ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN
PHYCOCYANIN TỪ TẢO SPIRULINA

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HCM THÁNG 07 NĂM 2013


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

TS. Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 1:

PGS.TS. Phạm Thành Quân

Cán bộ chấm nhận xét 2:

PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG TP.HCM,
ngày 29 tháng 07 năm 2013
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm :
1. PGS.TS. Phạm Thị Ánh Hồng

Chủ tịch

2. TS. Lại Quốc Đạt

Thư ký

3. PGS.TS. Phạm Thành Quân

Phản biện 1

4. PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng

Phản biện 2

5. TS. Trần Bích Lam

Ủy viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.
Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn

Bộ môn quản lý chuyên ngành

i



ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---oOo--TP. HCM, ngày 29 tháng 07 năm 2013

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Lê Thị Bích Phượng

Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 04-02-1988

Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống

MSHV: 11110211

1- TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN

PHYCOCYANIN TỪ TẢO SPIRULINA
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
 Khảo sát q trình trích ly phycocyanin có hỗ trợ sóng siêu âm.

 Khảo sát q trình tinh sạch phycocyanin.
 Tối ưu hố q trình thu nhận phycocyanin.
 Tạo chế phẩm.
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2013
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
07/2013
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
TS. Trần Bích Lam
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành
thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QL
CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

ii

KHOA QL CHUYÊN
NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ Trần Bích
Lam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo Tơi trong suốt q trình nghiên cứu và
thực hiện đề tài này.
Tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình Tơi đã ln động viên và hỗ trợ Tơi để
Tơi có điều kiện tốt nhất trong thời gian làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Bách Khoa – Đại
học Quốc gia TP. HCM, bộ môn Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống đã giảng dạy,
truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường. Cán bộ
phịng thí nghiệm cơng nghệ thực phẩm, hố sinh, vi sinh đã tạo điều kiện môi
trường thuận về phịng thí nghiệm, trang thiết bị để Tơi thực hiện luận văn.
Đồng thời,Tôi cũng cảm ơn các bạn học viên cao học khố 2011 đã cùng
cộng tác, giúp đỡ Tơi trong quá suốt trình học tập và thực hiện luận văn.

Tp. HCM, tháng 07 năm 2013
Học viên cao học
Lê Thị Bích Phượng

ii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Tảo xoắn spirulina đã được biết đến và sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và
y dược. Chất màu chủ yếu trong tảo spirulina là phycocyanin có màu xanh lam.
Phycocyanin có khả năng chống oxi hố, chống viêm, hỗ trợ điều trị ung
thư… nên phycocyanin được ứng dụng rộng rãi làm: phụ gia trong thực phẩm, thực
phẩm chức năng, dược phẩm..
Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp thu nhận phycocyanin
từ tảo spirulina cho ra các kết quả sau. Trích ly phycocyanin có hỗ trợ sóng siêu âm
cho hiệu suất trích ly tăng gấp 3 lần so với mẫu không sử dụng. Sau khi tách bã
bằng ly tâm 4000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, dịch màu trích ly được loại
protein tạp kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 10% (w/v). Tiếp tục kết tủa phycocyanin
ở điều kiện tối ưu: (NH4)2SO4 33.7% (w/v), 18 phút. Ly tâm thu tủa ở 10000
vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Thẩm tích đối nước loại tạp chất vơ cơ qua màng
celophan trong 8h. Tinh sạch dịch màu phycocyanin bằng sắc kí lọc gel sephadex
G-100 thu được phân đoạn tốt nhất A620/A280 = 4.63. Sản phẩm sau sấy phun có độ

ẩm 5.3%, tỉ lệ A620/A280 = 1.74.

