Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN VĂN HỒNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI
TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC
ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HP PROTEASE
THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM
Chuyên ngành: KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số ngành : 2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2004


CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

Người chấm nhận xét 1: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯNG

Người chấm nhận xét 2: TS. LẠI MAI HƯƠNG

Luận văn thạc só được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày..... tháng..... năm 2004

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------------

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
---oOo---

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Nguyễn Văn Hồng

Phái:

Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 22-10-1979

Nơi sinh: Cao lãnh - Đồng Tháp

Chuyên ngành: Khoa học và Công nghệ thực phẩm

Mã số:

2.11.00

I-TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HP PROTEASE THEO PHƯƠNG
PHÁP NUÔI CẤY CHÌM
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

-

Chọn và tối ưu hóa thành phần môi trường lỏng nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh
tổng hợp enzyme protease.

-

Xác định điều kiện thích hợp cho phương pháp nuôi cấy bề sâu với qui mô nuôi cấy trong
erlen thể tích 250 ml: khảo sát ảnh hưởng của pH đầu, lượng giống cấy và độ thoáng khí
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme.

-

Xác định khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của chế phẩm protease thô thu được

-

Khảo sát khả năng thủy phân protein của chế phẩm protease thu nhận.

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN
VI- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯNG
VII- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2: TS. LẠI MAI HƯƠNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CÁN BỘ NHẬN XÉT 1

CÁN BỘ NHẬN XÉT 2


TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯNG

TS. LẠI MAI HƯƠNG

Nội dung và đề cương luận văn thạc só đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua
TRƯỞNG PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Ngày.....tháng.....năm 2004
CHỦ NHIỆM NGÀNH

PGS. TS. PHẠM VĂN BÔN


L
Ơ
ØICẢMƠ
N
☯

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Văn Việt Mẫn đã
nhiệt tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức cũng như những kinh
nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực
phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền
đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nâng cao
kiến thức trong thời gian qua.
Em thành thật cám ơn các thầy, cô cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp
đỡ và tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành thí nghiệm.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Phân viện Khí tượng Thủy văn
và Môi trường phía Nam cùng các anh chị đồng nghiệp, tất cả bạn bè đã
thảo luận, ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện luận
văn.


ABSTRACT

This study, focuses on the optimization of liquid fermentation medium for
protease biosynthesis by Aspergillus oryzae.
A solution is prepared by dissolving 2.5 grams of dextrin, 5.0 grams of
soybean flour, 3.0 grams of shaccharose , 0.9 grams of sodium carbonate, 0.3
grams of sodium hydrogen carbonate, 0.3 grams trisodium polyphosphate, 0.1
grams of yeast extract and 100 ml water in 250ml Erlenmeyer flask. The solution is
sterilized at 1210C for 20 minutes. The initial pH of the medium is approximately
10.5.
Then the submerged fermentation conditions are optimized. The inoculating
rate is 222.5 mg dry spores/ l, agitation rate 350 rpm and fermentation time 52
hours.
The pH and the temperature optimum of the produced protease are
determined (pHopt = 6.5, topt = 550C).
This research has shown that the produced protease can be applied in
different proteolysis of food processing.


MỤC LỤC
Nội Dung
Trang
Danh mục các bảng
Danh mục các hình

1. LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
2. TỔNG QUAN ................................................................................................... 3
2.1. PROTEASE ................................................................................................. 3
2.1.1. Khái niệm ............................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại protease .................................................................................. 3
2.1.2.1. Theo pH xúc tác ............................................................................. 3
2.1.2.2. Theo trung tâm hoạt động .............................................................. 4
2.1.2.3. Theo cơ chế xúc tác ....................................................................... 4
2.1.3. Tính chất ................................................................................................ 7
2.1.3.1. Serine peptidase ............................................................................ 7
2.1.3.2. Cystein peptidase ........................................................................... 7
2.1.3.3. Metalo peptidase ........................................................................... 8
2.1.3.4. Aspartic peptidase ......................................................................... 8
2.2. SINH TỔNG HP PROTEASE ................................................................ 8
2.2.1. Nguồn thu nhận enzyme ........................................................................ 8
2.2.2.1 Nấm mốc Aspergillus oryzae................................................................. 10
2.2.2.2. Sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật .................................................. 10
a. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng .............................................................. 10
b. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme .................................................. 12
Cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme ........................................... 13
Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp enzyme ........................................... 15
2.2.3. Môi trường sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vaät .................................... 17


