Ứ N G D Ụ N G P H Ư Ơ N G PH ÁP ĐIỆN DI M A O Q U Ả N TR O N G
ĐỊNH LƯ

NG TẠP Đ

N G PH ÂN Đ ỐI Q U A N G D Ạ N G R

CỦA VALSARTAN TRONG D ư ợ c PHẢM

Ts. Nguyễn T hị Ngọc Vân*; Ths. Kyun g R a n L

**

TÓ M T T
Valsartan được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp [1]. Trong cấu trúc phân tử có một cacbon bất đổi xứng, nhưng chỉ
có đồng phân S­valsartan có lấc đụng dược lý [2]. Đên nay chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp điện di mao
quản để định lượng tạp đồng phân đối quang của valsartan trong được phẩm.
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Phái triển quy írình định lượng đồng thời valsartan và đồng phân đối quang
trong dược ph ầ n với độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh.
Đối tưọng và phương pháp nghiên cún: Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan® (160 mg
valsartan) được sàn xuất bời công ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc) và công ty Novartis (Basel, Switzerland).
Phương pháp nghiên cứu: Tối ưu hóa các điều kiện điện đi tách đồng thời valsartan và đồng phân đối quang và tiến
hành thẩm định quy tr nh định lượng. Từ đó, áp đụng quy tr nh định ỉượng một vài chể phầm trên thị trường.
Kết quả: Điều kiện điện di tối ưu gồm dung dịch đệm phosphate 25 mM, pH 8, chứa 10 mM Acetyl­(5­CD làm chất
điện giải nền, điện thế áp đụng là 30 kV ở 30°c. Ibuprofen được sử đụng làm chất chuẩn nội. Quy tr nh đã được thẩm
định với khoảng nồng độ là 0,5 ­ 30 pg/ml của đồng phân dạng R. Giới hạn phát hiện là 0,01%, giới hạn định lượng là
0,05%, so với nồng độ valsatan 1 mg/mỉ. Tỷ lệ hồi phục của đồng phân R từ 97 ­ 99,6% trong chế phẩm chứa valsartan.
Quy tr nh được áp đụng để định lượng tạp đồng phân dạng R có trong viên nén chứa valsartan.
Kết luận: Quy tr nh định iượng đã thẩm định có tính đặc hiệu, cho độ đdng và độ chính xác cao. Phương pháp được
tiến hành đơn giản, tiếl kiệm đung mơi hố chất, đồng then vẫn cho kết quả đáng tin cậy.
* Từ khóa: Vaỉsartan; Phương pháp điện di mao quàn; Dạng đồng phân đối quang dạng R.

Application o f capillary electrophoresis method fo r determination o f the R-enantiomer
ofValsartan as impurity in pharmaceuticalformulation
Sum m ary
Valsartan is widely applied for treatment of hypertension and administrated as a single isomer (S­valsartan). To the
best of our knowledge, the enantiomeric purity determination of Valsartan in commercial products has never been
investigated in capillary electrophoresis (CE) method. Thus, the aim of our study is to develop a CE method for
simultaneous determination of Valsartan and R­enantiomer in pharmaceutical formulation with high sensitivity and
short analytical time.
Materials and method: Valsarect® tablets (160 mg VAL) were kindly supplied by JW pharmaceutical industries
corporation (Korea). Diovan® tablets (160 mg VAL) were manufactured by Novartis (Basel, Switzerland). Method:
Optimization of the electrophoretic conditions and method validation. Then apply method for determination of
pharmaceutical formulation.
Results: optimized conditions included 25 mM phosphate buffer, pH 8.0, containing 10 mM Acelyl­(5­CD as
background electrolyte, an applied voltage of +30 kV and a temperature of 30°c. Ibuprofen was used as internal
standard. The assay was validated for the R­enantiomer in the range of 0.5 ­ 30 ng/mL. The limit of detection was
0.01%, the limit of quantitalion was 0.05%, compared to a concentration of valsartan of 1 mg/ml. Intra­day precision
varied between 2.57% and 5.6%. Relative standard deviations of inter­day precision ranged between 4.46% and 6.76%
for peak area ratio. The percentage recovery of the R­enantiomer ranged between 97.0 to 99.6% in valsarian product.
The assay was applied to determine the R­enanliomer as an impurity.

