Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS PHOSPHORYL hóa và một số cơ trơn cô lập

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.12 MB, 51 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HĨA

VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL

HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa

: QH.2013.Y

Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ THỊ THƠM

2. PGS. TS. DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược,
Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược
học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin
chân thành cảm ơn các thầy cơ đã giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình
học tập trong suốt 5 năm qua.

Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và

PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo

điều kiện giúp em hồn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ
môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em
trong q trình hồn thành khóa luận.

Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp

khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài 
cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax 
stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số

KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin
cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hồn thành khóa luận này.

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ để khóa luận thêm hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải thích

ACh Acetylcholin

BH4 Tetrahydrobiopterin

CaM Camodulin

CD Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation)

cGMP GMP vòng (Cyclic guanosine monophosphate)

COX Cyclooxygenase

COX-1 Cyclooxygenase-1

COX-2 Cyclooxygenase-2

eNOS Endothelial nitric oxide synthase

FAD Flavin adenine dinucleotide

FMN Flavin mononucleotide

GTP Guanosine-5'-triphosphate

HUVEC Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein

endothelial cell)

ICAM - 1 Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1)

iNOS Inducible nitric oxide synthase

LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%)

LPS Lipopolyshaccharide

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

nNOS Neuronal nitric oxide synthase

NO Nitric oxide

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal

anti-inflammatory drugs)

NST Nhiễm sắc thể

PDGF Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth

factor)

PG Prostaglandin

PGE2 Prostaglandine E2

PGI2 Prostacyclin

PS27 Cao giàu saponin Tam thất hoang

PSBt Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang

PSnH Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam thất hoang

PST Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang

RT-PCR PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain

reaction)

Ser Serine

sGC Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase)

Thr Threonin

TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M.Feng)

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình Trang

Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M.

Feng)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các chất 1–15 phân lập từ Panax

stipuleanatus

Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch 5

Hình 1.4 Cấu trúc của eNOS 9

Hình 1.5 Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hóa eNOS 11

Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội

mạc

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin 15

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19

Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình ni và hệ thống ghi 20

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2- 23

Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang 25

Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang 25

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng

hợp NO

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện protein eNOS phosphoryl hóa

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện mARN COX-2

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện protein COX-2

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Các dạng của NOS 8

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ... 2

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang ... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật ... 2

1.1.2. Sinh thái và phân bố ... 2

1.1.3. Thành phần hóa học ... 3

1.1.4. Tác dụng dược lý ... 4

1.1.5. Công dụng ... 4

1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS ... 5

1.2.1. Nội mạc mạch máu ... 5

1.2.2. eNOS ... 6

1.3. Tổng quan về viêm và COX-2 ... 14

1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm ... 14

1.3.2 COX – 2 ... 15

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 18

2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu ... 18

2.1.1. Nguyên liệu ... 18

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ... 19

2.2. Dung mơi, hóa chất và thiết bị ... 20

2.3. Phương pháp nghiên cứu ... 21

2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập... 21

2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa ... 22

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 24

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập ... 24

3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa ... 26

3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 ... 28

3.2. Thảo luận ... 30

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập ... 30

3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa ... 31

3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 ... 33

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lịng
mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn
mạch quan trọng và có nhiều vai trị trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu
như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mơ…
Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội
mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều
khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có q trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là
một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67]. Rối loạn chức
năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và q trình viêm đã được
báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37].
Trong những năm gần đây, sự điều hịa eNOS thơng qua q trình phosphoryl hóa
đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi

Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].

Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất
hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài
thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp 
NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58].
Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Điều này đặt ra câu
hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay
khơng? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu 
hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cơ lập” với ba mục tiêu:

1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên
cơ trơn cơ lập của khí quản, bàng quang và thể hang.

2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. 
Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên 
khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do
vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá.
Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5,
có cuống ngắn, hình thn hay mác thn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai
đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5
nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu
đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2].

Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11] 
1.1.2. Sinh thái và phân bố

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

3

1.1.3. Thành phần hóa học

Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là
saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin
khung dammaran với hàm lượng thấp [19].

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2
saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành
phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng
nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43].

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được
11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là
spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm
tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra
3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45]

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

4

1.1.4. Tác dụng dƣợc lý

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –

11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc

trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người
(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với

giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dịng tế bào HL-60 và HCT-116 [15].

Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, 
hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất

từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự

biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2
(cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị
như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45].

Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol
ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thơng qua kích
hoạt quá trình apotosis của tế bào [46].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao
TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở
các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao
saponin tồn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành
malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với

liều LD50 = 8,8 g/kg [5].

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả
TTH có tác dụng chống đơng và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11].

1.1.5. Công dụng

Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có cơng
dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh
dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an
thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

5

1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 
1.2.1. Nội mạc mạch máu

1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc

Về giải phẫu học từ trong ra ngồi, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo
đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm
những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mơ (Hình 1.3) [3].

Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1]

Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch
huyết cũng có một lớp tế bào nội mơ lợp mặt trong lịng mạch. Lớp nội mơ thuộc biểu
mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa
nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào

nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng

thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện

tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52].

1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu

Nội mạc mạch máu có vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự lưu thơng
dịng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các
q trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội mơi
[30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

6

Các tế bào nội mơ có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các

chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân

cực có nguồn gốc nội mơ/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co

mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin,

P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và
VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin
và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực
bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6)
và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin,
fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa

plasminogen mơ), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố
Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con
đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:
VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor),
PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor)
[17,26,27,38].

Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến
nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch
vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn
và các hội chứng viêm [26,27].

1.2.2. eNOS

1.2.2.1. Nitric oxide

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

7

Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30
Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của
NO có một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO có khả năng phản ứng với các
nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc
tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó. Mặt khác, NO tan kém trong
nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hịa các q trình
sinh lý. Tuy nhiên, chất này khơng bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị
chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25].

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym

NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2-. NOS là enzym xúc tác

cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69]. Ở động vật có

vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST)
khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay
NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai

để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2-, phản ứng này được tạo điều kiện bởi

enzym NO2- reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và

nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO2- đóng vai

trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn.

Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng q trình oxy hóa để hình thành nên NO2

-và NO3-. Q trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một

phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2-) để hình

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

8

Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69]

NOS - 1 NOS – 2 NOS - 3

Tên phổ

biến 
nNOS
(Neuronal NOS)
iNOS
(Inducible NOS)
eNOS
(Endothelial NOS)
Tế bào 
biểu hiện

Neuron thần kinh và
một số tế bào khác.

