BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
----------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG KHÁNG THỂ GẮN ĐẶC HIỆU
VỚI LISTERIA MONOCYTOGENES BẰNG KỸ THUẬT
PHAGE DISPLAY

NGUYỄN XUÂN HƯNG

HÀ NỘI 2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
----------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG KHÁNG THỂ GẮN ĐẶC HIỆU
VỚI LISTERIA MONOCYTOGENES BẰNG KỸ THUẬT
PHAGE DISPLAY

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN XUÂN HƯNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TÔ KIM ANH

HÀ NỘI 2006


i

MụC LụC
MụC LụC ........................................................................................................................ i
LờI CảM ƠN.................................................................................................................. ii
THUậT NGữ VIếT TắT ..............................................................................................iii
LờI Mở ĐầU................................................................................................................. iv
I. TổNG QUAN TàI LIệU ............................................................................................ 1

1. Listeria monocytogenes ......................................................................................... 1
2. Các phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes .................................... 17
3. Kü thuËt phage display ...................................................................................... 24
II. NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU.................................................. 37

1. Vật liệu.................................................................................................................. 37
2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 40
III. KếT QUả Và THảO LUậN ................................................................................. 51

1. Phương pháp cố định tế bào mới ...................................................................... 51
2. Sàng lọc phage ..................................................................................................... 56
3. Chọn dòng phage đặc hiệu với L. monocytogenes .......................................... 59
3.1
3.2

Sàng lọc các dòng phage riêng biệt với L. monocytogenes 0704 ......... 59
Sàng lọc các dòng đà chọn với các chủng vi khuẩn khác nhau ............ 62


4. Tách dòng và đọc trình tự gen mà hóa kháng thể ...................................... 65
4.1
4.1

Nhân bản gen mà hoá kháng thể bằng PCR ........................................... 65
Tách dòng sản phẩm PCR ....................................................................... 67

5. Xác định đặc trưng của kháng thể thu được .................................................. 78
5.1
5.2

Tiên đoán cấu trúc bậc ba ....................................................................... 78
Tiên đoán các thông số khác .................................................................. 79

6. Kết luận ................................................................................................................ 80
7. Đề nghị.................................................................................................................. 81
TàI LIệU THAM KHảO............................................................................................. 83
Phụ lục ...................................................................................................................... 97


ii

LờI CảM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS.
Tô Kim Anh - Phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh
học và Công nghệ Thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS. Lê
Quang Huấn - Phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Khoa học Công nghệ
Việt Nam đà hướng dẫn tận tình và dìu đắt tôi trong quá trình nghiên cứu và
hoàn thành luận án.

Trong quá trình làm luận văn vừa qua, tôi đà nhận được sự giúp đỡ và
tận tình chỉ bảo của các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt là
ThS. Vũ Thị Bích Hường.
Nhân dịp này tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh
học và Công nghệ Thực phẩm đà giúp đỡ và dạy bảo tôi trong thời gian học
tập, nghiên cứu.
Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn gia đình tôi đà tạo mọi điều kiện và động
viên tôi hoàn thành luận văn!


iii

THUậT NGữ VIếT TắT
Stt

Ký hiệu

Tên đầy đủ

1

ADN

Axit Deoxyribonucleic

2

Amp

Ampicillin


3

bp

Base pair (cặp baz¬ nit¬)

4

ddNTP

Dideoxynucleotide

5

dNTP

Deoxynucleotide

6

EDTA

Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

7

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (thÝ nghiƯm hấp phụ

miễn dịch gắn enzyme)

8

EtBr

Ethidium Bromide

9

HRP

Horseradish peroxidase

10

IPTG

Isopropyl-b -D-Thiogalactopyranoside

11

IR

Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn)

12

Ka


Kanamycin

13

kDa

Kilo Dalton

14

LB

Môi trường Lauria Betani

15

LEB

Listeria enrichment broth (Môi trường làm giàu Listiera)

16

LRR

Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine)

17

LTA


Axit lipoteichoic

18

NASBA

Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa
trên trình tự axit nucleic)

19

OD

Optical Density (Mật độ quang học)