2.2.3.1. Phân loại môi trường ...................................................................... 17
2.2.3.2. Các phương pháp thiết lập môi trường ........................................... 18
2.2.4. Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme protease.............................. 19
2.2.4.1. Thành phần môi trường .................................................................. 19
a. Nguồn carbon .................................................................................... 19
b. Nguồn nitơ ......................................................................................... 20

c. Chất cảm ứng ..................................................................................... 20
d. Các chất dinh dưỡng khác ................................................................. 21
2.2.4.2. Điều kiện nuôi cấy ......................................................................... 21
a. Nhiệt độ ............................................................................................. 21
b. pH môi trường ................................................................................... 22
c. Độ ẩm môi trường .............................................................................. 22
d. Độ thoáng khí .................................................................................... 23
e. Thời gian nuôi cấy ............................................................................. 23
2.2.4.3. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ........................................... 23
a. Phương pháp nuôi cấy bề mặt ........................................................... 23
b. Phương pháp nuôi cấy chìm .............................................................. 25
c. Ưu và nhược điểm của mỗi phương pháp .......................................... 26
2.2.5. Tách và tinh chế enzyme protease ........................................................ 26
2.2.5.1. Một số nguyên tắc tách và tinh sạch enzyme................................. 26
2.2.5.2. Phương pháp thu nhận chế phẩm thô protease ngoại bào .............. 27
2.2.6. Ứng dụng của protease .......................................................................... 28
3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 31
3.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 31
3.1.1. Vi sinh vật ............................................................................................... 31
3.1.2. Môi trường giữ giống .............................................................................. 31
3.1.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................ 32


3.2. Các hóa chất dùng trong thí nghiệm ............................................................. 32
3.3. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm ................................................... 34
3.4. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 35
3.4.1. Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................... 36
3.4.2. Thuyết minh sơ đồ................................................................................... 37
3.5. Các phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu ...................................... 42
3.5.1. Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải

tiến .................................................................................................................... 42
3.5.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry........................... 45
3.5.3. Xác định hàm lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu, sử dụng
Ninhydrin ............................................................................................... 47
3.5.4. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố theo phương án
trực giao bậc hai ..................................................................................... 48
4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................. 52
4.1. Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
sinh tổng hợp enzyme protease ................................................................... 52
4.1.1. Khảo sát chọn môi trường cơ bản............................................................ 52
4.1.2. Xác định hàm lượng chất cảm ứng trong môi trường nuôi ...................... 55
4.1.3. Xác định hàm lượng các hợp chất vi lượng trong môi trường nuôi ......... 57
4.1.4. Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy bằng phương pháp qui
hoạch thực nghiệm ................................................................................. 60
4.2. Xác định điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
enzyme protease theo phương pháp nuôi cấy chìm..................................... 65
4.2.1. Xác định pH ban đầu của môi trường nuôi cấy ....................................... 65


4.2.2. Xác định tỉ lệ giống cấy .......................................................................... 66
4.2.3. Xác định độ thoáng khí ........................................................................... 67
4.2.4. Khảo sát động học quá trình sinh tổng hợp enzyme protease................. 69
4.3. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho chế phẩm protease thô từ canh trường
bề sâu Aspergillus oryzae ............................................................................ 70
4.3.1. Xác định nhiệt độ tối ưu.......................................................................... 70
4.3.2. Xác định pH tối ưu .................................................................................. 71
4.4. Khảo sát khả năng thủy phân protein của chế phẩm protease thu nhận ...... 73
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................... 76
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 76
5.2. Đề nghị các hướng nghiên cứu tiếp theo ...................................................... 77

