KẾT LUẬN
- Trên chuộí cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, thân cây
chuối tiêu có tác dụng làm giam nồng độ glucose máu,
cholesterol toàn phần, ỉriglycerid huyết thanh, ức chế

hoạt độ G6Pase ờ gan nhưng không làm thay đổl
đáng kề nồng độ insulin huyết thanh. Lô chuột điều trị
bằng hỗn dịch thử có những dấu hiệu hồi phục ờ tiểu
đảo tụy.
- Dự đoán cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu
có thể là: ức chế tân tạo đường thơng qua ức chế
G6Pase và có thề làm tăng nhạy cảm của mơ đích với
insulin, cải thiện tinh trạng kháng insulin trong ĐTĐ typ
2.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt nam,
Nhà xuất bản Y học, Tr.467,468.
2. Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ
glucose huyết của địch chiết phân đoạn chloroform thâii
cây Ý dĩ trên động vật thực nghiệm", Luận văn tốt nghiệp
thạc sĩ, Trung ỉâm thơng íin thư viện trường Đại học dược
Hà Nội, Tr.20-40.

3. Đỗ Thị Nậuyệt Quế (2013), "Nghiên cứu tác dụng
hạ glucose huyễt cua rễ cay choc mau Nam bộ (salasia
cochinchinensis L., Celasíraceae) trên thực nghiệm",
Luận án ỉiến sĩ dược học, Trung tâm Thư viện Quốc gia,
Viện Dược iiệu, tr.7, 28 -32.
4. Enechi 0. c. Odo c. E. Agosi p. o. (2014), "Antioxidant vitamins, phytochemicals and proximate
composition of the ethanol extract of the leaves of Musa

paradisiaca", African Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 8(18), pp. 464-468.
5. IDF (2013), Diabes Aiias, International diabetes
federation, pp. 7-15, 27.
6. Latha M. Pari L (2003), "Antihyperglycemic effect of
Cassia auricuiata in experimental diabetes and its effect
on key metabolic enzymes invoved in cacrbohydraie
metabolism", Clinical and Experimental Pharmacology
and Physiology 30, pp. 38-43.
7. Virginia D, Kappei !, H. Luisa (2013), "Beneficial
effects of banana leaves (Musa xparadisiaca) on glucose
homeostasis: multiple sites of action", Revista Brasileira
de Farmacognosia, 23(4), pp. 706-715.

NGHIÊN c ứ u PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN
CỦA HỘJ CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẠT c ơ VỚI SỢI c ơ
KHÔNG ĐỀU - MERRF Ở NGỮỜI VIỆT NAM
Người ỉhực hiên: Bùi Thị Khánh
Khoa Y học cơ s ờ - Trường Cao đắng Y tế Thái Bình
Người hướng dẫn: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
Phịng thí nghiệm trọng điểm Protein - Enzyme,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Ha Nội
TÓM TÁT
Đặt vẩn đề: MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ
không đều, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thề.
Mục tiêu: Sàng lọc phát hiện đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể ờ Việt Nam, xây
dựng phương pháp định lượng một đột biến MERRF.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng mẫu máu ngoại vi
cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty the, được lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ương với phương pháp PCRRFLP, real-time PCR và giải trình tự các đoạn gen nghi ngờ mang đột biến nghiên cứu.
Kết quả: Không phát hiện trường hợp nào mang đột biến trong 312 bệnh nhân lấy mẫu nghiên cứu, thiết kế

thành cồng mẫu dị Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl và thiết lập được điều kiện đề phân tích định
lượng đột biến A8344G cửa hội chứng MERRF bằng real-time PCR. Kết quả nghiên cứu được tái khẳng định
bằng ỹiài trình tự vùng gert quan tâm đều cho kết quả âm tính cho về đột biến A8344G, T8356C, G8363A.
Kết luận: Tuy không phát hiện được đột biển, nhưng chúng tồi hy vọng với phương pháp sàng lọc và định
lượng được thiết lập sẽ là cồng cụ hữu ích cho các nghiên cứu sau về 3 đọt biến này.
Từ khóa: MERRF, động kính giật cơ, sợi cơ khơng đều.
SUMMARY
Background: MERRF - syndrome myoclonic epilepsy with ragged-red fibres, affecting the nervous system and
skeletal muscles as well as other systems o f the body, caused by mutations in (he genes MT-TK o f mitochondrial
DNA. Screening and quantitative some mutations o f myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - MERRF in Việt
Nam patients.
Materials and method: We conduct 3 mutation screening o f MERRF syndrome peripheral blood form o f 312
patients with suspected brain mitochondrial myopathy, was taken from the Central Pediatrics Hospital by PCRRFLP, real-time PCR and sequencing nucleic acid fragments suspected mutated gene research.
Results: Do not detected any cases o f mutation A8344G, T8356C, G8363A under MERRF syndrome in 312
patients studied, by PCR-RFLP. Designing successful Taqman probes by bridge methyl nucleotides to detect and
quantify the degree o f heterogeneity o f mutations A8344G under syndrome by real-time PCR MERRF. Develop

521


successful baseline mutation A8344G MERRF syndrome, baseline is established, can bs applied to quantitative
analysis A8344G mutation in patients with the mutation pattern with a detection limit to 0.1%, R2 = 0.997
confidence.
Conclusion: still undetected mutations, but we hope with the screening methods and quantitative tool set will
be useful for future research on those mutations.
Keywords: MERRF, myoclonic epilepsy, ragged-red fibres.
ĐẶT VẮN ĐỀ
MERRF (myoclonic epilepsy with ragged - red
fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không
đều, anh hưởng đển hệ thần kinh và cơ xương cũng

như các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bời những
đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Ngoài ra,
người mang hội chứng MERRF cỏ thê kèm theo động
kinh, mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí
nhớ. Triệu chứng thường khởi phát ờ trẻ em sau một
giai đoạn phát triển bỉnh thường, kết quả hay gặp íà
điếc, thấp bé, thối hóa thần kinh thị giác, đơi khi quan
sát được các u mỡ khu trú dưới da. Tế bào cơ bát
thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham
nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dưới
kính hiển vi.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều cơng trinh
nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác đính nguyên
nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền
của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động
!âm sàng, mô bệnh học, cơ chể phát sinh và biểu hiện
bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm
khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy
là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn

Các cặp mồi và mẫu dò (Integrated DNA
Technologies); Thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP
(Enzynomics); Enzyme giới hạn (Thermoscientitics);
Kapa probe fast qPCR, Master Mix (Kapabiosystems).
Các hóa chất cịn lậi đều được mua từ các hãng tin
cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiếỉ cằn thiết cho
nghiên cứu sinh học phân tử;
2. Mảy móc và trang thiết bị
Các máy móc chính dừng trong nghiên cứu bao
gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient

(Eppendorf), máy real-time PCR ỈQTM 5 cycler
(Biorad), máy ly tâm iạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị
điện di ngang, điện di đứng (Biorad) vả hệ thong chụp
ảnh điện di Geldoc (Biorad).
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số được
tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân
theo QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen.
3.2. Kiểm tra và định lượng DNA tách chiểt: Sự có
mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gei
agarose 1%. Nồng độ của DNA tách chiết được định
lượng bằng cách đo mật độ háp thụ ánh sáng tư ngoại
của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên
chưa được phát hiện và khơng có phương pháp điều
máy Nano-Drop.
trị hiệu quả.
3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR:
• ở Việt Nam, gần như chưa có cơng trinh nào đi Đoạn gen ty thề mang đột bien MERRF được khuếch
sâu nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến
đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các
MERRF ờ người Việt Nam.
cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế và chế độ nhiệt
Nhằm góp phần vào việc chẩn đốn, điều trị và tư
thích hợp.
vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh
3.4. Kỹ thuậí PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình
nhân mang hội chứng MERRF chúng tơỉ tiến hành đề
chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP):
tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột
Sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose

biến cua hội chưng động kinh, giật cơ với sợi cơ
2 % được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong
không đều - MERRF ở người Việt Nam".
đệm tương ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt được
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIÊN
thực hiện với thành phần như sau: 1 ụì đẹm enzyme
cứu
giới hạn 10X; 0,5 pi enzyme giới hạn (50 đơn ví/Ịji);
1. Nguyên liệu
7,5 ụị sản phẩm PCR và 6,25 Mi ddH20 cho tồng ihe
1.1. Mấu bệnh phẩm
tích 15 ụl, hỗn hợp phản ứng được giữ ờ 37°c, tư 12Mâu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân người Việt
16 giờ. Sau đó, sản phầm cắt được điện di trên geí
Nam nghi bị bệnh ty thể được lẩy từ Bệnh viện Nhi
polyacrylamide 12 % và đột biến được phát hiện dựa
Trung ương, các bệnh nhân được nghi ngờ mắc hội
vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới
chứng MERRF dựa trên sự có mặt cùa ít nhất hai
ánh sáng tử ngoại.
trong ba đặc điểm sau:
2.5. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh
Tác động lâm sàng liên quan đến 3 hoặc nhiều hơn
quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA - locked
3 cơ quan: hệ thần kỉnh trung ương, cơ xương và cơ nucleic acid): Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G
tỉm, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.
được định ỉứợng bang phương pháp real-time PCR sừ
Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy.
dụng mẫu dị huỳnh quang có trình tự bồ sung với
Hình ảnh chụp cộng hưởng từ não khơng bình
trinh tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5' của mẫu dị có

thường.
gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520
1.2. Các hóa chắt, nguyên liệu khác:
nm) cho mẫu dị đặc hiệu VỚ! trinh tự khơng đột biến
Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và khơng
và HEX (535/556 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự
mang đột biến A8344G íà sản phẩm cùa đề tài
đột biến, cịn đầu 3’của mẫu dị có gắn chất hấp phụ
tương ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black
KC.04.10/11-15. Kit tách chiết DNA tổng số (Qiagen);

522


fluorescence quencher).
cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt
2.6.
Giải trình íự đoạn gen chứa đột biến: Trình tự thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng íỏ các mẫu
đoạn gen được xác định dựa theo phương pháp
bệnh nhân nghiên cứu không mang đột bien G8363A.
Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa
Hiện nay có rất nhiều phương pháp có thể áp dụng
dideoxynucleotide - ddNTP).
để phát hiện ra sự có mặt của đọt biến gen ty thể như
KẾT QUẢ VÀ TH AO LUẬN
PCR-RFLP, SSCP, xác định írỉnh tự gen, DGGE, real­
1. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu
time PCR. Tuy nhiên, PCR-RFLP vẫn là một kỹ thuật
Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu
phân tử đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sang lọc

máu của các bệnh nhân cho thấy các che phẩm DNA
thông dụng một iượng mẫu lớn. Trương Thị Huệ và
tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một
tập thể đã nghiên cứu trên 106 bệnh nhân Việt Nam,
băng DNA rõ nét, chứng tỏ DNA tổng số tách được
nhưng cũng không phát hiện được bệnh nhân nào
đều nguyên vẹn.
mang đột biến A8344G và T8356C. Trên íhế giới đã có
Kết quả đo mậí độ hấp ìhụ ốnh sáng tử ngoại ở
nhiều công bố về sàng lọc đột biến A8344G trên bệnh
260 nm của chế phẫm DNA tổng số đều có tỷ số
nhân cơ não ty thể với kết quà đáng chú ý như nahiên
A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế
cứu của Qi và cộng sự điều tra đột biến gen ty the trên
phẩm DNA ít íẫn protein hay RNA. Như vậy, chúng tôi
552 bệnh nhân Trung Quốc, phát hiện 4 bệnh nhân
đã thu được các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cẩu
mang đột biến A8344G (chiềm 0,72%); Cũng một
đề tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo.
nghiên cứu khác trên 124 bệnh nhân Trung Quốc,
2. Sàng lọc các đột biên gen thuộc hội chứng
Zhang và cộng sự đã phát hiện ra 2 bệnh nhân mang
MERRF ờ người V ỉẹt Nam bằng phương pháp
đột biến A8344G (1,61%); Kwon và tập thể, khi nghiên
PCR-RFLP
cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc,
2.1. Sàng lọc đột biến A8344G
đã phát hiện được 3 trường hợp mang đột biến
Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị
A8344G (4,6%). Như vậy, có thể thấy tần suầt phát

trí 8344 trên míDNA chúng tơi đã tiến hành nhân bàn
hiện đột biến A8344G trong các nghiên cứu ỉà rất khác
đoạn gen có kích thước 212 bp bằng kỹ thuật PCR với
nhau. Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể Hên
cặp mồi đặc hiệu. Kết quả điển đi kiểm tra sản phẩm
quan nhiều đến cách lấy mẫu điều tra ban đầu và có
PCR trên gel agarose 2% cho thấy sản pham DNA
thể còn những nguyên nhân khác nữa cần được íàm
khuếch đại cùa đoạn gen có kích thước như tính tốn
rỗ.
lý thuyết (212 bp), điều này chứng tị chúng íơi đã
3.
Xây dựng đường chuẩn để định lượng đột
nhân bản thành cong đoạn gen 8155 - 8366 từ mâu
biến A8344G bẫng kỹ th u ậ t real-time PCR
DNA ĩổng sổ của các bệnh nhân. Sản phẩm PCR
3.1. Thiết kế mẫu dị huỳnh quang Taqman LNA
được cắí trực tiếp bằng enzyme giới hạn Banll, điện di
Việc íhiếí kế mồi cho real-time PCR dùng Taqmarì
sản phẩm cắỉ trên gel polyacrylamide 12 % và phát
probe về cơ bản được thực hiện theo các nguyên tắc
hiện độí biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của
ihiết kế mồi chung cho PCR. Đột biến điểm A8344G
phổ băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện
(MERRF) được chúng tôi nghiên cứu định lượng bằng
di sản phầm PCR-RFLP cho thấy cac mẫu DNA nhân
kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dổ Taqman khóa
bản của bệnh nhân đều xt hiện 3 băng có kích
câu methyl.
thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với

Bảng: Trình tự cùa mẫu dị dùng cho real-time
sản phẩm cắt cùa plasmid không mang đột biến.
PCR
Chứng iỏ các mẫu bệnh nhân được sàng lọc khơng
Vị trí trên DNA
Mẩu dò/Mồi
Trỉnh tự
mang độỉ biến A8344G.
ty thể
2.2. Sàng lọc đột biến T8356C
5'
AGC
CCA
CTG
TAA
AGC
RT8344-FW
8291 -8309
TAAC3’
Đoạn gen chưa đột biến T8356C phải được
5’
GGC
ATT
TCA
CTG
TAA
khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp moi đặc hiệu,
RT8344-RV
8370-8350
AGA GGT 3’

Sản phẩm PCR ơ trên được cắt trực tiếp bằng enzyme
Wt-8344A6
FAM-AGA
T+TA
+A+GA
giới hạn Drai. Điện di sản phảm cắt trên gel
8332 - 8346
FAM
+GA+A +CC-IBFQ
polyacrylamide 12 % đều xuất hiện 2 băng có kích
MÍ-8344GHEX-GAT +TA+A +GAG
8333 - 8346
thước khoảng 192 và 28 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh
HEX
+A+GC C-IBFQ
nhân nghiên cứu không mang đột bien T8356C.
Ghi chú: dau + ch? nucleotide LNA
2.3. Sàng lọc đột biến G8363A
3.2.
Đánh giâ tính đặc hiệu của mẫu dị đột biến
^ Chủng tơi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp
A8344G
đặc hiệu với sợi XUÔI và sợi ngược của đoạn mtDNA
Kết quả phân tích real-time PCR cho thấy khi chạy
nghiên cứu. Kiểm tra sản pham PCR bằng phương
real-time PCR với píasmid mang đột biến 8344G thì tín
pháp điện di trên gel agarose 2 % cho kết quả ỉà một
hiệu huỳnh auang chỉ lên vởi kênh HEX trong khi phản
băng DNA duy n h lt có kích thước 220 bp được nhân
ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò MỈ-8344G-HEX và

lên. Sản phẩm PCR ờ trên được cắt trực tiểp bằng
Wt-8344A-FAM. Tương tự, với plasmid không mang
enzyme giới hạn Niallỉ. Sản phẩm cắt được điện di
đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín hiệu FAM. Kết
trên gel polyacrylamide 12 % và phát hiện đột biến dựa
quả này khẳng định mẫu dị mà chúng tơi thiết kế có
vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DNA
khả năng phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu
dưới ánh sáng tử ngoại. Phổ băng điện di cho thấy tất
không đột biến.

523


3.3. Xây dụng đường chuẩn và đánh giá độ tin
cậy của phường pháp real-time PCR để đĩnh lừợng
đột biến A8344G
Để xây dựng đường chuẩn của đoạn gen mang đột
biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bang real-time
PCR, píasmid mang DNA đột biến và khơng đột biến
A8344G được pha lỗng về cùng một nòng độ ià 1 X
1010 bản sao/ụi và sau đó pha lỗng theo hẹ số 10
dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sử dụng khuôn ià
hỗn hợp plasmid đột biến và khơng đột biến theo tỷ íệ
1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 bản sao/ịil.
Kết qua phân tích real-time PCR cho thấy đường
chuẩn của DNA không mang đột biến và DNA mang
đột biến, tạo ra bằng việc sư dụng các tỷ lệ nồng độ
khác nhau giữa plasmid chứa đoạn gen ty thể mang
đột biến A8344G và không mang đột biến có độ tuyến

tính cao, giá trị cùa hệ số tương quan R2 giữa sổ bản
sao DNA ty thề và số chu kỳ ngưỡng với mẫu dị w t8344A-FAM (khơng mang đột biến) ià 0,999 và Mt8344G-HEX (mang đột biên) íà 0,999, hiệu quả PCR
nằm trong khoảng 94-100%. Slope của probe w t8344A-FAM là -3,458, probe MÍ-8344G-HEX là -3,317.
Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phương
pháp chủng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn ty
lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến
iả 0,01 % - 100% đột biến bằng cách trộn piasmid
mang đột biến và khổng đột biến với các thể tích nồng
độ tương ứng. Sau đó chúng tơi tiến hành định lượng
mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tương quan tuyến
tính giữa phần trăm ty lẹ độ biền thực te và lỉ thuyết.

Kểt quả cho thấy giới hạn phát hiện ổộí biến của
phương pháp thiết iập được !à 0,1 % sự tương quan
tuyến tĩnh gíưa tỷ iệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ
tin cậy cao (R2 - 0,997). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
cho kết quả giống nhau. Như vậy đường chuẩn chúng
tôi thiết lập được có độ tin cậy và độ nhạy tương
đương với nghiên cứu cua Trương Thị Huệ và tập th i
(2012 ) trong việc xây dựng đường chuẩn định lượng
đột biến A3243G bằng phương pháp real-time PCR sư
đụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%, R2 =
0,997).
3.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định
lượng đột biến A8344G
Trong 312 mẫu bệnh phẫm đã sàng lọc bằng
phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện
được trường hợp nào mang đột biến A8344G. Để
khẳng định thêm về kết quả nàỹ chủng tôi lựa chọn
ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3,

BN4, BN5) và thử nghiệm bằng phương pháp real­
time PCR đã được thiet lập ở trên.
Kết quả định lượng cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm
được thử nghiệm chỉ thu được tín hiệu FAM, là tín
hiệu khơng đột biển trong khi đó tin hiệu HEX ià tín
hiệu đột biến đều khơng phát hiện được. Đường
chuẩn được xây dựng có độ tuyến tỉnh cao (R2 >
0,995). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả
giống nhau. Vì vậy chúng tồi một lần nữa khẳng định 5
mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến
A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phương pháp
PCR-RFLP và real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh

quang LNA.
4.
Sàng lọc đột biến gen thuộc hội chứng
MERRF bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp
Đề một lan nữa khằng đỉnh kết qua nghiên cứu
bằng PCR-RFLP íà chính xác chúng tơi đã lựa chọn 29
mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chửng MERRF với
triệu chứng rõ nhat ổể giải trình tự đoạn gen 8155 9292 thuộc vùng các đột biến này.
Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp cùa 29
bệnh nhân nghi bị MERRF được chúng tôi nhân gen
từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm
được nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide sử
dụng mồi theo cồ hai chiều. Kết quả phân tích trình tự
thu được cho thấy khơng có trường hợp nào mang đột
biến Ấ8344G, T8356C và G8363A cùa hội chứng
MERRF. Như vậy, kết quả xác định trinh tự rnột lần
nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP íà

chính xác và đáng tin cậy.
KẾT LUẬN
Đã sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF,
írên bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể (312 bệnh nhân
đối với đột biến A8344G và 182 bệnh nhân đối với đột
biển T8356C và G8363A) bằng phương pháp PCRRFLP nhưnp không phát hiện được trường hợp nào
mang đột bien.
Đã thiết kể thành cơng mẫu dị Taqman mang
nucleotide dạng khỏa cầu methyi và thiết lập được
điều kiện để phân tích định lượng đột biến A8344G
cùa hội chứng MERRF bằng real-time PCR vởi giới
hạn phát hiện đến 0,1% với độ tin cậy cao (hệ số R2 =
0,997)
Đã giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 9292 (1137 bp) của 29 mẫu bệnh nhân trong số các
bệnh nhân có biểu hiện bệnh íhần kinh cơ và cho kết
quả âm tính về đột biến A8344G, T8356C, G8363A
bằng PCR-RFLP và tái khẳng định íất cả các bệnh
nhân này đều không mang 1 trong 3 các đột biến vừa
nêu
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục sàng lọc để phát hiện các đột biến MERRF
trên bệnh nhân nghi mac bệnh thần kinh, cơ não ở
Việt Nam.
Xâỵ dựng phương pháp phát hiện, định lượng các
đột biến gen ty thể khác nham hỗ trợ việc chần đoán
lâm sàng và nghiên cứu mối liên quan giữa mức độ
biểu hiện bệnh với tỷ !ệ đột biến.
TÀI LIỆÙ THAM KHẢO
1. Blakêly L. E., Alston L. c., Lecky B., Chakrabart B-,
Falkous G. Turnbull M. D., Taylor w . R., Gorman s. G.

(2014), “Distal weakness with respiratory insufficiency
caused by the m.8344A > G "MERRF" mutation”, Science
Direct, 24, pp. 533-536.
2 . Kwon S. J., Park s. s., Kim J. M., Ahn T. B., Kim s.
H., Kim S., Lee S. H.,Ha c. K.,Ahn M. Y., Jeon B. s.
(2004), "Investigation of common mitochondrial point
mutations In Korea”, Genes and apoptosis to aging and
disease, 1011, pp. 339-344.
3. Lorenzoni p. J., Scola R. H., Kay c. s. K., Silvado
c. E. S., Werneck L. c. (2014), “When should MERRF
(myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers) be
the diagnosis?”, Arquivos Neuro-psiquiatria, 72(10), pp.

524


803-881.
4. Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu

S., Pei P., Wang s., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao
J.,Sun F., Zhang Y.,Wu Y.,Wang s., Xiong H.,Wu X.
(2006), “Screening of common mitochondrial mutations in
Chinese
patients
with
mitochondria!
encephaiomyopathies", Mitochondrion, 7, pp. 147-150.
5. Szuhai K., Ouweiand J. M., Dirks R. w ., Lemaĩtre
M., Truffert J. c., Janssen J. M., Tanke H. J., Holme
E., Maassen J. A., Raap A. K. (2001), “Simultaneous

A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy
number quantification in Myoclonus Epilepsy and RaggedRed Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular
Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids
Research, 29(3), pp. 1-6.
6. Truong T. H., Nguyen T. V. A., Nguyen V. L„ Pham

V. A., Phan T. N. (2014), “Screening of common pointmutations and discovery of new T14727C change in
mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy
patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp. 441-448.
7. Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone
E., Bonato s., Donadoni c Torgano G., Moggio M
., Corti
S., Bresolin N., Comi G. p. (2009), “Mitochondria! DNA
G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical,
biochemical and pathological study", Journal Neurol
Science, 281(1-2), pp. 85-92.
8. Zhang Y., Yang Y. L , Sun F., Cai X., Qian N., Yuan
Y., Wang z. X.,Qị Y.,Xiao J. X.,Wang X. Y., Zhang Y.
H., Jiang Y. w „ Qin J.,W u X. R. (2007), “Clinical and
molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or
Leigh-like syndrome", Journal of Inherited Metabolic
Disease, 30(2), pp. 265-267.

NGHIÊN CỨU CHÁN ĐOÁN DI TRUYỀN
TRƯỚC CHUYẺN PHÔI BỆNH TEO c ơ TỦY
Ths. Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học và Di truyền Yhọc, Học viện Quânỵ)
' sv. Trần Van Tuấn, SV. Đồng Phú cấu
(Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y)
BS. Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản)
Hướng dắn: PGS.TS. Trần Văn Khoa

(Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân y)
TÓM TẲT
Đặt vấn đề: Bệnh teo cơ tủy là bệnh thần kinh cơ ơo bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt trên nhiễm sắc thể số
5. Trẻ bị bệnh' teo cơ tủy thường có tiên luựng rất xấu và từ vong sơm. Vì vậy, vẩn đề phịng tránh chủ động bệnh
teo cơ tủy phải được ưu tiên hàng đầu. Mục tiêu: mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng được quy trình chẩn
đốn di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy. Đối tượng và phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi đã được
chần đoán bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt va bố mẹ của họ; 30 mẫu té bào phơi sính
thiết từ phơi dư ngày 3; 04 gia ơình đã từng sinh con bị bệnh SMA và tự nguyện tham gia chẩn đôn di truyền
trước chuyền phơi bệnh teo cơ tủy. Kỹ thuật PCR- RFLP và minisequencing đế phát hiện đột biến gen SMNt gây
bệnh teo cơ tủy. Phương phâp nhân toàn bộ bộ gen nhằm khuếch đại bộ gen lên hàng nghìn lần. Kết quả: Kỹ
thuật PCR- RFLP đã được chuẩn hóa để phát hiện đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100%.
Kỹ thuật này cũng có hiệu quả nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi sinh thiết là 93,33%. Xây dựng đuực
quỵ trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va
minisequencing. Áp dụng quy trình xây dựng được đối với 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di
truyền bệnh teo cơ tủy trước chuyển phơi và có 03 phơi đã được chuyển, một cặp vợ chồng đã sinh được một em
bé khỏe mạnh, một cặp đang mang thai. Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng và áp dụng
được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy bằng cách sử dụng đồng thời hai kỹ thuật
PCR-RFLP và minisequencing.
Từ khóa: Bệnh teo cơ tủy.
SUMMARY
PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY
Nga Nguyen Thi Thanh*, Tuan Tran Van*, Cau Dong Phu* Yen Dao Hai**
(*: Military medical university; **: Coal and Mineral Hospital)
Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder.
Most o f patients are caused by the homozygous absence o f exon 7 o f the telomeric copy o f the SMN gene
(SMNt) on chromosome 5. Until now, no specific treatment for SMA, only to treat the complications o f the disease
IS crucial. SMA usually presents severe, high mortality rate. So, the SMA prevention issues should be top priority.
Denved from practical needs, we conducted the project “Preimplantation Genetic Diagnosis o f spinal muscular
atrophy" with the following objective setting up a preimplantation genetic diagnosis assay o f SMA. Materials and
Method: This study was earned out on 17 patients and their parents, 30 blastomeres were obtained from surplus


525