ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-------------TRẦN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN Ca-AFP VÀO CÂY
GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) NHẰM KHẢ NĂNG
TĂNG TÍNH KHÁNG BỆNH THỐI MỀM CỦ DO
NẤM Pythium aphanidermatum

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. Hồ Chí Minh, 01/2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

--------------

TRẦN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN Ca-AFP VÀO CÂY
GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) NHẰM KHẢ NĂNG
TĂNG TÍNH KHÁNG BỆNH THỐI MỀM CỦ DO
NẤM Pythium aphanidermatum

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
TS. NGUYỄN HỮU HỔ

TP. Hồ Chí Minh, 01/2011


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH và
VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học 1: Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học 2: Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hổ

Cán bộ chấm nhận xét 1: Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hƣơng

Cán bộ chấm nhận xét 2: Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG
Tp.HCM ngày 23 tháng 01 năm 2011.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS.TS. Nguyễn Thúy Hƣơng
2. PGS.TS. Nguyễn Đức Lƣợng
3. TS. Phạm S
4. TS. Lê Thị Thủy Tiên
5. TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Bộ môn quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

Bộ mơn quản lý chuyên ngành


TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
----------------

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---oOo--Tp. HCM, ngày 15 tháng 01 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: TRẦN THỊ NGỌC HÀ

Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 01/01/1986

Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

MSHV: 09310566

1-TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu biến nạp gen Ca-AFP vào cây gừng (Zingiber officinale Rosc.)
nhằm khả năng tăng tính kháng bệnh thối mềm củ do nấm Pythium aphanidermatum.
2-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Xây dựng hệ thống tái sinh cây gừng từ lát mỏng tế bào mầm củ.

- Xây dựng hệ thống tạo chồi từ mô phân sinh của chồi in vitro bổ dọc.
- Thử tính chống chịu hygromycin của chồi in vitro bổ dọc và chồi in vitro nguyên vẹn.
- Chuyển gen vào cây gừng bằng phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens.
- Kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu Ca-AFP ở chồi gừng giả định chuyển gen bằng
phƣơng pháp phân tích PCR.
3-NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/01/2010.
4-NGÀY HỒN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/12/2010.
5-HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN:
Phó giáo sƣ – Tiến sĩ Nguyễn Đức Lƣợng
Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hổ
Nội dung và đề cƣơng Luận văn thạc sĩ đã đƣợc Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CẢM ƠN


Với lòng biết ơn sâu sắc, em chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Công nghệ
sinh học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng giảng dạy và
truyền đạt kiến thức cho chúng em, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt
luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Đức Lƣợng, ngƣời đã truyền đạt
cho em những kinh nghiệm quý báu và cho em thêm lòng tin để bƣớc trên con đƣờng
khoa học đầy chông gai.
Em vô cùng cảm ơn thầy Nguyễn Hữu Hổ – ngƣời thầy đáng kính. Thầy đã tận
tình chỉ bảo cho em trong suốt thời gian em thực tập tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.
Hồ Chí Minh. Thầy đã động viên, hƣớng dẫn giúp em vƣợt qua những khó khăn, trở
ngại. Em cảm ơn thầy rất nhiều.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thúy Hƣơng – cơ chủ nhiệm
kính u của em. Cơ đã giúp em vƣợt qua những khó khăn trong q trình thực hiện
luận văn.
Em thành thật cảm ơn tất cả các thầy cơ, anh chị ở phịng Cơng nghệ gen – Viện
Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh đã ln quan tâm chỉ bảo và tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành tốt luận văn.
Con xin cảm ơn ba mẹ đã luôn động viên, cổ vũ tinh thần trong suốt thời gian
qua.
Xin cảm ơn cám bạn đã luôn bên tôi, giúp đỡ và động viên tôi.
Xin chân thành cảm ơn.
Trần Thị Ngọc Hà


ii

TÓM TẮT
Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây gừng đƣợc hiện theo hai hƣớng. 1/ Lát mỏng tế
bào mầm củ (cắt ngang) đƣợc dùng để cảm ứng tạo mô sẹo phơi hóa trên mơi trƣờng

MS bổ sung 2 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA; sự hình thành phơi soma và tái sinh chồi
sau đó, chỉ xảy ra trên mơi trƣờng MS có 8 mg/l BA và 0,2 mg/l 2,4-D.
2/ Sự tạo cụm chồi trực tiếp từ mô phân sinh đỉnh chồi in vitro cho kết quả tốt nhất
trên môi trƣờng MS chứa 1 mg/l TDZ. Môi trƣờng tốt nhất dùng để nhân giống in
vitro cây gừng là MS bổ sung 6 mg/l BA và 2 mg/l 2-iP. Nồng độ chất chọn lọc
hygromycin thích hợp để chọn lọc dịng chuyển gen là 4 mg/l đối với chồi in vitro bổ
dọc và 6 mg/l đối với chồi in vitro nguyên vẹn, cụm chồi non. Vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 chứa plasmid pITB-CaAFP đƣợc sử
dụng trong thí nghiệm chuyển gen cây gừng. Các dòng chuyển gen đƣợc xác định bởi
phƣơng pháp nhuộm GUS và phân tích PCR.