TÀI LIỆU THAM KHAÛO .................................................................................... 78


DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội Dung

Trang

Hình 2.1: Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid.............................. 3
Hình 2.2: Sơ đồ cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme....................................... 14
Hình 2.3: Sơ đồ cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp enzyme. ...................................... 16
Hình 3.1: Sơ đồ quá trình làm môi trường giữ giống ............................................ 31
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu. .................................................................................. 37
Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến. ... 44
Hình 3.4: Sơ đồ xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. ............... 46
Hình 4.1: Sự thay đổi hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy trong 4 môi
trường M1, M2, M3 và M4 ........................................................................ 53
Hình 4.2: Sự thay đổi hoạt độ protease theo thời gian trong các môi trường có
hàm lượng bột đậu nành có hàm lượng khác nhau .................................... 57
Hình 4.3: Động học hoạt độ protease trong các môi trường nuôi cấy khi thay
đổi hàm lượng chất chiết nấm men. .......................................................... 59
Hình 4.4: Hoạt tính protease trong các thí nghiệm tối ưu...................................... 63
Hình 4.5: Động học quá trình sinh tổng hợp enzyme protease bởi Aspergillus
oryzae theo phương pháp nuôi cấy bề sâu ................................................. 70
Hình 4.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease. ............................ 71
Hình 4.7: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme .................................................... 72
Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin theo thời gian thủy phân ................... 74


DANH MỤC CÁC BẢNG


Nội Dung

Trang

Bảng 2.1: Phân loại protease theo cơ chế tác dụng lên cơ chất ............................. 5
Bảng 2.2: Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt và bề sâu ........... 26
Bảng 3.1: Các hóa chất được dùng trong quá trình thí nghiệm............................... 32
Bảng 3.2: Các dụng cụ và thiết bị được dùng trong quá trình thí nghiệm .............. 34
Bảng 3.3: Thành phần môi trường M1.................................................................... 38
Bảng 3.4: Thành phần môi trường M2.................................................................... 38
Bảng 3.5: Thành phần môi trường M3.................................................................... 39
Bảng 3.6: Thành phần môi trường M4.................................................................... 39
Bảng 3.7: Cách pha dung dịch Tyrosin chuẩn. ....................................................... 43
Bảng 3.8: Cách pha dung dịch albumin chuẩn. ...................................................... 46
Bảng 4.1: Bảng kết quả giá trị hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi
trong các môi trường khác nhau............................................................... 52
Bảng 4.2: Hàm lượng bột đậu nành trong môi trường nuôi cấy.............................. 55
Bảng 4.3: Bảng kết quả giá trị hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi
trong môi trường khi thay đổi hàm lượng bột đậu nành. ......................... 56
Bảng 4.4: Hàm lượng chất chiết nấm men trong các môi trường nuôi cấy............. 58
Bảng 4.5: Sự thay đổi hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi trong các
môi trường có hàm lượng chất chiết nấm men khác nhau. ...................... 59
Bảng 4.6: Các yếu tố khảo sát. ............................................................................... 60
Bảng 4.7: Ma trận trực giao bậc hai. ...................................................................... 61
Bảng 4.8: Mô hình thí nghiệm. ............................................................................... 61
Bảng 4.9: Hoạt tính protease trong các thí nghiệm tối ưu. ..................................... 62


Bảng 4.10: Các giá trị tính được. ............................................................................ 63

Bảng 4.11: Thành phần môi trường tối ưu nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
sinh tổng hợp enzyme protease. ............................................................. 65
Bảng 4.12: Hoạt độ enzym protease khi nuôi trong các môi trường có giá trị pH
ban đầu khác nhau ................................................................................... 66
Bảng 4.13: Ảnh hưởng lượng giống ban đầu đến hoạt tính enzyme protease
trong canh trường. .................................................................................... 67
Bảng 4.14: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ enzyme protease trong canh
trường nuôi. .............................................................................................. 68
Bảng 4.15: Giá trị hoạt độ protease thay đổi theo thời gian................................... 69
Bảng 4.16: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease............................ 71
Bảng 4.17: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme protease .................................... 72
Bảng 4.18: Hàm lượng nitơ amin trong quá trình thủy phân cá cơm ...................... 74


-1-

Trong những năm gần đây ngành công nghệ sinh học phát triển ngày càng
mạnh mẽ và đạt được nhiều thành tựu về lý thuyết cũng như trong sản xuất.
Nhiều quốc gia trên thế giới xem công nghệ sinh học là ngành mũi nhọn, thu
được nhiều lợi nhuận kinh tế cao. Một trong những lónh vực được quan tâm nhiều
nhất của công nghệ sinh học là công nghệ sản xuất các chế phẩm enzyme. Đó là
những chất xúc tác sinh học, có hoạt tính rất lớn và chỉ thu nhận được thông qua
con đường sinh tổng hợp từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Enzyme không
thể tổng hợp được bằng con đường hóa học. Phương pháp thu nhận enzyme từ vi
sinh vật được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng
cao, tạo ra được những hệ enzyme phong phú và có hoạt lực mạnh mẽ. Nguyên
liệu làm môi trường nuôi vi sinh vật lại dễ tìm và rẻ tiền.
Một trong những chế phẩm enzyme vi sinh vật được sản xuất và ứng dụng
nhiều nhất hiện nay là protease. Enzyme này được sử dụng nhiều trong các
ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược,… đặc biệt trong ngành công nghệ thực