Nhiều loại tế bào hệ
thống miễn dịch như
đại thực bào khi đáp

ứng với

lipopolysaccharid
(LPS), cytokin và các
chất khác.

Tế bào nội mô

Gen NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon

Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc

Chức năng

và các quá

trình sinh 
học

Ở hệ thần kinh trung
ương: có liên quan
đến quá trình học tập
và ghi nhớ; kiểm soát
huyết áp trung ương.
Ở hệ thần kinh ngoại
vi: Chất dẫn truyền
thần kinh, giãn cơ trơn
và mạch

Tham gia vào sinh lý
bệnh của quá trình
viêm và hệ thống
miễn dịch

Tham gia vào

nhiều chức năng

tim mạch quan

trọng: Giãn mạch,
ức chế các quá
trình như kết tập
tiểu cầu, kết dính

bạch cầu, tăng sinh
của tế bào cơ trơn
thành mạch.

1.2.2.2. eNOS

eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO
sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều
hịa nhiều q trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu
hiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tế
bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

9

Cấu trúc gen và protein

eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36);
có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70].
Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng
homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:

- Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH
(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine
dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide).

- Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4

(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin.

- Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid
amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM).

Hình 1.3. Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29]

Phosphoryl hóa eNOS

Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc
Ca2+ và không phụ thuộc Ca2+:

Cơ chế phụ thuộc Ca2+: eNOS là một enzym phụ thuộc Ca2+/CaM. Khi nồng

độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS.

CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện
tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thơng qua FAD và

FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa

L-arginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao

gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69].

Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã,

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

10

cho sự điều hòa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của
dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ

thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41]. Các nghiên cứu
chỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp

hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hóa Ser1177, Ser617

và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr495 và Ser114 làm
giảm chức năng eNOS. Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hòa bởi nhiều
yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF),
bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/
threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II),
AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl
hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41].

Ngồi ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với các
protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của
caveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS
[59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều
hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào
nội mơ khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và
“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS với

2 protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

11

Hình 1.5. Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hóa eNOS.

Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41]

(VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô 
mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P: 
sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: 
high-density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; ) 
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc

a. Điều hòa trương lực mạch máu

Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa tan
(sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP
vòng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành
cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG),

thúc đẩy q trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+

nội
bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột
bị xóa bỏ gen eNOS [47].

b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

12

sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành
xơ vữa động mạch [69]. Rối loạn tính tồn vẹn của hàng rào nội mơ có thể khởi
phát các sự kiện của tiền viêm. NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mô
gây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS -
reactive oxygen species) và angiotensin II. Điều này có thể góp phần vào tác dụng
chống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64].

c. Ức chế sự kết tập tiểu cầu

NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu

vào thành mạch [68,72].

d. Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch

NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh
của tế bào cơ trơn thành mạch. Tác dụng này có thể thơng qua trung gian cGMP
[14,51]. Bên cạnh đó NO còn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng có
nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn. NOS cũng
quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dịng chảy
trong bệnh mạn tính [22].

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

13

1.2.2.4. Vai trị của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý 
a. Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn
tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16]. Quá
trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO
kèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1.
Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO có thể ức
chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch. Do vậy, eNOS có
thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt
tính của eNOS thơng qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâm

đáng kể vì những vai trị sinh lý bệnh của nó [41].

b. Nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi
máu ở chuột bị loại bỏ eNOS khơng thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì
đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và
tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trị có lợi của NO và
eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55].

c. Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động
mạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ. NO và eNOS có vai trị quan trọng
giãn mạch gây hạ áp. Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa
bỏ gen eNOS [47].

d. Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và
phá hủy các ROS. Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh
lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn
đến rối loạn chức năng nội mô. Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân
tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mơ [41].

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

14

1.3. Tổng quan về viêm và COX-2

1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố
gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì q trình viêm có thể gây ra các tổn thương,
hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4]. Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự
tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch
cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau. Q trình này có sự
tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin,
prostaglandin, leucotrien. Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố
đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3].

PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất
được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo khơng bão hịa được giải

phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2. Acid arachidonic

được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/H
synthase để hình thành nên PGG2 và sau đó là PGH2. PGH2 không bền bị chuyển
hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7).

Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2

(PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α)

[33,61]. Trong đó, PGE2 đóng vai trị quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất

cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm. Cụ thể, PGE2 gây giãn
mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của
quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien,PGE2 làm tăng tính thấm của
thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện. Đau là kết quả PGE2

làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và

tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau. Cuối cùng, PGE2 được xem như một chất trung

gian gây sốt. Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách
tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36].

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

15

yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây
viêm và tham gia vào bệnh lý viêm. Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của
các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory
drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu
hiện nay [44].

Hình 1.7. Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

(Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzym

prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

1.3.2. COX – 2

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

16

1.3.2.1. COX-2 trong một số bệnh lý

a. Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch
gây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch. Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như
hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ. Quá trình viêm xảy ra bên
trong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35]. Một số nghiên cứu
cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch
xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa. Trong
mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào,
bạch cầu mono, tế bào nội mơ. Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạch
theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướng
động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28].
Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 có
thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54]. Từ đó, có thể thấy
được vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch. Tuy nhiên, các chất ức
chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và
do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35].

b. Sinh mạch và ung thư

Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy
ra trong suốt quá trình phát triển của phôi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh
sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư. Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian
gây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35]. Sự tăng tổng hợp

PGE2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng không phải là COX-1 cũng đã được quan

sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mơ lành [48,71]. Ngồi ra, cả
hai loại NSAIDs tác dụng không chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt tính
ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mơ hình động vật [50]. Từ đó có thể
gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35].

c. Suy thận

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

17

COX-2 và protein COX-2 cũng như hoạt tính của enzyme này tăng lên. Sự tăng biểu
hiện của COX-2 có liên quan đến sự sản xuất angiotensin II, tăng natri, tăng huyết áp
cầu thận và viêm ống thận [62]. Bên cạnh đó, các chất ức chế chọn lọc trên COX-2
cũng cho thấy tác dụng làm chậm sự xơ hóa cầu thận và protein niệu trên chuột bị cắt
bỏ một phần thận gợi ý vai trị có lợi của các chất này trong suy thận [49].

1.3.2.2. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

18

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và đối tƣợng nghiên cứu 
2.1.1. Nguyên liệu

Thân rễ Tam thất hoang được thu hái tại Hoàng Su Phì, Hà Giang vào tháng
08/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Tam thất hoang - Panax

stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài

nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Quy trình chiết xuất các phân đoạn của Tam
thất hoang được tiến hành theo sơ đồ dưới (Hình 2.1 và 2.2). Các phân đoạn dịch
chiết dược liệu được tiến hành tại khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, do PGS.TS.