SUMMARY
Studying on in vitro plant regeneration in ginger was carried out via two
pathways. 1/ Transverse thin cell layers (tTCLs) that were cut from the sprout were
used to induce calli and somatic embryogenic calli on MS medium (containing
2,4-D 2 mg/l and BA 0.5 mg/l); somatic embryogenesis and shoot regeneration were
only observed when somatic embryogenic calli were transferred onto MS medium that
contained BA 8 mg/l and 2,4-D 0.2 mg/l. 2/ Apical meristematic tissues of young
shoot

induced

multi-micro

shoots

on

MS


medium that

contained

TDZ

1 mg/l. The medium that had the best result for shoot multiplication was MS with BA
6 mg/l and 2-iP 2mg/l. Concentrations of hygromycin that were used to select
transformants were 4mg/l (with apical meristematic tissues of young shoot) and
6 mg/l (with young multi-micro shoots). Transgenic study on ginger used
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404/ pITB-CaAFP. Successful transformation
was confirmed by histochemical Gus assay and PCR analysis.


iii

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ...............................................................................................................i
Tóm tắt ................................................................................................................... ii
Danh mục hình ....................................................................................................... vi
Danh mục bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các từ viết tắt ......................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chƣơng 1.

TỔNG QUAN .................................................................................. 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY GỪNG ..................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm .............................................................................................. 3
1.1.2. Giá trị sử dụng ...................................................................................... 5

1.1.3. Bệnh thối mềm củ ở gừng ..................................................................... 6
1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT ...................................... 10
1.2.1. Phƣơng pháp chung ............................................................................ 10
1.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens .................................................................................................... 12
1.3. SƠ LƢỢC VỀ GEN KHÁNG NẤM Ca-AFP ............................................. 20
1.3.1. Giới thiệu............................................................................................ 20
1.3.2. Gen Ca-AFP ....................................................................................... 21
1.4. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN ................................ 22
1.4.1. Nhuộm GUS ....................................................................................... 22
1.4.2. Phân tích PCR .................................................................................... 23
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC LIÊN QUAN ĐẾN
HƢỚNG ĐỀ TÀI ............................................................................................... 27
1.5.1. Các nghiên cứu về nhân giống, tái sinh và chuyển gen ở cây gừng ..... 27
1.5.2. Các nghiên cứu về defensin thực vật kháng nấm và ứng dụng trên cây
trồng chuyển gen ............................................................................................ 30
1.5.3. Ứng dụng gen kháng nấm Ca-AFP vào cây trồng chuyển gen ............ 31
Chƣơng 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................ 32


iv

2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 32
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 32
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 32
2.1.3. Vi khuẩn ............................................................................................. 34
2.1.4. Mơi trƣờng và điều kiện nuôi cấy ....................................................... 35
2.1.5. Sơ đồ quy trình thí nghiệm.................................................................. 37

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 37
2.2.1. Khử trùng mẫu .................................................................................... 38
2.2.2. Khảo sát môi trƣờng nhân chồi ........................................................... 39
2.2.3. Khảo sát môi trƣờng tạo mô sẹo và tái sinh từ lát mỏng tế bào mầm củ39
2.2.4. Khảo sát môi trƣờng tạo chồi từ mô phân sinh chồi in vitro bổ dọc ..... 42
2.2.5. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin thích hợp cho quá trình chọn
lọc dịng chuyển gen ...................................................................................... 43
2.2.6. Chuyển gen và chọn lọc dòng chuyển gen .......................................... 44
2.2.7. Xác định dòng chuyển gen .................................................................. 46
Chƣơng 3.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 50

3.1. KHỬ TRÙNG MẪU ................................................................................... 50
3.2. KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG NHÂN CHỒI ................................................ 50
3.3. KHẢO SÁT MÔI TRƢỜNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH TỪ LÁT MỎNG
TẾ BÀO MẦM CỦ............................................................................................ 53
3.3.1. Tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi ...................................................... 53
3.3.2. Nhân mô sẹo sinh phôi, tạo phôi soma và tạo chồi từ phơi .................. 57
3.4. KHẢO SÁT MƠI TRƢỜNG TẠO CHỒI TỪ MÔ PHÂN SINH CHỒI IN
VITRO BỔ DỌC ................................................................................................ 60
3.5. KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ CHẤT CHỌN LỌC HYGROMYCIN .................. 65
3.5.1. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin tác động lên khả năng sống
của chồi gừng in vitro bổ dọc ......................................................................... 65
3.5.2. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin tác động lên khả năng sống
của chồi gừng in vitro nguyên vẹn.................................................................. 66
3.6. CHỌN LỌC DÒNG CHUYỂN GEN BẰNG HYGROMYCIN .................. 69
3.6.1. Mẫu chồi in vitro bổ dọc ..................................................................... 70
3.6.2. Mẫu cụm chồi non .............................................................................. 70



v

3.7. XÁC ĐỊNH DÒNG CHUYỂN GEN ........................................................... 72
3.7.1. Nhuộm GUS tạm thời ......................................................................... 72
3.7.2. Nhuộm GUS sau quá trình chọn lọc .................................................... 73
3.7.3. Phân tích PCR .................................................................................... 74
Chƣơng 4.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................... 76