phẩm như chế biến thịt, cá, sữa, nước giải khát,… Thực tế ở nước ta, các chế phẩm
protease hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành rất cao nên việc ứng
dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất thực phẩm chưa được rộng rãi và thường
làm tăng đáng kể giá thành sản phẩm.
Gần đây tại Việt Nam đã có một số đề tài nghiên cứu về enzyme này. Tuy
nhiên, các tác giả chỉ tập trung khảo sát phương pháp nuôi cấy bề mặt. Phương
pháp bề mặt đòi hỏi nhiều lao động thủ công, môi trường không đồng nhất nên
khó kiểm tra và điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme. Một nhược điểm
đáng lưu ý là canh trường bề mặt thường chứa nhiều enzyme khác nhau, gây khó
khăn cho việc tinh sạch chế phẩm sản xuất.


-2-

Nội dung của bài luận văn này là tập trung khảo sát quá trình nuôi cấy nấm
mốc Aspergillus oryzae theo phương pháp bề sâu nhằm mục đích sinh tổng hợp
enzyme protease. Các nhiệm vụ được giao bao gồm:
1) Chọn và tối ưu hóa thành phần môi trường lỏng nuôi cấy nấm mốc
Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme protease.
2) Xác định điều kiện thích hợp cho phương pháp nuôi cấy bề sâu với qui
mô nuôi cấy trong erlen thể tích 250 ml: khảo sát ảnh hưởng của pH đầu,
lượng giống cấy và độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp enzyme.
3) Xác định khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của chế phẩm enzyme protease
thô thu được.


-3-

2. TỔNG QUAN
2.1. PROTEASE

2.1.1. Khái niệm: [2], [12], [28], [29], [36], [39], [40]
Enzyme protease hay peptid hydrolase (3.4) là một chất xúc tác sinh học có
bản chất là protein. Nó xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)
trong phân tử protein và các polipeptid. Sản phẩm của quá trình thủy phân này
có thể là các acid amin, các peptid, các polipeptid chuỗi ngắn,…

h2n-ch-co-nh-ch-co-...-nh-ch-cooh
R1

h2o

Rx

R2

h2n-ch-cooh + h2n-ch-co-...-nh-ch-cooh
R1

R2

Rx

Hình 2.1: Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid

2.1.2. Phân loại protease:
Protease là tên gọi chung một nhóm bao gồm nhiều enzyme khác nhau.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp phân loại protease.
2.1.2.1. Theo pH xúc tác: [7], [12], [15], [36], [39], [40].
Dựa theo mức độ hoạt động trong dung dịch có giá trị pH khác nhau mà
enzyme protease được chia làm ba loại:



-4-

¾

Protease acid: loại protease này thường được thu nhận từ các loài

nấm mốc như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Asp. saitoi, Asp.
shirousami. pHopt = 2,5 ÷ 3,0. Hầu hết chúng được sử dụng trong chế biến các sản
phẩm từ thịt.
¾

Protease trung tính: loại này có thể thu nhận từ rất nhiều loài nấm

mốc khác nhau như: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. fumigatus, Asp. terricola.
Protease trung tính thường có pHopt = 6,0 ÷ 7,5 và được sử dụng trong công
nghiệp thực phẩm.
¾

Protease kiềm: Loại protease này thường được thu nhận từ các

loài nấm mốc như: Asp. oryzae, Asp. sojae, Asp. flavus. Protease kiềm có pHopt = 8
÷11. Các loại protease kiềm được ứng dụng nhiều trong sản xuất bột giặt.
2.1.2.2. Theo trung tâm hoạt động: [31], [36], [39], [40]
Dựa trên những kết quả nghiên cứu thu được về trung tâm hoạt động của
các protease, các nhà khoa học chia protease thành bốn nhóm:
- Serine peptidase.
- Cystein peptidase.
- Aspartic peptidase.