* Đại học Y Dược cần Th
** Đại học Quẩc gia Kangwon, Hàn Quốc

641


Conclusion: Th basic charact ristics o f th CZEfulfil g n ral validation crit ria and thus th m thod can b us d
in routin analysis. It nabl s d t ction as low as 0.01% o f impurity R- nantiom r o f valsartan in drugs.
* K y words: Valsartan; Capillary l ctrophor sis m thod; R- nantiom r.

LĐẶTVẨNĐẺ

V alsartan có tên khoa học là N ­(l~oxo­pentyl)­N ­[2’~(lH ­tetrazol­5­yl)[l,l­b iphenyl]­4­yi] methyl]
­L­valin. Thuốc có tác động ức chế chọn lọc thụ thể type 1 của Angiotensin II (A TI), làm giảm huyết áp và
được sử đụng trong điều trị tăng huyét áp [11. Trong cấu trúc phân tử cửa valin, có một cacbon bất đối xống
tuy nhiên chỉ có đồng phân S­valsarían có tác dụng được lỷ, đồng phân đối quang của nó (R­valsartan) được
xem như tạp chất trong cơng thức [2]. Việc nghiên cứu và thiết lập những giới hạn về các tạp chất tồn tại bên
cạnh các thành phần có hoạt tính ngày càng trờ nên quan Èrọng đối với ngành dược. So với HPLC, kỹ thuật
điện đi mao quản chỉ cần một lượng nhỏ dung môi, chất chọn lọc đối quang và lượng m ẫu nhỏ. Kỹ thuật này
có nhiều ưu điểm như hiệu năng cao, nhiều cơ chế tách khác nhau và linh hoạt trong .chọn lựa và thay đổi
dung môi và các chất chọn lọc [3,4].
Cho đến nay, chưa có nghiên cửu nào sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng
phân đối quang của valsartan trong dược phẩm. V vậy, mục tiêu của nghiên cửu nhằm P hát triển m ột quy
trình định lượ ng đồng thời valsartan và đồng ph â n đổi quang cửa n trong dược p h ẩ m với độ nhạy cao
và ph â n tích n hanh đáp ú n g n h u cầu p h â n tích hiện tại.

n>

(2)

(3)

'

H nh 1. Cấu trúc hoá học của valsartan, R­valsartan và Ibuprofen (chuẩn nội)
II. Đ Ố I T Ư Ợ N G VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊN c ứ u
2.1.

Đ ố i tượng nghiên cứu


­ Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan®(160 m g vaỉsartan) được sản xuất bởi
cơag ty JW Pharmaceutical (Ansung, Hàn Quốc) và công ty Novartis (Basel, Switzerland.
Thiết bị phân tích
- Máy điện di mao quản Hewlett Packard313(CA, USA) với đầu dò dãy diod quang (DAĐ) sử dụng phần
mềm HP3DCE Chemstation để điểu khiển thiết bị và thu thập dữ liệu.
­ Khối phổ kế JEOL (JAPAN), JM S­700 được trang bị đầu dị ion hóa điện tử hoạt động ở ché độ ion
dương. Phạm vi quét từ 50 ­ 500 mỉz.
­ Máy quét phổ đo đường bay của ion (Matrix­assisted laser desorption/ionization Time of flight
(MALDI­TOF)).
­ M áy Brucker Avance­600 (600.25 MHz, Brucker, Germany) đo phổ *H­NMR dùng TMS làm chất đối
chiếu. Phổ được ghi ở 600 M Hz với dung môi CD3OD.
648


H a chat, dung mơi
Tat cả các hóa chất và thuốc thù sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích
Chuẩn valsartan được cung cấp bởi cơng ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc). Chuẩn đồng phân đối

