháp hấp dẫn để điều trị tăng
đường huyết và thừa cân béo phì. Gần đây có nhiều nghiên cứu về các AGIs từ nguồn vi
sinh vật như Bacillus subtilis, Actinoplanes spp, Aspergillus oryzae (A. oryzae). AGIs được
tìm thấy trong nhiều thực phẩm lên men, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm αglucosidase, ứng dụng hỗ trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì. Sử dụng A. oryzae bằng
lên men đỗ tương đang là hướng mới cho chất chiết xuất có hoạt tính kìm hãm αglucosidase, sản phẩm AGIs từ đỗ tương lên men bằng A. oryzae hiện đang được phát triển


2
ở nhiều quốc gia, với mục đích hỗ trợ kiểm sốt đường huyết, hỗ trợ kiểm sốt thừa cân
béo phì. Trong các nghiên cứu đã công bố chủ yếu sử dụng đỗ tương (Glycine max) lên
men bằng A. oryzae để thu nhận AGIs. Tuy nhiên các thông tin công bố về bản chất và cơ
chế hình thành AGIs từ các loại đậu đỗ lên men bằng A. oryzae còn hạn chế. Chính vì thế,
việc nghiên cứu có hệ thống thu nhận AGIs từ A. oryzae lên men trên các nguồn nguyên
liệu trong nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là vấn đề cấp thiết,
mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao“Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm αglucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng” là một việc làm cấp thiết hiện nay,
được tiến hành với những mục tiêu sau:
(1) Phân lập, tuyển chọn A. oryzae phù hợp (cho quá trình lên men rắn, xốp) cho hoạt tính
kìm hãm α-glucosidase cao.
(2) Xác định quy trình thu nhận chế phẩm AGIs bằng phương pháp lên men rắn, xốp nhờ

A. oryzae nghiên cứu và xác định bản chất của AGIs hình thành bằng A. oryzae nghiên
cứu.
(3) Ứng dụng chế phẩm AGIs.
Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với nội dung sau:

2. Nội dung
- Phần 1: Tuyển chọn A. oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao:
+ Phân lập A. oryzae từ các mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương
mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội và Chợ
Đồng Xuân – Hà Nội.
+ Tuyển chọn A. oryzae phân lập được, có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao.
+ Định danh A. oryzae tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 5,8S - ITS2.
- Phần 2: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên
men, nhiệt độ, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian
nhân giống) ảnh hưởng tới quá trình nhân giống A. oryzae nghiên cứu.
- Phần 3: Xác định một số yếu tố (độ ẩm, pH ban đầu, cơ chất môi trường lên men,
thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống
ban đầu, tỷ lệ trấu môi trường rắn, độ dày khối môi trường lên men và thời gian nhân


3
giống) ảnh hưởng tới khả năng hình thành AGIs bằng A. oryzae nghiên cứu bằng lên men
rắn, xốp.
- Phần 4: Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi, nồng độ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu,
nhiệt độ, thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ mơi trường
đỗ đen xanh lịng sau lên men bằng A. oryzae nghiên cứu.
- Phần 5: Nghiên cứu tinh sạch, xác định thành phần hóa học và định lượng AGIs
được hình thành bằng A. oryzae nghiên cứu: Xác định dung môi, nồng độ dung môi cho
tinh sạch sơ bộ AGIs; Thu nhận AGIs bằng các enzyme thủy phân lần lượt với pepsin,
trypsin, pancreatin, α- amylase và maltase; Tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch AGIs bằng

sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP - HPLC); Xác định khối lượng phân tử và trình tự
amino acid của AGIs tinh sạch được phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass
spectrometer. Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng
Ludwig NR hoặc SwissPro; Định lượng hàm lượng AGIs bằng RP – HPLC.
- Phần 6: Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất AGIs bằng A. oryzae nghiên cứu và
hướng ứng dụng AGIs: Xây dựng phương pháp cô sấy dịch chiết AGIs cho tạo chế phẩm
AGIs; Đề xuất công nghệ sản xuất AGIs bằng A. oryzae nghiên cứu; Đánh giá tính an tồn
về độc tính cấp, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và an tồn thực phẩm của AGIs tạo ra
bằng A. oryzae nghiên cứu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nước ta có nguồn nguyên liệu đậu đỗ rất đa dạng và nấm mốc A. oryzae phân lập
từ tự nhiên là rất phong phú. Trong sản xuất AGIs từ nấm mốc A. oryzae người ta thường
dùng đỗ tương làm môi trường lên men [104]. Sản phẩm AGIs từ môi trường sau lên men
từ đỗ tương bằng A. oryzae cho hiệu quả giảm đường huyết đối với người bệnh ĐTĐ cao,
sử dụng an tồn và khơng có tác dụng phụ. Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các đậu
đỗ trong nước làm nguyên liệu để lên men A. oryzae cho sản xuất AGIs.
Các A. oryzae bản địa phân lập từ các nguồn nguyên liệu mẫu tương, mẫu đỗ đen
mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc lấy ở Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; Cựu Đà,
Thanh Oai, Hà Nội và Chợ Đồng Xuân – Hà Nội.
Phương thức lên men rắn, xốp được chọn lựa dựa trên điều kiện thí nghiệm đơn
giản.


4
Tinh sạch AGIs dùng cho nghiên cứu thành phần, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
và định lượng AGIs được hình thành bằng A. oryzae nghiên cứu.
Chế phẩm AGIs kỹ thuật, chỉ qua chiết xuất, làm sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng
thực tiễn trong cải thiện AGIs giúp hỗ trợ điều trị ở người bệnh ĐTĐ.


4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của
luận án
- Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới:
+ Phân lập và tuyển chọn được A. oryzae T6 ở Việt Nam cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao;
+ Xác định được quy trình thu nhận chế phẩm AGIs bằng phương pháp lên men rắn,
xốp trên môi trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels) của Việt Nam nhờ A.
oryzae T6. Bước đầu ứng dụng chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền;
+ Xác định được bản chất của AGIs này là peptide có khối lượng phân tử là
926,4861 Da.
- Kết quả luận án là cơng trình ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về
peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên mơi
trường đỗ đen xanh lịng nhờ A. oryzae (từ việc phân lập và tuyển chọn A. oryzae, các điều
kiện lên men, chiết AGIs, tinh sạch AGIs, xác định bản chất của AGIs, tạo chế phẩm
AGIs), góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm alpha
glucosidase để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ và béo phì.

5. Bố cục luận án
Luận án gồm 138 trang (khơng kể phụ lục), 16 bảng, 33 hình và 165 tài liệu tham
khảo, được trình bày 3 chương trong 7 phần lớn: Đặt vấn đề (4 trang); Tổng quan (35
trang); Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả
và thảo luận (58 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang ); Danh mục các cơng trình đã cơng
bố của luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (18 trang).


5

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)
1.1.1. Khái niệm bệnh đái tháo đường

Bệnh ĐTĐ hay còn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa
carbohydrate khi hoocmon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động vào cơ thể,
biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7 mmol/l. ĐTĐ liên quan đến rối loạn
chuyển hóa glucid, lipid, protid và điện giải. Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê và
tử vong trong thời gian ngắn nếu không được điều trị kịp thời. Tăng đường huyết kéo dài
sẽ gây ra rất nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim, mạch
vành, tai biến mạch máu não, suy thận, thần kinh, biến chứng gây mù lòa và rất nhiều biến
chứng cấp tính khác đe dọa đến tính mạng người bệnh. Riêng biến chứng tim mạch ở
những người mắc bệnh tiểu đường tăng gấp 2 - 3 lần so với những người bình thường.
Theo ước tính, tuổi thọ trung bình của bệnh nhân tiểu đường giảm 5 - 10 năm so với người
không bị tiểu đường [1].
Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO) [156] bệnh ĐTĐ
phân thành hai nhóm sau:
- Bệnh ĐTĐ typ 1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (nồng độ insulin giảm thấp
hoặc mất hoàn toàn): Do tổn thương hay suy giảm chức năng tế bào beta của tuyến tụy,
tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên bệnh nhân cần
phải tiêm hoặc uống insulin.
- Bệnh ĐTĐ typ 2 hay còn gọi là ĐTĐ không lệ thuộc insulin: Do kháng insulin kết
hợp với khả năng bài tiết insulin giảm. ĐTĐ typ 2 chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh ĐTĐ, cơ
thể người bệnh vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ khiến đường chỉ lưu hành trong máu mà
không đưa vào tế bào. Điều trị bệnh này, người bệnh áp dụng chế độ ăn uống hợp lý có thể
kiểm sốt được bệnh.
- ĐTĐ typ đặc biệt khác: Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen; giảm
hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen; bệnh tụy ngoại tiết; bệnh tụy nội tiết; tăng đường
huyết do thuốc, hóa chất; nhiễm trùng….