- Metalo peptidase.
Đây là cách phân loại được đánh giá là cụ thể nhất.
2.1.2.3. Theo cơ chế xúc tác: [31], [36], [39], [40]
Dựa trên cơ chế tác dụng của protease lên cơ chất, người ta phân enzyme
thành hai nhóm lớn: exopeptidase và endopeptidase. Trong đó, exopeptidase
(còn gọi là peptidase) tham gia xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid từ đầu
mút của phân tử protein. Nếu phân cắt ở đầu có gốc amino hoặc carboxyl tự do
thì gọi là enzyme aminopeptidase hay carboxypeptidase. Coøn endopeptidase


-5-

(còn gọi là protease) xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid nằm ở giữa
mạch phân tử protein.
Phương pháp phân loại này rất tổng quát, nên chỉ mang tính chất định tính
sơ bộ ban đầu.
Bảng 2.1: Phân loại protease theo cơ chế tác dụng lên cơ chất.
Ký hiệu
EC

Nhóm enzyme

Chú thích

Ví dụ

Exopeptidase
Xúc tác thủy phân liên kết
3.1.11


Aminopeptidase

peptid ở đầu amino của mạch

Aminopeptidase

polypeptid
3.4.13

3.4.14

3.4.15

Dipeptidase

Xúc tác thủy phân liên kết
peptid trong phân tử dipeptid

Dipeptidyl

và Xúc tác thủy phân liên kết

tripeptidyl

peptid từng cặp, bắt đầu từ

peptidase

đầu amino


Peptidyldipeptidase

Dipeptidase

Cathepsin

Xúc tác thủy phân liên kết
peptid từng cặp, bắt đầu từ

Carboxypeptidase

đầu carboxyl
Xúc tác thủy phân liên kết

3.4.16

Serin

peptid từ đầu carboxyl, có Carboxypeptidase

carboxypeptidase gốc serin trong trung tâm C, cathepsin
hoạt động.


-6-

Xúc tác thủy phân liên kết
3.4.17

Metalo


peptid từ đầu carboxyl, trung Carboxypeptidase

carboxypeptidase tâm hoạt động có ion kim A và B
loại: Zn2+ hay Co2+

3.4.18

Cystein
carboxypeptidase

Xúc tác thủy phân liên kết Lysosomal
peptid từ đầu carboxyl, trung carboxypeptidase
tâm hoạt động có gốc cystein

B

Endopeptidase
Có gốc serin trong trung tâm Chymotripsin A, B,
3.4.21

Serin peptidase

hoạt động xúc tác thủy phân C, α, β tripsin,
liên kết peptid ở giữa mạch protease kiềm thu
phân tử protein
Có gốc cystein trong trung

3.4.22


Cystein peptidase

tâm hoạt động xúc tác thủy
phân liên kết peptid ở giữa
mạch phân tử protein.

nhận từ vi sinh vật.
Papain,

ficin,

bromelain,
cathepsin B.

Có 2 nhóm aspartic trong
3.4.23

Aspartic

trung tâm hoạt động xúc tác Pepsin,

peptidase

thủy phân liên kết peptid ở D, renin.

cathepsin

giữa mạch phân tử protein.
Có ion kim loại trong trung
3.4.24


Metalo peptidase

tâm hoạt động xúc tác thủy
phân liên kết peptid ở giữa
mạch phân tử protein.

Collagenase,

một

số protease trung
tính từ vi sinh vật.


-7-

2.1.3. Tính chất: [12], [28], [31], [36], [39], [40].
2.1.3.1. Serine peptidase:
Nhóm enzyme này có pH tối thích trong khoảng 7 ÷ 11, đại diện cho nhóm
này là các enzyme có nguồn gốc từ động vật như: trysin, chymotrysin, elastase,
plasmin và thrombin. Một số enzyme được sinh tổng hợp từ vi sinh vật, đặc biệt
là vi khuẩn và nấm mốc như: Bacillus cereus, Bac. firmus, Bac. licheniformis,
Bac. subtilis…, Streptomyces fradiae, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae,…
Trung tâm hoạt động của serine peptidase luôn có một gốc serine và một gốc
histidine.
Các tác nhân làm mất hoạt tính của nhóm enzyme này là:
diizopropylflourophosphate (DIFP) hay phenylmethanesulfonylflouride (PMSF).
Những chất này làm alkyl hóa bất thuận nghịch gốc serine trong trung tâm hoạt
động của enzyme. Sự ức chế bất thuận nghịch còn có thể xảy ra khi có mặt các

