BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC

NGUYỄN THANH THƠI

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
AURAMINE O VÀ RHODAMINE B
TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HĨA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - THÁNG 05/2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC

NGUYỄN THANH THƠI – 40.201.091

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
AURAMINE O VÀ RHODAMINE B

TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN:
ThS. HUỲNH THỊ NHÀN
ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐHSP TP. HCM

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
TP. HCM, ngày 05 tháng 05 năm 2018

NHẬN XÉT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên khóa luận:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ
RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN
Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thanh Thơi

Cán bộ phản biện:
40.201.091

ThS. Phan Thị Hoàng Yến

Số trang

_______

Số chương

_______

Số bảng số liệu

_______

Số hình vẽ

_______

Số tài liệu tham khảo

_______

Sản phẩm

_______


Đánh giá Khóa luận
1. Về cuốn báo cáo:

2. Nhận xét của chủ tịch hội đồng:

Điểm khóa luận:
Nguyễn Thanh Thơi: ………../10
Chủ tịch Hội đồng

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐHSP TP.HCM

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ
RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN
Cán bộ hướng dẫn:
ThS. HUỲNH THỊ NHÀN
ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG
Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2017 đến tháng 5/2018.

Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN THANH THƠI – 40201091
Nội dung đề tài:
 Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời Auramine O và
Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối
detector tử ngoại khả kiến. Sử dụng quy trình đề xuất phân tích một số mẫu thực
tế.
 Phạm vi: Phân tích trên nền một số mẫu thực phẩm (cải chua, măng, thịt gà).
 Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector tử ngoại khả kiến.
 Kết quả mong đợi của đề tài: Nghiên cứu đề xuất điều kiện HPLC tối ưu để
phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B, đề xuất được quy trình xử lý
một số mẫu thực phẩm và phân tích trên một số nền mẫu thực tế.
TP. HCM, ngày 05/05/2018
Sinh viên

iii


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung
và cơ Huỳnh Thị Nhàn đã hướng dẫn em tận tình, hỗ trợ và giúp đỡ em từ những ngày
đầu thực hiện đến khi hồn thành đề tài:
“Nghiên cứu quy trình xác định Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Dược Sài Gịn
(Sapharcen), cô Lê Thị Hồng Vân (giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Trường
Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh), thầy Huỳnh Lời, anh Lê Văn Huấn đã hỗ trợ
và hướng dẫn em sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA và cho
em những lời khun bổ ích trong q trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bửu Đăng, cô Văn

Thị Cẩm Duyên, cô Phạm Thị Thảo Uyên, thầy Võ Công Minh, thầy Nguyễn Ngọc Hưng
đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành thực nghiệm và các thầy cơ Khoa Hóa – trường
Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền cho em những kiến thức quý báu
trong những năm tháng em học ở trường.
Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến gia đình, anh chị, bạn bè và tất cả những người
luôn ở bên cạnh em, động viên, ủng hộ, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này.
Đặc biệt, em muốn cảm ơn bạn Phan Thị Ngọc Trinh đã cùng em thực hiện đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2018
Nguyễn Thanh Thơi

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
AOAC (Assosiation of Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hóa phân tích
chính thức.
PDA (Photodiode array): Đầu dò diode quang.
LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry): Sắc ký lỏng khối phổ.
HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
ICH (International Conference on Harmonization): Hội nghị quốc tế về hài hịa hóa.
ISO (International Organization for Standardization): Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa.
LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện.
LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng.
S

N

(Signal to noise ratio): Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu.

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam.

STT: Số thứ tự.
AO: Auramine O.
RB: Rhodamine B.