“ Acetyỉ­p­cyđodextrin (A­p­CD) của công ty Wacker­Chemie GmbH (Burghausen, Đức), a­cyclodextrin
(a­CD), p­cyclodẹxtrin (p­CD), y­cyclodextrin (y­CD), 2­hydroxypropyl­cc­cycỉo­dextrm (HP~a~CD) và
methyl­p­cyđodextrin (M “P~CD) được cung cấp bời Sigma­Aldrich, 2­(Hyđroxypropyl)~p­cyclodexirin (HP“
p­CD) được mua từ công ty Fluka (Đức).
­ Acid phosphoric và natri hydroxid được mua từ Cơng ty Hóa chấÊ tinh khiết Duksan, Hàn Quốc, Dikali
dihyđrogenphosphat loại P.A.
­ Nước cất khử khoáng.
2.2. Phư ơng pháp nghiên cứ u
2.2.1. Chu ẩn b ị dung dịch chuẩn đồng phân dạng R của valsartan

R­valsartan được chuẩn bị bằng phản ứng hóa học chuyển dạng đồng phân từ nguyên liệu valsartan (S­
valsartan). Từ mẫu phản ứng, đồng phân dạng R được phân lập tù hệ thống HPLC bán điều chế. Điều kiện

sắc ký: cột Chiralcel OD­H (5 Ịim, 10 X 250 mm), n­hexane 2­propanoI: tr íỉuoro­acetic acid (92 : 8 : 0.1,
tt/tt/tt) được đùng làm pha động với tốc độ dịng 2.0 ml/phút, bước sóng phát hiện là 220 nm.
Sau khi thu được đồng phân dạng R, kiểm ỉra độ tinh khiết bằng hệ thống HPLC phân E ích CỘE Ch ralcel
OĐ­H (5jim, 250 X 4.6 mm, i.d.) và pha động gồm có n­hexane:2­propanoỉ: trifluoroacetic acid (90:10: 0,1,
tt/tưtt), tốc độ dịng ỉà 0.8 ml/phút, ờ bước sóng 220 nm,
Xác định cấu trúc của chuẩn R­vaỉsartan bằng phổ MALDI­TOF M S, ‘H NMR: MALDI­TOF/EI m/z
436.1973 [M+H3+, m/z 432.1991 [M~H203; lH­NMR (CD3OD) 5 7.02 ­ 7.66 (aromatic proton ), 4.66 ­ 4.76
(U ­H , CH2 coupling), 4.61 (NH), 4.58 (6­H, CH, d), 2.63 (7­H, CH, m), 2.20 ­ 2.26 (2­H, c u 2, m), 1.53 ­
1.66 (3­H, CH2, m), 1.25 (4­H, CH 2, m), 0.84 ­1 .0 2 (8,9­H, CH3, dd), 0.96 (5­H, CH 3,t).
V o y a o o r s p a o #1 = N F 1

(A)

.0 =>NR(2 .00)=»SWB =>CtiaP = 4 sa .z , 14SSO]
4 S8 .17 9 2

B .3376
4 S 9 .4 24 8

4 3 8 .1 9 7 2

Sao

440

450

M a BU(irựz)

4 80


4e8

V o y u g o r S p o c #1 CO.NF1.0=»NH{2.00)=>SM5=O.CT{BP = 4 S 0 .2 , 17027]
4 S 8 .1 6 7 0

(B)

1
4-.

8 ,3 2 9 3

Mima(m/2)

I

H nh 2. Phổ M A L D ITOF MS của (A) valsartan và (B) đồng phân R­valsartan
So sánh với tài liệu tham khảo [2] và phổ của valsartan (công ty dược phẩm JW ) nhằm xác định chính xác
chất chuẩn nhóm nghiên cứu chuẩn bị chính là đồng phân đối quang R của valsarían.
649


2.2.2. C hu ẩn b ị các dun g d ịch chuẩn gốc

Dung dịch chuẩn gốc valsartan (10 mg/ml) và R­valsartan (100 ng/ml) pha ừong dung môi methanol,
dung địch chuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng trong hỗn hợp methanol : nước (1:1, tt/tt).
Nồng độ đung dịch chuẩn Vãlsartan, R­valsartan và chuẩn nội tương ứng là 1 mg/ml, 10 fig/ml, 1 ịig/mJ.
Nồng độ R­valsartan trong hỗn hợp là 1% so với valsartan, phù hợp với giới hạn cho phép của tạp đồng phân
quang học trong chế phẩm (theo Dược điển Mỹ ƯSP 32).

2.2.3. C hu ẩn b ị d u n g dịch th ử
Cân 20 viên chế phẩm và nghiền thành bột. Cân một lượng bột tương ứng với 10 m g valsartan, cho vào
b nh định mức đung tích 10 ml và hịa tan với khoảng 1 ml ethanol, đem siêu âm trong 15 phút và thêm 1 ml
IS, 1 ml hỗn hợp methanol: nước (50:50, tưtt). Tiếp tục đánh siêu âm hỗn hợp trong 15 phút để các chất tan
hoàn toàn. Dung dịch được lọc qua giấy lọc W hatman kích thước 0,45 p,m.

Tối ưu hóa các điều kiện điện dỉ tách đồng thời vaỉsarỉan và đồng phân đổi quang
­ Khảo sát chọn dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp
­ Nồng độ dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc
­ Nồng độ và pH đệm
­ Nhiệt độ cột và dịng điện thế phù hợp

Thẩm định quy trình định lượng
Phương pháp thầm định được thực hiện theo hướng đẫn ICH 2005 Q2 (R l) [5] với các tiêu chí gồm tính tương
thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đóng và độ
thơ của phương pháp. Tính tuyến tính được xây dựng với 6 nồng độ khác nhau của đung dịch đồng phân dạng R.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dựa trên tín hiệu nhiễu tương ứng 3:1 và 10:1. Quy tr nh định lượng
được thẩm định vói khoảng nồng độ từ 0,05 ­ 3,0 % hàm lượng của tạp R­valsartan so với hoạt chất valsartan
trong chế phẩm.
Cyclođextrin

N(mM )

a­CD
(Ỉ­CD
Y-cD

10

M­Ị5­CD


10

A­I5­CD
HP­a­CD
HP­Ê­CD

ĨS

Thời gian di chuyển (phứt)
Valsartan
R­vaisartan

Ss

­

10

­
­

­

­

­
­

10


­

­

­

­

17.234

16.847

.2.95

­

­

­

15.977

16.147

1.26

10

9.398


10

­

10

10.401

10.817

3.08

III. K Ế T QUẢ

3.1- Tối ưu hóa các điều kiện điện di
Khảo sát chọn đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp: Độ phân giải của đồng phân đối quang valsartan là
3,08 khỉ sử dụng A­Ị3­CD.
Bảng 1: các đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc được khảo sát cho quy tr nh tách đồng thời các đồng phân đối
quang valsarían.
­ Khơng tách được
Nồng độ tối ưu cùa A­P­CD được khảo sát bằng cách thay đổi từ 5 đến 35 mM. Độ phân giải tốt nhất tại
nồng độ 10 mM để tách valsartan và đồng phân đạng R. Nồng độ của đệm phosphate được khảo sát trong
khoảng 25 ­ 100 niM, nồng độ điện giải tối ưu là 25 mM, tại đó độ phân giải phù hợp và thịi gian phân tích
650


ngắn. Khoảng pH từ 6 ­ 9 được áp dụng để tối ưu hóa pH của chất điện giải, pH được chọn là 8. Nhiệt độ
thay đổi từ 15 ­ 30°c, nhiệt độ được chọn ià 30°c. Hiệu quả của điện thế áp dụng được khảo sát bằng cách
thay đổi từ 15 ­ 30 kV. Khi điện thế tăng iên đến 30 Kv, thời giạn phân tích được rút ngắn lại và pic nhọn

hơn. Do đó, điện thế là 30 kV được chọn để tách các đồng phân đối quang của valsartan. Như vậy, điều kiện
sắc ký tối ưu bao gồm đệm phosphat 25 mM, pH 8 chứa A­p­CD 10 mM là chất điện giải nền, nhiệt độ mao
quàn ià 30°c và điện thế áp dụng là 30 kV.
Điện di đồ đặc trưng của valsartan và đồng phân dạng R được phân tích dưới điều kiện tối ưu (hình 3).
A,

,00(2012VA­.t o

o

1.1^010VANSJVO­O­to*.0>
/

(1)

“

(2)

/ì

o­

/

(3)
I

V .


J

.

.....

•*­
2 ­­­­­­­­­­­­­­­­­

­

- é ...............

7

a

T*

R

'

H nh 3. Điện di đồ đặc trưng của hỗn hợp gồm valsartan (1 mg/ml), đồng phân đối quang R nồng độ 0,1% và
chuẩn nội nồng độ 0,1% so với nồng độ của hoạt chất chính valsartan
Điều kiện tách: cột mao quản silica kích thước 64,5, chiều dài hiệu quả 56 cm, 50 Ịim i.d., đệm phosphat
25 mM, pH 8 và to mM A­p­CD; điện thế 30 kV; bước sóng phát hiện 205 nm; nhiệt độ cột 30°c. (1) chuẩn
nội (ibuprofen); (2) vaisartan; (3) đồng phân R của vaisartan.
3.2. T h ẩm định phư oiìg pháp


Khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.
____________________ Thông sổ___________________________________________________ .
_______
Phương tr nh hồi quy
y = 1.3812 X + 0.1724
Khoảng nồng độ khảo sát % đồng phân R so với
n c ™ /™r ^ ___,___ „ //lf,
valsartan (lmg/ml)
° ’5 ­ 30 ^ /m h Tưcmg ứng 0,05 ­ 3,0 (%)
R2

1

L.O.D. (% đồng phân R so với vaĩsartan)

0,01 (%)

L.O.Q. (% đồng phân R so với valsartan)______________

0,05 (%)

Độ chính xác
Độ chính xác (%)

Trong ngày (R.S.D, %)

Liên ngày (R.S.D, %)

0,1


2,57

6,76

0,8

2,76

4,88

2

5,60

4.46

đúng
Lượng chuẩn thêm vào (%)

Lưọng t m lại (%)

Độ phục hồi (%)

Bias (%)

0,08
0,1
0.12

0.0855

0.1040
0.1268

98.04
96.96
99.61

6.9
4.Ĩ
5.7

3.3. Đ ộ thơ của phư ong pháp

Độ thơ của phương pháp được xác định thông quạ những thay đổi nhỏ so yới điều kiện tối ưu đã khảo sát
mà không làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Để xác định độ thô cùa phương pháp, 4 yếu tố sau được chọn
651


để khảo sát: đệm pH 8 ± 0,2; 10 mM A­p­CD ± 1; 25 mM đệm phosphate ± 2; điện thé 30 ± 1 kV. Kết quả:
những thay đổi nhỏ này khơng làm thay đổi tỷ ệ điện tích đỉnh của R­valsartan so vói pic của chuẩn nội.
3.4.

ứ n g dụng quy trình đã thẩm định để định lượng chế phẩm chứa valsarỉan

Hàm lượng của đồng phân R của valsartan trong viên nén Valsarect và Diovan
Chế phẩm

Tạp đồng phân R­valsartan (%)

R.S.D (%)