6
- ĐTĐ thai nghén: là bệnh được phát hiện ở những phụ nữ có rối loạn dung nạp
glucose hoặc ĐTĐ khởi phát trong thời kỳ mang thai.

Người mắc bệnh ĐTĐ nặng hay nhẹ dựa vào mức độ kiểm soát đường huyết. Có 04
mức kiểm sốt đường huyết [1].
- Mức 1: Mức kiểm soát đường huyết tốt, hàm lượng glucose trong máu < 7 mmol/l.
- Mức 2: Mức kiểm soát đường huyết bình thường, hàm lượng glucose trong máu từ
7 – 10 mmol/l.
- Mức 3: Mức kiểm soát đường kém, hàm lượng glucose trong máu từ 10 – 13
mmol/l.
- Mức 4: Mức kiểm soát đường rất kém, hàm lượng glucose trong máu > 13 mmol/l.
1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ [1, 153]
Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 1: Những người mắc bệnh ĐTĐ loại 1, họ sẽ
phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ khơng có khả năng tạo ra
hormon này. Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong hai dạng chính tùy theo tác dụng
nhanh hay chậm: Dạng tác dụng nhanh dùng ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong
cơ thể phù hợp với lượng carbohydrate sắp nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi
tối để giữ lượng đường trong máu không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau. Hiện nay,
việc uống insulin dạng viên là khơng thể vì insulin trong mơi trường dạ dày sẽ bị phân hủy.
Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong một vỏ nang thích hợp để có
thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong ruột non và ngấm vào máu.
Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 2: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân,
phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động. Chỉ bệnh
nhân ĐTĐ loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm
lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp
tiêm insulin. Hoạt chất để điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
- Nhóm hoạt chất thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea: Glyburide
(Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride (Amaryl)
và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).


7
- Nhóm hoạt chất giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide:

Metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione:
glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos)
- Nhóm hoạt chất ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng AGIs: acarbose
(Precose, Glucobay), miglitol (Glyset)...
Phương pháp kìm hãm α-glucosidase trong điều trị ĐTĐ loại 2 được ưu tiên sử dụng
vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ khơng tham gia vào q
trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sản
sinh insulin … như các phương pháp khác.

1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể
1.2.1. Enzyme α-glucosidase
1.2.1.1. Sơ lược về enzyme [19]
Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tế
bào sinh vật. Trong cuộc sống, nhờ có enzyme mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học với
một hiệu suất rất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH.
Như vậy, enzyme là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản
ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzyme sẽ biến đổi
chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzyme.
Enzyme có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác
bởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi khơng được xúc tác. Có trên 4000 phản
ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme.
Hoạt tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Tác nhân kìm hãm là các phân
tử làm giảm hoạt tính của enzyme, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng
hoạt tính của enzyme.
1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase
Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase,
glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α–D-glucosidase,
transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase



8
hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng
thủy phân).
Enzyme glucosidase là enzyme thủy phân thuộc nhóm glucosidase (α-, β- và α-1,3glucosidase) là enzyme exohydrolysis có chức năng thủy phân từ đầu khử đến đầu không
khử của oligosaccharide chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4 glycosides.
Enzyme glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường
tiêu hóa động vật... việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt
về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme...những thơng số này chỉ
có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một α-glucosidase cụ thể enzyme α-glucosidase
được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen mã hóa lysosomal α-glucosidase dài
khoảng 20 kb. Enzyme α-glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ là 4 - 4,5. α-glucosidase có
khả năng phân cắt các liên kết α -1 →4, α-1 →3 và α-1 →2 D glucoside có thể hấp thụ trực
tiếp vào máu [63]. α-glucosidase có tác dụng xúc tác thủy phân đường maltose và đường
sucrose.
Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy
phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non. Tiến trình
thủy phân này địi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để thủy phân các phân
tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp
tục phân hoá các oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu
vào máu. Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzyme α-glucosidase có thể làm giảm sự
thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu [82].