Đỗ Thị Hà cung cấp. Các phân đoạn được nghiên cứu bao gồm: Cao tổng (ký hiệu:
PST); phân đoạn n-hexan (ký hiệu: PSnH); phân đoạn diclomethan (ký hiệu: PS
DCM); phân đoạn n-butanol (ký hiệu: PSBt) và cao giàu saponin (ký hiệu: PS27)

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

19

Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu

 Cơ trơn cô lập của bàng quang, thể hang và khí quản

Chuột cống trắng khỏe mạnh chủng Wistar, trọng lượng từ 150 – 250 g được
sử dụng trong nghiên cứu này. Chuột được nuôi trong điều kiện thoáng mát với chu
kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối và không hạn chế về thức ăn nước uống. Mọi quy trình
nghiên cứu trên động vật thực nghiệm trong nghiên cứu này tuân theo hướng dẫn
chăm sóc và sử dụng động vật của Học viện Quân Y.

Quy trình cơ lập cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang chuột:
- Gây mê chuột bằng ketamin 25 mg/kg.

- Bộc lộ bàng quang, thể hang và khí quản.

- Tách lấy các cơ quan trên cho vào cốc chứa dịch nuôi Tyrode ở nhiệt độ
khoảng 37 °C.

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

20

- Dùng 2 móc kim loại để móc 2 đầu dải cơ trơn và cho vào bình ni đã chứa

sẵn dung dịch nuôi Tyrode (15 ml) được ổn định nhiệt độ 37 °C và cung cấp
đủ oxy. Một móc được gắn cố định dưới đáy bình và móc cịn lại được nối
với đầu đo áp lực của hệ thống Powerlab để ghi sự biến đổi lực co của đoạn
cơ trơn (Hình 2.3).

Hình 2.3. Phƣơng pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình ni và hệ thống ghi

 Tế bào nghiên cứu

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 sử dụng cho nghiên cứu biểu hiện của
COX-2 và tế bào HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người/ human umbilical
vein endothelial cell) dùng cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa
được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD).

Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 37 °C, CO2 5 %, trong mơi trường

có chứa 10 % huyết thanh bào thanh bò (Fetal bovine serume - FBS), penicillin
(100 units/ml) và streptomycin (100 µg/ml). Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế
bào được nuôi đến mật độ 80 – 90 % và chịu không quá 20 lần phân chia tế bào.

2.2. Dung mơi, hóa chất và thiết bị

 Dung mơi, hóa chất

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

21

- Dung dịch nuôi Tyrode (Thành phần gồm: NaCl: 139,2 mM; KCl: 2,7 mM;
CaCl2: 1,8 mM; MgCl2: 0,49 mM; NaHCO3: 11,3 mM; Na2HPO4: 0,4 mM;
glucose: 5,5 mM).

- Nghiên cứu biểu hiện của eNOS và COX-2: Bộ dụng cụ kiểm tra, chuẩn hóa
chất, kháng thể, các dung môi được mua từ Promega, Sigma-Aldrich và
Santa Cruz.

 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống bình nuôi cô lập gồm 4 bình ni, với hệ thống ổn nhiệt và cung
cấp oxy liên tục cho các bình ni.

- Hệ thống ghi Powerlab 8.0 của công ty Austruments, Úc.

- Máy đo mật độ quang Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo
Scientific).

- Máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems).

- Máy chụp Western blot Odyssey Fc Imager (LI-COR Biosciences).

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập

Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập được tiến hành
tại Bộ môn Sinh lý học, Học viện Quân Y. Quy trình thử thuốc như sau:

- Cơ trơn sau khi cô lập và được gắn vào bình ni, đặt một lực tác động cơ sở
tương đương 2 g lên đoạn cơ trơn cô lập và chờ 30 phút để hoạt động của cơ
trơn ổn định.

- Nhỏ vào bình ni 0,15 ml dung dịch acetylcholin với nồng độ tăng dần từ
1:103 đến 1:105. Khi có sự thay đổi lực co cơ rõ ràng trên đồ thị, tiến hành
chuyển sang thử tác dụng của dược liệu.

- Nhỏ 0,15 ml dung dịch mỗi loại dịch chiết dược liệu vào bình ni cơ lập
từ nồng độ 0,5 mg/ml đến nồng độ 2 mg/ml. Trong nghiên cứu này, chúng
tôi thử 4 phân đoạn dược liệu (Cao tổng, phân đoạn n-hexan, phân đoạn
diclomethan và phân đoạn n-butanol) với 3 mức liều: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml
và 2 mg/ml. Mỗi phân đoạn dược liệu được thử 2 lần.

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

22

2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa

 Phân tích RT – PCR cho mARN của COX-2

ARN toàn phần được phân lập từ tế bào bằng cách sử dụng bộ Kit miRNeasy
Mini Kit (Qiagen, #217004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức độ biểu hiện
của mARN được phân tích bằng máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied
Biosystems) sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Xanh (Qiagen, # 204156)
và các cặp mồi xét nghiệm từ Qiagen: cặp mồi Ptgs2 (COX-2, QT00165347) có
trình tự mồi xi GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3’ và mồi ngược
5’-GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3’; cặp mồi Mm_GADPH (QT01658692)
có trình tự mồi xi TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′ và mồi ngược
5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′.

 Phân tích Western blotting

- Sau khi nuôi cấy, các tế bào được thu gom và rửa bằng PBS (Phosphate

buffer saline, thành phần gồm NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM

và KH2PO4 1,8 mM).

- Ly giải tế bào bằng 100 µl dung dịch đệm gồm NaCl 120 mM, Tris 40 mM
(pH 8), NP40 0,1% trong đá ở thời gian 30 phút.

- Ly tâm tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 20 phút. Phần dung dịch phía trên
được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp
Bradford.

- Ủ phần dung dịch chứa protein ở 95 °C trong 5 phút và điện di trên gel SDS -
polyacrylamid 10%.

- Chuyển protein trong gel sang màng nitrocellulose.

- Ủ với kháng thể đơn dòng sơ cấp chuột chống COX-2 cho nghiên cứu biểu
hiện của COX-2 hoặc phosphoryl-eNOS cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS
phosphoryl hóa và beta-actin. Để phát hiện kháng thể sơ cấp, các màng được
tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase (Beverly, MA).
Trong các phân tích Western blot, beta-actin được sử dụng như là protein
chứng cho biểu hiện của các protein khác.