Valsarect®

0.116

L S I S J Va u v t y

0.215

1.55
£\ J . Z i

IV. BÀN LUẬN
Valsartan là dẫn xuất tetrazol chứa gốc aciđ (pKa = 4,73) và gốc carboxylic (pKa = 3,9). Do đó, khoảng
pH trung tính được chọn cho phân tích đồng phân quang học với mục đích proton hóa hồn tồn và hạn chế
địng điện thẩm thấu để quan sát kết quả. Kết quả khảo sát chọn dẫn xuất cycỉođextrin chọn lọc phù hợp được
tr nh bày trong bảng 1, điều kiện điện đi được chọn là đệm phosphat 50 mM (pH 7) chứa các dẫn xuất CD (a ­
,p­, y­, M­Ị3­, A­ỊỈ­, H P ­a­ and HP­p­CD). Độ phân giải của đồng phân đối quang valsartan là 2,95 khi sử
đụng M­ỊÌ­CD và 3,08 khi sử dụng A­p­CD. Tuy có độ phân giải giống nhau so với M­p­CD nhưng A­p­CD
được chọn lựa do thời gian phân tích ngắn và tín hiệu cao so với nhiễu. Do tính lưỡng tính của valsartan nên
thịi gian lưu chịu ảnh hưởng nhiều bởi pH, v pH quyết định khả năng tích điện âm hay dương của hcrp chất.
Khoảng pH từ 6 ­ 9 được áp dụng để tối un hóa pH của chất điện giải. Két quả, sự di chuyển của các chất
tăng khi giá trị pH tăng, pH quá cao làm tăng dịng EOF do đó, khơng thuận lợi tách các đồng phân đối
quang. Do đó, đệm phoaphat 25 mM tại pH 8 được chọn lựa làm chất điện giải nền tối ưu. Với điều kiện tối
ưu vừa được khảo sát, thời gian điện di của valsartan và đồng phân đạng R tương ứng là 5,6 và 5,9 phút.
Quy tr nh đã được thẩm định với khoảng nồng độ là 0,5 ­ 30 fig/ml của đồng phân dạng R. Giới hạn phát
hiện là 0,01%, giới hạn định lượng là 0,05%, so với nồng độ valsatan 1 mg/ml. Độ chính xác trong ngày với
giá trị RSD trong khoảng 2,57 “ 5,6%, độ chính xác liên ngày với RSD trong khoảng 4,46 ­ 6,76%. Tỷ lệ hồi
phục của đồng phân R từ 97 ­ 99,6% trong chế phẩm chứa valsartan.
Phương pháp đã ứng dụng để định lượng tạp đồng phân đối quang R­valsartan trong hai chế phẩm viên

nén Valsarect ® và Diovan <§>. H àm lượng R­valsartan được tính tốn dựa vào đường chuẩn, 0,22% trong
viên Diovan® và 0,12% trong viên Valsarect. Kết quả định lượng cho thấy phương pháp này có tính chọn
lọc để phân tích các tạp đồng phân mà khơng bị ảnh hưởng bời các tá được có trong công thức.
V. K É T LUẬN
Các kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp điện di mao quản định lượng tạp đồng phân R­valsartan
với các điều kiện đã khảo sát có tính đặc hiệu, cho độ đứng và độ chính xác cao. Phương pháp điện đi mao
quản tién hành đơn giản, tiết kiệm dung mơi hố chất, đồng thời vẫn cho kết quả đáng tin cậy.
T À I L IỆU T H AM K H Ả O
1. G. Flesch, Ph. Muller, p. Lloyd. Absolute bioavailabiỉity and pharmacokinetics of valsartan, an angiotenin II
receptor antagonist in man, Eur. J. Clin. Pharmcol. 52 (1997) 115­120.
2. J. Nie, B. Xiang, Y. Feng, D. Wang. Isolation and identification of process impurities in crude valsartan by HPLC,
mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance Spectroscopy, J. Liq. Chromatogr. R lat. T chnol. 29 (2006) 553­568.
3. L. Suntomsuk. Recent advances of capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis. Anal Bioanal. Ch m. 398
(2010) 29­52.
4. Sánchez­Hernández L., Garcia­Ruiz c ., Luisa Marina M., Luis Crego A. Recent approaches for enhancing
sensitivity in enantioseparations by CE, El ctrophor sis. 31 (2010) 28­43.
5. International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use,
Q2(RI), Valsartaniđat on of Analytical Procedure: methodology, 2005, .

652