20

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

21

PEG

Polyetylen Glycol

22

SDS


Sodium Dodecyl Sulphate

23

TAE

Tris - Acetate - EDTA

24

TE

Tris - EDTA

25

v/ph

vßng/phót

26

X-gal

5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- b - D-galactopyranoside


iv


LờI Mở ĐầU
Sự có mặt của vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm là một trong các
vấn đề sức khỏe được quan tâm rộng rÃi nhất trên thế giới. Bệnh do những vi
sinh vật này gây ra chiếm xấp xỉ 25% tổng số ca tử vong trên toàn cầu. Do đó,
rất nhiều nghiên cứu nỗ lực chế tạo các xét nghiệm nhằm phát hiện nhanh vi
sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhằm tối thiểu hóa mỗi nguy hại cho người
tiêu dùng.
L. monocytogenes là một trong những thủ phạm gây bệnh nghiêm trọng
cho người và động vật. Vi khuẩn này được quan tâm đặc biệt bởi khả năng
phát triển ở nhiệt độ thấp và tỷ lệ gây chết khi nhiễm lên tới 30%. Rất nhiều
phương pháp phát hiện nhanh L. monocytogenes đà được phát triển, trong đó
các phương pháp miễn dịch, đặc biệt là sắc ký miễn dịch cho thấy tiềm năng
ứng dụng to lớn bởi tính đơn giản, độ nhạy, độ chính xác cao và khả năng áp
dụng tại thực địa của nó. Chìa khóa thành công của kỹ thuật này nằm ở kháng
thể gắn đặc hiệu với L. monocytogenes.
Để tạo kháng thể có nhiều phương pháp, tuy nhiên phage display là một
trong những kỹ thuật hiệu quả để chọn lọc các kháng thể tái tổ hợp từ thư viện
kháng thể. Đề tài luận văn thạc sỹ khoa học Nghiên cứu tách dòng kháng
thể gắn đặc hiệu với Listeria monocytogenes b»ng kü thuËt phage display”
mong muèn gãp phÇn nghiên cứu tạo ra kháng thể đơn dòng gắn đặc hiệu với
L. monocytogenes . Trong đề tài này, các vấn đề được giải quyết bao gồm:
- Xây dựng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn mới, đơn giản, phù hợp
với kỹ thuật phage display.
- Lựa chọn và tạo kháng thể đặc hiệu cho L. monocytogenes sử dụng kỹ
thuật phage display.
- Tách dòng và đọc trình tự đoạn kháng thể thu được
- Mô phỏng cấu trúc của kháng thể thu ®­ỵc.


1


I
I. TỉNG QUAN TµI LIƯU
1. LISTERIA MONOCYTOGENES
1.1 Giíi thiƯu chung
Listeria monocytogenes lần đầu tiên được mô tả bởi Murray và cộng sự
năm 1926 [1]. Trước đó một số báo cáo đà đề cập việc phân lập được chủng có
khả năng là Listeria [2], đáng tin cậy nhất là báo cáo của Hulphers [3]. Tuy
nhiên, tác giả của các báo cáo này không gửi chủng do họ phân lập tới Ngân
hàng giống chuẩn nên sau đó các chủng này không được nghiên cứu và so
sánh với các chủng khác [4].
Năm 1927, khi nghiên cứu các trường hợp chết lạ thường của chuột
nhảy xảy ra gần Johannesburg, Nam Phi, Pirie đà khám phá một vi sinh vật
mới, là tác nhân gây bệnh Tiger River và đặt tên nó là Listerella
hepatolytica [5]. Hai tác giả Murray và Pirie cùng gửi chủng của họ tới Ngân
hàng giống chuẩn Quốc gia (NTC) tại viện Lister ở London. Giám đốc thời
bấy giờ của NTC là Leningham ®· bÞ bÊt ngê bëi sù gièng nhau cđa hai chủng
này nên yêu cầu Murray và Pirie tiếp xúc. Khi sự đồng nhất là rõ ràng, họ
quyết định gọi vi khuẩn này là Listerella monocytogenes [5, 6]. Tuy nhiên
năm 1939, Hội đồng phản biện, ủy ban hệ thống vi khuẩn quốc tế đà từ chối
tên chi Listerella nên Pirie đề xuất tên chi là Listeria năm 1940[5].
Không như một số vi khuẩn gây bệnh là nguyên nhân chính dẫn đến các
vụ bùng phát lớn có tính lịch sử như Vibrio cholerae hay Yersinia pestis, L.
monocytogenes và bệnh do nó gây ra (listeriosis) mới bắt đầu được ghi nhận


2

chính thức vào năm 1924. Trường hợp nhiễm L. monocytogenes được xác
nhận đầu tiên ở người là của một quân nhân bị viêm màng nÃo vào cuối chiến

tranh Thế giới thứ nhất. Một điều thú vị là một sử gia đà giả định rằng L.
monocytogenes có thể là nguyên nhân khiến Queen Ams 17 (thế kỷ 17) mang
thai không thành công [7].
1.2 Phát sinh loài và phân bố
Phát sinh loài
Mối liên hệ giữa Listeria với các vi khuẩn khác là không rõ ràng cho
đến thập kỷ 70 của thế kỷ 20. Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey,
Listeria cùng Lactobacillus, Brochothrix, Kurthia, và Caryophanon thuộc lớp
Bacilli với các đặc trưng: đối xứng, không tạo bào tử, dạng que, Gram dương,
(bảng 1) [4].
Trong nhiều năm, chi Listeria chỉ
chứa

một

loài

duy

nhất

là

L.

monocytogenes. Sau đó các loài khác được
bổ sung vào chi này gồm: L. denitrificans
(vì có khả năng khử nitrate) năm 1948, L.
grayi (để vinh danh nhà vi sinh vật Mỹ, M.


Bảng 1: Vị trí phân loại Listeria
Giới:
Ngành:
Lớp:
Bộ:
Họ:
Chi:

Bacteria
Firmicutes
Bacilli
Bacillales
Listeriaceae
Listeria

L. Gray) năm 1966, L. murrayi (để vinh danh nhµ vi sinh vËt Canada, E. G. D.
Murray) năm 1971, L. innocua (vì sự vô hại của nó) năm 1981, L. ivanovii (để
vinh danh nhà vi sinh vật Bungary, I. Ivanov) năm 1985, L. welshimeri (để
vinh danh nhà vi sinh vật Mỹ, H. J. Welshimer) năm 1983, và L. seeligeri (để
vinh danh nhà vi sinh vật Đức, H. P. R. Seeliger) năm 1983. Gần đây, các
phương pháp sinh học phân tử giúp đánh giá tính đa dạng của chi Listeria
chính xác hơn, cho thấy nó gồm 6 loài: L. monocytogenes, L. ivanovii, L.
innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, vµ L. grayi [8]. Phân tích phát sinh loài


3

dựa trên các gen mà hóa 16S rRNA, 23S rRNA cịng nh­ prs, ldh, vclA, vclB
vµ iap chØ ra r»ng cã thĨ chia 5 trong sè 6 loµi thc chi Listeria thành hai
nhánh: L. monocytogenes và L. innocua nằm trong cïng mét nhãm trong khi

nhãm thø hai gåm L. welshimeri, L. ivanovii, và L. seeligeri (hình 1) [9].