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

23

 Đo quang sản phẩm NO

Lượng NO trong môi trường nuôi cấy tế bào được xác định gián tiếp thông

qua ion NO2- (nitrit) bằng cách sử dụng thuốc thử Griess (Enzo Life Sciences,
Plymouth Meeting, PA). NO có thời gian bán hủy ngắn, trong cơ thể NO bị chuyển
hóa thành NO2- và NO3- (nitrat) do vậy để phân tích chính xác lượng NO tổng số
được tạo ra ta phải theo dõi cả nồng độ NO2- và NO3-. Thuốc thử Griess gồm
sulfanilamid và N-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid (NED). Đầu tiên,
sulfanilamid sẽ phản ứng với NO2- tạo thành muối diazoni. Sau đó muối này sẽ
phản ứng với NED để hình thành nên hợp chất azo màu hồng và có cực đại hấp thụ
ở bước sóng 540 nm (Hình 2.4).

Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2

Môi trường tế bào HUVEC (100 µl) sau khi được ủ 24 giờ với 30 µg/ml dịch
chiết dược liệu, được ủ tiếp với enzym nitrit reductase trong 1 giờ ở 37 ° C để khử

NO3- thành NO2-. Thêm thuốc thử Griess 100 µl sau đó và mẫu được đem đo mật độ

quang ở bước sóng 540 nm.
 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa
Y, Đại học Lund, Thụy Điển (Department of Experimental Medical Science,
Faculty of Medicine, Lund University, Sweden).

 Xử lý kết quả

- Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Kết quả được biểu
diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị
trung bình giữa các lơ bằng test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc
Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lơ. Sự khác biệt giữa các lơ
được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

- Hình ảnh điện di protein được xử lý bằng phần mềm Image J 1.49u để đưa ra

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

24

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập

Để xác định tác dụng co giãn trên các hệ cơ trơn cô lập, chúng tôi đã tiến
hành thử trên 4 phân đoạn của Tam thất hoang gồm cao tổng (PST); phân đoạn
n-hexan (PSnH); phân đoạn diclomethan (PS DCM) và phân đoạn n-butanol (PSBt)
thu được kết quả ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập 
Thuốc

thử

Liều thử 
(mg/ml)

Cơ trơn khí 
quản

Cơ trơn bàng 
quang

Cơ trơn thể 
hang

PST

0,5 ± - -

1 + + -

2 ++ + +

PSBt

0,5 - - -

1 - + -

2 + ++ +

PSnH

0,5 - ± ±

1 - ± ±

2 + ± ±

PS DCM

0,5 ± ± ±

1 ± ± ±

2 ± ± ±

(-) không giãn; (±) tác dụng không rõ ràng; (+) giãn nhẹ; (++) giãn rõ 
Nhận xét: Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng (PST) và phân đoạn n-butanol

(PSBt) của TTH gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí
quản và cơ trơn bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn
này bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn rõ từ nồng độ 2 mg/ml.

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

25

 Một số hình ảnh giãn cơ trơn của các phân đoạn TTH

Hình 3.1. Sự giãn cơ trơn khí quản của phân đoạn tổng Tam thất hoang

Nhận xét: Hình 3.1 cho thấy

khí quản co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:10

và giãn không rõ ràng ở liều PST 0,5 mg/ml, giãn nhẹ ở liều 1 mg/ml và giãn

rõ từ liều 2 mg/ml.

Hình 3.2. Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của phân đoạn tổng Tam thất hoang

Nhận xét: Hình 3.2 cho thấy bàng quang co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:104 và

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

26

3.1.2. Tác dụng trên eNOS phosphoryl hóa

Tác dụng giãn cơ trơn có thể do NO được giải phóng từ hệ thống tế bào nội
mơ mạch máu tạo ra. Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành thí nghiệm đo nồng độ NO
được giải phịng từ tế bào nội mơ sau khi ủ với các dịch chiết Tam thất hoang. Tế
bào HUVEC sau khi ủ với nhiều phân đoạn dịch chiết khác nhau (30 µg/ml) của
Tam thất hoang trong 24 giờ, lượng NO trong môi trường nuôi cấy được xác định

gián tiếp qua NO2- bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Griess. Kết quả

thu được ở hình 3.3.

 Tác dụng của tam thất hoang trên sự tổng hợp NO:

Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng hợp NO

(Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5). 
Trong đó: (*): p<0,05 so với nhóm chứng; (**): p<0,01 so với nhóm chứng) 
Nhận xét: Kết quả phân tích hình 3.3 cho thấy có 2 phân đoạn là phân đoạn tổng

(PST) và cao giàu saponin (PS27) làm tăng sản phẩm NO có ý nghĩa so với nhóm
chứng. Trong đó phân đoạn tổng tăng 1,83 ± 0,24 lần (p < 0,05) và cao giàu saponin
tăng 2,11 ± 0,36 lần (p < 0,01) so với nhóm chứng.

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

27

 Tác dụng trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa

Việc tăng sản xuất NO có liên quan gì tới việc hoạt hóa eNOS bằng cơ chế
phosphoryl hóa hay khơng. Kết quả thí nghiệm phân tích hàm lượng protein eNOS
được phosphoryl hóa được trình bày ở hình 3.4.

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện 
protein eNOS phosphoryl hóa (p-eNOS: Protein eNOS phosphoryl hóa)

Nhận xét: Các băng của protein β-actin giữa các nhóm khá đồng đều và rõ nét (hình

3.4.A). Phân tích định tính kết quả Western blot cho thấy tất cả các phân đoạn TTH
đều làm tăng biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa so với nhóm chứng, trong
đó phân đoạn tổng (PST) và cao giàu saponin (PS27) làm tăng sự biểu hiện của
protein eNOS phosphoryl hóa rõ nhất, thể hiện ở những băng đậm, rõ nét hơn so với
băng của nhóm chứng (hình 3.4.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần
mềm Image J (hình 3.4.B) cũng cho kết quả phân đoạn tổng (PST) và cao giàu
saponin TTH (PS27) làm tăng tỷ lệ protein eNOS phosphoryl hóa/ β-actin lần lượt

(A)

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU

28

6,73 và 9,61 lần so với nhóm chứng. Như vậy kết quả Western blot tương đồng với
kết quả định lượng sản phẩm NO.