ii


ABSTRACT
Spirulina is well-known for its applications both in food industry and
medicine. Its primary pigment is the blue green-colored phycocyanin.
Phycocyanin is an antioxidant, anti-inflammatory and cancer-treatment
adjuvant substance which is widely used to produced food additives, functional
foods and pharmaceautical drugs.
Here, we worked on how to get phycocyanin from spirulina. In the extraction
step, we’ve increased the extraction efficiency three-folds with the assistance of
ultrasonication. The slurry was removed by centrifugation at 4000 rpm, 4°C in 10
min. Protein impurities was removed from the extraction solution by precipitation
with (NH4)2SO4 10% (w/v). Phycocyanin was then precipitated at optimal condition
of (NH4)2SO4 33.7% (w/v) in 18 min. The precipitate was gathered by
centrifugation at 10000 rpm in 10 min at 4°C. Inorganic impurities are removed by
dialysis through celophan membrane in 8h. Phycocyanin pigment solution was
further purified by gel filtration on sephadex G-100 to achive the best segment
A620/A280 = 4.63. After spray drying, the moisture of the product is 5.3% and the
ratio of A620/A280 = 1.74.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những số liệu, kết quả trong bài luận văn này đều do Tôi
làm thực nghiệm và khảo sát ra. Các tư liệu, số liệu nào của các nghiên cứu trước
mà Tơi có sử dụng trong bài luận văn đều được trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo

rõ ràng.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước các cơ quan có thẩm quyền khi bài
luận văn của Tơi khi có khiếu nại về vi phạm bản quyền.

iv


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 1
1.1 Tổng Quan Về Tảo Spirulina ................................................................................... 1
1.1.1 Phân bố ............................................................................................................ 2
1.1.2 Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 3
1.1.3 Đặc điểm sinh sản ........................................................................................... 3
1.1.4 Đặc điểm sinh hóa .......................................................................................... 4
1.1.5 Giá trị dinh dưỡng .......................................................................................... 4
1.1.5.1 Protein .................................................................................................... 4
1.1.5.2 Lipid ....................................................................................................... 6
1.1.5.3 Carbohydrate .......................................................................................... 6
1.1.5.4 Sắc tố ...................................................................................................... 7
1.1.5.5 Vitamin ................................................................................................... 7
1.1.5.6 Khoáng chất ........................................................................................... 8
1.1.5.7 Enzyme ................................................................................................... 9
1.2 Phycocyanin trong tảo spirullina.............................................................................. 9
1.2.1 Giới thiệu về phycocyanin .............................................................................. 9
1.2.2 Cơ chế tổng hợp C-PC ................................................................................... 12
1.2.3 Sản xuất PC ................................................................................................... 13
1.2.4 Tinh sạch C-PC .............................................................................................. 14
1.2.5 Ứng dụng của C-PC....................................................................................... 14
1.2.5.1 Đầu dò huỳnh quang ............................................................................ 14
1.2.5.2 Ứng dụng trong thực phẩm ................................................................. 15

1.2.5.3 Ứng dụng trong dược phẩm ................................................................ 15
1.2.5.4 Kết luận ................................................................................................ 18
1.3 Các nghiên cứu đã công bố về thu nhận phycocyanin ........................................... 18
1.4 Trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm .............................................................................. 19
1.4.1 Một số khái niệm và tính chất của sóng siêu âm ........................................ 19
1.4.1.1 Khái niệm ............................................................................................ 19

v


1.4.1.2 Các hiệu ứng khi sóng siêu âm truyền qua hệ chất lỏng .................... 20
1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình siêu âm ............................................... 21
1.4.3 Sóng siêu âm và q trình trích ly ............................................................... 21
CHƯƠNG 2 : NGUN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 23
2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 23
2.1.1 Nguyên liệu ................................................................................................... 23
2.1.2 Hoá chất ........................................................................................................ 23
2.1.3 Thiết bị - Dụng cụ ........................................................................................ 23
2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 23
2.2.1 Sơ đồ thu nhận và nghiên cứu phycocyanin ............................................... 23
2.2.2 Khảo sát tốc độ ly tâm tách bã ..................................................................... 26
2.2.3 Khảo sát phương pháp trích ly ..................................................................... 26
2.2.4 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 để tủa protein tạp ............................. 27
2.2.5 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 để tủa phycocyanin .......................... 27
2.2.6 Khảo sát thời gian kết tủa phycocyanin ...................................................... 28
2.2.7 Tối ưu hoá quá trình kết tủa phycocyanin .................................................. 28
2.2.8 Thẩm tích dịch màu phycocyanin ............................................................... 29
2.2.9Tinh sạch phycocyanin bằng sắc kí phân đoạn ............................................ 29
2.2.10 Sấy phun tạo chế phẩm .............................................................................. 30
2.3 Sắc kí cột gel sephadex ......................................................................................... 30

