NGHIÊM NGỌC HOA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGHIÊM NGỌC HOA

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE
TRONG ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH
PHÁT HIỆN CHẤT ĐỘC CƠ PHƠT PHO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CNSH2017-A
Hà Nội – Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------NGHIÊM NGỌC HOA

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE
TRONG ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH PHÁT
HIỆN CHẤT ĐỘC CƠ PHÔT PHO

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Lê Quang Hòa
2. TS. Phạm Kiên Cường

Hà Nội – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Học viên: Nghiêm Ngọc Hoa
Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Người hướng dẫn 1: TS. Lê Quang Hòa
Đơn vị: Viện Công nghệ Sinh học-Công nghệ thực phẩm/ĐH Bách Khoa HN
Người hướng dẫn 2: TS. Phạm Kiên Cường
Đơn vị: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự
Tên luận văn: “Nghiên cứu biểu hiện enzym acetylcholinesterase trong
Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát hiện chất độc cơ phôt pho”.
Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận
văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, tôi đã tiến
hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận
văn được tôi trực tiếp thực hiện. Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo
cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào.
Học viên

Nghiêm Ngọc Hoa

1



LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hịa, Viện
Cơng nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và
TS. Phạm Kiên Cường, Viện Công nghệ mới - Viện Khoa học & Công nghệ quân
sự đã tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành
luận văn.
Trong thời gian thực tập và làm việc tại phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Hóa
sinh – Viện Cơng nghệ mới - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự, tôi đã nhận
được sự quan tâm giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật cùng sự
động viên chân thành của các cán bộ tại phịng. Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp
đỡ q báu đó.
Nhân dịp này tơi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt
tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu. Qua đây, tôi cũng
xin chân thành cảm ơn các cán bộ phịng thí nghiệm Viện cơng nghệ sinh học và
cơng nghệ thực phẩm, các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học
Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tơi trong q trình thí nghiệm.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ mới - Viện
Khoa học & Công nghệ quân sự và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công
nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi
giúp tơi hồn thành luận văn.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động
viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Học viên
Nghiêm Ngọc Hoa

2



MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................2
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................5
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................6
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................9
Chương I: TỔNG QUAN ..........................................................................................10

1.1. Enzym acetylcholinesterase (AChE) ........................................................ 10
1.1.1. Phân loại, cấu trúc enzym acetylcholinesterase .................................... 10
1.1.2.Tính chất xúc tác của AChE .................................................................. 13
1.1.3.Vai trò, ứng dụng của AChE trong nghiên cứu phát hiện chất độc phốt
pho hữu cơ ………………………………………………………………...14
1.2.Nhân dòng, biểu hiện acetylcholinesterase ............................................... 17
1.2.1.Nhân dòng, biểu hiện AChE .................................................................. 17
1.2.2.Tối ưu hóa codon trong E.coli. .............................................................. 21
1.3.Tinh sạch enzym AChE ............................................................................ 23
1.4.Sản xuất enzym acetylcholinesterase ........................................................ 24
Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..........................................................29

2.1. Nguyên liệu, máy móc ............................................................................. 29
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 29
2.1.2. Máy móc ................................................................................................ 29
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 30
2.2.1. Phương pháp PCR ................................................................................. 30
2.2.2. Điện di trên gel agarose......................................................................... 31
2.2.3. Nhân dòng gen mã hóa enzym AChE vào vector ................................. 32
2.2.4. Cắt vector nhân dịng mang đoạn gen mã hóa enzym AChE và vector

biểu hiện bằng enzym giới hạn. ...................................................................... 32
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn ........................................................... 33
2.2.6. Gắn gen mã hóa enzym AChE vào vector biểu hiện ............................ 34
3


2.2.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzym AChE. ...................................... 34
2.2.8. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E.coli và thu protein tổng số trong phân đoạn
dịch chiết và kết tủa tế bào. ............................................................................. 35
2.2.9. Kiểm tra biểu hiện AchE bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch. .. 36
2.2.10. Phương pháp tối ưu điều kiện biểu hiện AChE trong E.coli .............. 38
2.2.11.Phương pháp tinh sạch enzym AChE .................................................. 39
2.2.12. Nghiên cứu tính chất của AChE tái tổ hợp ......................................... 40
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................42

3.1. Nghiên cứu tạo vector tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa
acetylcholinesterase trên E. coli. ..................................................................... 42
3.1.1. Tối ưu hóa codon gen mã hóa acetylcholinesterase trong E.coli. ......... 42
3.1.2. Xây dựng vector biểu hiện pET43a-AchE ............................................ 44
3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. coli........ 51
3.2.1.Kiểm tra biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase trên E. coli .......... 51
3.2.2. Xác định hoạt tính của enzym AChE tái tổ hợp ................................... 54
3.3. Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi vi khuẩn E.coli để sinh nhiều enzym . 55
3.4. Nghiên cứu quy trình tinh sạch acetylcholinesterase tái tổ hợp .............. 57
3.5. Nghiên cứu một số tính chất của enzym acetylcholinesterase tái tổ hợp
thu được. .......................................................................................................... 63
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................... 63
3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ............................................................. 66
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................69


1.KẾT LUẬN .................................................................................................. 69
2.KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................70