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................ 76
4.2. ĐỀ NGHỊ .................................................................................................... 76
Tài liệu tham khảo ................................................................................................. 78
Phụ lục A ............................................................................................................... 87
Phụ lục B ............................................................................................................... 89


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Gừng Zingiber officinale. .........................................................................4
Hình 1.2. Bệnh thối mềm củ ở gừng. .......................................................................7
Hình 1.3. Nấm Pythium aphanidermatum nhìn dƣới kính hiển vi. ............................8
Hình 1.4. Vịng đời của nấm Pythium aphanidermatum. ........................................ 10
Hình 1.5. Vi khuẩn A. tumefaciens đang bám vào tế bào thực vật (nhìn dƣới kính hiển
vi). ......................................................................................................................... 13
Hình 1.6. Khối u ở thực vật do A. tumefaciens gây ra............................................. 13
Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của opine (octopine, nopaline). ..................................14
Hình 1.8. Sơ đồ gen của Ti–plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens. ...................... 15

Hình 1.9. Các bƣớc biến nạp T-DNA vào tế bào kí chủ. ........................................ 17
Hình 1.10. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid ............... 19
Hình 1.11. Phản ứng của X-gluc với β-glucuronidase. ........................................... 22
Hình 1.12. Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ
của phản ứng PCR. ................................................................................................ 26
Hình 1.13. Phản ứng PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân. ................... 27
Hình 2.1. Gừng Zingiber officinale Rosc. .............................................................. 32
Hình 2.2. Mơ hình cấu trúc đoạn T - DNA chuyển vào cây gừng. .......................... 34
Hình 2.3. Plasmid CAMBIA1301. ......................................................................... 35
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm. ................................................................................... 37
Hình 2.5. Mầm gừng có kích thƣớc phù hợp đƣợc đem khử trùng. ......................... 38
Hình 2.6. Cách tạo lát mỏng tế bào dùng ni cấy. ................................................ 41
Hình 2.7. Cách bổ đơi chồi in vitro. ....................................................................... 43
Hình 2.8. Vật liệu chuyển gen. ............................................................................... 45
Hình 2.9. Vi khuẩn phát triển sau 3 ngày nuôi chung. ............................................ 45
Hình 3.1. Sự phát triển của mầm củ sau khi khử trùng. .......................................... 50


vii

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn kết quả số chồi mọc thêm từ một mẫu ban đầu trên các môi
trƣờng khác nhau. ..................................................................................................51
Hình 3.3. Kết quả nhân giống in vitro cây gừng qua các giai đoạn. ........................ 53
Hình 3.4. Kết quả nhân giống in vitro ở các môi trƣờng sau 6 tuần. ....................... 53
Hình 3.5. Sự hình thành rễ từ lát mỏng tế bào ni cấy trên mơi trƣờng có Dicamba.53
Hình 3.6. Kết quả cảm ứng tạo mơ sẹo nói chung và mơ sẹo khơ nói riêng từ lát mỏng
tế bào mầm củ sau khoảng 2 tháng nuôi cấy. ......................................................... 55
Hình 3.7. Các dạng mơ sẹo hình thành trên mơi trƣờng cảm ứng. .......................... 56
Hình 3.8. Quá trình phát triển của mô sẹo sinh phôi và tái sinh chồi từ lát mỏng tế bào
mầm củ. ................................................................................................................. 58

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn kết quả tỉ lệ tạo chồi từ mô phân sinh đỉnh chồi in vitro bổ
dọc. ........................................................................................................................ 61
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn kết quả số chồi tạo đƣợc từ mô phân sinh đỉnh chồi in vitro
bổ dọc. ................................................................................................................... 61
Hình 3.11. Q trình tạo chồi từ mơ phân sinh đỉnh chồi in vitro bổ dọc. ............... 63
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin tác động đến khả năng sống của chồi
in vitro bổ dọc........................................................................................................ 66
Hình 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin tác động đến khả năng sống của chồi
in vitro nguyên vẹn. ............................................................................................... 66
Hình 3.14. Kết quả quá trình chọn lọc đối với mẫu chồi in vitro bổ dọc. ................ 71
Hình 3.15. Kết quả quá trình chọn lọc đối với mẫu cụm chồi non. ......................... 71
Hình 3.16. Kết quả nhuộm GUS tạm thời đối với mẫu chồi in vitro bổ dọc............ 72
Hình 3.17. Kết quả nhuộm GUS tạm thời đối với mẫu cụm chồi non. .................... 72
Hình 3.18. Kết quả nhuộm GUS sau chọn lọc đối với mẫu chồi in vitro bổ dọc. .... 73
Hình 3.19. Kết quả nhuộm GUS sau chọn lọc đối với mẫu cụm chồi non. ............. 73
Hình 3.20. Kết quả phân tích PCR. ........................................................................ 74


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vai trò các gen vir.................................................................................. 16
Bảng 2.1. Thành phần thuốc thử GUS .................................................................... 33
Bảng 2.2. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA thực vật ........................................ 33
Bảng 2.3. Hóa chất dùng trong phân tích PCR ....................................................... 34
Bảng 2.4. Thành phần môi trƣờng nhân chồi.......................................................... 39
Bảng 2.5. Môi trƣờng khảo sát khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ................................ 41
Bảng 2.6. Môi trƣởng khảo sát khả năng tạo chồi .................................................. 43
Bảng 3.1. Kết quả nhân chồi in vitro ...................................................................... 51
Bảng 3.2. Kết quả cảm ứng tạo mô sẹo từ lát mỏng tế bào sau khoảng 2 tháng nuôi cấy

.............................................................................................................................. 55
Bảng 3.3. Kết quả tạo chồi từ mô phân sinh đỉnh chồi in vitro bổ dọc .................... 62
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin tối thiểu gây chết đối với chồi in vitro
bổ dọc .................................................................................................................... 65
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin tối thiểu gây chết đối với chồi in vitro
nguyên vẹn ............................................................................................................ 68


ix

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: Acid (2,4-dichlorophenoxy) acetic

2-iP

: N6-(2-isopentyl) adenine

ABA

: Acid abscisic

ATP

: Adenosine triphosphate

Avr

: Avirulence


BA

: Benzyl adenyl

Ca-AFP

: Cicer arietinum antifungal protein

DNA

: Deoxyribonucleic acid

IAA

: Indol acetic acid

IBA

: 3-indolebutyric acid

Kinetin

: 6-furfurylaminopurine

LMTB

: Lớp mỏng tế bào

lTCL


: Longitudinal Thin cell layer

NAA

: 1-naphthalene acetic acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic acid

T–DNA

: Transferred DNA

TDZ

: 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl)

Ti–plasmid : Tumor inducing – plasmid
tTCL

: Transverse Thin cell layer

UV


: Ultraviolet

Vir

: Virulence

Dicamba

: 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid


1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Gừng là một trong những cây gia vị, cây thuốc quan trọng, đƣợc sử dụng rộng
rãi trên thế giới. Từ thời cổ đại, ngƣời vùng Ấn Độ, Trung Quốc, châu Âu đã rất coi
trọng gừng bởi dƣợc tính của nó và gừng đƣợc dùng trong việc chăm sóc sức khỏe
và chữa bệnh cho mọi ngƣời [48].
Ngày nay, gừng khơng những có mặt trong các bữa ăn, trong thành phần của
nhiều loại thuốc chữa bệnh mà còn đƣợc dùng trong sản xuất nƣớc giải khát, bánh
kẹo. Vì nhu cầu sử dụng của nhiều ngƣời trên thế giới, gừng đã đƣợc trồng rộng rãi
trên khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhất là vùng từ Ấn Độ đến Trung Quốc.
Mỗi năm, thế giới sản xuất khoảng 1,2 triệu tấn gừng tƣơi, trong đó Ấn Độ và
Trung Quốc chiếm gần 49,96%. Tính theo diện tích trồng gừng thì Nigeria và Trung
Quốc là hai nƣớc dẫn đầu thế giới. Cịn tính theo sản lƣợng thì Ấn Độ là nƣớc sản
xuất gừng lớn nhất thế giới, mỗi năm cung cấp khoảng 370 nghìn tấn, chiếm
30 – 40% sản lƣợng gừng toàn thế giới [48, 80].
Tuy nhiên, gừng lại bị nhiều bệnh hại tấn công, làm giảm giá trị kinh tế nhƣ
bệnh thối củ, bệnh héo rũ, bệnh vàng lá, đốm lá… Trong đó, bệnh thối mềm củ và

héo rũ chiếm phần lớn, gây thiệt hại nhiều nhất. Bệnh thối mềm củ do nấm Pythium
sp. gây ra, hay gặp nhất là Pythium aphanidermatum [48]. Mầm bệnh có thể xâm
nhiễm ở mọi giai đoạn phát triển của gừng. Chồi, rễ và củ là những vùng chính,
nấm xâm nhiễm. Khi củ giống bị nhiễm nấm sẽ không thể nảy chồi do chồi đã bị
thối. Nếu nhiễm nấm sau khi nảy chồi, mầm bệnh sẽ tấn công vào phần rễ rồi lan
sang củ. Nếu cây trƣởng thành bị nhiễm nấm, lá sẽ bị vàng bắt đầu từ ngọn, lan dần
xuống phía dƣới và cuối cùng là tồn bộ chồi héo khơ, cây chết, củ bị thối nhũn.
Khi cây đã nhiễm bệnh, thƣờng phải bỏ và vùng đất đó phải đƣợc xử lý kĩ trƣớc khi
trồng lại vào vụ sau. Bệnh thối mềm củ rất nguy hiểm, chỉ từ một vùng nhỏ bị
nhiễm bệnh có thể lây lan nhanh thành vùng rộng, gây thiệt hại rất lớn từ 30 – 50%,
thậm chí có thể mất trắng nếu không phát hiện kịp thời [48].


2

Việt Nam là một trong những nƣớc sản xuất gừng của vùng Đơng Nam Á và
cũng nằm trong tình trạng chung, hiện cũng bị thiệt hại lớn bởi bệnh thối mềm củ.
Để phịng ngừa bệnh, hằng năm ngƣời nơng dân phải sử dụng các loại thuốc kháng
nấm để phun xịt trƣớc khi trồng, cũng nhƣ trong giai đoạn cây phát triển. Việc này
gây tốn kém và ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra
giống gừng mới có khả năng kháng bệnh thối mềm củ là vấn đề cấp thiết hiện nay.
Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu biến nạp gen Ca-AFP vào cây gừng
(Zingiber officinale Rosc.) nhằm khả năng tăng tính kháng bệnh thối mềm củ do
nấm Pythium aphanidermatum” mục đích tạo ra dòng gừng mới đáp ứng nhu cầu
cấp thiết hiện nay.
Một phần kết quả của đề tài đã đƣợc đăng qua bài báo: “Trần Thị Ngọc Hà,
Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Đức Lƣợng, 2010. Nghiên cứu tái sinh in vitro cây gừng
(Zingiber officinale Rosc.) thông qua nuôi cấy lát mỏng tế bào mầm củ. Tạp chí
Cơng nghệ sinh học, 8 (3A): 639-645”.
PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu là giống gừng Dé của Việt Nam, đƣợc trồng phổ biến ở
các tỉnh thành phía Nam.
Xây dựng hệ thống tái sinh cây gừng nhằm phục vụ cho việc chuyển nạp gen.
Chuyển nạp gen Ca-AFP vào cây gừng bằng vi khuẩn A. tumefaciens.
Đề tài tập trung vào việc tạo ra dòng gừng mới mang gen Ca-AFP. Đề tài giới
hạn ở việc dùng phƣơng pháp phân tích PCR để xác định dịng chuyển gen.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Việc xây dựng hệ thống tái sinh cây gừng nhằm chọn ra môi trƣờng tái sinh
thích hợp, dùng phục vụ cho việc tái sinh mẫu sau chuyển gen. Gen Ca-AFP đƣợc
chuyển nạp vào giống gừng Dé của Việt Nam nhằm tạo ra dòng gừng mới có khả
năng tăng tính kháng bệnh thối mềm củ do nấm Pythium aphanidermatum – một
bệnh gây thiệt hại rất lớn về năng suất thu hoạch củ.


Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU


3

Chƣơng 1.

TỔN QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY GỪNG
1.1.1. Đặc điểm
Gừng thuộc chi Zingiber phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới từ Đông Á
đến Đông Nam Á, Nam Á, bao gồm khoảng 150 loài: 34 loài ở Trung Quốc, 24 loài
ở Ấn Độ và 11 loài ở Việt Nam [73]. Trong sản xuất và trong tự nhiên, ở nƣớc ta

phổ biến có 3 lồi:
- Gừng dại (Zingiber cassumuar) củ khá to, nhiều xơ, vị cay, nhiều mùi hăng,
thịt củ màu vàng xanh đƣợc dùng làm thuốc, gia vị, thƣờng mọc hoang dại trong tự
nhiên.
- Gừng gió (Zingiber zerumbet) ít đƣợc trồng, củ chỉ dùng làm dƣợc liệu.
- Loài gừng trồng phổ biến (Zingiber officinale) trong sản xuất có hai giống
khác nhau:
Gừng trâu, củ to, ít xơ, ít cay, thích hợp cho xuất khẩu.
Gừng dé đƣợc gây trồng phổ biến, cho củ nhỏ hơn, vị cay và nhiều xơ
hơn, hiện nay đang đƣợc bán nhiều ở thị trƣờng trong nƣớc [73, 80].
Ở đây, chúng tôi đề cập đến Zingiber officinale, với hệ thống phân loại nhƣ
sau [73]:
Bộ

: Zingiberales

Họ

: Zingiberaceae

Phân họ

: Zingiberoideae

Chi

: Zingiber

Lồi


: Zingiber officinale

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái
Gừng là cây thân thảo, cao 40 – 80 cm. Cây mọc thẳng đứng, có nhiều rễ, chồi
khí sinh mang lá và thân củ nằm dƣới mặt đất.


4

Thân ngầm phình to chứa các chất dinh dƣỡng gọi là củ, xung quanh củ có các
rễ tơ. Rễ và củ chỉ phát triển tập trung ở lớp đất mặt, sâu 0 – 15cm [73, 80].
Lá mọc so le, thẳng đứng, màu xanh đậm dài 15 – 20cm, rộng khoảng 2cm.
Mặt trên lá màu xanh sẫm, nhẵn bóng, mặt dƣới lá và gân lá hơi nhạt. Lá có bẹ lá,
khơng có cuống. Các bẹ lá dài ơm lấy nhau làm thành thân giả (thân khí sinh). Độ
che phủ mặt đất của tán lá khơng cao.
Cây gừng ít khi ra hoa, trục hoa mọc từ gốc dài tới 15 – 20cm. Cụm hoa dài
khoảng 5cm, rộng 2 – 3cm, do nhiều vảy hợp thành, vảy phía dƣới ngắn, càng lên
trên càng dài và rộng hơn. Hoa màu vàng xanh nhạt. Cánh mơi màu vàng có viền tia
ở mép, dài khoảng 2 cm, rộng 1,5 cm, chia thành 3 thùy tròn, các thùy bên ngắn và
hẹp hơn.
Số lƣợng chồi nằm ở củ gừng không nhiều, là nguồn giống duy nhất hiện nay
để trồng nhân giống gừng.
Tồn cây, nhất là củ có mùi thơm, vị cay nồng [73, 80].

A

B

Hình 1.1. Gừng Zingiber officinale [77].
A: Cây gừng. B: Củ gừng.


1.1.1.2. Đặc điểm sinh thái
Cây gừng đƣợc trồng phổ biến ở các vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, nhiệt độ trung
bình hàng năm 21 – 27oC, lƣợng mƣa hàng năm 1.500 – 2.500 mm, nơi có độ cao
trên mặt nƣớc biển từ vài mét tới 1.500 m. Cây gừng thích hợp ở vùng có một mùa


5

khơ ngắn, nhiệt độ khơng khí tƣơng đối cao trong thời kỳ củ phát triển. Tại các
vùng núi cao hơn 1.500 m, khí hậu lạnh, nhiều sƣơng giá thì khơng nên trồng gừng.
Ở Việt Nam, cây gừng (Zingiber officinale) đƣợc trồng khá phổ biến từ Bắc (đồng
bằng Bắc Bộ, Cao Bằng, Lạng Sơn) vào Nam (đồng bằng sông Cửu Long). Nhƣng
chủ yếu đƣợc trồng với quy mô nhỏ, trong các hộ gia đình với sản lƣợng chƣa
nhiều, cung cấp cho thị trƣờng địa phƣơng và trong nƣớc là chính [73, 80].
Cây gừng cần đất tƣơng đối tốt, tầng đất dày, tơi xốp, ít đá lẫn, khả năng giữ
nƣớc lớn nhƣng thốt nƣớc tốt, có độ ẩm đầy đủ trong suốt thời gian cây sinh
trƣởng, tốt nhất là đất thịt, không ƣa đất cát và đất sét. Đất có hàm lƣợng mùn cao
rất thích hợp cho trồng gừng.
Gừng là lồi cây ƣa ẩm nhƣng không chịu úng nƣớc. Nếu độ ẩm trong đất cao
sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh tấn công, nhất là bệnh thối mềm củ [73, 80].
1.1.2. Giá trị sử dụng
Gừng không chỉ là một loại gia vị mà còn là một vị thuốc đã đƣợc sử dụng từ
lâu ở các nƣớc châu Á nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật… và Việt Nam. Ngày nay,
với các phƣơng pháp phân tích hiện đại đã khẳng định vai trị quan trọng của gừng
trong y dƣợc.
Trong củ gừng ngoài tinh bột, protein, lipid cịn chứa các hợp chất hóa học
quan trọng:
- Các loại dầu dễ bay hơi: zingeberene, curcumene, borneol, neral, geranial,
geraniol, citronyl acetate, α-terpineol và linalool.

- Các hợp chất cay: gingerol, shogaol.
- Các dẫn xuất của gingerol.
Công dụng của gừng tƣơi và gừng khô tƣơng tự nhau, chỉ khác nhau là gừng
tƣơi khơng dễ tiêu hóa nhƣ gừng khơ. Với các hợp chất sẵn có, gừng có tác dụng
dụng tích cực trong việc giúp các hệ cơ quan trong cơ thể hoạt động tốt hơn và chữa
trị nhiều bệnh [80].


6

- Tác động lên hệ tiêu hóa: Gừng tác động lên enzyme cuối trong chuỗi
chuyển hóa thức ăn, kích thích hệ tiêu hóa hoạt động tốt hơn. Gừng có chứa enzyme
phân giải protein, thúc đẩy q trình tiêu hóa, tăng hoạt động của mật, bảo vệ gan,
chống lại các độc tố [70].
- Tác động lên hệ tim mạch: Theo Suekawa (1984), gingerol và shogaol có
trong dịch chiết gừng có tác động làm giảm huyết áp, nhịp tim và lƣợng cholesterol
có hại, tăng lƣợng cholesterol có ích.
- Tác dụng chống nơn: 6-gingerol và 6-shogaol có tác dụng ức chế co bóp dạ
dày giúp chống nôn [58].
- Tác dụng kháng viêm: Dịch chiết gừng với ethanol có tác dụng làm giảm
việc tiết prostaglandin của tế bào bạch cầu, nhờ đó có thể hạ sốt, kháng viêm [37].
- Tác dụng kháng sinh: Hiserodd (1998) đã tách chiết đƣợc 6-, 8-, 10-gingerol
và đem đánh giá khả năng ức chế Mycobacterium avium và M. tuberculoses. Kết
quả là 10-gingerol có tác dụng ức chế hai loại vi khuẩn trên trong điều kiện in vitro.
- Tác dụng kháng giun sán: Theo Sanderson (2002), dịch chiết gừng có tác
dụng ức chế đối với giun Schistosom amansoni trƣởng thành và tiêu diệt trứng của
nó.
1.1.3. Bệnh thối mềm củ ở gừng
Gừng là một loại cây thân thảo bị nhiều bệnh hại tấn công làm ảnh hƣởng rất
nhiều đến chất lƣợng và giá trị kinh tế của gừng. Theo thống kê của Srivastava

(1998) thì có khoảng 30 lồi vi sinh vật và hai lồi giun trịn (Meloidogyne
incognita và Pratylenchus coffeae) gây hại cho gừng trong giai đoạn tăng trƣởng
cũng nhƣ tồn trữ bảo quản. Pythium spp., Fusarium oxysporum, Ralstonia
solanacearum và Pratylenchus coffeae là nguyên nhân gây ra các bệnh thƣờng gặp
nhƣ thối mềm củ, vàng lá, héo rủ, thối khô. Trong đó phổ biến nhất là bệnh thối
mềm củ do nấm Pythium aphanidermatum và bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia
solanacearum.


7

Ở đây, chúng tôi xin đề cập đến bệnh thối mềm củ ở gừng do nấm
P. aphanidermatum.
1.1.3.1. Biểu hiện bệnh
Mầm bệnh có thể xâm nhiễm ở mọi giai đoạn phát triển của gừng. Chồi, rễ và
củ là những vùng chính nấm xâm nhiễm. Khi củ giống bị nhiễm nấm sẽ không thể
nảy chồi do chồi đã bị thối. Nếu nhiễm nấm sau khi nảy chồi, mầm bệnh sẽ tấn công
vào phần rễ rồi lan sang củ. Biểu hiện ban đầu là những đốm bị úng nƣớc ở vùng cổ
rễ. Dần dần những đốm này lan rộng làm củ mềm, úng nƣớc và thối nhũn. Chồi ngả
màu vàng rồi chết [80].

A

B

Hình 1.2. Bệnh thối mềm củ ở gừng [75].
A: Biểu hiện của bệnh thối mềm củ. B: Bệnh thối mềm củ tấn công vào củ và thân.

Nếu cây trƣởng thành bị nhiễm nấm, lá sẽ bị vàng bắt đầu từ ngọn, lan dần
xuống phía dƣới. Lá chết, thân đổ và tồn bộ chồi héo khơ. Cây khi nhiễm bệnh có

màu nhợt nhạt. Những vùng nhiễm bệnh sẽ úng nƣớc, mềm, gốc lung lay, dễ nhổ
lên. Củ nhiễm bệnh, đầu tiên chuyển màu sang nâu, dần thối rửa, các vùng mô nhũn
lớn dần (phần bên trong bị thối nhanh hơn phần vỏ). Cuối cùng cây chết, củ bị thối
nhũn toàn bộ. Bệnh phát triển nhanh và khi củ bị thối có mùi hơi khó chịu.


8

1.1.3.2. Tác nhân gây bệnh
Pythium aphanidermatum là một mầm bệnh có biên độ kí chủ rộng. Nó là một
lồi có tính xâm nhiễm cao của Pythium, gây úng nƣớc, nhũn ở thân, củ; gây thối ở
các loài cỏ và trái cây. Nhiệt độ ấm và độ ẩm cao có lợi cho nấm phát triển [75].
Giới

: Chromalveolata

Ngành

: Heterokontophyta

Lớp

: Oomycetes

Bộ

: Pythiales

Họ


: Pythiaceae

Chi

: Pythium

Loài

: Pythium aphanidermatum

Pythium là 1 chi trong họ Pythiaceae. Các khuẩn ty trong suốt, thể sợi nấm
khơng có vách ngang. Sự khác biệt của P. aphanidermatum và các loài Pythium
khác thể hiện qua đặc điểm của túi bào tử, túi nỗn, tinh trùng. Bào tử vơ tính có
chia thùy [80].

Hình 1.3. Nấm Pythium aphanidermatum nhìn dƣới kính hiển vi [75].