2.4 Tổng quan về sấy phun .......................................................................................... 34
2.4.1 Kỹ thuật sấy phun ......................................................................................... 33
2.4.1.1 Nguyên lý làm việc ............................................................................. 34
2.4.1.2 Các giai đoạn của quá trình sấy phun ................................................ 34
2.4.2 Thiết bị sấy phun .......................................................................................... 34
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun .......................................... 35
2.4.4 Ưu nhược điểm của quá trình sấy phun ...................................................... 36
1.4.4.1 Ưu điểm ................................................................................................ 36
2.4.4.2 Nhược điểm ......................................................................................... 46
2.5 Các cơng thức tính tốn.......................................................................................... 37

vi


2.5.1 Cơng thức tính hàm lượng phycocyanin ..................................................... 37
2.5.2 Cơng thức tính độ tinh khiết của phycocyanin ........................................... 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................. 38
3.1 Nghiên cứu q trình trích ly phycocyanin ............................................................ 38
3.1.1 Nghiên cứu tốc độ ly tâm tách bã sau trích ly ............................................. 38
3.1.2 Nghiên cứu trích ly phycocyanin ................................................................. 39
3.2 Nghiên cứu quá trình tinh sạch phycocyanin ......................................................... 42
3.2.1 Nghiên cứu nồng độ muối (NH4)2SO4 để tách Protein tạp ......................... 42
3.2.2 Nghiên cứu nồng độ muối (NH4)2SO4 để tủa Phycocyanin ....................... 43
3.2.3 Nghiên cứu thời gian kết tủa phycocyanin .................................................. 45
3.2.4 Tối ưu hố q trình kết tủa Phycocyanin ................................................... 46
3.2.5 Thẩm tích loại bỏ các tạp chất vô cơ ........................................................... 50
3.2.6 Nghiên cứu tinh sạch phycocyanin bằng sắc kí cột Sephadex – G100 ...... 50
3.2.6.1 Tinh sạch phycocyanin với dung môi là đệm photphat 0.01M, pH =
6.8 ................................................................................................................................. 50
3.2.6.2 Tinh sạch phycocyanin với dung môi là nước ................................... 52

3.2.6.3 So sánh hai q trình sắc kí cột gel sephadex với dung mơi khác
nhau .............................................................................................................................. 54
3.3 Sấy phun tạo chế phẩm .......................................................................................... 55
3.4 Đề xuất quy trình thu nhận phycocyanin ............................................................... 56
3.4.1 Quy trình cơng nghệ ..................................................................................... 56
3.4.2 Thuyết minh quy trình .................................................................................. 58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 60
4.1 Kết luận .................................................................................................................. 60
4.2 Kiến nghị ................................................................................................................ 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỤC LỤC

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của phycocyanin ............................................................ 10
Hình 1.2: cấu trúc của phycocyanin bilin chromophore (a) và bilirubin (b). ............. 10
Hình 1.3: So sánh mối tương quan của bilirubin và phycocyanorubin ........................ 11
Hình 1.4: Cấu trúc α, β - dimer phycocyanin từ Spirulina platensis.......................... 12
Hình 2.1: Sơ đồ thu nhận phycocyannin. .................................................................... 24
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu thu nhận phycocyannin ................................................... 25
Hình 2.3: Mơ hình của q trình sắc kí cột gel ............................................................ 30
Hình 2.4: Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc kí lọc gel sephadex ................. 33
Hình 2.5: Hoạt động rây phân tử của gel sephadex ..................................................... 33
Hình 2.7: Hệ thống sấy phun MOBILE MINOR dùng trong nghiên cứu .................. 35
Hình 3.1: Đồ thị khảo sát tốc độ ly tâm tách bã sau khi trích ly .................................. 39
Hình 3.2: Tác dụng của siêu âm lên q trình trích ly phycocyanin và protein .......... 40
Hình 3.3: Ảnh hưởng của sóng siêu âm lên độ sạch của dịch trích phycocyanin........ 40
Hình 3.4: Độ sạch của dịch phycocyanin sau khi tách protein tạp ............................. 42