4


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Trình tự cặp mồi AChE 68 Fw/Rv ..............................................................30
Bảng 2: Thành phần một phản ứng PCR ..................................................................30
Bảng 3: Thành phần phản ứng gắn đoạn gen AChE vào vector pTOP TA V2 ........32
Bảng 4: Thành phần phản ứng cắt vector..................................................................33
Bảng 5: Thành phẩn phản ứng ligase ........................................................................34
Bảng 6: Thành phần gel Acrylamide .......................................................................36
Bảng 7: Thành phần môi trường LB lỏng .................................................................60
Bảng 8: Thành phần đệm phosphate 0,02M, pH 7,4.................................................60
Bảng 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzym AChE tái tổ hợp ..............63
Bảng 10: Xác định độ bền nhiệt của AChE ..............................................................65
Bảng 11: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzym AchE tái tổ hợp .....................66
Bảng 12: Xác định giá trị pH tối thích của AchE tái tổ hợp .....................................67

5


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Trung tâm hoạt động của AChE ...............................................................12
Hình 1.2: Mơ phỏng cấu trúc bậc bốn của TcAChE .................................................13
Hình 1.3: Mơ hình động học tối thiểu của xúc tác AChE .........................................13
Hình 1.4: Ảnh hưởng của chất độc cơ phốt pho tới enzym AChE ...........................16
Hình 1.5: Nguyên tắc của bộ cảm biến sinh học OP dựa trên sự ức chế AChE .......17

Hình 1.6: Quy trình nhân dịng và biểu hiện AChE của bị .....................................19
Hình 1.7: So sánh hoạt tính của enzym DmAChE tái tổ hợp trước và sau khi tối ưu
codon qua các mốc thời gian nuôi cấy ......................................................................22
Hình 1.8: Chỉ số CAI của hBChE trước và sau khi tối ưu trong nấm men Pichia
pastoris ......................................................................................................................23
Hình 1.9: Vector pET43a .........................................................................................26
Hình 1.10 : Trình tự vector pET 43a .........................................................................27
Hình 1.11: Quy trình biểu hiện enzym AChE tái tổ hợp ..........................................28
Hình 2.1: Chu trình nhiệt PCR ..................................................................................31
Hình 3.1: Chỉ số CAI của cADN AChE bò (Bos taurus) nếu biểu hiện trong E. coli
...................................................................................................................................42
Hình 3.2: Chỉ số CAI của cADN AChE bị sau tối ưu hóa codon nếu biểu hiện trong
E.coli.........................................................................................................................43
Hình 3.3: PCR kiểm tra cặp mồi sau khi thiết kế với plasmid pGEMT-AChE ........44
Hình 3.4: Đĩa khuẩn lạc E.coli DH5α trên đĩa LB có bổ sung Amp ........................45
Hình 3.5: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv .........................46
Hình 3.6: Kiểm tra khuẩn lạc 1 và 2 với cặp mồi M13 Fw/Rv .................................46
Hình 3.7: Ảnh điện di kết quả tách plasmid pTOP-AChE ........................................47
Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pTOP – AChE với enzym giới hạn
NdeI và XhoI .............................................................................................................48
Hình 3.9: Ảnh điện di kết quả tách plasmid pET 43a ...............................................48
Hình 3.10: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pET43a với enzym giới hạn NdeI và
XhoI ...........................................................................................................................49
Hình 3.11: Đĩa khuẩn lạc E. coli DH5α trên đĩa LB có bổ sung Amp .....................50
6


Hình 3.12: PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv .......................50
Hình 3.13: Đĩa khuẩn lạc E. coli BL21 DE3 trên đĩa LB có bổ sung Amp, Cm ......52
Hình 3.14: PCR kiểm tra 6 khuẩn lạc với cặp mồi T7/ AChE68 ..............................52

Hình 3.15: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện AChE ở
E. coli ........................................................................................................................53
Hình 3.16: Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các nồng độ IPTG ............................55
Hình 3.17 : Kết quả điện di tối ưu biểu hiện ở các thời gian cảm ứng .....................56
Hình 3.18: Sắc ký ái lực qua cột His-bind tinh sạch AChE tái tổ hợp .....................57
Hình 3.19: Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra sự biểu hiện của
pET43a-AChE ở E. coli BL21 DE3 đã tinh sạch (B) ..............................................58
Hình 3.20: Quy trình tinh sạch enzym AChE tái tổ hợp ...........................................59
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của AChE tái tổ hợp ......................64
Hình 3.22: Hoạt độ AChE tái tổ hợp khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ................65
Hình 3.23. Độ bền pH của AChE tái tổ hợp .............................................................66
Hình 3.24: Đồ thị xác định pH tối thích của AChE .................................................67
Hình 3.25: Ảnh hưởng của một số chất độc đến hoạt độ của AChE tái tổ hợp ........68

7


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ach

Acetylcholine

AchE

Acetylcholinesterase

AchI

Cơ chất Acetylthiocholine iodide


BuChE

Butyrylcholinesterase

BVTV

Bảo vệ thực vật

ChE

Cholinesterase

CAT

Chloramphenicol acetyl-transferase

CB

Carbamate

cADN

complementary ADN (AND bổ trợ)

DTNB

Chất sinh màu 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)

EDTA


Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

kDa

Kilodalton

OP

Các hợp chất thuốc trừ sâu phốt pho hữu cơ

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen)