3.1.3. Tác dụng trên gen COX-2 và protein COX-2

Bên cạnh các tác dụng trên co giãn mạch, các hoạt tính về chống viêm của
các dịch chiết cũng được thử nghiệm trên tế bào đại thực bào. COX-2 được biết là

một trong các protein liên quan tới đáp ứng viêm của tế bào. Biểu hiện mARN phản
ánh gián tiếp sự biểu hiện của protein COX-2. Tế bào đại thực bào Raw 246.7 được
kích thích gây viêm bằng LPS (Lipopolysaccharid) 1 µg/ml rồi ủ cùng với các dịch
chiết các phân đoạn của TTH (nồng độ 30 µg/ml) trong 24 giờ. Kết quả phân tích
mARN và protein COX-2 được trình bày lần lượt ở hình 3.5 và hình 3.6.

 Tác dụng trên sự biểu hiện gen COX-2:

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện 
mARN COX-2

(Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5); 
(*): p < 0,05 so với nhóm chứng; LPS: Lipopolysaccharide)

Nhận xét: Kết quả phân tích RT-PCR cho mARN COX-2 hình 3.5 cho thấy, tế bào

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

29

 Tác dụng trên sự biểu hiện protein COX-2:

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện 
protein COX-2

Nhận xét: Phân tích Western blot cho protein COX-2 cũng cho kết quả tương đồng

với phân tích biểu hiện mARN COX-2: nhóm tế bào được ủ với LPS làm tăng biểu
hiện của protein COX-2 so với nhóm chứng (băng đậm, rõ nét hơn so với nhóm đối
chứng). Các tế bào đã được kích thích gây viêm bằng LPS được ủ với dịch chiết 
dược liệu, các phân đoạn TTH không làm thay đổi nhiều sự biểu hiện của protein

COX-2 so với nhóm LPS (kích thước và độ đậm của các băng khơng thay đổi nhiều,
hình 3.6.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần mềm Image J hình
3.6.B cũng cho kết quả tương tự. Phân đoạn n-hexan, phân đoạn tổng và phân đoạn
n-butanol có làm giảm biểu hiện của protein COX-2 nhưng mức độ giảm rất ít so
với nhóm LPS. Tuy nhiên, trong phân tích này các băng protein β-actin giữa các
nhóm không đồng đều, các băng không rõ nét; điều này có thể gây ảnh hưởng đến
kết quả nghiên cứu.

(A)

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

30

3.2. Thảo luận

Chi Panax L. là một chi thuốc quý với nhiều loài đã được khẳng định giá trị 
sử dụng như Nhân sâm (Panax ginseng), Tây dương sâm (Panax quinquefolium), 
Tam thất (Panax notoginseng), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)… Nghiên 
cứu về thành phần hóa học của các loài cây này đều chỉ ra saponin là thành phần
chính [76]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc 
chi Panax L., là cây thuốc có giá trị, ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy 
Hoàng Liên Sơn [9]. Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ
và lá của tam thất hoang có chứa saponin khung oleanan với hàm lượng cao cùng
một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [6]. Tuy nhiên, đến nay các
nghiên cứu về lồi này vẫn cịn hạn chế. Mặt khác, saponin trong các loài thuộc chi

Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng sự tổng hợp NO

[39,73] và chống viêm [32,45,58]. Chính vì vậy, chúng tơi chọn đối tượng nghiên
cứu là Tam thất hoang và tiến hành đề tài này với mong muốn làm rõ tác dụng của

tam thất hoang trên cơ trơn cô lập và biểu hiện của eNOS, COX-2 từ đó nâng cao
giá trị sử dụng cho loài cây này.

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập

Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của TTH
gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí quản và cơ trơn
bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn này bắt đầu
xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn mạnh từ nồng độ 2 mg/ml. Các phân đoạn
n-hexan (PSnH) và diclomethan (PS_DCM) hầu như không thể hiện tác dụng trên các
hệ cơ trơn này ở tất cả các nồng độ.

Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Tâm (2016) cho kết quả cả phân đoạn tổng và
phân đoạn n-butanol của TTH đều cho tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [7]. Mặc
dù nghiên cứu của chúng tôi đánh giá trên một tác dụng khác nhưng đều cho thấy
phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol TTH là 2 phân đoạn có hoạt tính sinh học
cao, có thể chứa các thành phần hóa học có tiềm năng. Gợi ý những nghiên cứu sâu
hơn trên 2 phân đoạn này.

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

31

giãn cơ trơn thể hang thỏ khi kích thích gây co bằng phenylephrin (5 x 10-6

M) tại
liều 1 mg/ml và gây giãn cực đại tại liều 40 mg/ml, tác dụng phụ thuộc nồng độ
[20]. Tương tự, theo Kim Sun Ouck (2008), dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc

P.ginseng (chiết bằng dung môi ethanol 50 %) bắt đầu gây giãn cơ trơn âm đạo thỏ

từ liều 1 mg/ml và gây giãn trên 85 % tại liều 20 mg/ ml (p < 0,05) [42]. Nghiên
cứu của Wen Fei Chiou (2000) cũng cho thấy ginsenosid tổng của P. ginseng (dịch 
chiết n-butanol) gây giãn thể hang thỏ được kích thích gây co bằng phenylephrin (3
x 10-6 M) theo phương thức phụ thuộc liều từ 1 – 20 mg/ml với EC50 là 3,65 ± 0,27
mg/ml [18]. Nghiên cứu của chúng tôi tuy tiến hành trên đối tượng cơ trơn khác,
yếu tố kích thích gây co cũng như dược liệu khác nhưng cho kết quả khá tương
đồng với các nghiên cứu trên. Tuy nhiên, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở bước đầu
đánh giá định tính sơ bộ tác dụng của các phân đoạn TTH với khoảng liều hẹp.

Nghiên cứu của Jang H. A và cộng sự (2012) cho kết quả saponin của

P.ginseng gây giãn cơ trơn bàng quang và niệu đạo đoạn tiền liệt trên cả in vitro và 
in vivo [12]. Theo một nghiên cứu khác của Tamaoki J. và cộng sự (2000)

ginsenosid của P.ginseng gây giãn cơ trơn phế quản người theo phương thức phụ 
thuộc liều [39]. Tác dụng gây giãn cơ trơn của saponin cũng đã được chứng minh
qua nhiều nghiên cứu khác [18,73]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, n-butanol là
dung mơi hịa tan tương đối chọn lọc các saponin, phân đoạn n-butanol thể hiện tác
dụng gây giãn cơ trơn tốt hơn phân đoạn n-hexan và diclomethan. Như vậy, saponin
có thể là thành phần cho tác dụng gây giãn cơ trơn của TTH.