Hình 3.5: Ảnh hưởng nồng độ muối (NH4)2SO4 (w/v) để kết tủa Phycocyanin........ 44
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian đến sự kết tủa phycocyanin ................................. 45
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy trên hệ trục khơng gian phẳng và
ba chiều ........................................................................................................................ 49
Hình 3.8: Khảo sát quá trình sắc kí cột sephdex G-100 với dung mơi là đệm ............ 51
Hình 3.9: Độ tinh khiết của phycocyanin sau quá trình sắc kí cột sephadex G-100
với dung mơi là đệm..................................................................................................... 52
Hình 3.10: Khảo sát q trình sắc kí cột sephdex G-100 với dung mơi là nước ......... 53
Hình 3.11: Độ tinh khiết của phycocyanin sau q trình sắc kí cột sephadex G-100
với dung mơi là nước ................................................................................................... 54
Hình 3.12: Quy trình trích ly phycocyanin có hỗ trợ bằng siêu âm ............................. 56
Hình 3.13 : Quy trình tinh sạch và tạo chế phẩm phycocyanin. ................................. 57

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần acid amin trong Spirulina .......................................................... 5
Bảng 1.2: Hàm lượng sắc tố tự nhiên trong sinh khối Spirulina platensis .................... 7
Bảng 1.3: Thành phần các vitamin trong Spirulina ....................................................... 8
Bảng 1.4: Thành phần các khoáng trong Spirulina ........................................................ 8
Bảng 1.5: Các loài tảo và điều kiện nuôi cấy sản xuất ra phycocyanin ...................... 13
Bảng 1.6: Thuộc tính chống oxy hóa của Phycocyanin thể hiện qua nghiên cứu
trong ống nghiệm ......................................................................................................... 17
Bảng 1.7 : Vai trò của phycocyanin trong điều trị một số bệnh ................................ . 17
Bảng 1.8: Tóm tắt một số kết quả siêu âm hỗ trợ q trình trích ly ............................ 22
Bảng 2.1: Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 23
Bảng 2.2: Trọng lượng các chất đi qua được các loại sephadex khác nhau. ............... 32
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tốc độ ly tâm tách bã sau trích ly ..................................... 38
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu trích ly phycocyanin có sử dụng sóng siêu âm ........... 40

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 để tách Protein tạp.................. 42
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 để tủa Phycocyanin ................ 44
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát thời gian kết tủa phycocyanin .......................................... 45
Bảng 3.6: Giá trị tâm và bước nhảy của các yếu tố thí nghiệm ................................... 46
Bảng 3.7: Xây dựng phương trình hồi quy trong tối ưu hóa (với X1, X2 là biến mã
hóa của các biến X1, X2 tương ứng) ........................................................................... 47
Bảng 3.8: Kết quả các giá trị trong phương trình hồi quy ........................................... 48
Bảng 3.9: Kết quả tinh sạch phycocyanin với dung môi là đệm photphat .................. 50
Bảng 3.10: Kết quả tinh sạch phycocyanin với dung môi là nước .............................. 52