Hình 1: Cây phát sinh
loài của chi Listeria
dựa trên các gen 16S
rRNA,

23S

rRNA,

iap, prs, vclB và ldh.
Chủng

không

bệnh:

màu

gây
xanh,

chủng gây bệnh: màu
đỏ [Theo 9].

Phân bố
Có thể phân lập L. monocytogenes từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm
đất, thức ăn gia súc, nước, nước thải, thực phẩm và phân [10-12]. Thức ăn gia
súc ủ kỵ khí có khả năng là nguồn chính gây lây nhiễm L. monocytogenes

trong chăn nuôi gia súc cũng như nguồn gốc bùng phát lây nhiễm vi sinh vật
gây bệnh này trong chuỗi thức ¨n [13].


4

1.3 Đặc tính cơ bản của Listeria monocytogenes
1.3.1 Đặc tính hình thái
L. monocytogenes là vi khuẩn Gram dương, hình que ngắn, cân đối, hai
đầu tròn, kích thước (0,4 - 0,5) x (0,5 2) mm (hình 2). Loài vi khuẩn này
không hình thành capsul và không sinh
bào tử [14]. Chúng sống ở dạng dơn
bào hoặc chuỗi ngắn hoặc có thể xếp
thành các dạng X, Y. Đôi khi tế bào có
hình cầu với đường kính trung bình
khoảng 0,5 mm. Trong canh trường
lỏng, một số tế bào mất khả năng duy

Hình 2: Hình ¶nh cđa vi khn
L. monocytogenes qua kÝnh hiĨn vi
®iƯn tư quét.

trì nhuộm Gram và đôi khi bị nhầm với
chi Haemophillus [15].
Listeria có các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu theo nhóm là kháng
nguyên tế bào (somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H. Nhóm
kháng nguyên O có 15 loại (I-XV) còn kháng nguyên H gồm 4 loại (A-D)
[16]. Kiểu huyết thanh của các chủng Listeria được xác định dựa trên sự hiện
diện của các kháng nguyên O và H này (bảng 2). Theo đó L. monocytogenes
có 13 kiểu huyết thanh, víi 3 kiĨu hut thanh 4b, 1/2a, 1/2b lµ nguyên nhân

gây ra khoảng 98% các vụ nhiễm độc ở người [17, 18]. Các chủng có kiểu
huyết thanh 4b được phân lập từ hầu hết các vụ bùng phát listeriosis trong khi
các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b thường là nguyên nhân của các trường hợp
nhiễm bệnh rải rác [18].


5

Bảng 2: Kiểu huyết thanh của các loài Listeria [Theo 16]
Kiểu
huyết
thanh

Kháng nguyên O

Kháng
nguyên H

Loài

1/2a

I, II

A, B

L. monocytogenes

1/2b


I, II

A, B, C

L. monocytogenes

1/2c

I, II

B, D

L. monocytogenes

3a

II, IV

A, B

L. monocytogenes

3b

II, IV

A, B, C

L. monocytogenes


3c

II, IV

B, D

L. monocytogenes

4a

(V), VII, IX

A, B, C

L. monocytogenes

4b

V, VI

A, B, C

L. monocytogenes

4c

V, VII

A, B, C


L. monocytogenes

4d

(V), VI, VIII

A, B, C

L. monocytogenes

4e

V, VI, (VIII), (IX)

A, B, C

L. monocytogenes

7

XII, XIII

A, B, C

L. monocytogenes

5

(V), VI, (VIII), X


A, B, C

L. ivanovii

6a

V, (VI), (VII), (IX), XV

A, B, C

L. welshimeri

6b

(V), (VI), (VII), IX, X, XI

A, B, C

L. innocua

1.3.2 Đặc tính sinh lý
L. monocytogenes là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có khả năng sinh
trưởng trong ®iỊu kiƯn hiÕu khÝ, vi hiÕu khÝ, m khÝ thậm chí trong chân
không [13]; thành phần G-C gần với Bacillus, Clostridium, Enterococcus,
Streptococcus, và Staphylococcus [19]. Chúng có khả năng di động tại 10 25C nhưng không di động tại 35C [20]. Bảng 3 trình bày các đặc tính sinh lý
cơ bản của L. monocytogenes.
Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn L. monocytogenes phụ
thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy, pH, nồng độ muối và mức độ dinh d­ìng cã