Những kết quả nghiên cứu trên cho chúng tôi những đánh giá sàng lọc ban
đầu về tác dụng TTH trên cơ trơn. Tác dụng giãn cơ trơn của TTH có thể liên quan
đến sự giải phóng NO. Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng saponin của một
số lồi thuộc chi Panax L. có tác dụng gây giãn cơ trơn thơng qua cơ chế tăng giải 
phóng NO [39,73]. Do vậy, chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của các phân
đoạn dịch chiết TTH trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và tổng hợp NO,
đồng thời để đánh giá vai trị của saponin, ngồi các phân đoạn trên thì chúng tôi
tiến hành thêm với cao giàu saponin của TTH.

3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

32

Nghiên cứu sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp
NO cho kết quả khá tương đồng với nhau. Điều này cho thấy được vai trò quan trọng
của eNOS phosphoryl hóa trong điều hịa hoạt động của eNOS và tổng hợp NO.

Theo Kim Young Mi và cộng sự (2007) dịch chiết nước của Hồng sâm Hàn
Quốc (P. ginseng) ở nồng độ 500 µg/ml có tác dụng tăng sản xuất NO so với nhóm 
chứng trên tế bào HUVEC (p < 0,01) sau 4 giờ ủ và tăng eNOS phosphoryl hóa phụ
thuộc thời gian [53]. Theo nghiên cứu của Ahn Hee Yoon (2013), tại nồng độ 150
µg/ml dịch chiết thơ EtOH 70% và dịch chiết giàu gingsenosid của P.ginseng có tác 
dụng làm tăng NO và dịch chiết giàu gingsenoside loại protopanaxatriol còn làm
tăng biểu hiện eNOS phosphoryl hóa trên TB HUVEC có ý nghĩa so với nhóm
chứng (p<0,05) sau 10 phút ủ. Nghiên cứu của chúng tơi sử dụng nồng độ thấp hơn
30 µg/ml, tuy nhiên hai nghiên cứu sử dụng dung môi chiết khác nhau, phương
pháp đo NO và thời gian ủ với dược liệu cũng khác nhau nên dẫn đến sự khác nhau
của kết quả.

Cao giàu saponin thể hiện tác dụng mạnh hơn phân đoạn tổng và các phân
đoạn khác. Theo Tamaoki J. và cộng sự (2000) ginsenosid tác dụng tăng giải phóng
NO từ mơ phế quản phụ thuộc nồng độ [39]. Nghiên cứu của Ahn Hee Yoon và
cộng sự (2013) cũng cho thấy dịch chiết giàu ginsenosid loại protopanaxatriol của

P.ginseng tác dụng tốt hơn dịch chiết thô trên sự tổng hợp NO [74]. Như vậy có thể

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42>

33

NO và eNOS đóng vai trị quan trọng trong sự giãn cơ trơn thành mạch. Kết
hợp với kết quả nghiên cứu trên cơ trơn có thể thấy cơ chế gây giãn cơ trơn của
TTH có liên quan đến sự giải phóng NO và hoạt hóa eNOS. Nghiên cứu của
Tamaoki J và cộng sự (2000) cũng đã chứng minh rằng tác dụng gây giãn cơ trơn
phế quản của ginsenosid từ P. ginseng thông qua cơ chế tăng giải phóng NO [39]. 
Theo Kim Sun Ouck và cộng sự (2008), tác dụng giãn cơ trơn âm đạo thỏ của dịch
chiết Hồng sâm Hàn Quốc có thể thơng qua nhiều cơ chế trong đó bao gồm qua trung
gian NO [42]. Những nghiên cứu này củng cố thêm giả thiết mà chúng tôi đặt ra.

Trong nghiên cứu của chúng tôi TTH thể hiện tác dụng giãn cơ trơn, tăng
giải phóng NO và biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa. Các nghiên cứu trước cho
thấy TTH có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu, kéo dài thời gian đông máu in vitro 
gợi ý tiềm năng của TTH trong điều trị các bệnh tim mạch [7,11].

3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2

Theo kết quả ở hình 3.5 và 3.6, tất cả phân đoạn TTH đều không ức chế sự
biểu hiện của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm
bằng LPS ở liều 30 µg/ml.

Chống viêm là tác dụng được nghiên cứu khá phổ biến của các loài thuộc chi

Panax L. Theo Bak Min Ji và cộng sự (2012), dầu P.ginseng được chiết bằng

phương pháp CO2 siêu tới hạn ở mức liều 10 - 100 µg/ml làm ức chế biểu hiện của

mARN và protein COX-2 trên tế bào RAW 246.7 được kích thích gây viêm bằng
LPS (p < 0,05) [57]. Theo Seo Jin Joung và cộng sự (2005), dịch chiết lên men giàu
ginsenosid Rg3 và Rh2 của P.ginseng ức chế biểu hiện protein COX-2 trên tế bào

RAW 246.7 ở mức liều 2 µg/ml; 10 µg/ml (p < 0,05) và 50 µg/ml (p < 0,001) [40].

</div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

34

khiết cịn nghiên cứu của chúng tôi dùng phân đoạn thô. Hơn nữa, hai nghiên cứu
sử dụng 2 dòng tế bào khác nhau (tế bào đại thực bào RAW 246.7 và tế bào ung thư
gan HepG2) cũng như yếu tố kích thích gây viêm khác nhau (LPS và TNF) nên dẫn
đến kết quả khác nhau.

Hạn chế của nghiên cứu

Nghiên cứu của chúng tơi cịn một số hạn chế như sau:

 Nghiên cứu tác dụng gây giãn cơ trơn của các phân đoạn Tam thất hoang cịn

mang tính chất định tính với khoảng liều hẹp và số lần lặp lại ít. Chúng tơi
mới chỉ đánh giá được trên cơ trơn cô lập của bàng quang, khí quản và thể
hang mà chưa đánh giá được trên cơ trơn thành mạch là một trong những vị
trí có liên quan đến NO nội mạc và eNOS.

 Thành phần hóa học trong các phân đoạn dịch chiết chưa được nghiên cứu

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã rút ra một số kết luận sau:

1. Phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của Tam thất hoang gây giãn cơ trơn
khí quản, cơ trơn bàng quang và cơ trơn thể hang của chuột khi kích thích
gây co bằng acetylcholin theo phương thức phụ thuộc liều, tác dụng bắt đầu
xuất hiện từ liều 1 mg/ml, giãn rõ ở liều 2 mg/ml.

2. Phân đoạn tổng và cao giàu saponin của Tam thất hoang làm tăng sản phẩm
NO và tăng sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa trên tế bào HUVEC ở
mức liều 30 µg/ml.