metyl - ceton bị halogen hóa. Chúng sẽ alkyl hóa gốc histidine trong trung tâm
hoạt động. Ngoài ra, người ta còn tìm thấy tác nhân ức chế nhóm enzyme này
xuất hiện trong các cơ thể sống như: lá lách, lòng trắng trứng, rễ cây khoai tây,
hạt của một số loại đậu.
2.1.3.2. Cystein peptidase:
Đặc trưng cho nhóm này là: papain (được chiết tách từ cây đu đủ),
bromelain (được chiết tách từ các bộ phận của cây dứa), ficin được chiết tách từ
cây sung và một số protease từ vi sinh vật. Nhóm enzyme này hoạt động trong
vùng pH rất rộng 4,5 ÷ 10 và phụ thuộc vào cơ chất, tuy nhiên vùng pHopt là 6 ÷
7,5. Trong trung tâm hoạt động của cystein peptidase có một gốc cystein.
Enzyme này rất nhạy với tác nhân oxy hóa, vì vậy khi dùng tác nhân này thường


-8-

kèm theo tác nhân khử (ví dụ như cystein). Tác nhân gây vô hoạt cystein
peptidase: các chất oxy hóa, ion kim loại hoặc tác nhân alkyl hóa.
2.1.3.3. Metalo peptidase:
Các enzyme thuộc nhóm này bao gồm: exopeptidase, dipeptidase,
aminopeptidase, carboxypeptidase A&B, prolidase, prolinase và một số protease
thu nhận từ vi sinh vật nhö: Bacillus cereus, Bac. megaterium, Bac. subtilis, Bac.
thermoproteolyticus, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae,...
Hầu hết các protease trong nhóm này đều có chứa ion kim loại trong phân
tử enzyme. Phần lớn chúng chứa một mol Zn2+ trên một mol protein. Nhưng với
prolidase và prolinase thì chứa 1 mol Mn2+. Vùng pH hoạt động của nhóm này
khoảng 6 ÷ 9.
2.1.3.4. Aspartic peptidase:
Đại diện nhóm này là các enzyme có nguồn gốc từ động vật như: renin,
pepsin hoạt động trong khoảng pH từ 2 ÷ 4, riêng với cathepsin D có pHopt 3 ÷ 5,
tuy nhiên điều này còn phụ thuộc vào nguồn cơ chất và nguồn enzyme. Với

enzyme renin, trong khoảng pH 6 ÷ 7, nó có khả năng cắt liên kết κappa-casein
với tính đặc hiệu cao làm đông tụ sữa.
Aspartic peptidase có nguồn gốc từ vi sinh vật có thể chia thành hai nhóm
cơ bản là pepsin–like (giống như pepsin) và renin-like (giống như renin). Nhóm
pepsin-like được thu nhận từ Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamori, Penicillium
spp,… Nhóm renin-like được thu nhận từ Asp. usamii, Mucor pusillus,…
2.2. SINH TỔNG HP PROTEASE:
2.2.1. Nguồn thu nhaän enzyme: [10], [12], [14], [15], [32], [34], [39], [40]
Vì enzyme có bản chất là protein nên chúng chỉ có thể tổng hợp bằng con
đường sinh học, không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó, muốn thu


-9-

nhận enzyme, chỉ có con đường duy nhất là thu nhận chúng từ cơ thể sinh vật hay
nói cách khác, bằng con đường sinh tổng hợp.
Hiện nay người ta khai thác và thu nhận enzyme từ ba nguồn cơ bản:
9 Từ động vật: sử dụng renin từ dạ dày bê, thu nhận pepsin từ dạ dày của
động vật. Tuy nhiên việc sản xuất các enzyme từ nguồn động vật bị hạn chế về
nguồn nguyên liệu.
9 Từ thực vật: thu nhận papain từ nhựa quả đu đủ, bromelin từ vỏ trái dứa
hay thân dứa, ficin từ sung.
9 Từ vi sinh vật: trong ba nguồn sinh vật dùng để khai thác và thu nhận
enzyme, nguồn vi sinh vật được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì có các ưu
điểm:
•

Vi sinh vật có kích thước nhỏ, chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất

ngắn. Do đó, tốc độ sinh tổng hợp enzyme và hoạt tính của các enzyme từ vi sinh

vật rất cao. Bên cạnh đó, cường độ xúc tác của các enzyme từ vi sinh vật vượt xa
các enzyme từ các nguồn sinh vật khác.
•

Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú. Ta có thể sản xuất

nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có cả những enzyme không thể thu nhận
được từ động thực vật.
•

Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng có khả năng sinh

tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn có thể thực hiện khá dễ dàng trong một
thời gian ngắn vì vi sinh vật có khả năng thích ứng nhanh với môi trường nuôi
cấy. Trong khi đó, việc cải tạo giống động vật và thực vật để sản xuất enzyme
đòi hỏi một thời gian rất dài.
•

Vi sinh vật có tốc độ sinh sản rất cao. Trong một thời gian ngắn, ta có

thể thu nhận một lượng sinh khối lớn. Do đó, với một quy mô nhất định và trong
thời gian ngắn ta có thể thu nhận một lượng enzyme rất lớn.


- 10 -

•

Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng. Ta


có thể dễ dàng tìm kiếm nguyên liệu dùng để sản xuất chế phẩm enzyme từ vi
sinh vật. Trong nhiều trường hợp, nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật
thu nhận enzyme hoàn toàn không phải là nguyên liệu thực phẩm cho người,
thậm chí có thể sử dụng cả phế liệu trong nông nghiệp, công nghiệp. Điều này
giúp ta thu nhận được nguồn lợi nhuận to lớn khi sản xuất enzyme từ vi sinh vật.
•

Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô

công nghiệp, khả năng cơ giới hóa và tự động hóa cao.
•

Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết, điều kiện địa lý như

nuôi, trồng động vật và thực vật.
2.2.2.1. Nấm mốc Aspergillus oryzae: [10], [34].
Aspergillus oryzae là một loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus, bộ nấm túi
(Ascomycetes). Chúng có mặt hầu như mọi nơi trong tự nhiên, nhưng thường gặp
trong đất. Khuẩn ty của Aspergillus oryzae không có màu, còn bào tử thuộc dạng
bào tử trần có màu xám nhạt-lục.
Aspergillus oryzae có thể tổng hợp nhiều enzyme khác nhau nhưng chủ yếu
là amylase và protease. Đây là một loại nấm mốc được coi là có khả năng sinh
tổng hợp mạnh mẽ protease ngoại bào nhất, tuy nhiên lượng protease được sinh
tổng hợp còn phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, thành phần môi trường, điều kiện
nuôi cấy và thời gian nuôi cấy.
2.2.2.2. Sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật:
a) Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng: [2], [5], [11], [37], [39], [40]
Trong cơ thể vi sinh vật luôn tồn tại hai nhóm enzyme quan trọng: enzyme
bản thể và enzyme cảm ứng. Điểm khác biệt quan trọng giữa hai nhóm enzyme
này là sự tổng hợp enzyme bản thể không chịu ảnh hưởng của thành phần môi

trường nuôi cấy. Enzyme bản thể được tổng hợp với vận tốc ổn định và tồn tại với


- 11 -

số lượng ổn định. Còn enzyme cảm ứng chỉ được vi sinh vật sinh tổng hợp với
hàm lượng cao khi có cơ chất cảm ứng trong môi trường. Những enzyme thủy
phân cơ chất trong môi trường nuôi cấy như protease thường thuộc hệ enzyme
cảm ứng.
Thực nghiệm cho thấy khi nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên môi
trường cám mì theo phương pháp bề mặt, có hàng chục enzyme được tạo thành,
trong đó có amylase, protease, maltase, pectinase, invertase, ribonuclease... Nếu
nuôi cấy nấm mốc này trên môi trường Czapek với tinh bột và nitrat thì chỉ có αamylase được tạo thành, còn các enzyme khác chỉ ở dạng vết. Nhưng nếu thay
natri nitrat bằng casein từ sữa đã tách béo thì protease được tạo thành cùng với αamylase.
Hiện tượng này được giải thích bằng lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng
enzyme. Theo đó, một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng, nếu
như nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu
của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất. Các enzyme
thuộc loại này được gọi là enzyme cảm ứng. Các cơ chất kích thích quá trình tổng
hợp này được gọi là chất cảm ứng. Đây là một chất được xem là bộ khung nền để
sinh tổng hợp enzyme cảm ứng, rất cần thiết để thu được những enzyme mong
muốn. Trong sản xuất công nghiệp ta cần phải lựa chọn những chất cảm ứng và
hàm lượng thích hợp của nó trong môi trường để thu hiệu suất sinh tổng hợp
enzyme là cao nhất. Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh rằng những chất
trung gian của quá trình biến đổi cơ chất cũng có thể đóng vai trò là chất cảm
ứng.
Ngược lại với quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzyme chính là hiện tượng
kìm hãm tổng hợp cảm ứng enzyme. Hiện tượng này xảy ra khi những sản phẩm
cuối của quá trình chuyển hóa tăng đến mức quá thừa thì chính sản phẩm này sẽ