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Phân loại sắc ký theo pha tĩnh ............................................................................. 9
Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn ........................................................................................ 18
Bảng 2.2. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC .................................. 18
Bảng 2.3. Danh mục hóa chất tinh khiết ............................................................................ 19
Bảng 2.4. Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA ............. 24
Bảng 2.5. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .............. 28
Bảng 2.6. Lấy mẫu và thơng tin mẫu ................................................................................. 28
Bảng 3.1. Kết quả bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong MeOH
và trong ACN...................................................................................................................... 32
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi pha động ................................................................ 33
Bảng 3.3. Khảo sát các giá trị pH sử dụng acid acetic ....................................................... 33
Bảng 3.4. Khảo sát pH = 3 sử dụng acid formic ................................................................ 34
Bảng 3.5. Khảo sát pH = 2,3 và 2,6 sử dụng H3PO4 .......................................................... 35
Bảng 3.6. Chương trình gradient khảo sát tốc độ dòng ..................................................... 37
Bảng 3.7. Khảo sát tỉ lệ dung mơi ban đầu ........................................................................ 39
Bảng 3.8. Chương trình gradient tối ưu ............................................................................. 39
Bảng 3.9. Dữ liệu nồng độ và diện tích AO, RB thu được khi tiến hành chạy sắc ký ...... 40
Bảng 3.10. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn .............................. 42
Bảng 3.11. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của AO ....................................... 43
Bảng 3.12. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của RB ....................................... 43
Bảng 3.13. Diện tích của các chất phân tích và giá trị B i' tương ứng ở mỗi nồng độ ....... 44
Bảng 3.14. Bảng các giá trị Ftính của các chất phân tích ..................................................... 44

Bảng 3.15. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ....................................................................... 46
Bảng 3.16. Thể tích chiết và diện tích peak sắc ký ............................................................ 47
Bảng 3.17. Kết quả phân tích mẫu măng ........................................................................... 49
Bảng 3.18. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu măng ............................................................. 49
Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu cải chua ....................................................................... 52
Bảng 3.20. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu cải chua ......................................................... 52
Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu thịt gà .......................................................................... 53
vi


Bảng 3.22. Hệ số thu hồi AO và RB của mẫu thịt gà ........................................................ 53

vii


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Auramine O ..................................................................... 3
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của Rhodamine B................................................................... 4
Hình 1.3. Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ .......................................................... 8
Hình 1.4. Hệ thống sắc ký khí ............................................................................................. 9
Hình 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng ........................................................................................... 9
Hình 1.6. Hình ảnh minh họa sắc ký đồ............................................................................. 10
Hình 1.7. Hình ảnh minh họa peak sắc ký ......................................................................... 10
Hình 1.8. Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss ........................................ 12
Hình 1.9. Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết ........................................... 13
Hình 1.10. Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký ..................................................... 14
Hình 1.11. Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC ....................................................... 15
Hình 2.1. Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi ...................... 21
Hình 2.2. Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6 ..................................................... 22
Hình 2.3. Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S N ..................................... 26

Hình 2.4. Khảo sát thể tích dung mơi chiết ....................................................................... 29
Hình 3.1. Sắc đồ khảo sát pH = 3 sử dụng acid acetic ...................................................... 34
Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hệ số khơng đối xứng theo pH ............................................. 34
Hình 3.3. Sắc đồ khảo sát pH = 3,0 sử dụng acid formic .................................................. 35
Hình 3.4. Sắc đồ khảo sát pH = 2,6 sử dụng acid phosphoric ........................................... 35
Hình 3.5. Sắc đồ chạy đẳng dịng với dung mơi MeOH – HCOOH (pH = 3)................... 36
Hình 3.6. Sắc đồ chạy đẳng dịng với dung mơi ACN – HCOOH (pH = 3) ..................... 36
Hình 3.7. Sắc đồ chạy đẳng dịng với dung mơi ACN – đệm acetate ............................... 37
Hình 3.8. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dịng 0,6 mL/phút......................................... 37
Hình 3.9. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút......................................... 38
Hình 3.10. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dịng 0,85 mL/phút..................................... 38
Hình 3.11. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dịng 1 mL/phút.......................................... 38
Hình 3.12. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Auramine O.................... 41
Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Rhodamine B ................. 41
viii


Hình 3.14. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ở nồng độ 0,02 ppm ............................. 45
Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ở nồng độ 0,05 ppm ............................. 46
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích peak vào các lần chiết AO (a) và RB (b) ............. 47
Hình 3.17. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .............................................................................. 48
Hình 3.18. Các sắc ký đồ phân tích mẫu măng ................................................................. 50
Hình 3.19. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của AO .................................................... 51
Hình 3.20. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của RB .................................................... 51

ix


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................................ v
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................... vi
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1. Auramine O ...........................................................................................................3
1.1.1. Cấu tạo ................................................................................................................. 3
1.1.3. Ứng dụng ............................................................................................................. 3
1.1.4. Độc tính................................................................................................................ 3
1.2. Rhodamine B .........................................................................................................4
1.2.1. Cấu tạo ................................................................................................................. 4
1.2.2. Tính chất .............................................................................................................. 4
1.2.3. Ứng dụng ............................................................................................................. 5
1.2.4. Độc tính................................................................................................................ 5
1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký ................................................................ 7
1.4.1. Khái niệm sắc ký ................................................................................................. 7
1.4.2. Phân loại .............................................................................................................. 8
1.4.3. Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................. 9
1.5. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)......................................................14
1.5.1. Bình chứa pha động ........................................................................................... 15
1.5.2. Bộ phận khử khí ................................................................................................. 15
1.5.3. Bơm cao áp ........................................................................................................ 16
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 18
2.1. Hóa chất và dụng cụ ............................................................................................ 18
2.1.1. Hóa chất ............................................................................................................. 18
2.1.1.1. Chất chuẩn ................................................................................................... 18
2.1.1.2. Dung mơi ..................................................................................................... 18
2.1.1.3. Các hóa chất khác ........................................................................................ 19
2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu .................................................. 19
x



2.1.2.1. Trang thiết bị ............................................................................................... 19
2.1.2.2. Dụng cụ ....................................................................................................... 20
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 20
2.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC ............................................ 20
2.2.1.1. Khoảng bước sóng của detector PDA ......................................................... 20
2.2.1.2. Thăm dị thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18 ......... 20
2.2.2. Tối ưu hóa pha động .......................................................................................... 21
2.2.2.1. Khảo sát dung môi pha động ....................................................................... 21
2.2.2.2. Khảo sát pH ................................................................................................. 22
2.2.2.3. Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động .......................................... 23
2.2.2.4. Tốc độ pha động .......................................................................................... 23
2.2.3. Thẩm định phương pháp .................................................................................... 23
2.2.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ................................................................................ 24
2.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ............................................................ 25
2.2.3.3. Giới hạn phát hiện ....................................................................................... 26
2.2.3.4. Giới hạn định lượng .................................................................................... 27
2.2.3.5. Độ đúng ....................................................................................................... 27
2.2.4. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm ......................................................................... 28
2.2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu........................................................................... 28
2.2.4.2. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm .................................................................. 29
2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả............................................................. 29
2.2.5.1. Xử lý kết quả dựa trên đường chuẩn ........................................................... 29
2.2.5.2. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm ...................................................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 32
3.1. Điều kiện phân tích HPLC ..................................................................................32
3.1.1. Bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong các dung mơi .. 32
3.1.2. Tối ưu hóa pha động .......................................................................................... 32
3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động ....................................................................... 32
3.1.2.2. Khảo sát pH pha động ................................................................................. 33

3.1.2.3. Khảo sát chương trình dung mơi pha động với chế độ đẳng dòng ............. 36
xi


3.1.2.3. Khảo sát tốc độ dòng ................................................................................... 37
3.2. Thẩm định phương pháp .....................................................................................40
3.2.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc....................................................................................... 40
3.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn của AO và RB ....................................................... 40
3.2.2.2. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn ......................... 42
3.2.2.3. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng ................................................ 42
3.2.2.4. Kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp ................................................. 43
3.2.3. Giới hạn phát hiện.............................................................................................. 44
3.2.4. Giới hạn định lượng ........................................................................................... 45
3.2.5. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ......................................................................... 46
3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực tế ......................................................... 47
3.3.1. Quy trình chiết mẫu ........................................................................................... 47
3.3.2. Mẫu măng .......................................................................................................... 48
3.3.2.1. Phân tích mẫu măng và xác định hệ số thu hồi ........................................... 48
3.3.2.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu măng ............................... 50
3.3.3. Mẫu cải chua ...................................................................................................... 51
3.3.3.1. Phân tích cải chua và xác định hệ số thu hồi............................................... 51
3.3.3.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu cải chua ........................... 52
3.3.4. Mẫu thịt gà ......................................................................................................... 53
3.3.4.1. Phân tích mẫu gà và xác định hệ số thu hồi ................................................ 53
3.3.4.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu thịt gà .............................. 53
3.3.5. Kết quả khảo sát mẫu thực tế ............................................................................. 54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 55
4.1. Kết luận ...............................................................................................................55
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 57

PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 60

xii


MỞ ĐẦU
Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề thời sự của xã
hội và mang tính chất tồn cầu. Thực phẩm trên thị trường rất đa dạng và có nhiều
nguồn gốc khác nhau (thực phẩm trong nước, thực phẩm được nhập khẩu từ nhiều
nước khác trên thế giới). Trong thực phẩm, ngoài các thành phần tự nhiên có sẵn thì
người cung ứng thường bổ sung thêm các chất gọi là phụ gia thực phẩm để bảo quản
hoặc tạo màu sắc sản phẩm.
Tuy nhiên, một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế hoặc do hiểu biết còn hạn
chế đã thêm những chất không được phép vào thực phẩm gây ảnh hưởng nghiêm trọng
đến sức khỏe của người tiêu dùng. Trong những năm gần đây, vấn nạn thực phẩm
nhiễm Auramine O và Rhodamine B được phát hiện ngày càng nhiều, không chỉ xảy
ra ở Việt Nam mà còn một số quốc gia khác trên thế giới, chẳng hạn như Trung Quốc.
Auramine O và Rhodamine B là các chất được sử dụng chủ yếu trong công
nghiệp nhuộm. Phân tử của các chất này chứa nhiều hệ liên hợp, trong đó có vịng
benzene. Khi ăn phải các thực phẩm nhiễm Auramine O hoặc Rhodamine B dù với
hàm lượng lớn hay nhỏ đều gây ra những biến đổi khơng tốt đối với cơ thể và có thể
để lại những hậu quả lâu dài. Vì thế, yêu cầu phân tích định tính và định lượng hai chất
này trong thực phẩm đang rất được quan tâm.
Trong nước, số lượng tác giả nghiên cứu phân tích đồng thời Auramine O và
Rhodamine B trong thực phầm hầu như chưa có. Các đề tài phân tích riêng rẽ
Rhodamine B và đặc biệt là Auramine O còn rất hạn chế mặc dù các chất màu này đã
được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu.
Qua những tài liệu, những bài báo đã cơng bố trên các tạp chí uy tín, chúng tơi
thấy rằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tốt để định
tính và định lượng hai thành phần này trong các mẫu thực phẩm.

Vì vậy, dựa trên thực tế đó cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật
chất vốn có của phịng thí nghiệm Bộ mơn Hóa Phân Tích – trường Đại học Sư phạm
Thành Phố Hồ Chí Minh và Trung tâm khoa học Cơng nghệ Dược Sài Gịn
(Sapharcen) – trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tơi tiến hành
thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B
trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử
ngoại khả kiến”.
1


Đề tài này nhằm mục đích nghiên cứu xây dựng một phương pháp xác định đồng
thời hai chất màu này trong thực phẩm và tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Auramine O
Auramine O (Vàng ô) là tên gọi thương mại của chất thuộc phân nhóm ketoimine[2].
1.1.1. Cấu tạo
Tên IUPAC: bis[4-(dimethylamin)phenyl]methanimium chloride
Tên khác: Basic yellow 2, pyocatanium auremine, pyoktanin yellow, canary
yellow, pyoktanin, C.I
Công thức phân tử: C17H22N3Cl
Khối lượng mol: 303,84 gam/mol
Cơng thức cấu tạo:
NH.HCl

N


N

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Auramine O
Ở điều kiện thường, Auramine O là tinh thể hình kim vàng[2]. Auramine O tan tốt
trong nước, ethanol[2] và một số dung môi hữu cơ khác.
Điểm nóng chảy: 267oC (513oF và 540K)
pKa: 9,8 và 10,7
Bước sóng hấp thụ (  max ) cực đại: 370 nm và 435 nm[19][20][21]
Bước sóng phát xạ: 550nm
1.1.3. Ứng dụng
Auramine O là chất nhuộm hữu cơ, được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp
nhuộm vải, gỗ, giấy, …. [2].
1.1.4. Độc tính
Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế của Tổ chức y tế thế giới
(WHO/IARC), chất vàng ô là chất đứng hàng thứ 5 trong 116 chất có khả năng gây
ung thư hàng đầu trên thế giới.
Khi thí nghiệm trên động vật sống, Auramine O được báo cáo là gây tổn thương
DNA trong tế bào gan, thận và tủy xương. Sau khi thực hiện thí nghiệm DNA nhiễm
Auramine O của dịng tế bào người trong ống nghiệm thì các nhà khoa học phát hiện
rằng DNA bị hư hại nghiêm trọng.

3


Auramine O dễ tan trong nước, ethanol. Nó là một loại thuốc nhuộm có tính
base. Một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế đã thêm Auramine O vào đậu nành,
thức ăn cho cá để làm thay đổi màu sắc sản phẩm[23], làm chất phụ gia trong chế biến
thức ăn gia súc và làm chất tạo màu trong cơng nghiệp thực phẩm[2]. Các dữ liệu về
độc tính cho thấy rằng Auramine O kích thích nhẹ đến niêm mạc da, có thể gây ra

viêm kết mạc, và gây kích ứng đường hơ hấp trên. Khi con người hít phải hoặc tiếp
xúc với Auramine O thì có thể bị ngộ độc, gây ung thư, với hàm lượng lớn có thể phá
hủy DNA, tế bào gan, thận và tủy[2].
1.2. Rhodamine B
1.2.1. Cấu tạo

COOH

H3C

N

O

N

CH3

ClH3C

CH3

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của Rhodamine B
Tên IUPAC:
[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]diethylammonium cloride
Tên khác: Rhodamine 610, CI pigment Violet 1, Basic Violet 10
Công thức phân tử: C28H31N2O3Cl
Khối lượng phân tử: 479,01 (gam/mol)
1.2.2. Tính chất
Ở điều kiện thường, Rhodamine B là chất dạng bột màu đỏ. Rhodamine là phân

tử chứa nhóm azo (chất có liên kết –N=N– trong cấu tạo phân tử) nên tan được trong
dầu[3], trong nước (50 mg/mL tạo dung dịch màu tím đỏ) và dung mơi hữu cơ như
methanol (70 mg/mL), ethanol, tan nhẹ trong acetone[3]. Nhiệt độ nóng chảy của
Rhodamine B là 210°C – 211°C[3].
Tỉ trọng tương đối: 0,79 g/cm3
Bước sóng hấp thụ cực đại (  max ): 550 nm[3]; 520 nm[23]; bước sóng hấp thụ cực
đại trong ethanol 526 nm[3]

4


pK a,[R + ][H+ ][RH+ ]  3, 2 (Cl 0,1M, 25o C)

Bước sóng phát xạ: 580 nm.
1.2.3. Ứng dụng
Rhodamine B được sử dụng để tạo màu và nhộm màu trong cơng nghiệp sợi,
nhuộm màu trong phịng thí nghiệm[3][13], nhuộm màu trong xét nghiệm tế bào (do khả
năng bền màu và phát quang màu tím đỏ).
Rhodamine B phát huỳnh quang nên được ứng dụng nhiều trong công nghệ
sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dịng chảy, quang phổ
huỳnh quang … Tuy nhiên, nếu dùng Rhodamine B để nhuộm thực phẩm sẽ gây ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe con người.
1.2.4. Độc tính
Theo Ủy ban an tồn thực phẩm của Châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc
nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban Châu Âu đã quy định rõ các
chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm nên khơng
có giới hạn cho phép đối với nhóm chất nhuộm này[6].
Rhodamine B cũng đã được cảnh báo là chất có thể gây độc cấp tính và mãn tính.
Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới cho thấy rằng Rhodamine B có thể gây
ung thư, đột biến nếu da tiếp xúc trực tiếp với chất này. Nếu Rhodamine B dính vào

người, nó có thể gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da mắt ... Nếu hít phải hơi chất này
thì sẽ gây ra triệu chứng ho, ngứa cổ, khó thở đau ngực. Nếu ăn phải thức ăn chứa
Rhodamine B, nó gây nơn mửa, gây hại cho gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng
như có thể gây ung thư[4][6].
Thực nghiệm trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5
mg/kg qua đường ăn uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch. Rhodamine B đi vào cơ thể, nó có
thể bị chuyển hóa thành amine thơm tương ứng, chất này có phần độc hại hơn
Rhodamine B và đây cũng chính là nguyên nhân gây ung thư. Khi Rhodamine B
chuyển hóa thành các dẫn xuất và tồn tại trong cơ thể thì nó và các dẫn xuất của nó sẽ
tác động mạnh mẽ đến các q trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan[6]. Một số
thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc DNA và nhiễm sắc
thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào. Do tính độc hại của Rhodamine B rất lớn nên hầu hết
các quốc gia trên thế giới đều cấm sử dụng chất này trong thực phẩm.

5


1.3. Lịch sử nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngồi nước
Cơng trình số 27 trong danh mục tài liệu tham khảo[27] nhóm tác giả đã nghiên
cứu phương pháp xác định Rhodamine B có trong ớt khơ, nước ép trái cây và rượu
vang đỏ. Các chất phân tích có trong ớt khơ, nước ép trái cây, rượu vang đỏ đã được
chiết với acetonitrile. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò huỳnh
quang (HPLC – Flu) được sử dụng để xác định các chất phân tích. Thành phần pha
động gồm đệm phosphate có nồng độ 3 g/mol và methanol (3:7, tỉ lệ thể tích), pH
được điều chỉnh để đạt giá trị 7,0 bằng acid orthophosphoric. Kết quả đường chuẩn
tuyến tính với khoảng nồng độ chất chuẩn từ 1-100 ppb. LOD của Rhodamine B là 0,1
ppb trong ớt khô; 0,2 ppb trong cả hai loại thức uống là nước ép trái cây và rượu vang
đỏ. LOQ của Rhodamine B đối với ớt khô là 0,6 ppb, nước ép trái cây 0,5 ppb và rượu
vang đỏ 0,5 ppb. Hệ số thu hồi trung bình của Rhodamine B là 98,2% – 110,3% trong
ớt khô, 94,6% – 102,2% trong nước ép trái cây, và 90,4% –104,6% trong rượu vang

đỏ. Độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp này là 2,3% – 9,0%.
Cơng trình số 23[23] trong danh mục tài liệu tham khảo, các tác giả đã sử dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV-Vis để xác định 7 loại
phẩm màu khơng được có trong thực phẩm bao gồm Auramine O, Basic Orange, Acid
Orange II, Acid Orange, Rhodamine B, Para Red và Sudan I. Các mẫu thực phẩm như
đậu nành, thịt được chiết bằng acetonitrile, methanol và kiềm. Các mẫu gia vị được
chiết bằng acid acetic và acetonitrile 70%, cột sắc ký (250mm x 4,6mm x 5µm), pha
động methanol – 50 mmol/L amonium acetate (dùng H3PO4 điều chỉnh pH đến 4,5).
LOD trong khoảng 0,01 – 0,1 mg/L; LOQ trong khoảng 0,175 – 1,25 mg/kg. Hệ số thu
hồi trung bình lớn hơn 80%; độ lệch chuẩn tương đối (RSD, n = 3) trong phạm vi
2,04% – 5,66%.
Cơng trình “Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao”[6] của nhóm các tác giả Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân
(Viện dinh dưỡng quốc gia). Các tác giả đã phân tích các mẫu bột ớt, bột cà ri, bột sa
tế sử dụng phương pháp HPLC. Trong đề tài này, Rhodamine B trong mẫu được hòa
tan trong hỗn hợp acetonitrile/acetone, dịch chiết được lọc, ly tâm, lấy dung dịch xác
định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dị UV – Vis ở bước
sóng 550 nm, cột pha đảo RP C18 (150mm x 4,6mm x 5µm). LOD thu được 0,2 ppm,
LOQ là 0,6 ppm. Bài báo cũng chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích
mẫu bao gồm:
6


+ Sử dụng thiết bị siêu âm để chiết Rhodamine B từ nền mẫu cho thấy
Rhodamine B không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không quá 70oC.
+ Thời gian chiết tách và chạy sắc ký tốt nhất được thực hiện trong ngày, sang
các ngày tiếp theo nồng độ Rhodamine B có giảm nhưng khơng đáng kể, ngày thứ 4
thì nồng độ Rhodamine B giảm đi một nửa.
Tác giả Lê Thị Hường Hoa đã “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác
định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm”[3] – trong luận án tiến

sĩ dược học của mình. Rhodamine B là một trong số các chất mà tác giả đã phân tích.
Đối tượng phân tích của tác giả này là mỹ phẩm. Điều kiện sắc ký là cột sắc ký
Hypersil ODS (C18), (5µm x 200mm x 4,6 mm) hoặc tương đương, nhiệt độ cột là
30oC, tốc độ dịng là 1 ml/phút. Bước sóng phát hiện Rhodamine B là 535 nm, vùng
quét phổ 275 – 760 nm, thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Thời gian sắc ký 35 phút. Pha động
được sử dụng là dung dịch tetrabutylammonium (TBA) 0,005 M – nước (75 : 25, theo
thể tích). LOD của Rhodamine B là 0,8 ppm. Tác giả không đề cập đến LOQ.
1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký[4][5]
1.4.1. Khái niệm sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự tương tác của
các hợp chất với hai pha là pha động và pha tĩnh.
Các thành phần của hệ sắc ký bao gồm pha động, pha tĩnh và chất phân tích.
Pha động là một hệ dung mơi chảy qua vật liệu nhồi, pha tĩnh là một lớp phủ trên
vật liệu nhồi và tương tác với các chất phân tích, vật liệu nhồi là một bề mặt rắn mà
trên đó pha tĩnh liên kết với nhau.
Các chất phân tích tương tác mạnh mẽ nhất với pha tĩnh sẽ mất nhiều thời gian để
đi qua hệ thống hơn so với những chất tương tác với pha tĩnh yếu hơn.
Những tương tác này xảy ra trong một hệ thống sắc ký thường là các tương tác
mang bản chất hóa học, nhưng trong một số trường hợp, tương tác vật lý cũng có thể
được sử dụng trong sắc ký.

7


Hình 1.3. Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ
1.4.2. Phân loại
Sắc ký có thể được phân loại dựa trên loại pha động, pha tĩnh và vật liệu nhồi.
1.4.2.1. Phân loại theo hệ pha
Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký đầu tiên dựa trên loại pha động được sử dụng
trong hệ thống. Theo cách phân chia này, có hai loại sắc ký là sắc ký khí (GC) với pha

động là chất khí và sắc ký lỏng (LC) với pha động là chất lỏng.
Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký cũng có thể dựa trên loại pha tĩnh trong hệ
thống. Hai cách phân chia này có thể được tóm tắt trong bảng sau:

8


Bảng 1.1. Phân loại sắc ký theo pha tĩnh
Loại sắc ký

Tên phương pháp

SẮC KÝ KHÍ
Sắc ký khí – rắn

Sắc ký khí – lỏng

Sắc ký liên kết pha khí
Hình 1.4. Hệ thống sắc ký khí
Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)

SẮC KÝ LỎNG

Sắc ký phân bố

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử

Hình 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng

1.4.2.2 Phân loại theo vật liệu nhồi

Các kỹ thuật sắc ký cũng có thể phân loại dựa trên vật liệu nhồi được sử dụng
trong hệ thống. Với cách phân loại này, có các kỹ thuật sắc ký cột nhồi, sắc ký mao
quản, sắc ký bản mỏng.
1.4.3. Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.3.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng của sắc ký lỏng. Đây là một kỹ
thuật mà theo đó một mẫu hỗn hợp các chất được tách thành các thành phần để định
tính, định lượng và tinh chế. Trong HPLC, khả năng tách chất dựa vào sự tương tác
của chất phân tích với các thành phần của pha động và pha tĩnh, trong đó tương tác
giữa chất phân tích với pha động là quan trọng[5].

9


1.4.3.2. Các đặc trưng của sắc ký lỏng hiệu năng cao
i) Sắc ký đồ
Sắc ký đồ là một đáp ứng điển hình thu được bằng phương pháp sắc ký. Sắc ký
đồ cho thấy sự phụ thuộc của nồng độ so với thời gian rửa giải.

Hình 1.6. Hình ảnh minh họa sắc ký đồ
Trong đó, tR được gọi là thời gian lưu; tM (hoặc to) là thời gian chết; Wb là độ
rộng đường nền trong một đơn vị thời gian lưu; Wh là độ rộng bán phổ (tức là độ rộng
của peak sắc ký ở chiều cao bằng nửa chiều cao của peak sắc ký) trong một đơn vị thời
gian.
ii) Peak sắc ký
Chiều rộng peak và vị trí peak xác định sự phân tách các chất trong kỹ thuật sắc
ký.


Hình 1.7. Hình ảnh minh họa peak sắc ký
Sự phân tách của các chất trong sắc ký phụ thuộc vào hai yếu tố là sự khác biệt
trong việc giữ lại các chất phân tích (tức là sự khác biệt về thời gian lưu hoặc thể tích
cần thiết cho sự rửa giải chúng) và bề rộng của mỗi peak sắc kí phải hẹp.
iii) Thời gian lưu
Thời gian lưu (tR) của chất phân tích hoặc thể tích lưu (VR) trong sắc ký có liên
quan trực tiếp đến độ mạnh trong sự tương tác giữa chất phân tích với các pha động và
pha tĩnh.