1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ
Cho đến nay, ĐTĐ vẫn là bệnh chưa thể chữa khỏi hoàn toàn. Thuốc chữa bệnh ĐTĐ
được chia thành nhóm: Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất
kìm hãm dipeptidyl peptidase IV và AGIs.
Hiện nay, rất nhiều AGIs được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh ĐTĐ
như voglibose (U.S. Pat. No. 6,200,958), acarbose (U.S. Pat. No. 5,643,874), miglitol (U.S.
Pat. No. 4,639,436)...

Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học về sử dụng AGIs để điều
trị bệnh ĐTĐ như: Tinh bột hoặc đường (sucrose), còn được gọi là carbohydrate. Cấu tạo


9
carbohydrate gồm hai hay nhiều monosaccharide (glucose hoặc fructose). Để cơ thể hấp
thụ được, carbohydrate sẽ phân cắt hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống
enzyme tiêu hóa. Dưới tác dụng của amylase, tinh bột phân cắt thành maltose. Maltose và
sucrose là các disaccharide, dưới tác dụng của α-glucosidase các disaccharide sẽ phân cắt
thành các monosaccharide ở ruột non. AGIs có thể kìm hãm hoạt tính α-glucosidase nên
ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp insullin
diễn ra dễ dàng hơn [130].

Hình 1.1 Mơ phỏng tiêu hóa Carbohydrate (tinh bột và đường sucrose) trong cơ thể [53]

Chất kìm hãm α-glucosidase có tác dụng làm tăng nồng độ peptide -1 dạng glucagon
(GLP-1) và peptide -2 dạng glucagon (GLP-2) trong huyết tương. GLP-1 và GLP-2 là các
hormon được sinh ra từ tế bào L nội tiết nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột
kết. GLP-1 kích thích sự tiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh tế bào beta. GLP-2 cải
thiện cấu trúc và chức năng của ruột non bằng cách tăng cường cấu trúc của lơng nhung và
tăng hoạt tính vận chuyển và enzyme. GLP-2 làm giảm sự viêm ruột. GLP-1 và GLP-2


10
được tạo ra khi có sự kích thích thần kinh, hormon hoặc các yếu tố dinh dưỡng. AGIs có
khả năng ngăn cả sự phân cắt carbohydrate nên kéo dài thời gian có mặt carbohydrate
trong ruột. Vì vậy một lượng lớn carbohydrate sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và
tương tác với tế bào L làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP-2. Cho rằng khi có mặt glucose ở
ngoại biên ruột non, glucose sẽ bị lên men tạo thành các axit chuỗi ngắn kích thích sự sản
xuất và tiết GLP-1 và GLP-2 hoặc quá trình vận chuyển glucose phụ thuộc vào Na khi qua

màng tế bào L sẽ kích thích tiết GLP-1 và GLP-2. Nồng độ GLP-1 trong huyết tương tăng
sẽ thúc đẩy q trình kiểm sốt glycemic và cản trở sự có mặt glucose trong máu [101].

1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor)
(AGIs)
Việc tìm kiếm các AGIs có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực
phẩm… Đã có nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có hoạt tính kìm
hãm α-glucosidase. Tuy nhiên, những tác nhân kìm hãm α-glucosidase tổng hợp bằng con
đường hóa học hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ. Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt
chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học
trên thế giới. Thông thường, việc nghiên cứu các AGIs luôn bắt đầu từ các hợp chất có
trong tự nhiên vì nguồn rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ. Do đó, các nhà khoa
học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính kìm hãm enzyme
này để định hướng trong nghiên cứu. Nhiều nước đã công bố trên các tạp chí quốc tế về
các thực vật, vi sinh vật có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với mục đích sử dụng trong
lĩnh vực thực phẩm chức năng, dược phẩm, cũng như đã trích ly được nhiều hợp chất có
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ này.
Năm 1970, người ta đã nhận ra rằng việc sử dụng các AGIs có thể kiểm soát sự hấp
thụ carbonhydrat và giúp hỗ trợ điều trị cho những người mắc bệnh ĐTĐ một cách hiệu
quả. Bản chất của các chất kìm hãm là các flavonoid, pseudooligosaccharide, thiosugars,
iminosugar, carbasugar,…có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật và vi sinh vật [63].
Hiện nay, các AGIs được chia thành các nhóm chính: Disaccharide, iminosugar,
thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugar và các hợp chất khơng có liên kết glucosidic.
AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Chiết xuất từ thực vật, động
vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường vi sinh vật [161].