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Se203

Serine ở vị trí 203

Synap

Khớp thần kinh

8


MỞ ĐẦU

Các chất phốt pho hữu cơ có độc tính rất cao, ảnh hưởng rất xấu tới sức
khỏe con người. Vì vậy, việc xác định dư lượng các chất phốt pho hữu cơ trong các
nông sản, thực phẩm…là việc làm hết sức cần thiết để bảo vệ sức khỏe người dân.
Dựa trên cơ chế của phản ứng thuỷ phân các cơ chất (acetylcholine,
butylrylcholine, acetyl- metylcholine …) xúc tác bởi enzym AChE và phản ứng ức
chế enzym AChE bởi các chất độc thần kinh (q trình photphoryl hố enzym
AChE), người ta đã xây dựng được phương pháp sinh hoá để phân tích phát hiện
chất độc cơ phốt pho.
Với các nghiên cứu trước đó, chúng tơi đã nhân dịng thành cơng enzym
Acetylcholinesterase tinh sạch từ hồng cầu bị vào vector pGEMT. Chính vì các lý
do trên, chúng tơi tiếp tục thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện enzym
acetylcholinesterase trong Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát
hiện chất độc cơ phôt pho” với mục tiêu tạo được enzym acetylcholinesterase tái tổ
hợp trong E. coli phục vụ mục đích phân tích phát hiện chất độc cơ phôt pho.
Đề tài gồm 3 nội dung chính:
- Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa enzym acetylcholinesterase phân lập tại Việt
Nam trên hệ biểu hiện E. coli.
+ Tối ưu hóa codon gen mã hóa acetylcholinesterase trong E. coli.
+ Nghiên cứu tạo vector tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa acetylcholinesterase
trên E. coli.
+ Nghiên cứu xác định hoạt tính acetylcholinesterase thu được từ E. coli.
+ Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện ni vi khuẩn E. coli để sinh nhiều enzym.
- Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch acetylcholinesterase tái tổ hợp.
+ Nghiên cứu xác định quy trình tinh sạch acetylcholinesterase tái tổ hợp.
+ Nghiên cứu xác định hoạt tính của acetylcholinesterase sau tinh sạch.
- Nghiên cứu một số tính chất của acetylcholinesterase tái tổ hợp thu được.

9



Chương I: TỔNG QUAN
1.1 . Enzym acetylcholinesterase (AChE)
1.1.1. Phân loại, cấu trúc enzym acetylcholinesterase
a. Phân loại
Cholinesterase (ChE) là tên một nhóm enzym xúc tác cho sự thủy phân phân tử
acetylcholine thành choline và acid acetic; có tác dụng làm chấm dứt sự dẫn truyền
xung thần kinh qua synap[31]. Đây là một phản ứng cần thiết để các tế bào neuron
thần kinh cholinergic phục hồi trở lại trạng thái nghỉ ngơi sau một thời gian hoạt
hóa.
Có 2 loại enzym thủy phân acetylcholine (ACh) là:
Acetylcholinesterase (AChE) hay cholinesterase thật (còn được biết dưới tên
cholinesterase hồng cầu, Ach acetylhydroxylase) có mặt chủ yếu ở mô thần kinh,
hồng cầu và chất xám của não[1]. Enzym này giúp dẫn truyền các xung động qua
các đầu tận của dây thần kinh tới các sợi cơ.
Pseudocholinesterase

(PChE)

hay

cholinesterase

huyết

thanh,

(còn

được biết dưới tên choline esterase II, ACh acylhydrolase, butyryl-cholinesterase
[BChE], cholinesterase huyết tương được sản xuất chủ yếu trong gan. Enzym này

xuất hiện với một lượng nhỏ ở tụy, ruột non, tim và chất trắng của não.
Cholinesterase (ChE) thuỷ phân butyrylthiocholine tạo thành thiocholine và
butyrate. Phản ứng giữa thiocholine và Dithiocholinenitrobenzoate (DTNB) tạo
phức hợp màu vàng (tăng dần).
ChE
Butyrylthiocholine + H2O -------------------> Thiocholine+ butyrate
Thiocholine + DTNB ---------------------> 2 Nitro-5mecaptobenzoate
Sự khác biệt giữa hai loại cholinesterase nói trên là tác dụng ưu tiên xúc tác đối
với cơ chất của enzym: AChE thủy phân ACh nhanh hơn, còn BChE thủy phân
butyrylcholine nhanh hơn.
10


Trong hệ thống phân loại, AChE được xếp vào các nhóm enzym xúc tác phản
ứng thủy phân ester carboxyl (E.C.3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolases) thuộc lớp
enzym thủy phân hydrolase. Enzym AChE có ký hiệu phân loại là E.C 3.1.1.7. Phản
ứng đặc hiệu của AChE là thủy phân acetylcholine tạo thành choline và acetate với
tốc độ 25000 phân tử acetylcholine trong 1 giây. Enzym AChE có vai trị rất quan
trọng trong việc dẫn truyền xung thần kinh từ màng trước qua màng sau synap.
b. Cấu trúc
Các nghiên cứu AChE cho thấy: bản chất của AChE là một phân tử protein thuần
túy có cấu trúc bậc 4, trên bề mặt có các trung tâm hoạt động đóng vai trị xúc tác.
Các tinh thể AChE đầu tiên thu được ở dạng tetrameric được tinh chế từ mô cơ
điện của Electrophorus electricus [7]. Mặc dù tính chất sơ bộ của nó đã được báo
cáo, tuy nhiên cấu trúc vẫn chưa thu thập được. Cấu trúc tinh thể đầu tiên của
Torpedo californica AChE (TcAChE) được xác định vào năm 1991 [13]. Tiếp theo
là một chuỗi cấu trúc 3D của TcAChE đi kèm với số lượng lớn các chất ức chế, bao
gồm thuốc chống bệnh Alzheimer; cũng như các cấu trúc AChE của chuột, của
Drosophila và của người.
Các nghiên cứu động học ban đầu chỉ ra rằng trung tâm hoạt động của AChE

gồm 2 phần, tương ứng là vùng “esteratic” và “anionic” (hình 1.1) [14]. Vùng
esteratic được cho là khá giống với các vùng xúc tác của các serine hydrolysase
khác. Trong AChE của Torpedo californica (TcAChE) vùng serine phản ứng với
OPs được xác định là S200. Cả nghiên cứu động học và nghiên cứu hóa học đều
cho thấy sự có mặt của dư lượng histidine trong vùng trung tâm hoạt động. Vùng
“anionic” liên kết với nhóm amoni bậc bốn của ACh và được cho là vị trí gắn kết
cho cả hai phối tử bậc bốn như edrophonium và N-methylacridinium, hoạt động như
chất ức chế cạnh tranh, và đối với oxit bậc bốn thì hoạt động như một chất kích hoạt
của các nhóm chất phốt pho hữu cơ-chất ức chế AChE. Các nghiên cứu về hóa học
lẫn quang phổ đều cho thấy sự hiện diện của dư lượng các hợp chất thơm ở vùng
hoạt động của AChE.

11


Hình 1.1: Trung tâm hoạt động của AChE
Cấu trúc của AChE đã được phát hiện lần đầu tiên bởi J.L Susman vào năm 1991
nhờ kỹ thuật X-Ray [34]. Phân tử AChE là một monomer peptide dài 537 amino
acid có cấu trúc đa hình, được hình thành bởi các tiểu đơn vị xúc tác hình cầu, mỗi
loại có khối lượng 70-80 kDa. Các tiểu đơn vị này có thể chia thành 2 dạng: dạng
hình cầu và dạng khơng đối xứng. Dạng hình cầu bao gồm monomer, dimer hoặc
tetramer. Dạng khơng đối xứng được hình thành bởi ba cấu trúc phụ: tiểu đơn vị
xúc tác (có dạng hình cầu), tiểu đơn vị collagen và tiểu đơn vị không phân bào. Các
dạng đa hình của AChE cịn được tìm thấy ở nhiều cơ quan trong các loài khác
nhau.
TcAChE (Torpedo californica AChE) tự nhiên là một dạng homodimeric.
TcAChE cũng được xác định cấu trúc ba chiều lần đầu tiên bằng kỹ thuật X-Ray
(hình 1. 2). Monomer có hình elip, kích thước khoảng 45 Ao x 60Ao x 65Ao. Chúng
được tạo thành bởi 12-stranded central β được bao quanh bởi 14 α-helices. Cặp đầu
và cặp cuối của mỗi sợi tạo thành một vịng kẹp tóc β, tạo nên liên kết hydro với

tám sợi còn lại [33]. Cấu trúc này khá tương đồng với một số lipase và esterase.
TcAChE có sự tương đồng lên đến 60% so với AChE của động vật có vú [34]. Nói
chung, cấu trúc AChE ít bị thay đổi ở các lồi khác nhau.

12


Hình 1.2: Mơ phỏng cấu trúc bậc bốn của TcAChE
1.1.2. Tính chất xúc tác của AChE
Cơ chế xúc tác của AChE dựa trên sự hình thành của một chất trung gian acyl
tetraedal, và bao gồm các giai đoạn bổ sung nucleophilic và phản ứng acid-base.
Trong thập kỷ 1970, Rosenberry đã đề xuất một mơ hình động học nhỏ nhất giả
định sự điều chỉnh cấu hình của AChE xảy ra ngay sau khi tiếp xúc cơ chất và
trước khi có phản ứng hóa học (hình 1.3) [8, 9]. Tuy nhiên, mơ hình này chỉ đúng
khi mơ tả hoạt động xúc tác của AChE và BChE đối với các cơ chất trung tính, hoặc
với cơ chất tích điện dương có nồng độ thấp. Trong các trường hợp khác cần sử
dụng các mô hình phức tạp hơn [25].

Hình 1.3: Mơ hình động học tối thiểu của xúc tác AChE
AChE có hiệu suất xúc tác cao. Tuy nhiên, AChE không phải là một enzym chọn
lọc vì nó khơng chỉ thủy phân ACh mà cịn tác dụng với các chất có cấu trúc tương

13


tự ACh như arylic esters, anilides, thioesters, amides, selenoesters, acylic và Ndemethylated [29].
1.1.3.

Vai trò, ứng dụng của AChE trong nghiên cứu phát hiện chất độc


phốt pho hữu cơ
Hóa chất BVTV hay cịn gọi là thuốc BVTV là những loại hóa chất bảo vệ cây
trồng hoặc những sản phẩm bảo vệ mùa màng, là những chất được tạo ra để chống
lại và tiêu diệt loài gây hại hoặc các vật mang mầm bệnh. Chúng cũng gồm các chất
để đấu tranh với các loại sống cạnh tranh với cây trồng cũng như nấm bệnh cây.
Ngồi ra, các loại thuốc kích thích sinh trưởng, giúp cây trồng đạt năng suất cao
cũng là một dạng của hóa chất BVTV. Hóa chất BVTV là những hóa chất độc, có
khả năng phá hủy tế bào, tác động đến cơ chế sinh trưởng, phát triển của sâu bệnh,
cỏ dại và cả cây trồng, vì thế khi các hợp chất này đi vào mơi trường, chúng cũng có
những tác động nguy hiểm đến môi trường, đến những đối tượng tiếp xúc trực tiếp
hay gián tiếp. Và đây cũng là lý do mà thuốc BVTV nằm trong số những hóa chất
đầu tiên được kiểm tra triệt để về bản chất, về tác dụng cũng như tác hại [36]. Trong
nhóm thuốc bảo vệ thực vật có nhóm phốt pho hữu cơ (OP); nhóm OP là các chất
độc đối với hệ thần kinh, tác động lên enzym acetylcholinesterase. Các OP làm ức
chế không thuận nghịch enzym này và tác động theo nhiều cách khác nhau. Các
chất phốt pho hữu cơ có độc tính rất cao, ảnh hưởng rất xấu tới sức khỏe con người.
Theo y văn dấu hiệu và triệu chứng nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật gốc photpho
hữu cơ bao gồm: nhức đầu, choáng váng, cảm giác nặng đầu, nhức thái dương, giảm
trí nhớ, dễ mệt mỏi, ngủ khơng ngon giấc, ăn kém ngon, chóng mặt. Ở một số
trường hợp, có rối loạn tinh thần và trí tuệ, giật nhãn cầu, run tay và một số triệu
chứng rối loạn thần kinh khác [36]. Vì vậy, việc xác định dư lượng các chất phốt
pho hữu cơ trong các nông sản, thực phẩm…là việc làm hết sức cần thiết để bảo vệ
sức khỏe người dân.
Người ta đã phát hiện được vai trò quan trọng của gốc serin trong trung tâm hoạt
động của một số esterase (đặc biệt là cholinesterase). Vai trò của serin được phát

14


hiện khi dùng các chất phốt pho hữu cơ như diisopropylfluorophosphate hay

tetratylpyrophosphate làm chất ức chế enzym acetylcholinesterase [9]. Theo đó, gốc
phosphate của chất ức chế đã kết hợp với nhóm hydroxyl của gốc serin trong trung
tâm hoạt động của acetylcholinesterase tạo nên những dẫn chất O-phốt phoryl vững
bền (hình 1.4). Các liên kết này chỉ bị phân giải trong những điều kiện nhất định bởi
những chất ái nhân, như các dẫn chất của hydroxylamin…
Với những kết quả của nhiều nghiên cứu thực nghiệm khác nhau, đã đi đến kết
luận: chính nhóm serin của acetylcholinesterase đã thực hiện chức năng của chất
nhận trung gian đối với nhóm acyl trong các phản ứng thủy phân các cơ chất thiên
nhiên hoặc các phản ứng kết hợp với các chất ức chế [12], [13].
Người ta đã chứng minh rằng nhóm hoạt động của cholinesterase là serin và cơ
chế hoạt động của enzym này dựa trên đặc tính ái nhân của nhóm (-OH) của
serin[14]. Khi nhóm hoạt động này phản ứng este hóa với phosphate của chất độc
phốt pho hữu cơ thì chất này khóa nhóm (-OH) lại và do đó enzym mất hoạt tính.
Nguyên lý phân tích chất độc phốt pho hữu cơ bằng enzym acetylcholinesterase
dựa trên cơ sở sau:
+ Dưới tác dụng xúc tác của enzym acetylcholinesterase quá trình thủy phân cơ chất
acetylcholine xảy ra theo phản ứng (a):
AChE

ACh + H2O

Cholin + acid acetic (a)

Khi có mặt của các chất độc phốt pho hữu cơ (chất ức chế đặc hiệu), sẽ xảy ra
theo phản ứng (b) tạo thành phức chất trung gian giữa enzym – chất ức chế khá bền
và cholinesterase tự do:
AChE + chất ức chế

AChE - ức chế + ACh (tự do) (b)


15


Hình 1.4: Ảnh hưởng của chất độc cơ phốt pho tới enzym AChE
Do vậy: Xác định độ giảm hoạt độ acetylcholinesterase chính là xác định mức
độ nhiễm độc hợp chất phốt pho hữu cơ.
Các phương pháp phân tích thơng thường để phát hiện nồng độ của các loại
thuốc trừ sâu phốt pho hữu cơ bao gồm điện di mao quản, đo màu, sắc kí khí (GC),
khối phổ (MS), sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu suất cao HPLC [37] . Tuy
nhiên các phương pháp nói trên có một số hạn chế như q trình chuẩn bị mẫu cơng
phu tốn thời gian, đòi hỏi thiết bị đắt tiền và nhân lực được đào tạo… Để khắc phuc
những nhược điểm trên, việc phát triển sử dụng cảm biến sinh học đang được các
nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Các cảm biến sinh học này có những ưu
điểm đơn giản, nhạy cảm, có chi phí phát triển thấp và thân thiện với người dùng.
Trong trường hợp sử dụng cảm biến sinh học AChE để phát hiện các hợp chất cơ
phốt pho, tín hiệu tạo ra tỷ lệ nghịch với nồng độ của các hợp chất cơ phốt pho, hay
nói cách khác chúng ta có thể nói rằng sự gia tăng nồng độ của các hợp chất cơ phốt
pho đưa đến sự giảm tín hiệu cảm ứng[38]. Bộ cảm biến sinh học trong đó AChE
được sử dụng làm nguyên tố nhận dạng cơ bản hoạt động trên hiệu ứng ức chế. Cơ
chế của bộ cảm biến như sau: nếu chất ức chế khơng có trong mẫu thì acetincholine
sẽ vẫn được chuyển thành thicholine và axit axetic. Nhưng nếu chất ức chế có trong
mẫu thì nồng độ thiocholine bị giảm hoặc khơng có thiocholine và axit axetic được
16


sản xuất (hình 1.5). Dưới ảnh hưởng của dịng điện, thiocholine bị oxy hóa. Dịng
điện hóa được tạo thành tỷ lệ nghịch với nồng độ chất độc trong mẫu và thời gian
phơi nhiễm [38].

Hình 1.5: Nguyên tắc của bộ cảm biến sinh học OP dựa trên sự ức chế AChE

1.2. Nhân dòng, biểu hiện acetylcholinesterase
1.2.1. Nhân dòng, biểu hiện AChE
Ở động vật có vú, acetylcholinesterase được mã hóa bởi một gen AChE duy nhất
trong khi một số động vật không xương sống có nhiều gen mã hóa cho enzym
AChE.
Acetylcholinesterase (AChE) đóng một vai trị quan trọng trong việc phát hiện
thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, việc chiết xuất AChE từ nguyên liệu tự nhiên có những
nhược điểm như năng suất thấp, tinh sạch phức tạp và độ ổn định kém. Do đó, việc
tạo ra AChE tái tổ hợp với hiệu suất cao được quan tâm nghiên cứu. Trên thế giới
đã có nhiều cơng trình biểu hiện enzym AChE ở nhiều hệ thống biểu hiện khác
nhau.
Năm 1993, Meir và cộng sự đã biểu hiện AChE của người trong E.coli dưới sự
kiểm soát hoạt động của deo promoter hoặc promoter chịu nhiệt λPL [4] . Để nâng
cao hiệu quả biểu hiện trong hệ thống sinh vật nhân sơ, cADN của AChE tái tổ hợp

17


(rhAChE) được sửa đổi ở đầu N bằng cách gây đột biến điểm nhằm thay thế một số
vùng giàu GC bằng AT. Những thay đổi này không làm thay thế trình tự axit amin
nhưng dẫn đến sự tổng hợp phong phú protein. rhAChE được tích lũy trong tế bào
với hiệu suất tổng hợp chiếm 10% trong tổng số protein vi khuẩn. Một phần protein
tái tổ hợp không hoạt động đã được thu dưới dạng khơng hịa tan. rhAChE tái tổ
hợp có hoạt tính thu được sau q trình hịa tan, cuộn gập và q trình oxy hóa dù
hiệu quả thu hồi thấp. Hoạt tính của enzym tái tổ hợp tăng từ 20-40 lần bằng cách
thay thế Cys580 bằng Serine. rhAChE thu được không sai khác với AChE tự nhiên
phân lập từ hồng cầu về độ đặc hiệu và các chất ức chế chọn lọc.
Năm 1994, người ta đã biểu hiện đồng vị dimer và tetrameric AChE trên bề mặt
các tế bào chromatin ni cấy trên thượng thận bị [26].
Năm 1997, đoạn gen AChE từ Electrophorus electricus được biểu hiện trong tế

bào COS, HEK và tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc [32].
Năm 1998, gen acetylcholinesterase của bò (BoAChE) đã được nhân dòng từ
ADN genome và đã được xác định cấu trúc gồm có 5 exon mã hóa cho tiểu đơn vị
AChE T và tiểu đơn vị thay thế H [20]. Các exon này có sự bảo tồn cao về cấu trúc
gen AChE ở động vật có vú. Trình tự axit amin suy diễn của tiểu đơn vị của tiểu
đơn vị T ở bị rất giống với ở người, chỉ có 34 vị trí sai khác. Tuy nhiên, trình tự
BoAChE nhân dịng khác với trình tự axit amin đã được cơng bố của AChE phân
lập từ huyết thanh bào thai bò (FBS-AChE). Trình tự gen hồn chỉnh mã hóa cho
tiểu đơn vị BoAChE T đã được biểu hiện trong tế bào 293 phơi thận của người
(HEK-293). Các tính chất xúc tác và khả năng phản ứng với các chất ức chế khác
nhau của enzym tái tổ hợp BoAChE tương tự như enzym AChE tự nhiên ở bò.
BoAChE tái tổ hợp khi hòa tan tồn tại ở dạng monomer, dimer and tetramer, nhưng
ở FBS-AChE thì dạng tetramer khơng bền.
Trình tự mã hóa của gen BoAChE được xác định bằng phương pháp PCR, sử
dụng ADN genome tách từ tế bào thận của bò đực trưởng thành và dựa trên 2 bản
sao độc lập cho mỗi đoạn ADN được khuếch đại. Các đoạn mồi được thiết kế để bắt
cặp với các exon khác nhau dựa trên sự tương đồng của AChE ở động vật có vú. 6
đoạn ADN khuếch đại (hình 2b) được sử dụng để xác định trình tự gen của AChE
của bị: Các đoạn ADN bao gồm phần chứa đầu C của exon 2 (đoạn I), cũng như
18


đoạn exon 3 (đoạn II) và 6 (đoạn III) đều được khuếch đại sử dụng mồi thối hóa có
nguồn gốc từ trình tự axit amin của FBS-AChE đã được cơng bố, mỗi đoạn này
được nhân dòng tách biệt vào vector pGEM-T (Pomega). Để xác định trình tự của
ranh giới giữa exon 2 và 3, hai đoạn bổ sung đã được khuếch đại và nhân dòng:
phần đầu N của exon 2 (đoạn IV) và intron 2 (đoạn V). Để nhân dòng exon 4 và 5
và thiết lập ranh giới của exon 3 và 6, một đoạn khoảng 2,6 kb (đoạn VI) từ vị trí
kết thúc exon 3 kéo dài đến vị trí bắt đầu exon 6 cũng đã được khuếch đại.
Trình tự mã hóa cho tiểu đơn vị T của BoAChE đã được tạo thành bởi các

exon 2, 3, 4 và 6 thông qua các mối liên kết tổng hợp ADN thích hợp. Trình tự gen
mã hóa BoAChE được nhân dịng vào vector pBo2346 bằng 2 enzym BspEI ± SalI
(hình 2c). Sau đó, BoAChE lại tiếp tục được chuyển vào vector biểu hiện
pHuAChE-nc bằng cặp enzym EcoRV ± SalI và liên kết với một đoạn peptide tín
hiệu của AChE ở người (hình 1.6).

Hình 1.6: Quy trình nhân dịng và biểu hiện AChE của bò

19


a. Sơ đồ cấu trúc gen AChE của bò suy diễn từ trình tự ADN
b. Các đoạn ADN được sử dụng để nhân dòng gen AChE của bò
c. Plasmid pBo2346 mang 4 exon mã hóa cho tiểu đơn vị T của enzym AChE
d. Vector biểu hiện pBoAChE-nc mang gen AChE của bò, gen neo và cat
Năm 2013, các nhà khoa học đã xây dựng hệ thống biểu hiện bề mặt của
acetylcholinesterase chiết suất từ tằm tơ (BmAChE) và nghiên cứu hoạt tính của nó
[12]. Gen Acetylcholinesterase đã biến đổi được gắn với protein định vị (AGα1) từ
Saccharomyces cerevisiae và chuyển vào tế bào P.pastoris chủng GS115. Chủng tái
tổ hợp chứa gen dung hợp bmace-AGα1 sẽ cảm ứng biểu hiện BmAChE trên bề mặt
tế bào P.pastoris. Sử dụng phương pháp soi kính hiển vi huỳnh quang và đếm tế
bào theo dịng chảy cho thấy BmAChE đã biểu hiện thành công trên bề mặt tế bào
P.pastoris GS115. Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp Ellman cho
kết quả 787.7 U/g (khối lượng tế bào ướt). Hơn nữa, hoạt tính của BmAChE đã
được khẳng định thông qua các xét nghiệm ức chế với eserine, và với carbamate và
thuốc trừ sâu chứa photpho hữu cơ. BmAChE được biểu hiện có IC50 là 4.17×10-8
và có độ nhạy cảm cao với eserine và 5 loại thuốc trừ sâu chứa carbamate, cũng như
7 loại thuốc trừ sâu chứa photpho. Từ kết quả nghiên cứu kết luận rằng BmAChE có
hoạt tính sinh học tốt.
Năm 2016, các nhà khoa học Thổ Nhĩ Kì đã nhân dịng và biểu hiện thành cơng

tồn bộ đoạn gen cADN mã hóa cho AChE của não người (hAChE) vào trong
vector pET SUMO [8]. Vector tái tổ hợp được biểu hiện trong Escherichia coli
BL21 (DE-3). Protein thu được có gắn đi His-tag dưới sự cảm ứng biểu hiện của
IPTG và được tinh sạch bằng sắc kí ái lực (Ni2+). Protein tái tổ hợp có kích thước 90
kDa. Hoạt tính của enzym được tính theo Ellman và cộng sự ở pH 9,0; sử dụng đệm
glycine-NaOH; nhiệt độ phòng. Km và Vmax được xác định lần lượt là 0,63 và
0,69.

20


1.2.2. Tối ưu hóa codon trong E.coli.
Chỉ số thích ứng Codon (CAI) là kỹ thuật phổ biến nhất để phân tích tính phù
hợp sử dụng Codon. Trái ngược với các phương pháp khác về độ lệch sử dụng
codon, chẳng hạn như 'số lượng codon' hiệu quả (Nc), đo độ lệch từ sai lệch thống
nhất (giả thuyết không), CAI đo độ lệch của chuỗi gen mã hóa nhất định đối với bộ
gen tham chiếu [42].
Lý tưởng nhất, bộ tham chiếu trong CAI bao gồm các gen được biểu hiện cao,
để CAI cung cấp chỉ thị mức biểu hiện gen theo giả định rằng có lựa chọn dịch để
tối ưu hóa trình tự gen theo mức độ biểu hiện của chúng. Lý do cho điều này là: các
gen được biểu hiện cao cần phải cạnh tranh với các nguồn lực (tức là ribosome)
trong các sinh vật phát triển nhanh và có ý nghĩa đối với chúng cũng được dịch
chính xác hơn. Cả hai giả thuyết đều dẫn đến các gen được biểu hiện cao bằng cách
sử dụng phần lớn các codon cho các lồi có nhiều tRNA trong tế bào.
Năm 2008, Nicola và cộng sự đã nghiên cứu tính phù hợp sử dụng codon ảnh
hưởng đến sự biểu hiện protein [27]. Hiệu quả sản xuất các loại protein khác nhau
trong E.coli có thể bị ảnh hưởng bởi tính phù hợp sử dụng codon. Phương pháp tiếp
cận thường được sử dụng để khắc phục vấn đề này bao gồm cả việc gây đột biến
nhắm mục tiêu để loại bỏ codon hiếm hoặc bổ sung các tRNA codon hiếm trong các
dòng tế bào cụ thể. Gần đây, những cải tiến trong công nghệ đã giảm thiểu chi phí

tổng hợp các gen. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã thiết kế các mẫu biểu
hiện trong E. coli của 30 gen dehydrogenase / reductase của con người (SDRs) được
phân tích trong ba thí nghiệm độc lập, so sánh các phiên bản gốc và tổng hợp
(codon-optimization) của mỗi gen. Các gen được biểu hiện trong vector có nguồn
gốc từ hệ vector pET có gắn thêm đuôi polyhistidine vào đầu N của protein; gen
biểu hiện được cảm ứng bằng cách sử dụng IPTG và protein hòa tan được phân lập
bằng sắc kí ái lực kim loại Ni-NTA. Biểu hiện của các cấu trúc gen tự nhiên và tổng
hợp được so sánh trong hai chủng vi khuẩn, trong đó một chủng chứa một plasmid
(pRARE2) mang 7 tRNA của codon hiếm. Kết quả cho thấy, ở chủng E.coli bình
thường gen tổng hợp có khả năng biểu hiện và tinh sạch tốt hơn so với dạng tự
21


nhiên; chỉ có một trường hợp gen tự nhiên biểu hiện tốt hơn. Quan trọng hơn, trong
hầu hết nhưng không phải tất cả trường hợp, biểu hiện của các gen tự nhiên kết hợp
với các tRNA codon hiếm giống với sự biểu hiện của các gen tổng hợp ở chủng tự
nhiên. Từ đó cho thấy biểu hiện của một số protein trong vi khuẩn có thể được cải
thiện bằng cách thay đổi tùy chọn codon.
Năm 2008, để cải thiện mức độ biểu hiện của AChE ruồi giâm Drosophila
melanogaster (DmAChE) trong nấm men Pichia pastoris, Wu và cộng sự đã tôi ưu
hóa cADN mã hóa cho DmAChE và tống hợp lại gen trước khi biểu hiện trong vật
chủ [39]. cADN tổng hợp thiếu chuỗi peptide tín hiệu GPI được nối với vector biểu
hiện trong P.pastoris tạo nên vector tái tổ hợp pPIC9K/ DmAChE. Plasmid dạng
mạch thẳng được biến nạp vào P. pastoris dòng GS 115 bằng phương pháp xung
điện. Kết quả thu được chủng nấm men với mức độ biểu hiện DmAChE tái tổ hợp
cao. Sau 5 ngày nuôi cấy với chất cảm ứng methanol thu được lượng enzym cao
nhất với hoạt độ 718,5 U/ml, cao hơn 3 lần so với biểu hiện DmAChE dạng tự
nhiên (hình 1.7). Chủng tái tổ hợp mới có khả năng được sử dụng để sản xuất các
enzym DmAChE tái tổ hợp trong việc ứng dụng để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu
organophosphate và carbamate.


Hình 1.7: So sánh hoạt tính của enzym DmAChE tái tổ hợp trước và sau khi tối ưu
codon qua các mốc thời gian nuôi cấy

22


Năm 2016, Tian và cộng sự đã biểu hiện thành cơng butyrylcholinesterase của
người (hBChE) sau tối ưu hóa codon trên nấm men Pichia pastoris dòng GS115
[35]. Chuỗi polypeptide sau tối ưu có trình tự axit amin trùng với trình tự axit amin
của hBChE đã được công bố. Đồng thời, tỉ lệ Guanine: Cytosine (G:C) tăng từ 40
lên 47% sau tối ưu (hình 1.8). hBChE tái tổ hợp thu được có nồng độ protein tổng
số đạt 292 mg/ml với hoạt độ 14,7 U/ml; sau tinh sạch thu được enzym có hoạt độ
riêng 8,1 U/mg với hiệu suất 68%. Enzym tái tổ hợp hoạt động ở pH tối ưu 7,4 ở
50ºC, giữ được họat tính ở dải pH rộng từ 4,0 đến 8,0; bền nhiệt ở 70ºC. Chỉ số
động học Km- 89,4 mmol/L và Vm đạt 1721 mmol/min/mg.

Hình 1.8: Chỉ số CAI của hBChE trước và sau khi tối ưu trong nấm men Pichia
pastoris
1.3. Tinh sạch enzym AChE
Acetylcholinesterase được phát hiện trong nhiều cơ thể sinh vật từ bậc thấp tới
bậc cao như nhuyễn thể, sò, cá, ngan, gà, thỏ, chuột, ngựa, bị..và ở người
[40],[28],[19] . Trong cơ thể, AChE khơng chỉ có ở mơ thần kinh mà cịn có ở các
mơ khác như: mô cơ,...và trong huyết thanh, hồng cầu [1]. Do có nhiều ứng dụng
quan trọng nên AChE được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau. Các phương pháp
tinh sạch đều dựa trên cơ sở tách chiết protein. Một trong các phương pháp thông
dụng nhất là sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn protein nhằm thu được chế
phẩm enzym thơ, sau đó sử dụng sắc ký để tinh sạch loại enzym mong muốn[21].
Enzym AChE thường được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực.
Năm 1970, AChE được Berman và cộng sự tinh sạch lần đầu từ mô của lươn

điện (Electrophorus electricus) và hồng cầu bò (Bovine erythrocyte membranes) [5]
23