3. Ở liều 30 µg/ml,các phân đoạn của Tam thất hoang không ức chế biểu hiện

của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm
bằng lipopolysaccharid 1 µg/ml.

Đề xuất

Qua q trình nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau:

1. Nghiên cứu tác dụng của phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol và cao giàu
saponin Tam thất hoang trên cơ trơn thành mạch để xây dựng khoảng liều
phụ thuộc và đánh giá cơ chế gây giãn cơ trơn.

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

TÀI LIỆU THAM KHẢO 
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Trịnh Bình (2013), Mơ - Phơi, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 101-111.

[2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội, 700.

[3] Phạm Thị Minh Đức (2011), Sinh lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 173,

335-336.

[4] Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh và Miễn dịch - Phần

Sinh lý bệnh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 113-125.

[5] Trần Công Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng

dược lý của 2 loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất 
hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 8(2), 93 - 94.

[6] Trần Công Luận và cộng sự (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học của 2

lồi Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus. Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 1(14), 17-23.

[7] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các

phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất 
hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khóa

luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội.

[8] Nguyễn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí

Dược liệu, 10(3), 71-76.

[9] Nguyễn Văn Tập và cộng sự (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh

thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), 
177-180.

[10] Mai Tất Tố (2012), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, 264-274.

[11] Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017), Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của

các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam 
thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro,

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[12] Jang H. A, Cho S. et al. (2012), "The relaxant effect of ginseng saponin on
the bladder and prostatic urethra: an in vitro and in vivo study", Urol Int, 
88(4), 463-469.

[13] Wendy K. A., Chris E. C. et al. (2001), "Nitric oxide synthases: structure,
function and inhibition", Biochemical journal, 357(Pt 3), 593–615.

[14] Garg U. C., Hassid A. (1989), "Nitric oxide-generating vasodilators and

8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and

proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells", J Clin Invest, 
83(5), 1774–1777.

[15] Liang C., Ding Y. et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax
stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & medicinal

chemistry letters, 20(23), 7110-7115.

[16] Wann-Hansson C., Hallberg I. R. et al. (2005), "Healthrelated quality of life
after revascularization for peripheral arterial occlusive disease: long-term
follow-up", J Adv Nurs, 51(3), 227-235.

[17] Redmond E. M., Cahill P. A (2016), "Vascular endothelium - Gatekeeper of
vessel health", Atherosclerosis, 248, 97-109.

[18] Wen Fei Chiou, Woan Ching Jan et al. (2000), "Non major ginsenosides
contribute to the relaxation of panax ginseng in rabbit corpus cavernosum ",

J Chin Med, 11(4), 197-204.

[19] Yang Chongren, Zhidong Jiang et al. (1985), "Two new oleanolic acid-type
saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 
103-108.

[20] Choi Y. D, Xin Z. C et al. (1998), "Effect of Korean red ginseng on the
rabbit corpus cavernosal smooth muscle", Int J Impot Res, 10(1), 37-43. 
[21] Funk C. D (2001), "Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid

biology", Science, 294(5548), 1871-1875.

[22] Rudic R. D., Shesely E. G. et al. (1998), "Direct evidence for the importance
of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling", The Journal of

</div>
(47)<div class='page_container' data-page=47>

[23] Salvado M. D., Alfranca A. et al. (2012), "Prostanoids in tumor
angiogenesis: therapeutic intervention beyond COX-2", Trends Mol Med, 
18(4), 233-243.

[24] Dinh Q. N., Drummond G. R et al. (2014), "Roles of Inflammation, Oxidative
Stress, and Vascular Dysfunction in Hypertension", Biomed Res Int.

[25] John Alexander Donald (2015), "Nitric Oxide", Handbook of Hormones, 
Elsevier, 603-e103A-604.

[26] Dierk H. E., Ernesto L. S. et al. (2004), "Endothelial Dysfunction", J Am Soc

Nephrol, 15(8), 1983-1992.

[27] Galley H. F., Webster N. R. (2004), "Physiology of the endothelium", British

journal of anaesthesia, 93(1), 105-113.

[28] Linton M. F., Fazio S. (2004), "Cyclooxygenase-2 and inflammation in
atherosclerosis", Curr Opin Pharmacol, 4(2), 116-123.

[29] Mount P. F., Kemp B. E. et al. (2007), "Regulation of endothelial and
myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation", Journal of

Molecular and Cellular Cardiology, 42(2), 271-279.

[30] Michel Félétou (2011), "Multiple Functions of the Endothelial Cells", The

Endothelium - Part 1: Multiple Functions of the Endothelial Cells—Focus on 
Endothelium-Derived Vasoactive Mediators, Morgan & Claypool Life Sciences.

[31] García-Carda G., Fan R. et al. (1998), "Dynamic activation of endothelial
nitric oxide synthase by Hsp90", Nature, 392(6678), 821-824.

[32] Li S. H, Chu Y (1999), "Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax
notoginseng", Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20(6), 551-554.

[33] Aaron N. Hata., Richard M. Breyer (2004), "Pharmacology and signaling of
prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation and immune
modulation", Pharmacology & Therapeutics, 103, 147-166.

[34] Fleming I., Busse R. (2003), "Molecular mechanisms involved in the regulation
of the endothelial nitric oxide synthase", American Journal of

</div>
(48)<div class='page_container' data-page=48>

[35] Gomez I., Foudi N. et al. (2013), "The role of prostaglandin E2 in human
vascular inflammation", Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty

Acids, 89(2-3), 55-63.

[36] Clària J (2003), "Cyclooxygenase-2 Biology", Current Pharmaceutical

Design, 9(27), 2177-2190.

[37] Davignon J, Ganz P. (2004), "Role of Endothelial Dysfunction in
Atherosclerosis", Circulation, 109(23 Suppl 1), III27-32.

[38] Herrmann J., Lerman A. (2001), "The endothelium: dysfunction and
beyond", J Nucl Cardiol, 8(2), 197-206.

[39] Tamaoki J., Nakata J. et al. (2000), "Ginsenoside-induced relaxation of
human bronchial smooth muscle via release of nitric oxide", British Journal

of Pharmacology, 130(8), 1859-1864.

[40] Seo Jin Young, Lee Jun Ho et al. (2005), "Effect of a fermented ginseng
extract, BST204, on the expression of cyclooxygenase-2 in murine
macrophages", International immunopharmacology, 5(5), 929-936.

[41] Kolluru G. K., Siamwala J. H. et al. (2010), "eNOS phosphorylation in
health and disease", Biochimie, 92(9), 1186-1198.