11
1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp [63]
Các AGIs từ tổng hợp, như: kojibiose (2-alpha-D-glucosyl-D-glucose) là hợp chất

thuộc nhóm chất disaccharide, nó là sản phẩm caramen hóa của glucose, 3-O-(-DGlucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin, Isofagomin và Noeuromycin là hợp chất thuộc
nhóm chất iminosugar, Valiolamin, Hydroxyvalidamin và Voglibose là hợp chất thuộc
nhóm chất carbasugar và pseudoaminosugar, X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan là hợp
chất thuộc nhóm chất thiosugar và các hợp chất khơng có liên kết glycosidic.
1.3.2. Chất kìm hãm α-glucosidase từ động vật
Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra chất chiết xuất
từ Stichopus japonicas (Hải Sâm) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Nghiên cứu cho
thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở tỷ lệ nguyên liệu : dung mơi là 0,5 mg/ml thì hoạt tính
kìm hãm α-glucosidase từ nấm men là 68% và từ dịch chiết Hải Sâm đã thu được ba loại
AGIs [128].
1.3.3. Chất kìm hãm α-glucosidase từ thực vật
Năm 1997, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện salacinol từ dịch chiết của rễ và lá cây
Salacia reticulata (một loại cây bụi leo thuộc họ Celastraceae được người dân Ấn Độ và
Sri Lanka sử dụng như một loại thuốc dân gian từ lâu đời ) có hoạt tính kìm hãm αglucosidase. Salacinol có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, sucrase và isomaltase của
chuột với giá trị IC50 lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59 µg/µl. Các nghiên cứu thử nghiệm trên
chuột chứng minh salacinol có hoạt tính kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnh
hơn acarbose. Một vài nghiên cứu lâm sàng cho thấy salacinol có tác dụng kiểm sốt lượng
đường trong máu [160]. Tại Nhật Bản, salacia oblonga đã được bán như một thực phẩm
chức năng (TPCN) và nó cũng được biết đến ở Mỹ với tên gọi Saptrangi hay Ponkora.
Năm 2002, Ye và cộng đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một
loại thảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột. Kết quả cho thấy
chuột bị gây ĐTĐ bằng alloxan được uống dịch chiết này đã làm giảm lượng đường huyết
sau ăn, ổn định lượng đường trong máu lúc đói. Tuy nhiên chất chiết này khơng gây ảnh
hưởng đến sự hấp thụ glucose trong ruột non ở chuột bình thường [159].


12
Năm 2004, Kim và cộng sự nghiên cứu AGIs từ quả thể của nấm Linh chi, chiết xuất
ra được AGIs, đặt tên là SGK-3 có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với giá trị IC50 là 4,6
µg/ml, nhưng khơng có hoạt tính kìm hãm glucosidase khác [105].