6

trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho L. monocytogenes sinh trưởng và
phát triển là 30 - 370C nhưng chúng có thể phát triển ở biên độ nhiệt độ khá
rộng: -0,4 - 500C [21]. Đặc biệt, Hudson và cộng sự đà công bố nhiệt độ thấp
nhất tại đó vẫn ghi nhận sự phát triển của L. monocytogenes là -1,5oC [22].
Thời gian thế hệ trung bình của L. monocytogenes là 43 giê ë 40C; 6,6 giê ë
100C vµ 1,1 giê ë 370C khi nuôi cấy trên môi trường TPB (Tryptose Phosphate
Broth) bỉ sung 0,6% cao nÊm men [4]. Tuy nhiªn, thêi gian thế hệ này khác
một chút ở các chủng khác nhau và trên các môi trường khác nhau. Một điều
đặc biệt là tham số môi trường của các chủng trong cùng một kiểu huyết thanh
khác nhau rất ít [4].
Nhìn chung, pH thích hợp cho L. monocytogenes phát triển là 7,2 tuy
nhiên nó có thể phát triển với pH biến động tõ 4,3 - 9,6 [23]. Sù sinh tr­ëng ë
pH thÊp còn phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy và loại axit trong môi trường.
Chưa tài liệu nào cho thấy L. monocytogenes phát triển ở pH < 4,3 tuy nhiên
theo Reimer và cộng sự, có thể hoạt hóa trở lại L. monocytogenes sau khi giữ
4h ở 37oC trong đệm citrate/phosphate pH 3,3 và sinh vật gây bệnh này không
thể sống quá 1 giê ë pH 1,4 [24].

kh¸c, L. monocytogenes ph¸t triĨn tối ưu

Bảng 3: Đặc tính sinh lý của
L. monocytogenes
Nhiệt độ
- 0,4 - 500C

ở aw ~ 0,97 [25]. Hoạt độ nước tèi thiĨu

pH


4,3 - 9,6

cho sù sinh tr­ëng cđa hÇu hÕt các chủng

aw

0,92 - 0,98

là 0,93 tuy nhiên một số chủng có thể

Nồng độ muối

0 - 12%

Khả năng di động

10 - 25C

Như với hầu hết các loài vi khuẩn

sinh trưởng ở aw ~ 0,92 [26].

L. monocytogenes có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ
muối cao tới 12% [4]. Loài vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trong môi trường
có nồng độ muối vừa phải (6,5%). Tuy nhiên, L. monocytogenes có thể duy trì
sự sống ít nhất 150 ngày trong muối tinh khiết và nhiệt độ nuôi cấy càng thấp


7


thì L. monocytogenes càng có khả năng tồn tại của trong môi trường có nồng
độ muối cao [27].
1.3.3 Đặc tính sinh hoá
L. monocytogenes là chủng vi khuẩn có khả năng lên men nhiều loại
đường và không sinh khí H2S. Các đặc tính sinh hoá của L. monocytogenes
được trình bầy trong bảng 4 [4].
Trong 7 loài Listeria
chỉ có L. monocytogenes, L.
ivanovii, và L. seeligeri làm
tan huyết trên môi trường
thạch máu và cho kết quả
thử nghiệm CAMP dương
tính. L. monocytogenes và
L. seeligeri có phản ứng
dương

tính

nghiệm

trong

CAMP

Bảng 4: Đặc tính sinh hoá của
L. monocytogenes
Catalase
+
Maltose


+

Oxidase

-

D - arabitol

+

Fructose

+

Esculine

+

Mannose

+

V.P

+

Amygdalin

+


RM

+

Calicine

+

Urease

-

Cellobiose

+

Indole

-

thử
với

(+): phản ứng dương tính

(-): phản ứng âm tính

Staphylococus aureus và âm
tính với Rhodococus equi trong khi L. ivanovii lại cho phản ứng ngược lại.

Trong 3 loài, chỉ có duy nhÊt L. monocytogenes cã thĨ sư dơng ngn cacbon
tõ rhamnose và không sử dụng cacbon từ xylose. Với thử nghiệm nitratase, L.
monocytogenes và một số loài khác cho phản ứng âm tính, duy nhất L. murrayi
là loài có thể chuyển hoá NO3- thành NO2- [4]. Bảng 5 trình bày các đặc tính
sinh hóa khác nhau giữa các loài listeria.
Hình thái khuẩn lạc của L. monocytogenes trên các môi trường thạch
khác nhau khá khác nhau. Dưới đây là hình thái khn l¹c cđa L.


8

monocytogenes trên một số môi trường thạch tiêu biểu thường được sử dụng
để phân lập và khẳng định chủng nghi ngờ là L. monocytogenes.
Bảng 5: Đặc điểm sinh hóa khác nhau giữa L. monocytogenes và các loài listeria khác.

Loài Listeria

Lên men carbonhydrate

Thư nghiƯm CAMP

b-haemolysis

M

R

X

SA


RE

monocytogenes

-

+

-

+

-

+

innocua

-

+/-

-

-

-

-


welshimeri

-

+/-

+

-

-

-

seeligeri

-

-

+

+

-

+

ivanovii


-

-

+

-

+

+

grayi

+

+/-

-

-

-

-

M, manitol; R, L-rhamnose; X, D-Xylose
Thư nghiƯm CAMP: khi cấy trải trên môi trường thạch máu cùng với chủng
có hoạt tính b-haemolysis là Staphylococcus aureus (SA) và/hoặc Rhodococcus equi

(RE), L. monocytogenes cho thấy vùng ly giải máu đặc trưng.