- 12 -

kìm hãm sự tổng hợp enzyme cảm ứng. Chất kìm hãm tác động vào hệ gen tổng
hợp các enzyme của quá trình phản ứng làm ngừng sản xuất toàn bộ các enzyme
của quá trình.
Ví dụ: Khi ta thêm một acid amin nào đó vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn
thì tế bào vi khuẩn không cần tổng hợp acid amin này nữa, do đó sẽ đình chỉ quá
trình sinh tổng hợp các enzyme cần xúc tác cho các phản ứng dẫn đến sự tạo
thành các acid amin đó. Các enzyme chỉ được tổng hợp trở lại khi có nhu cầu,
nghóa là khi nồng độ của các acid amin tương ứng giảm xuống. Hiện tượng này
thường gặp đối với các enzyme xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp acid amin,
nucleotide…..
b) Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme:[2], [15], [22], [28], [29], [37],[39]
Cơ chế cảm ứng và cơ chế kìm tỏa sinh tổng hợp enzyme trên cơ sở một cơ
chế thống nhất được Monod và Jacob nghiên cứu và đã mô tả như sau: trong quá
trình điều hòa sinh tổng hợp enzyme có hai cơ chế song hành, cơ chế cảm ứng và
cơ chế kìm tỏa. Trong đó cơ chế kìm tỏa là cơ chế chính, còn cơ chế cảm ứng là
phụ.
Trên ADN có những đoạn không đồng nhất về số lượng các nucleotit và
không đồng nhất về chức năng. Các đoạn này được gọi là gen. Các gen này lại
được phân ra các loại khác nhau như:
-

Gen cấu trúc: qui định thứ tự sắp xếp các axit amin trong chuỗi

polipeptid.
-

Gen chỉ huy: nằm gần gen cấu trúc, chúng không kìm hãm hoạt động của

gen cấu trúc.

-

Gen điều chỉnh: là điểm xuất phát và khởi đầu quá trình tổng hợp ARNm
trên gen cấu trúc.


- 13 -

Tổ hợp của gen chỉ huy và gen cấu trúc được gọi chung là các operon. Gen
điều chỉnh nằm phía ngoài operon và chúng có nhiệm vụ điều hòa hoạt động của
gen chỉ huy và gen cấu trúc. Các gen điều chỉnh tạo ra một loại protein có chức
năng kìm tỏa hay chất kìm tỏa di truyền.
Cả hai chất kìm tỏa này đều có hai tâm liên kết: một tâm liên kết với chất
cảm ứng và một tâm liên kết đặc hiệu với gen chỉ huy.
™ Cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme:
Quá trình này được thực hiện qua những bước sau:
- Đầu tiên, protein kìm tỏa K1 được tổng hợp tại riboxom trên cơ sở mã hóa
thứ tự sắp xếp của các axit amin nhờ gen điều chỉnh R.
- Protein kìm tỏa K1 tách khỏi riboxom và tới nhân sẽ tạo một phức đặc biệt
với gen chỉ huy O trong ADN. Kết quả sự liên kết này sẽ ngăn cản sự mã hóa của
các gen cấu trúc S1, S2 và S3 tương ứng, do đó ARNm sẽ không được tổng hợp,
nên các thông tin không được chuyển từ ADN đến riboxom, do vậy enzyme cũng
không được tổng hợp. Toàn bộ operon ở trong trạng thái bị kìm tỏa.
- Khi trong tế bào có cơ chất U, cơ chất này cùng với chất kìm tỏa K1 sẽ tạo
thành một phức K2. Lúc đó gen chỉ huy O được giải phóng khỏi chất kìm tỏa, toàn
bộ hệ thống operon được hoạt động, thông tin được nối lại từ ADN thông qua
ARNm với riboxom và enzyme được tạo thành.