Năm 2005, Li và cộng sự đã công bố dịch chiết của hoa Lựu punica granatum có
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với giá trị IC50 = 1,8µg/ml. Các thử nghiệm trên động vật
cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết này thì lượng đường trong máu của lô chuột bị
bệnh ĐTĐ đã giảm đáng kể cịn ở lơ chuột bình thường thì khơng bị ảnh hưởng [118].
Năm 2007, Nilubon và cộng sự đã công bố dịch chiêt bằng methanol từ lá cây hoa
sữa phơi khô (Alstonia scholaris) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ruột non chuột.
AGIs đã được tìm thấy trong dịch chiết này là 3-O-β-d-xylopyranosyl (1m→2")-β-dgalactopyranosude va(-)-lyoniresinol 3-O-β-d-glucopyranoside [130]. Trong đó, (-)lyoniresinol 3-O-β-d-glucopyranoside có hoạt tính kìm hãm sucrase với giá trị IC50=1,95
mM và kìm hãm α-glucosidase với IC50 là 1,43 mM; 3-O-β-d-xylopyranosyl (1m→2")-β-dgalactopyranosude chỉ kìm hãm α-glucosidase với giá trị IC50 là 1,96 mM [130].
Từ lâu đời nhân dân ta đã biết sử dụng lá vối (Cleistocalyx operculaturs) hay nụ
vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống thường ngày.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong lá và nụ vối chứa tanin, khoáng chất và vitamin…
Gần đây, các nhà khoa học của Viện Dinh dưỡng Quốc gia và Đại học phụ nữ Nhật Bản đã
công bố lá vối và nụ vối ở nước ta có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, trong đó nước chiết
từ nụ vối cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất. Các kết quả nghiên cứu trên động
vật cho thấy uống nụ vối thường xuyên có khả năng hạn chế tăng đường huyết sau ăn và hỗ
trợ ổn định đường huyết, hỗ trợ giảm lipid máu, phòng ngừa biến chứng của ĐTĐ [152].
Các nghiên cứu từ Nhật Bản đã chứng minh 1-deoxynojirimycin (DNJ) trong thành
phần cao lá dâu tằm là chất kìm hãm mạnh glucosidase và disaccharidase. DNJ ngăn cản
quá trình tạo glucose tại thành ruột và gan, từ đó làm giảm hàm lượng glucose đi vào máu.
Trong thành phần cao dâu tằm cịn chứa nhiều polyphenol mà điển hình là resveratrol, chất
này giúp tăng tính nhạy cảm của thụ thể insulin với hormone, do đó làm tăng phân hủy
glucose dư thừa. Như vậy, chiết xuất DNJ từ cao dâu tằm vừa kìm hãm tổng hợp mới, vừa
làm tăng thủy phân glucose giúp hạ đường huyết. Thêm nữa, các polyphenol còn có tác
dụng chống oxy hóa mạnh, giúp chống lại quá trình peroxide hóa lipid, từ đó giúp ngăn


13
ngừa các rối loạn chuyển hóa lipid dẫn đến nguy cơ gây biến chứng thành mạch ở bệnh
nhân ĐTĐ [108].
Năm 2009, Preecha và cộng sự đã nghiên cứu hai AGIs là corchorusides A và B từ

dịch chiết lá cây Corchorus olitorius, một loại rau có tác dụng hạ đường huyết của Thái
Lan, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với IC50 lần lượt là 0,18 ± 0,03 µM, 0,72 ± 0,03 µM
[139].
Trên thực tế cịn rất nhiều lồi thực vật chứa AGIs đã được nghiên cứu và công nhận.
Tuy nhiên, sản xuất các AGIs từ thực vật trên quy mô lớn cũng tốn kém và phức tạp.
1.3.4. Chất kìm hãm α-glucosidase từ vi sinh vật
Việc sản xuất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các
nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an tồn, khơng có các tác dụng
phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay một số chủng vi sinh vật như: A. oryzae, Actinomucor
elegans, Rhizopus arrhizus, Streptomyces, Actinoplanes, Flavobacterium saccharophilium,
Saccharomyces cerevisiae, Bacillus sp...đã được nghiên cứu cho hình thành AGIs [99, 106,
56]. Một số AGIs phổ biến như: Acarbose là một pseudotetrasaccharite được thu nhận từ
canh trường lên men Actinoplanes spp. SE-50. Validamycin A từ Streptomyces
hygroscopicus var. limoneus. Adiposin, trestatin B, cyclophellitol và CKD – 711 được lấy
từ Streptomyces calvus TM – 521, Streptomyces dimorphogenes và Phellinus sp. AGIs từ
A. oryzae là hướng nghiên cứu mới.
Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài Actinoplanes
SE50) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị IC50 = 0,5µM. Nó là chất bột mầu
trắng, có tác dụng kìm hãm α-glucosidase ở niêm mạc ruột, làm chậm quá trình thủy phân các
di-, oligo-, poly-saccharide thành monosaccharide là dạng có thể hấp thụ được. Acarbose
khơng làm tăng tiết insulin, khơng gây giảm glucose trong máu lúc đói khi dùng trị liệu ở
người. Acarbose có tên hóa học là: O-4,6-didesoxy-4-[(1S,4R,5S,6R]-4,5,6,trihydroxy-3hydroxy-methyl-2-cyclohexne-1-amino]-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranosyl-(1-4)D-glucopyranose;

O-4,6-didesoxy-4-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6,trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-

cyclohexen-1-yl]

amino]-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D-

glucose. Cơng thức hóa học là: C25H43NO18, có khối lượng phân tử: 645.63, khi hịa tan trong

nước có pKa là 5,1. Sau Acarbose, năm 1984, Kameda và cộng sự đã tìm ra valiolamine là
AGIs từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã