BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

DƢƠNG THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN
HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY THẠCH CHÂU
(Pyrenaria sp.), HỌ CHÈ (Theaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
DƢƠNG THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN
HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY THẠCH CHÂU
(Pyrenaria sp.), HỌ CHÈ (Theaceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. Phƣơng Thiện Thƣơng
TS. Bùi Hồng Cƣờng

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phƣơng Thiện
Thƣơng, Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu và TS. Bùi Hồng
Cƣờng, Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội là những
ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, ln động viên, chỉ bảo tận tình và tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên Khoa Hóa phân tích –
Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu và Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội đã ln tận tình, tạo điều kiện thuận lợi và hết lịng giúp đỡ tơi
trong suốt q trình thực hiện luận văn này.
Sau cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em và bạn
bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên tơi trong suốt q trình học tập, nghiên
cứu và hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2016
Học viên

Dƣơng Thị Hảo


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................…1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Chi Pyrenaria .....................................................................................................3
1.1.1. Thực vật học ....................................................................................................3
1.1.2. Công dụng trong sử dụng dân gian.................................................................5
1.1.3. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học......................................................5
1.2. Gốc tự do và các chất chống oxi hóa .................................................................6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................9
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................9
2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................9
2.2.1. Thuốc thử, dung mơi, hố chất........................................................................9
2.2.2. Phương tiện và máy móc ...............................................................................10
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................11
2.3.1. Nghiên cứu các đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học .....................11
2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ...................................................................12
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa của các phân đoạn cao và các hợp
chất phân lập được trên test in vitro và mơ hình in vivo .......................................20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................26
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật..........................................................................26
3.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học.............................................26
3.1.2. Đặc điểm vi học .............................................................................................28
3.2. Định tính thành phần hóa học ..........................................................................33
3.2.1. Định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng .........................................33
3.2.2. Định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng ..............................................34
3.2.3. Kết quả định lượng polyphenol tổng số ........................................................39
3.3. Chiết xuất phân lập một số hợp chất trong Thạch châu ...................................40
3.3.1. Chiết xuất và chuẩn bị cao phân đoạn ..........................................................40
3.3.2. Phân lập các hợp chất tinh khiết...................................................................41
3.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất phân lập được ......................................42



3.3.4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ Thạch châu. ..............45
3.4. Tác dụng chống oxy hóa trên test in vitro và mơ hình in vivo ........................51
3.4.1. Thử tác dụng trên test in vitro dọn gốc tự do DPPH. ..................................51
3.4.2. Thử tác dụng trên test in vitro dọn gốc tự do Superoxyd .............................53
3.4.3. Thử tác dụng chống oxy hóa trên mơ hình in vivo ........................................54
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................57
4.1. Về thực vật .......................................................................................................57
4.2. Về thành phần hóa học .....................................................................................58
4.3. Về tác dụng chống oxi hóa và mối liên quan với thành phần hóa học ............59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................62
Kết luận ...................................................................................................................62
Kiến nghị .................................................................................................................62


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

BuOH

n- Butanol

13

Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

C-NMR

DCM


Dichlorometha

DPPH

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

DTNB

5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

MS

Mass Spectrometry (phổ khối lƣợng)

GSH


Glutathione

Hex

n-Hexan

HPLC

High performance liquid chromatography

IC50

Inhibitory concentration 50%

IR

Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại)

IUCN

International Union for Conservation of Nature

MDA

Malonyl dialdehyd

NMR

Nuclear Magnetic Resonance


OD

Optical Density

POL

Lipid peroxidation

Rf

Retardation Factor

RSD

Relative standard devition

SD

Standard devition

SKLM (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

SOD

Superoxide dismutase

ROS/RNS/RCS

SRSA

Reactive oxygen species/ reactive nitrogen species/ reactive
chlorine species
Superoxide radical scavenging activity


TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TNB

5-thionitrobenzoic acid

UV-VIS

Ultra violet – Visible


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1. Cách pha hỗn hợp thử nghiệm phản ứng với DPPH

21

Bảng 3.1. Kết quả định tính hóa học các nhóm chất trong Thạch châu


33

Bảng 3.2. Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất PJE1 so sánh với chất

45

-amyrin và β-amyrin
Bảng 3.3. Bảng số liệu phổ NMR của chất PJE2 so sánh với chất α-

48

tocopherolquinon
Bảng 3.4. Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất PJE3 so sánh với chất

50

Phytol.
Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do DPPH các phân

51

đoạn từ mẫu Thạch châu
Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do DPPH các hợp

52

chất phân lập từ mẫu Thạch châu
Bảng 3.7. Bảng Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do Superoxyd


53

các phân đoạn từ mẫu Thạch châu
Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do Superoxyd các hợp

53

chất phân lập từ mẫu Thạch châu
Bảng 3.9. Hàm lƣợng MDA trong gan chuột (nmol/ 100mg gan)

55

Bảng 3.10. Hàm lƣợng GSH trong gan chuột (nmol/ 100mg gan)

56


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Một số chất chống oxi hóa thƣờng gặp trong tự nhiên

8

Hình 2.1. Một số hình ảnh cây Thạch châu (Pyrenaria jonquieriana

9


Pierre ex Laness.)
Hình 2.2. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu Thạch châu nghiên cứu

19

Hình 2.3. Cơng thức cấu tạo các dạng chuyển hóa của DPPH

20

Hình 2.4. Sơ đồ Thiết kế thí nghiệm trên chuột

24

Hình 3.1. Ảnh cơ quan sinh dƣỡng cây Thạch châu nghiên cứu

26

Hình 3.2. Ảnh cơ quan sinh sản mẫu Thạch châu nghiên cứu

27

Hình 3.3. Hình ảnh vi phẫu cắt ngang lá mẫu Thạch châu nghiên cứu

28

Hình 3.4. Hình ảnh vi phẫu thân cây Thạch châu

30

Hình 3.5. Một số đặc điểm bột lá và hoa Thạch châu


31

Hình 3.6. Một số đặc điểm bột thân Thạch châu

32

Hình 3.7. Kết quả định tính phân đoạn Hex của cây Thạch châu

35

Hình 3.8. Kết quả định tính phân đoạn EtOAc của cây Thạch châu

36

Hình 3.9. Kết quả định tính phân đoạn BuOH của cây Thạch châu

37

Hình 3.10. Kết quả định tính trong phân đoạn EtOH (C) và phân đoạn

38

nƣớc (N)
Hình 3.11. Kết quả định tính trong phân đoạn EtOH (C) và phân đoạn

39

nƣớc (N)
Hình 3.12. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn cao mẫu Thạch châu


40

Hình 3.13. Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ Thạch châu

42

Hình 3.14. Sắc ký đồ định tính các hợp chất phân lập đƣợc từ phân

43

đoạn EtOAc của mẫu Thạch châu nghiên cứu
Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập

44

Hình 3.16. Cơng thức cấu tạo chất PJE1 (β-amyrin)

47

Hình 3.17. Cơng thức cấu tạo chất PJE2 (α-tocopherolquinon)

49

Hình 3.18. Cơng thức cấu tạo chất PJE3 (phytol)

51


Hình 3.21. Tác dụng của thạch châu đến hàm lƣợng MDA trong gan


54

chuột bị gây độc bởi CCl4
Hình 3.22. Tác dụng của thạch châu đến hàm lƣợng GSH trong gan
chuột bị gây độc bởi CCl4.

55


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến 80% dân số trên
thế giới có sử dụng dƣợc liệu trong chăm sóc sức khỏe và ít nhất có 25% các loại
thuốc hiện đại có nguồn gốc (trực tiếp hay gián tiếp) từ dƣợc liệu [12]. WHO
cũng luôn khuyến nghị các nƣớc quan tâm đến việc dùng các thuốc cổ truyền vào
chăm sóc sức khỏe ban đầu, đánh giá mức độ an toàn và hiệu quả cũng nhƣ bảo
đảm nguồn cung cấp những thuốc này. Trong vài thập kỷ gần đây, với xu hƣớng
“Trở về với thiên nhiên”, nhiều nƣớc trên thế giới đã đẩy mạnh nghiên cứu, trồng
trọt, bào chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, từ cây, con làm
thuốc để hỗ trợ, phòng ngừa và điều trị bệnh.
Chi Pyrenaria là một chi nhỏ trong họ Chè (Theaceae) với khoảng hơn 26
loài trên thế giới [29]. Các loài trong chi thƣờng mọc ở vùng núi cao, khí hậu mát
mẻ ở Trung Quốc, Đông Bắc của Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản (Đảo Ryukyu),
Malaysia, Myanmar, Philippines, Thailand, Việt Nam. Gần đây chúng tơi phát
hiện lồi thạch châu Pyrenaria jonqueiana Pierre mọc nhiều tại các tỉnh vùng
Tây Nguyên nƣớc ta. Lá thạch châu đƣợc dân địa phƣơng sử dụng làm nƣớc
uống hàng ngày có tác dụng giải nhiệt, mát gan, lợi mật, tăng cƣờng sức đề
kháng... Tra cứu tài liệu trên thế giới có rất ít những nghiên cứu về chi Pyrenaria.
Tại Việt Nam, mới có một nghiên cứu Nguyễn Văn Dũng và cộng sự đã chứng
minh dịch chiết EtOH từ lá của lồi Pyrenaria jonqueiana Pierre có tác dụng ức

chế mạnh hoạt tính của pepsin và protease HIV-1, do đó có khả năng ngăn sự
nhân lên của virut HIV [11]. Nhƣ vậy, đến nay cịn có rất ít các nghiên cứu về
thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng .
Từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng chống oxy hóa của cây Thạch châu (Pyrenaria sp.), họ Chè
(Theaceae)” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định được chính xác tên khoa học
của mẫu nghiên cứu.

1


2. Định tính được các nhóm hợp chất và phân lập 2-3 hợp chất từ mẫu
nghiên cứu.
3. Thử tác dụng chống oxy hóa của dược liệu và các hợp chất phân lập
được.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chi Pyrenaria
1.1.1. Thực vật học
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Theo các tài liệu tham khảo, chi Pyrenaria đƣợc phân loại nhƣ sau [29]:
Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ (Order): Thạch lam (Ericales)
Họ (Family) : Chè (Theaceae)
Chi (Genus): Thạch Châu (Pyrenaria).

1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây bụi hoặc cây gỗ lớn, lá thƣờng xanh. Lá mọc đối, mép lá khía rãng cƣa.
Hoa đơn, mọc ở nách, có cuống nhỏ. Cánh hoa ngồi 5 (hoặc 6), xếp đè lên nhau,
kéo dài, không đều, bên trong màu nâu và nhẵn [14]. Cánh hoa trong 5 (hoặc ít
hơn), màu trắng hoặc màu vàng nhạt. Nhị nhiều, nhẵn, bao phấn cao, mọc thẳng.
Nhụy cao, có 3-5 nỗn. Quả đơn, cứng, tự mở, thƣờng chứa 2 hạt mỗi noãn. Hạt
khơng cánh, vỏ mịn. Rốn hạt lớn, khơng có nội nhũ, lá mầm mỏng [29].
1.1.1.3. Phân bố
Chi Pyrenaria là một chi nhỏ trong họ Chè (Theaceae) khoảng hơn 26 loài
trên thế giới [29]. Các loài trong chi thƣờng mọc ở vùng núi cao, khí hậu mát mẻ
ở Trung Quốc, Đơng Bắc của Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản (Đảo Ryukyu),
Malaysia, Myanmar, Philippines, Thailand, Việt Nam.
Hiện nay, theo phân loại của dự án “The plant list”, chi Pyrenaria có 18
lồi [52]. Cịn thực vật chí Trung Quốc cơng bố chi Pyrenaria có khoảng 26 lồi
trên thế giới nhƣng chỉ có 13 lồi đƣợc tìm thấy ở Trung Quốc [29].
Ở Việt Nam, chi Pyrenaria đƣợc cơng bố có 04 lồi bao gồm: P.
garraetiana, P. jonqueriana, P. polianeana, P. serrata mọc tạo Sapa, Bạch Mã
(Huế), Đà Lạt, Quảng Trị [14].

3


1.1.1.4. Một số loài trong chi Thạch châu mọc tại Việt Nam
a. Pyrenaria garretiana Craib. - Thạch châu Garrett
* Đặc điểm thực vật: cây gỗ lớn cao khoảng 8 m; nhánh có lơng dày nâu, nhánh
già nâu tro [14]. Lá có nhiều lá dày, cứng, xoan thon ngƣợc, dài 10-14 cm, rộng
4-5cm, mặt trên có màu vàng, gân phụ khơng đều, có 11-13 cặp, bìa có răng
nhọn; cuống dài 1 cm có lơng phún nâu. Hoa có cọng 5mm; lá hoa 2 -1 cm; lá đài
dạng lá hoa; cành hoa dài 18mm, dính nhau ở đáy; tiểu nhụ ngắn, vàng; vịi nhụy
5. Quả nhân cứng, hình trịn hoặc xoan, kích thƣớc 18x20mm [29].

* Phân bố: Cây mọc ở Sapa [14].
b. Pyrenaria jonqueriana Piere. - Thạch châu Jonquier
* Đặc điểm thực vật:.
Cây gỗ lớn, cao từ 7m đến 12 m [29] (một số thuộc đại mộc cao 18 m [14]).
Cành chia làm nhiều nhánh. Lá mọc so le, hình mác thn, đầu nhọn, phiến lá
dài, mỏng [14], [29] (kích thƣớc khoảng 9-14 x 2,5-4,5cm) [29], mép khía răng
cƣa lớn, mặt dƣới nâu lúc khô. Hoa không cọng, mọc ở nách, màu hơi vàng hay
trắng, có 11-13 phiến hoa, phiến to nhất cao 1,5cm, cánh hoa ngồi có nhiều lơng
mịn, cánh hoa chóp lõm, màu ngà, 3-6 hàng tiều nhụy vàng, nỗn 3 buồng. Quả
nhân cứng dài 3,5cm có 1-3 hạt [14], [29]. Hạt nén, thn dài, vỏ sáng bóng. Hoa
nở vào tháng 5-7, có quả tháng 10-12 [29].
* Phân bố: Cây mọc nhiều vùng núi cao (độ cao từ 800 m đến 1700m) ở các
nƣớc Đông Nam Á và vùng Châu Mỹ [14],[29]. Ở Việt Nam đƣợc tìm thấy nhiều
ở Vọng Phu, Bạch Mã, Đà Lạt [14].
c. Pyrenaria polilaneana Gagn.. - Thạch châu Poilane
* Đặc điểm thực vật: cây gỗ lớn cao khoảng 13 m; nhánh non mãnh, không lông.
Lá dài 7-10cm [14], không lông, tái ở mặt dƣới (nâu lúc khơ), bìa có răng. Hoa
trắng, rộng 3cm; lá đài nhƣ tơ ở mặt ngồi; cành hoa dính nhau ở đáy; tiểu nhụy
nhiều; nỗn sào 3 buồng, có lơng nhún, vịi nhụy 3. Quả nhân cứng tròn, dẹp dẹp,
to 3,5cm; hạt to khoảng 20x8 mm [29].
* Phân bố: Cây mọc ở vùng núi cao một số nơi nhƣ Quảng Trị, Bạch Mã (Huế)
[14].

4


d. Pyrenaria serrata Bl.. - Thạch châu răng cƣa
* Đặc điểm thực vật: Cây gỗ lớn, lâu năm, cao khoảng 10m; nhánh trịn, có lơng
mịn [14]. Lá hình bầu dục thon mƣợt, dài khoảng 7-10 cm, rộng 3-5cm, đáy từ từ
hẹp trên cuống dài 1,5-2cm, lúc cịn non có màu nâu nhạt, nâu đậm lúc già. Quả

có nhân cứng to, bẹp, đầu lõm, rộng 2,5-3cm [29].
* Phân bố: cây mọc ở vùng núi cao khoảng 800m tại Ba Vì, Hà Nội.
1.1.2. Công dụng trong sử dụng dân gian
Tại Châu Á, các loài trong chi Pyrenaria đƣợc dùng giải nhiệt, giải cảm phong
hàn, mát gan, có tác dụng tãng, trị phù thũng, nhức mỏi [9]. Ngoài ra chúng đƣợc
dùng chữa tê thấp, đau gân xƣơng, sốt, viêm sƣng, phù thũng, kiết lỵ, xuất huyết,
lở loét, rửa vết thuơng [12].
1.1.3. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học
Hiện nay các nghiên cứu về chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại
theo các phƣơng pháp mới nhƣ Protein hay ADN và hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu
về thành phần hóa học và tác dụng sinh học [35].
Dịch chiết methyl ethyl ceton của một số loài thuộc chi Pyrenaria đã đƣợc
chứng minh là có tác dụng ức chế β-ADN polymerase. Cũng từ dịch chiết này
ngƣời ta đã tách đƣợc acid ellagic là một hợp chất phenolic tự nhiên chống oxy
hóa đƣợc tìm thấy trong nhiều loại trái cây và rau quả [36]. Các đặc tính kháng
sinh của các axit ellagic có thể là do khả năng trực tiếp ức chế sự gắn kết của
ADN gây ung thƣ nhất định, bao gồm cả chất nitrosamin và polycyclic aromatic
hydrocarbon [35].
Cũng nhƣ với các chất chống oxy hóa polyphenol, acid ellagic có tác dụng
giảm stress oxy hóa [43].
Theo một nghiên cứu của Serram NP và cộng sự, cao chiết MeOH của
Pyrenaria sp. có tác dụng tăng tiết chất nhày và chống oxy hóa mạnh liên quan
đến tác dụng làm tăng số lƣợng các tế bào tiết nhày của dạ dày [44].
Hiện nay chƣa có nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý
của cây Thạch châu ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới.

5


Năm 2015, trong nghiên cứu về hoạt tính ức chế pepsin và protease HIV-1

từ cao chiết các dƣợc liệu, Nguyễn Văn Dũng và các cộng sự đã công bố cao
chiết EtOH 96% tỷ lệ 1 : 10 (1 g dƣợc liệu đƣợc ngâm trong 3-4 ngày với 10 ml
EtOH, lặp lại 2 lần) của lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Piere) có
hoạt tính ức chế pepsin (thử nghiệm theo phƣơng pháp của Anson cải tiến với cơ
chất hemoglobin) mạnh tƣơng đƣơng với một số dƣợc liệu nhƣ Bơ (hạt), Gối hạc
(lá), Ma hoàng (cả cây), Ổi (lá)… cao hơn một số loại nhƣ Côm láng, Đơn mặt
trời, Đơn tƣớng quân, Trà hoa Đà Lạt, Viễn chí lá nhỏ… [11].
Các lồi thuộc chi Pyrenaria hầu hết đều thuộc sách đỏ IUCN và chƣa có
nhiều nghiên cứu [51].
1.2. Gốc tự do và các chất chống oxi hóa
Thủ phạm hủy hoại sự sống bắt đầu từ những tiểu phân đặc biệt, phát ra từ
chuỗi hơ hấp tế bào tạo năng lƣợng. Đó là các gốc tự do. Gốc tự do làm sai lệch
cấu trúc và làm rối loại thông tin trên những phân tử sinh học, vật chất di chuyền
và tế bào. Đây là nguyên nhân của nhiều tiến trình bệnh lý, ung thƣ, tim mạch,
đái tháo đƣờng, lão hóa và cái chết theo lập trình. Chống gốc tự do, sử dụng chất
chống oxy hóa là chìa khóa cho một cuộc sống khỏe mạnh, lâu dài, mục tiêu của
y dƣợc hoc cổ truyền và hiện đại.
 Gốc tự do
Gốc tự do là các tiểu phân có điện tử tự do. Chúng có tác dụng oxy hóa cao, có
vai trị phân hủy, tổng hợp hóa học thơng qua bẻ gãy các liên kết để tạo liên kết
mới. Trong sinh học là các quá trình dị hóa, tổng hợp, bảo bệ và điều hịa. Gốc tự
do đƣợc hình thành qua hai con đƣờng: [31]
-

Nội sinh trong cơ thể gồm : chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể, q
trình peroxyd hóa lipid (POL) và từ các phản ứng tạo gốc oxy hóa
trong cơ thể.

-


Ngoại sinh do tác động của mơi trƣờng: các tia phóng xạ, bức xạ; ô
nhiễm môi trƣờng (ngoại môi) gây ô nhiễm cơ thể (nội mơi) nhƣ chất
dị sinh là các hóa chất, trừ sâu, diệt cỏ gây nhiều phản ứng Fenton

6


nguy hiểm, Stress oxy hóa là sự quá tải gốc tự do, làm mất cân bằng
nghiêm trọng giữa sự gia tăng đột biến các ROS/RNS/RCS và sự cạn
kiệt các tác nhân chống oxy hóa (Antioxidants) trong cơ thể.
 Các chất chống oxy hóa
“ Chất chống oxy hóa (Antioxidants) bảo vệ cơ thể, theo nghĩa rộng bất cứ
các chất nào ở nồng độ thấp, có thể kết hợp với một cơ chất oxy hóa và làm chậm
hoặc ngăn cản sự oxy hóa của cơ chất đó “ - định nghĩa cuả Halliwell. Thơng
thƣờng khi hoạt động, các chất chống oxy hóa sẽ nhƣờng electron cho các gốc tự
do, làm cho chúng trở thành trung hịa và do đó ít có khả năng phản ứng hơn
Các chất chống oxy hóa đƣợc chia thành 2 loại [31] :
-

Enzym chống oxy hóa: superoxide dismutase (SOD), catalase và
glutathion

-

Các chất phi enzym : là các antioxidant không phải là enzym cũng
đƣợc tổng hợp trong cơ thể nhƣng rất ít, chủ yếu là từ nguồn thức ăn
bổ sung. Hiện nay các nguồn bổ sung antioxidant nguồn gốc thiên
nhiên đƣợc quan tâm và sử dụng nhiều do tính an tồn, khả năng hấp
thu của nó. Antioxidant chính yếu, phổ biến nhất là vitamin C, Lipoic
acid, beta-caroten, Coenzym Q10 và vitamin E. Mỗi antioxidant có tác

dụng riêng với từng loại gốc tự do ở mỗi tế bào, chúng cộng tác với
nhau để loại trừ gốc tự do

-

Trong tự nhiên cũng có rất nhiều thực vật chứa hoạt chất đã đƣợc
chứng minh có khả năng chống oxy hóa nhƣ: Vitamin E trong đậu
xanh, cà rốt, xà lách, dầu thực vật; các flavonoid và phenolic nhƣ:
catechin, rutin…Chính vì vậy, cần có thêm nghiên cứu, phát hiện
những thành phần hoạt chất trong nhiều loại thực vật có tác dụng
chống oxy hóa.

7


Các tocopherol

Vitamin A

Kaempferol

Coenzym Q10

Quercetin

Rutin

OH

OH

HO

O

HO

OH
O
O

O
OH

O

1

HO

O
OH

1

O

OH
OH
OH


CH3
OH
OH

OH
OH

O

Hình 1.1. Một số chất chống oxi hóa thƣờng gặp trong tự nhiên

8


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu: cành mang hoa và lá của cây Thạch châu đƣợc thu hái tại xã
Mê Linh, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 02 năm 2015. Mẫu sau khi
thu hái đƣợc rửa sạch, một phần tƣơi để nghiên cứu về thực vật. Phần mẫu còn
lại đƣợc phơi khơ, đựng trong 2 lần túi PE kín và lƣu trữ tại Phịng Lƣu mẫu,
Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu.

A. Hình ảnh cành và nụ

B. Hình ảnh hoa

Hình 2.1. Một số hình ảnh cây Thạch châu jonqueriana
(Pyrenaria jonquieriana Pierre ex Laness.).
Mẫu đƣợc giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội theo Phiếu giám định số 02/2015. Tiêu bản thực vật đƣợc lƣu tại

Phòng tiêu bản cây thuốc, Bộ môn Thực vật với số hiệu là HNIP/18110/15 ( Phụ
lục 1).
2.2. Hóa chất và thiết bị
2.2.1. Thuốc thử, dung mơi, hố chất
2.2.2.1. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất
- Hex, dichloromethan (DCM), EtOAc, cloroform (CHCl3), MeOH, aceton,
BuOH đạt tiêu chuẩn phân tích và tách chất.

9


- Bản sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
GF254 (Merck), RP18 (Merck).
- Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck).
- Thuốc thử hiện màu dùng trong sắc ký lớp mỏng (dung dịch acid H2SO4 10 %
trong EtOH hoặc vanilin 1% trong H2SO4 10 % trong EtOH ).
2.2.2.2. Hóa chất và động vật sử dụng cho thử nghiệm sinh học
 Hóa chất thí nghiệm
- 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) của hãng Wako(Mỹ) mã số 047-04051,
- Xanthin của hãng Sigma mã số 1001097986.
- Đƣờng deoxyribose của hãng Merck mã số121649-5G .
- Enzym xanthin oxidase của hãng Sigma mã số 1001097986.
- Thuốc thử NBT của hãng Sigma.
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu của hãng Merck mã số 1090010100.
- Chất chuẩn acid gallic của hãng Sigma (Mỹ).
- Chứng dƣơng Quercetin của hãng Sigma (Mỹ).
- Vitamin E viên nang hàm lƣợng 100mg của Cơng ty Dƣợc phẩm Cửu Long.
- Hố chất tinh khiết: KCl, acid tricloracetic, acid thiobarbituric, HCl 0,1N
chuẩn, acid acetic, BuOH, CCl4 , dầu olive ...
 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả hai giống đực và cái, trọng lƣợng 2022 g đƣợc cung cấp bởi Học Viện Quân Y. Chuột đƣợc nuôi ổn định trong phịng
động vật ở nhiệt đơ 25±1 ˚C, thức ăn và nƣớc uống không hạn chế. Chuột đƣợc
nuôi ổn định 1 tuần trƣớc khi đƣợc sử dụng làm thí nghiệm.
2.2.2. Phương tiện và máy móc
- Dụng cụ thủy tinh: ống nghiệm, bình cầu, pipet paster, đĩa petri, bình tam
giác…
- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO).
- Cân phân tích (Presica X620M, độ chính xác 0,0001g)
- Cân kỹ thuật điện tử (Presica X220A, độ chính xác 0,001g).
- Tủ sấy (Binder M50, Đức).

10


- Cân xác định độ ẩm (MX60-HR).
- Máy cất quay chân không (Buchii R – 220, Thụy Sĩ)
- Cột thuỷ tinh dùng cho sắc ký cổ điển.
- Kính hiển vi Zeiss Axioskop 40 và kính hiển vi soi nổi Krussoptroni.
- Máy cắt vi phẫu bằng tay.
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon G10.
- Máy chấm mẫu sắc ký lớp mỏng Limonat 5 của hãng Camag (Thụy sĩ).
- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU
- Máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 Nicolet
- Máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa
học Công nghệ Việt Nam
- Máy đo phổ NMR Brruke AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học
thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
- Máy định lƣợng sinh hoá bán tự động Scout
- Máy nghiền đồng thể nội tạng (IKA MF 10.2 Impact grinding head).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu các đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học
* Phân tích hình thái thực vật .
- Mơ tả đặc điểm hình thái theo phƣơng pháp ghi trong tài liệu phân loại thực vật
[4], [5].
- Phân tích hoa trên kính hiển vi soi nổi và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
* Nghiên cứu các đặc điểm vi học theo tài liệu hướng dẫn [2].
* Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu
- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi, lồi trong các tài liệu hƣớng dẫn [9].
- Đối chiếu với các tài liệu chuyên sâu, tiêu bản đang lƣu tại các phịng tiêu bản
đƣợc cơng nhận.

11


2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.2.1. Phương pháp định tính bằng phản ứng hố học đặc trưng
Chuẩn bị mẫu: Sấy khô Thạch châu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C. Đem ra
tán nhỏ bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ
thống mát, khơ ráo để làm các phản ứng hóa học định tính theo tài liệu [5].
a) Định tính nhóm acid amin, acid hữu cơ, đƣờng khử, polysaccharid
Lấy 2g bột Thạch châu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất, đun sơi
cách thủy 5 phút, lọc nóng thu đƣợc dịch chiết làm phản ứng.
* Định tính acid amin: Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vào 3
giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sơi cách thủy 10 phút. Nếu có acid amin sẽ
dịch xuất hiện màu xanh tím.
* Định tính acid hữu cơ: Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vài
tinh thể Na2CO3 khan. Nếu có acid hữu cơ sẽ xuất hiện bọt khí nổi lên.
* Định tính đường khử: Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm
0,5ml thuốc thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B, đun sơi cách thủy 15
phút. Nếu có đƣờng khử sẽ xuất hiện tủa màu đỏ gạch.

* Định tính polysaccharid: Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm
0,5ml dung dịch Lugol, đun sơi cách thủy 2 phút. Nếu có polysaccharid, dịch lọc
chuyển thành màu tím đỏ.
b) Định tính nhóm alkaloid
Cho khoảng 10 g bột Thạch châu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm
bằng dung dịch amoniac đặc, đậy kín bình trong 30 phút. Cho thêm 15ml
cloroform, lắc đều, để yên trong 3 giờ. Lọc, dịch chiết cho vào bình gạn, chiết 2
lần, mỗi lần với 10 ml dung dịch H2SO4 1N. Gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3
ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid và thêm các thuốc thử đặc trƣng:
- ống 1: thêm 2 thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ có tủa nâu.
- ống 2: thêm 2 thuốc thử Dragendorff, nếu có alkaloid sẽ có tủa đỏ cam.
- ống 3: thêm 2 thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ có tủa trắng.

12


c) Định tính nhóm anthranoid
- Phản ứng Borntraeger: Lấy 3g bột Thạch châu cho vào bình nón dung
tích 100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10%, đun cách thủy sôi 15 phút, lọc
nóng vào bình gạn. Để nguội rồi lắc với 5ml cloroform. Gạn lớp cloroform để
làm phản ứng. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch cloroform. Lấy 1 ml
dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch amoniac
10%. Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nƣớc sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp
cloroform có màu vàng chứng tỏ trong Thạch châu có acid chrysophanic. Thêm
tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất
màu vàng còn lớp nƣớc sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.
Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung
dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Nếu có anthranoid lớp nƣớc sẽ có màu đỏ sim.
Anthranoid tồn phần (dạng glycosid và dạng tự do) đƣợc định tính hồn
tồn tƣơng tự nhƣng trong bƣớc chiết xuất ban đầu thay thế 5 ml nƣớc cất bằng 5

ml H2SO4 1N.
- Vi thăng hoa: Cân khoảng 3g bột Thạch châu vào một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên
bếp điện cho bay hết nƣớc trong Thạch châu. Đặt lên trên đĩa nhơm một lam
kính, trên lam kính để một miếng bơng đã tẩm nƣớc lạnh. Đun nóng đĩa nhơm
trên bếp điện. Sau 5 – 10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dƣới kính hiển vi.
Nếu có anthranoid sẽ xuất hiện các tinh thể hình kim màu vàng, nếu nhỏ dung
dịch NaOH 5% lên xuất hiện màu đỏ.
d) Định tính nhóm coumarin, flavonoid
Cân khoảng 3g bột Thạch châu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml
EtOH 90%. Đun cách thủy sơi trong 5 phút. Lọc nóng. Dịch lọc thu đƣợc để làm
phản ứng.
* Định tính nhóm coumarin
- Phản ứng mở, đóng vịng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch
chiết, đánh dấu ống 1 và 2. Ống 1 - thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để
nguyên. Đun sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội. Nếu có coumarin, ống 1 xuất hiện

13


tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong. Tiếp tục thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi
ống 2ml nƣớc cất. Lắc đều, quan sát thấy ống 1 dung dịch vẫn đục, ống 2 dung
dịch trong. Sau đó acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thấy dung dịch trong.
- Phản ứng Diazo hóa: Lấy 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó 2ml
dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt
thuốc thử Diazo mới pha. Nếu có coumarin thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch.
- Quan sát huỳnh quang: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ cho
khơ. Nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Bịt một nửa vết thấm dịch
chiết bằng tấm kim loại và đặt tấm giấy lọc dƣới ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng
366nm trong vịng 10 phút. Bỏ miếng kim loại ra và quan sát dƣới đèn tử ngoại
bƣớc sóng 366nm, nếu có coumarin quan sát thấy phần giấy lọc thấm dịch chiết

khơng bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che, tiếp tục đặt giấy lọc dƣới ánh
sáng tử ngoại bƣớc sóng 366nm mà khơng bị che miếng kim loại thì 2 phần phát
huỳnh quang nhƣ nhau.
* Định tính nhóm flavonoid
- Phản ứng với dung dịch kiềm:
Phản ứng với NH3: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khơ, sau đó
hơ trên miệng lọ amoniac đặc. Nếu có flavonoid sẽ thấy màu vàng chuyển sang
đậm hơn.
Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt
dung dịch NaOH 10%. Nếu có flavonoid sẽ thấy xuất hiện tủa màu vàng.
- Phản ứng Cyanidin: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie
kim loại, rồi giỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc, đun sơi cách thủy trong vài
phút. Nếu có flavonoid dung dịch có màu hồng hoặc đỏ.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 23 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc nhẹ. Nếu có flavonoid sẽ xuất hiện màu xanh đen.
- Phản ứng Diazo hóa: Lấy 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó 2ml
dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt
thuốc thử Diazo mới pha. Nếu có flavonoid thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch.

14


e) Định tính nhóm glycosid tim
Cho 20 g bột Thạch châu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn
25o, lắc đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất
nhựa) bằng chì acetat 30% để dƣ. Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dung
dịch Na2SO4 bão hịa đến khi khơng cịn tủa với Na2SO4 nữa. Lọc lấy dịch lọc
vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp cloroform - EtOH (4:1), mỗi lần 20ml, để
lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nƣớc bằng cách lọc qua bông. Chia đều dịch chiết
vào 4 ống nghiệm đã đƣợc sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc để
làm phản ứng định tính.

- Phản ứng Liebermann–Burchard: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml
anhydric acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành
ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp.
Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vịng màu hồng tím đến xanh ở mặt tiếp
xúc 2 lớp chất lỏng.
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc đều
cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (cho vào ống nghiệm to 1 phần
dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) mới pha vào
ống nghiệm. Nếu có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ cam.
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc đều
cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch
NaOH 10%, lắc đều. Nếu có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ.
- Phản ứng Keller-Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc
đều cho tan hết cắn. Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid
acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc,
tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm. Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có
vịng màu tím đỏ ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng.
f) Định tính nhóm saponin
- Hiện tượng tạo bọt: Cho 1 g bột Thạch châu vào ống nghiệm to, thêm 5 ml
nƣớc, đun sơi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml nƣớc

15