[42] Sun‐Ouck Kim, Kim Min Kyung et al. (2008), "The effect of Korean red
ginseng extract on the relaxation response in isolated rabbit vaginal tissue
and its mechanism", The journal of sexual medicine, 5(9), 2079-2084.

[43] Zou Kun Zhu Shu Katsuko Komatsu (2002), "Analysis of Saponins of Panax
Stipuleanatus by Using HPLC andAPIMS/MS Techniques [J]", Journal of

University of Hydraulic and Electric Engineering/yichang, 4.

[44] Chen L., Yang G. et al. (2013), "Prostanoids and inflammatory pain",

Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 104, 58-66.

[45] Chun L., D. Yan et al. (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax
stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of ginseng research, 37(1), 74.

[46] Chun L., Yan Ding et al. (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus 
and Their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells", Korean Chemical

</div>
(49)<div class='page_container' data-page=49>

[47] Huang P. L., Huang Z. et al. (1995), "Hypertension in mice lacking the gene
for endothelial nitric oxide synthase", Nature, 377(6546), 239-242.

[48] Kargman S. L., et al (1995), "Expression of prostaglandin G/H synthase-1
and -2 protein in human colon cancer", Cancer Res, 55, 2556-2559.

[49] Wang J. L., Cheng H. F. et al. (2000), "A selective cyclooxygenase-2
inhibitor decreases proteinuria and retards progressive renal injury in rats",

Kidney Int, 57(6), 2334-2342.

[50] Fischer S. M., Hawk E. T. et al. (2011), "Coxibs and other nonsteroidal
antiinflammatory drugs in animal models of cancer chemoprevention",

Cancer Prev Res (Phila), 4(11), 1728-1735.

[51] Hogan M., Cerami A. et al. (1992), "Advanced glycosylation endproducts
block the antiproliferative effect of nitric oxide. Role in the vascular and
renal complications of diabetes mellitus", J Clin Invest, 199, 1110–1115.

[52] Khazaei M., Moien-Afshari F. et al. (2008), "Vascular endothelial function

in health and diseases", Pathophysiology, 15(1), 49-67.

[53] Kim Y. M., Namkoong S. et al. (2007), "Water Extract of Korean Red
Ginseng Stimulates Angiogenesis by Activating the PI3K/Akt-Dependent
ERK1/2 and eNOS Pathways in Human Umbilical Vein Endothelial Cells",

Biol. Pharm. Bull, 30(9), 1674-1679.

[54] Raval M., Frank P. G. et al. (2010), "Celecoxib combined with atorvastatin
prevents progression of atherosclerosis", J Surg Res, 163(2), e113-122. 
[55] Scherrer-Crosbie M., Ullrich R. et al. (2001), "Endothelial nitric oxide

synthase limits left ventricular remodeling after myocardial infarction in
mice", Circulation, 104(11), 1286-1291.

[56] Zeiher A. M., Fisslthaler B. et al. (1995), "Nitric oxide modulates the
expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human
endothelial cells", Circulation Research, 76(6), 980-986.

</div>
(50)<div class='page_container' data-page=50>

[58] Li Y. N., Wu Y. L. et al. (2008), "Interaction between COX-2 and iNOS
aggravates vascular lesion and antagonistic effect of ginsenoside", J

Ethnopharmacol, 119(2), 305-311.

[59] Feron O., Belhassen L. et al. (1996), "Endothelial nitric oxide synthase
targeting to caveolae. Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac

myocytes and endothelial cells", Journal of Biological Chemistry, 271 
22810–22814.

[60] Jack R., Lancaster Jr. (2015), "Nitric oxide: a brief overview of chemical
and physical properties relevant to therapeutic applications", Future

science OA, 1(1).

[61] Emanuela Ricciotti, A. FitzGerald Garret (2011), "Prostaglandins and
Inflammation", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31(5), 986–1000.

[62] A. Rios, Vargas-Robles H. et al. (2012), "Cyclooxygenase-2 and kidney
failure", Prostaglandins Other Lipid Mediat, 98(3-4), 86-90.

[63] Bakhle Y. S., Botting R. M. (1996), "Cyclooxygenase-2 and its regulation in
inflammation", Mediators of Inflammation, 5(5), 305–323.

[64] Dimmeler S., Zeiher A. M. (1996), "Nitric oxide an endothelial cell survival
factor", Cell Death Differ, 6(10), 964–968.

[65] Irie S., Tavassoli M. (1991), "Transendothelial transport of macromolecules:
The concept of tissue blood barriers", Cell Biol Rev, 25(4), 317–321.

[66] Nadaud S., Bonnardeaux A. et al. (1994), "Gene structure, polymorphism
and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene",

Biochemical and Biophysical research communications, 198(3), 1027-1033.

[67] Curtis M. Steyers, Francis J. Miller (2014), "Endothelial Dysfunction in
Chronic Inflammatory Diseases", Int J Mol Sci, 15(7), 11324–11349.

[68] Alheid U., Frölich J. C. et al. (1987), "Endothelium-derived relaxing factor
from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human
platelets", Thrombosis Research, 47(5), 561-571.

</div>
(51)<div class='page_container' data-page=51>

[70] Kenneth K. W. (2002), "Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase
Activity and Gene Expression", New York Academy of Sciences, 962(1), 122-130. 
[71] Kutchera W. et al (1996), "Prostaglandin H synthase 2 is expressed
abnormally in human colon cancer: evidence for a transcriptional effect",

Proc Natl Acad Sci USA 93(10), 4816-4280.

[72] Radomski M. W., Palmer R. M. et al. (1987), "The anti-aggregating
properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and
nitric oxide", Br J Pharmacol, 92(3), 639-646.

[73] Chen X., Lee T. J. (1995), "Ginsenosides-induced nitric oxide-mediated
relaxation of the rabbit corpus cavernosum", Br J Pharmacol, 115(1), 15-18. 
[74] Ahn H. Y, Hong S. Y et al. (2013), "Panax ginseng extract rich in

ginsenoside protopanaxatriol offers combinatorial effects in nitric oxide
production via multiple signaling pathways", Springerplus, 2(1), 96.

[75] Kang R. Y., Freire-Moar J. et al. (1996), "Expression of
cyclooxygenase-2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis", Br J

Rheumatology, 35, 711-718.

[76] Yang W. Z., Hu Y. et al. (2014), "Saponins in the genus Panax L. 
(Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity",

</div>


Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam (Panax Vietnamensis Ha Et Grushv., Araliaceae) và đinh lăng (Polyscias fruticosa (l.) Harms, Araliaceae) trên trí nhớ