Trên môi trường LPM (Lithium Chloride-Phenylethanol-Moxalactam)
sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc của L. monocytogenes có dạng cụm nhăn nheo
hơi trắng, thường thấy có cấu trúc tương tự thể khảm, đôi khi có ánh mầu
xanh xám (Hình 3a) [28].
Trên môi trường thạch OXA (Oxford Agar) và MOX (Modified Oxford
agar), L. monocytogenes tạo thành khuẩn lạc mầu đen đường kính 1mm với
quầng đen bao quanh sau 24 giờ nuôi cấy. Sau 48 giờ, khuẩn lạc có đường
kính 2 - 3 mm, mầu đen với vòng đen bao quanh và lõm sâu ở giữa. Khuẩn lạc
cũng có thể xuất hiện với mầu nâu đen hoặc xanh đen (hình 3b). Khi kiểm tra
sự sinh trưởng của các loài Listeria khác, sau 24 giờ trên môi trường này thấy


9

cũng xuất hiện khuẩn lạc tuy nhiên không có mầu đen. Một số chủng không
phải L. monocytogenes thuộc chi Listeria bị ức chế trên môi trường này ở
350C [29].
Trên môi trường thạch PALCAM (Polymyxin-Acriflavine-Lithium
chloride-Ceftazidime-Easculin-Mannitol Agar), khuẩn lạc có mầu xanh xám,
đường kính khoảng 2 mm với một vùng lõm sâu ở giữa mầu đen và một quầng
đen bao quanh trên nền đỏ dâu tây của môi trường (hình 3c) [30].
Ngoài ra, gần đây một số môi trường thạch có bổ sung cơ chất chỉ thị
mầu đà được phát triển nhằm xác định trực tiếp các khuẩn lạc L.
monocytogenes dựa trên đặc trưng màu sắc của chúng (hình 3d, e, f). Trong số
đó tiêu biểu là các môi trường ALOA (Biolife, Milan, Italy), OCLA (OXOID,
Hampshire, United Kingdom), CHROM (Mast Diagnostics, Reinfeld,
Germany).


(a) LPM agar

(b) OXFORD agar

(c) PALCAM agar

(d) OCLA agar

(e) ALOA agar

(f) CHROM agar

Hình 3: Đặc trưng khuẩn lạc của L. monocytogenes trên một số môi trường thạch.


10

1.4 Các protein trên bề mặt tế bào Listeria monocytogenes
Hiện tại, bộ gen của L. monocytogenes và L. innocua đà được giải trình
tự thành công là bước đột phá giúp hiểu biết sâu sắc hơn về các vi sinh vật này
[31, 32]. Đặc biệt, so sánh trình tự bộ gen của L. monocytogenes với L.
innocua mang lại cái nhìn toàn diện về các yếu tố gây bệnh của L.
monocytogenes [33, 34]. Trong đó, protein bề mặt là một trong các thành phần
được quan tâm hàng đầu bởi đây là nơi tập trung các yếu tố trình diện kháng
nguyên, các yếu tố trung gian cho quá trình xâm nhiễm và gây bƯnh cđa L.
monocytogenes. Ph©n tÝch bé gen cđa L. monocytogenes cho thấy số lượng và
loại protein bề mặt của vi khuẩn này [35] nhiều hơn bất cứ vi khuẩn nào khác
đà biết trình tự bộ gen [36]. Điều này phù hợp với khả năng tồn tại trên diện
rộng của Listeria trong hệ sinh thái [34].
Có tới 133 protein bề mặt ®­ỵc m· hãa bëi bé gen cđa L.

monocytogenes. Trong ®ã, 41 protein thuộc họ protein LPXTG, 20 trong số đó
không cã trong bé gen cđa L. innocua [37] vµ 19 thuéc hä internalin. Bé gen
L. monocytogenes còng m· hãa 5 protein chứa miền LRR nhưng không có tín
hiệu sắp xếp LPXTG. Ngoài các protein bề mặt LPXTG, L. monocytogenes
mà hóa 9 protein bỊ mỈt GW (dipeptide Gly-Trp), 11 protein cã vùng đuôi kỵ
nước, 4 protein giống p60 và 68 lipoprotein (hình 4). 30 trong số 133 gen mÃ
hóa các protein bề mặt của L. monocytogenes không có trong bộ gen cđa L.
innocua (chiÕm 22,6%) so víi 270 gen (trong tỉng sè 2853 gen) cđa bé gen L.
monocytogenes kh«ng cã trong bé gen cđa L. innocua (chiÕm 10.5%). Chi tiÕt
vỊ c¸c protein bề mặt này được đề cập dưới đây.
LPXTG protein
Để gắn cộng hóa trị với thnh t bo vi khuẩn Gram dương, các protein
bề mặt cần tín hiệu sp xp đầu C c bit [38], cu thnh t mô thức (motif)


11

LPXTG (X là bất cứ axit amin nào) n»m tr­íc min kỵ nước dài khoảng 20
axit amin và phần đuôi gồm các axit amin tích điện dương. Số lượng protein
LPXTG này trong L. monocytogenes lớn hơn nhiều so với các loài Gram
dương khác [36].
InlA là protein LPXTG đầu tiên được xác định trong L. monocytogenes
[37], thuộc họ internalin. Họ này gồm các protein có miền đầu N chứa đoạn
lặp giàu leucine (leucine-rich repeat, LRR) nằm trước miền lặp nội mạch bảo
tồn (inter-repeat region, IR), một số đoạn lặp khác và tín hiệu sắp xếp
LPXTG. LRR liên quan đến các tương tác protein-protein và một số chức
năng khác như: bám dính, tương tác phối tử-thụ thể và tín hiệu [39]. Trong
InlA, miền đầu N gồm các vùng LRR và IR là cần và đủ để vi khuẩn xâm
nhập vào tế bào [40]. Protein xâm nhiễm thứ hai, InlB, không chứa motif
LPXTG. Bèn protein kh¸c thuéc hä internalin (InlE, InlF, InlG and InlH) của

L. monocytogenes cũng đà được xác định [41]. Tuy nhiên, chúng không liên
quan trong quá trình xâm nhiễm mà đóng vai trò quan trọng trong sự định vị
(colonization) của L. monocytogenes tại mô vật chủ in vivo [42].
Một điều thú vị là 11 protein LPXTG L. monocytogenes chứa các đoạn
lặp PKD tại đầu C. Hai protein họ internalin của L. monocytogenes (Lmo0331
and Lmo0333) chứa cả vùng LRR và các đoạn lặp PKD. Các protein này có
thể có vai trò bám dính và/hoặc tín hiệu. Ngoài các đoạn lặp PKD, protein
LPXTG Lmo1666 chứa mô thức Arg-Gly-Asp (RGD). Mô thức này th­êng
n»m trong c¸c protein trung gian cho sù b¸m dÝnh của vi khuẩn với các tế bào
eukaryote nên protein bề mặt Lmo1666 (không có trong bộ gen của L.
innocua) có thể đóng vai trò trung gian trong sự bám dính của L.
monocytogenes với tế bào chủ [35]. Một protein khác không được mà hóa bởi
bộ gen của L. innocua là Lmo0842 có thể liên quan đến tính độc và/hoặc sự
tạo thành biofilm [35]. Gần đây hơn, người ta đà xác định được Lmo2026, một


12

protein giống internalin của L. monocytogenes, đóng vai trò trong quá trình
xâm nhiễm và nhân lên trong nÃo của vi sinh vật này [43].

Hình 4: 5 nhóm protein bề mặt chính của L. monocytogenes: protein gắn với thành
tế bào thông qua tín hiệu sắp xếp LPXTG; protein có đuôi kỵ nước (protein
neo với thành tế bào thông qua các tương tác cộng hóa trị); GW protein;
protein P60 và lipoprotein. Phần số cho biết số lượng gen mà hóa cho từng
loại protein này.

Protein với đuôi kỵ nước
11 protein của L. monocytogenes có đầu C chứa miền kỵ nước, sau đó là
các axit amin tích điện dương. Phần đuôi này giúp protein gắn với bề mặt tế

bào vi khuẩn [44]. ActA, một protein bề mặt của L. monocytogenes với vai trò


13

quan trọng trong khả năng di động theo actin của vi khuẩn [44] là một protein
như vậy. Gần đây đà xác định được protein SvpA của L. monocytogenes
(Lmo2185) liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn theo cách tương tự với ActA và
cần để vi khuẩn thoát khỏi thể thực bào của đại thực bào [45].
Ngoài ActA và SvpA, bé gen cđa L. monocytogenes m· hãa 9 protein
kh¸c (Lmo0058, Lmo0082, Lmo0528, Lmo0552, Lmo0586, Lmo0701,
Lmo0821, Lmo2061 và Lmo2186) với trình tự tín hiệu và miền đầu C kỵ nước
giúp chúng gắn với màng tế bào. Trong đó chỉ ActA và Lmo0082 kh«ng cã
trong L. innocua [35].
GW (dipeptide Gly-Trp) protein
GW protein gắn không cộng hóa trị với bề mặt tế bào bằng cách tương
tác với axit lipoteichoic (LTA). InlB là một protein bề mặt tương đồng với họ
internalin của L. monocytogenes bởi nó có đoạn peptide tín hiệu và LRR,
nhưng không có motif LPXTG và vùng kỵ nước xuyên màng [37]. 231 axit
amin đầu C là cần và đủ để neo InlB với bề mặt vi khuẩn [46]. Các gốc này
tương tác với LTA trên bề mặt vi khuẩn [47] và glycosaminoglycan của tế bào
động vật có vú [48] thông qua phân đoạn GW (GW module). Tương tác này
khá yếu [36] mặc dù nhiều phân đoạn GW sẽ giúp GW protein gắn chặt hơn
với bề mặt tế bào [49]. Phân tích trình tự bộ gen L. monocytogenes đà xác
định thêm 7 protein khác chứa phân đoạn GW. InlB là protein duy nhất thuộc
nhóm này có cả phân đoạn GW và miền LRR [35].
Protein P60
P60 là protein màng có trọng lượng 60-kDa, liên quan trong quá trình
xâm nhập tế bào chủ của L. monocytogenes [15]. Một báo cáo gần đây cho
thấy protein này tham gia trong quá trình gắn của L. monocytogenes với các tế

bo Caco-2 thuộc ruột [50]. P60 là protein cÇu chøa hai miỊn LysM, mét miỊn


14

tương đồng Src 3 của vi khuẩn (SH3) và một miền NLPC/P60 đầu C. Miền
LysM được tìm thấy trong một biến thể khác của các enzyme liên quan trong
quá trình phân hủy thành tế bào vi khuẩn [51].
Dựa trên sự hiƯn diƯn cđa peptide tÝn hiƯu vµ mét miỊn NLPC/P60, đÃ
phát hiện được ba trình tự giống P60 khác trong bộ gen của L. monocytogenes.
Protein P45, cũng đà được xác định [52] là protein bề mặt có hoạt tính ly giải
peptidoglycan. Hai protein khác (Lmo0394 và Lmo1104) là các protein có
chức năng chưa biết tới, trong đó Lmo0394 chứa một miền SH3b.
Lipoprotein
Lipoprotein của vi khuẩn có khả năng là các phân tử tiền viêm và khởi
đầu đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được ở động vật có vú [53].
Lipoprotein gắn với bề mặt tế bào thông qua đầu N, hoạt hóa một số loại tế
bào (bao gồm bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu trung tính và các tế
bào B) nên rất quan trọng trong sinh bƯnh häc. 68 gen (chiÕm 2,5% tỉng sè
gen cđa L. monocytogenes) m· hãa lipoprotein, nhiỊu nhÊt trong sè các vi
khuẩn Gram dương gây bệnh [36]. Chỉ một số ít lipoprotein của L.
monocytogenes đà được nghiên cứu và xác định vai trò. Lipoprotein TcsA hoạt
hóa tế bào T [54], trong khi lipoprotein OppA [55] tham gia vào quá trình vận
chuyển oligopeptide và cần cho sự phát triển của tế bào ở nhiệt độ thấp. Một
số lipoprotein khác của L. monocytogenes tham gia tương tác sinh vật gây
bệnh - tế bµo chđ (nh­ Lmo1847 vµ Lmo1800) [35].

1.5 BƯnh do L. monocytogenes gây ra
Chỉ có 2 trong số 6 loài thuộc chi Listeria là vi sinh vật gây bệnh: L.
monocytogenes gây bệnh cho người và L. ivanovii gây bệnh cho các ®éng vËt



15

có vú khác [4]. Tuy nhiên, một số báo cáo cho thấy L. seeligeri và L. ivanovii
[14, 56] cũng gây bệnh cho người trong các trường hợp nhất định.
Nhiễm L. monocytogenes ở người gây bệnh listeriosis. Mặc dù nguy cơ
mắc listeriosis dường như thấp hơn so với các bệnh từ thực phẩm khác, nhưng
tỷ lệ tử vong khi mắc bệnh này rất cao, khoảng 20-30% [57] cho dù điều trị
sớm bằng kháng sinh [58]. Các trường hợp mắc listeriosis đầu tiên của người
được báo cáo năm 1929 ở Đan Mạch [59]. Trong 5 thập kỷ sau đó, listeriosis
xảy ra không thường xuyên [60]. Tuy nhiên từ cuối những năm 1970, L.
monocytogenes nổi lên là một sinh vật gây bệnh nguy hiĨm qua ®­êng thùc
phÈm [4] víi mét sè vơ bïng phát bệnh do tiêu dùng thực phẩm chế biến sắn
nhiễm L. monocytogenes như xà lách trộn [61], bơ mềm [62], pa tê [63, 64],
sữa [65]. Đáng chú ý là các vụ bùng phát bệnh tại các vùng không có liên
quan về mặt địa lý và ở những thời điểm khác nhau lại thường do những chủng
có chung kiểu huyết thanh gây ra [66]. Ngược lại với sự phổ biến trong các ca
bệnh lý, các kiểu huyết thanh này lại không thường được phát hiện trong các
cuộc điều tra thường lệ về an toàn thực phẩm [67]. Mặc dù nguồn gốc và cách
thức lan truyền của L. monocytogenes là khá phức tạp nhưng có thể được mô
tả một cách khái quát theo sơ đồ ở hình 5.
Có hai mức độ nhiễm L. monocytogenes là nhẹ hoặc rất nghiêm trọng
[68]. Các ca nhẹ đặc trưng bởi sốt cao đột ngột, đau đầu nặng, nôn mửa và các
triệu chứng khác giống cúm. Triệu chứng nặng của listeriosis xảy ra khi bị
nhiễm L. monocytogenes ở mật độ cao hoặc bị nhiễm vào hệ thần kinh trung
ương, bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng nÃo, và nhiễm vào tử cung của
phụ nữ mang thai gây sÈy thai hc thai chÕt non [58]. Chu kú đ bệnh của
listeriosis khác nhau từ 4 ngày cho đến vài tuần và thời gian phát bệnh từ vài
ngày đến vài tuÇn [13].



16

Phụ nữ mang thai bị nhiễm L. monocytogenes thường không biĨu lé
triƯu chøng bƯnh hc cã thĨ cã dÊu hiƯu như bị cúm nhẹ với chứng lạnh, mệt
mỏi, nhức đầu và đau cơ, đau khớp khoảng 2 đến 14 ngày trước khi bị sẩy
thai. Phụ nữ mang thai bị nhiễm L. monocytogenes cã thĨ trun bƯnh cho bµo
thai qua nhau thai. Bào thai bị nhiễm có thể chết non do viêm màng nÃo, hoặc
được sinh ra nhưng bị nhiễm trùng máu với tỷ lệ tử vong cao [13]. Người
trưởng thành không mang thai mắc listeriosis thường bị nhiễm trùng máu (15
đến 50 % trường hợp) hoặc viêm màng nÃo (55 đến 70 % trường hợp).
Thức ăn gia
súc

Thực vật

Các sản
phẩm sữa

Sữa

Thực vật

Phân

Thủy sản
Đất

Động vật


Thịt

Côn trùng
Rác

Rau
Nước

CON NGƯờI

Phân

Không khí
Bụi

Ngộ độc thực
phẩm

Người
Bào thai

Trẻ sơ sinh

Hình 5: Sơ đồ nguồn gốc và khả năng lan truyền của L. monocytogenes [4].

Các dạng bệnh lý không điển hình khác của listeriosis (5-10% trường
hợp) có thể là viêm màng trong tim, viêm cơ tim, viêm động mạch, viêm
phổi, viêm gan, viêm phúc mạc, áp xe tại chỗ, viêm khớp, viêm tủy xương,
viêm xoang, viêm tai, viêm màng kết và viêm mắt [4].



17

2. CáC PHƯƠNG PHáP PHáT HIệN Listeria monocytogenes
Bởi sự nguy hiểm của L. monocytogenes, các phương pháp phát hiện và
xác định vi sinh vật này ngày càng được phát triển và hoàn thiện. Có thể chia
thành hai nhóm phương pháp là các phương pháp dựa trên kiểu hình và các
phương pháp dựa trên kiểu gen hoặc phân chia theo phương pháp truyền
thống và phương pháp không truyền thống (hình 6).

Hình 6: Các phương pháp xác định L. monocytogenes.

2.1 Phương pháp truyền thống
Quá trình phân lập và xác định L. monocytogenes bằng phương pháp
truyền thống gồm bốn bước chính:
- Tăng sinh
- Tăng sinh chọn lọc
- Phân lập
- Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá
Chủng nghi ngờ được khẳng định thuộc chi Listeria khi có các đặc
trưng là Gram dương, hình que, không có khả năng kháng axit, không sinh nội
bào tử và có khả năng di động (hình 7). Tiếp đó sử dụng các phản ứng


18

catalase, oxidase, tan máu và các thử nghiệm lên men đường để xác định
chủng nghi ngờ thuộc loài nào trong chi Listeria (bảng 5).


Hình 7: Sơ đồ hệ thống phương pháp xác định Listeria [Theo 69].

Gần đây, một số môi trường thạch có bổ sung chất chỉ thị màu cho phép
xác định nhanh L. monocytogenes dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường
(hình 3). Các môi trường này có ưu điểm là đơn giản, hiệu quả về mặt giá cả,
đọc kết quả dễ dàng, cho phép tiến hành với lượng mẫu lớn, độ nhạy và tính
đặc hiệu cao và cã thĨ thùc hiƯn trong cïng khung thêi gian nh­ phương pháp
ELISA. Một số môi trường thạch chỉ thị màu thương mại dùng trong phát hiện
L. monocytogenes là OCLA (OXOID, Hampshire, United Kingdom),
CHROM agar (Mast Diagnostics, Reinfeld, Germany), vµ ALOA (Biolife,
Milan, Italy). Tuy nhiên, không sản phẩm nào có thể phân biệt L.
monocytogenes và L. ivanovii [70]. Bởi vậy ngày càng có nhiều phương pháp


19

mới được phát triển nhằm tăng độ nhạy, độ chính xác và giảm thời gian thí
nghiệm.

2.2 Phương pháp không truyền thống
2.2.1 Phương pháp dựa trên kháng thể
Các phương pháp miễn dịch dựa trên kháng thể đặc hiệu cho Listeria đÃ
được ¸p dơng phỉ biÕn trong kiĨm so¸t thùc phÈm trong nhiều năm vì tính đơn
giản, nhạy, chính xác và có thể tiến hành trực tiếp từ môi trường làm giàu mà
không cần các bước chuẩn bị mẫu phức tạp. Một số phương pháp miễn dịch
được phát triển thành kit và bán trên thị trường [8].
Thí nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA)
ELISA là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong phát hiện vi
sinh vật vì chúng dễ sử dụng và cho kết quả nhanh. Hơn nữa, khả năng phân
tích các mẫu phức tạp giúp phương pháp này đặc biệt hữu ích khi sử dụng

trong kiểm soát thực phẩm. Các tiến bộ gần đây cho phép xác định Listeria rất
nhanh trong các mẫu thực phẩm và môi trường. Các sản phẩm này có độ nhạy
tương đương với các phương pháp nuôi cấy truyền thống và cho kết quả trong
vòng 30h kể từ khi lẫy mẫu (bảng 6) [8].
Bắt giữ miễn dịch (Immuno-capture)
Immuno-capture là kỹ thuật tinh vi, sử dụng hạt từ hoặc que thử (dip
sticks) phủ kháng thể đặc hiệu để phân tách Listeria từ các vi khuẩn và các
chất kìm hÃm khác trong thực phẩm [71]. Trong khi một số báo cáo công bố
kháng thể đơn dòng và đa dòng gắn đặc hiệu với các yếu tố độc [8], hầu như
vẫn chưa có thử nghiệm nào hiệu quả (trừ VIDAS LMO assay bio-Merieux,
Marcy-Etoile, Pháp [72, 73]) do sự biểu hiện của các yếu tố độc in vitro rÊt
kh¸c nhau [74].