10


Sự lưu giữ chất phân tích trên một cột nhất định liên quan đến các chi tiết của hệ
thống sắc ký đó bao gồm kích thước của cột, tốc độ dịng của pha động. Trong đó, tốc
độ dịng trung bình của pha động có thể được tính thơng qua biểu thức: v 

L
với L là
tR

chiều dài của cột sắc ký.
iv) Hệ số dung lượng k '
Hệ số dung lượng ( k ' ) là một “thước đo” phổ biến hơn của thời gian lưu, được
xác định từ tR theo biểu thức: k ' 

tR  tM
. Vì vậy, hệ số dung lượng k ' cũng liên quan
tM

trực tiếp đến độ mạnh của sự tương tác giữa một chất phân tích với các pha tĩnh và pha

động.
Hệ số dung lượng rất hữu ích trong việc so sánh kết quả thu được trên các hệ
thống sắc ký khác nhau vì hệ số này không phụ thuộc vào chiều dài cột và tốc độ dịng
chảy.
Ngồi ra, giá trị của hệ số dung lượng cũng rất hữu ích trong việc tìm hiểu các cơ
chế lưu giữ chất phân tích, vì theo như định nghĩa cơ bản của k’ là:
k' 

mol As.p
mol A m.p

Với mol As.p đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha tĩnh và mol Am.p
đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha động ở trạng thái cân bằng. Ở vị trí
tâm của peak sắc ký sẽ là nơi mà cân bằng đạt được hoặc nơi đó chính là lân cận của
cân bằng.
Biểu thức hệ số dung lượng chỉ ra rằng nếu k ' càng nhỏ thì tR càng nhỏ và sự
tách trong trường hợp này kém. Ngược lại, nếu k ' lớn thì tR lớn khi đó peak bị dỗng.
Trong thực tế, đối với hỗn hợp ít cấu tử, k ' dao động trong đoạn từ 1 đến 5 là tối ưu.
Còn đối với hỗn hợp nhiều cấu tử k ' dao động trong nửa khoảng từ 1 đến 10.
v) Hiệu năng tách
Về mă ̣t lý thuyế t, hiệu năng tách liên quan đến các quá trình động học khác nhau
bao gồm sự lưu giữ chất phân tích và sự vận chuyển các chất trong cột sắc ký.
Về mă ̣t thực nghiê ̣m, hiệu năng tách liên quan đến độ rộng peak sắc ký của chất
phân tích. Hiệu năng tách có thể được đánh giá thơng qua việc xác định độ rộng hoặc
độ lệch chuẩn (  ) của các peak. Một kỹ thuật tách với hiệu năng cao sẽ tạo ra những

11


peak sắc ký hẹp (peak sắc ký hẹp có nghĩa là có sự khác biệt nhỏ trong tương tác tách

hai chất phân tích).

Hình 1.8. Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss
Giá trị  có thể được xác định từ độ rộng của các peak nếu chúng ta giả sử hình
dạng của peak tuân theo phân bố Gauss (phân bố chuẩn). Khi đó, Wb = 4  và Wh =
2,354  . Giá trị này phụ thuộc vào thời gian chất phân tích lưu giữ trong cột ( k ' hoặc
tR).
vi) Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết (N) dùng để so sánh hiệu năng của một hệ thống đối với các chất
phân tích có thời gian lưu giữ khác nhau. N được xác định từ tR và  thông qua biểu
t


thức: N  ( R )2 . Đối với các peak sắc ký có hình dạng Gauss, N có thể được xác định
2

2

 t 
 t 
bằng biểu thức: N  16  R  hoặc N  5,54   R  . Ngoài ra, giá trị N cũng có thể
 Wh 
 Wb 

được tính thơng qua thời gian lưu (tR), chiều cao đĩa lý thuyết (H) và diện tích peak sắc
ký (Speak) theo biểu thức: N  2  (

tR  H 2
) .
Speak


Giá trị N đối với một cột càng lớn thì khả năng tách hai chất của cột đó càng cao.
N phụ thuộc vào chiều dài của cột sắc ký, không phụ thuộc vào sự lưu giữ chất phân
tích.

12