P. aphanidermatum hiện diện trên toàn thế giới, đặc biệt ở các vùng ấm áp và
nhà kính. Nấm này thích hợp phát triển ở nhiệt độ 27 – 34oC và điều kiện ẩm ƣớt.
Nó có biên độ kí chủ rất rộng, bao gồm nhiều loài thực vật nhất niên và thực vật
trồng ở vƣờn nhƣ củ cải đƣờng, tiêu, hoa cúc, bơng vải, cỏ. Khí hậu nóng và ẩm ƣớt
dẫn đến cây gừng bị nhiễm bệnh ở giai đoạn mọc chồi do các mơ yếu và mọng
nƣớc[17]. Có hai cách để mầm bệnh lây nhiễm và duy trì: thứ nhất là thông qua các


9

củ bị bệnh, thứ hai là qua bào tử còn sống sót trong đất sau thu hoạch. Các phần củ
và rễ bị nhiễm bệnh còn lại trên cánh đồng, tạo thành một nguồn phát tán bệnh quan
trọng vì các phần này mang một lƣợng lớn bào tử. Bào tử noãn cũng đã đƣợc phát

hiện ở củ đƣợc cất trữ. Sự lây lan của căn bệnh này là điển hình của bệnh từ đất vì
khá nặng và phát triển nhanh trong mùa mƣa từ tháng sáu đến tháng mƣời [17].
Cịn ít nghiên cứu hình thái học về củ bị thối nhũn, nhƣng theo Ravindran
(2005), Pythium spp. ở trong cả gian bào và nội bào. Mơ thối hóa xuất hiện ở nhiều
nơi trên mơ kí chủ là do sự có mặt của các enzyme amylase, invertase và các
enzyme oxi hóa.
1.1.3.3. Chu kì bệnh
Các nguồn lây bệnh chính của thối mềm củ là sự hiện diện của các bào tử nấm
trong củ bị bệnh hoặc đất. Các bào tử này có thể nảy mầm trực tiếp hoặc gián tiếp.
- Nảy mầm trực tiếp: bào tử noãn tạo ra một ống mầm. Ống mầm này dài ra và
tạo ra một túi bào tử hoặc xâm nhập tế bào chủ trực tiếp.
- Nảy mầm gián tiếp: bào tử noãn sản xuất một túi bào tử và các động bào tử.
Có nhiều báo cáo cho thấy việc tế bào rễ của kí chủ tiết dịch là nguyên nhân của sự
tích tụ bào tử động xung quanh vùng rễ và tăng sự tạo nang, nảy mầm và xâm
nhiễm của nấm [66].
Bệnh lây lan là do độ ẩm trong đất cao, các bào tử động dễ dàng bơi theo nƣớc
đến tấn cơng vào rễ gừng – nơi hình thành các nang và ống mầm để bắt đầu quá
trình xâm nhiễm. Các thƣơng tổn xuất hiện tại điểm xâm nhiễm trong vòng 72 giờ
trong điều kiện thời tiết lý tƣởng. Túi bào tử đƣợc tạo ra trên bề mặt vết thƣơng của
kí chủ. Sự hình thành bào tử nỗn diễn ra trong mơ kí chủ hoặc trong đất. Các bào
tử nỗn là cấu trúc khơng hoạt động và có thể sống nhiều năm trong điều kiện
không thuận lợi [80].


10

Hình 1.4. Vịng đời của nấm Pythium aphanidermatum [75].

Có một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự xâm nhiễm Pythium và phát triển bệnh.
Trong đó, điều quan trọng là yếu tố thời tiết và đất đai, độ ẩm trong đất cao, nhiệt

độ ấm có lợi cho sự phát triển và lây lan bệnh. Gừng thƣờng đƣợc trồng ở vùng mƣa
nhiệt đới gió mùa từ tháng 3 đến tháng 10 là thời gian thuận lợi để khởi phát bệnh
(nhiệt độ 25 – 30ºC, mƣa nhiều). Một khi khởi bệnh, nó lây lan đến các vùng liền kề
chủ yếu là thông qua sự di chuyển của bào tử động trong nƣớc và các mảnh hyphal
[80].

1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
1.2.1. Phƣơng pháp chung
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn
đề sinh học ảnh hƣởng đến quá trình chuyển gen nhƣ sau:
- Khơng phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng (totipotency).
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một
gen ngoại lai.
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả
năng thu nhận gen biến nạp vào genome.


11

- Thành phần của các quần thể tế bào đƣợc xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ
quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay
chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thơng qua vi khuẩn
Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng
phƣơng pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu
hiện tạm thời của gen.
- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chƣa đảm
bảo là đã liên kết ổn định với genome.
- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở

nơi mà nó đƣợc đƣa vào [15].
Các bƣớc cơ bản của quá trình chuyển gen:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
- Phân lập gen (dùng phƣơng pháp PCR hoặc sàng lọc từ thƣ viện cDNA hoặc
từ thƣ viện genomic DNA).
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.
- Biến nạp vào E. coli.
- Tách chiết DNA plasmid.
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phƣơng pháp khác
nhau.
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.