ix


1
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng Quan Về Tảo Spirulina
Spirulina là vi sinh vật cổ đã từng xuất hiện từ cách đây khoảng 3,5 tỷ
năm. Chúng có lịch sử lâu đời hơn tảo nhân thực hoặc thực vật bậc cao tới
hơn 1 tỷ năm. (Lê Văn Lăng, 2003).
Với sự phát triển của khoa học công nghệ và cuộc cách mạng xanh, Bernal
Díaz del Castillo, một thành viên của nhóm Hernán Cortez, đã ni trồng thành
cơng lồi Spirulina maxima ở hồ Texcoco, thu sản phẩm khô và bán cho người sử
dụng ở chợ Tenochtitlán (nay thuộc thành phố Mexico). Dân bản địa đã đặt tên cho
sản phẩm này là Tecuitlalt. (Hoàng Nghĩa Sơn, 2000)
Vào năm 1827, dựa trên hình thái đặc trưng nhất là dạng sợi xoắn ốc với
khoảng 5 - 7 vịng đều nhau khơng phân nhánh, nhà tảo học người Đức - Deurben
đã đặt ra tên gọi Spirulina (gốc từ Latin và Anh ngữ “Spiral” có nghĩa là “xoắn”).
Năm 1940, một báo cáo khoa học của nhà thực vật học người Pháp Dangeard về một loại nguyên liệu là “Dihé” được người Kanembu sống gần hồ

Tchad sử dụng làm thức ăn. Tuy nhiên, bài báo này không được chú ý đến. (Belay
A, 2004)
Vào năm 1960, tiến sĩ Clement - người Pháp, tình cờ phát hiện lồi này khi
đến hồ Tchad ở Trung Phi. Khi Clement tìm hiểu về thức ăn của những thổ dân, bà
phát hiện trong mùa không săn bắn, họ chỉ dùng một loại bánh màu xanh mà
nguyên liệu chính là thứ họ vớt lên từ hồ. Qua phân tích, bà phát hiện ra loại bánh
có tên “Dihé” chính là sinh khối Spirulina. (Harald W, 2004).
Năm 1967, Spirulina được đánh giá là “wonderful furture food soure” tại hội
nghị quốc tế về ứng dụng vi sinh vật. Những phân tích ban đầu cho thấy protein
chiếm 60-70% trọng lượng khơ của Spirulina, protein này có hàm lượng acid amin
thiết yếu cân đối. Từ những kết quả trên, nhiều kế hoạch nghiên cứu cho mục đích
cơng nghiệp đã được thực hiện.
Cũng thời gian trên, Institut francais du pétrole thực hiện một luận án nghiên
cứu cụ thể và có hệ thống về loài tảo tươi xuất hiện trong bể bốc hơi của cơ sở sản
xuất sodium bicarbonat thuộc công ty Sosa-texcoco Ltd, cơng việc nghiên cứu này

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


2
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

được thực hiện bởi Zarrouk. Những kết quả nghiên cứu đạt được là cơ sở cho đánh
giá ban đầu về nuôi Spirulina ở quy mô lớn.
Kể từ năm 1970, những nghiên cứu về dinh dưỡng của Spirulina đã tăng lên
nhanh chóng. Spirulina đã được biết đến và sử dụng rộng rãi như một thành phần bổ
sung trong chế độ ăn uống ở một số nước. Tại Hoa Kỳ, NASA đã chọn nó như
nguồn thực phẩm cần thiết cho các phi hành gia trong khơng gian.

Năm 1973, FAO và WHO đã chính thức công nhận Spirulina là nguồn dinh
dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa.
Cho đến nay, rất nhiều nước trên thế giới sản xuất và sử dụng sinh khối
Spirulina làm thực phẩm cho người. Nhiều tổ chức sức khỏe, tổ chức xã hội ở nhiều
nước trên thế giới công nhận Spirulina là thức ăn bổ dưỡng và là thực phẩm của
tương lai.
Spirulina thuộc loại vi khuẩn đa bào, trong đó có khoảng 36 lồi con
người có thể sử dụng được và hai lồi quan trọng nhất là S. maxima hay S.
geitleri có nguồn gốc từ Châu Phi và S. Platensis có nguồn gốc từ Nam Mỹ.
Ở Việt Nam, giống được nghiên cứu đầu tiên, lưu giữ ở Viện Công Nghệ
Sinh Học là S. platensis do Pháp cung cấp. (Vonshak A, 2007).
Loài Spirulina platensis thuộc:
Ngành: Cyanophyta
Lớp: Cyanophyceae
Bộ: Oscillatoriales
Họ: Oscillatoriaceae
Giống: Spirulina
1.1.1 Phân bố
Spirulina được tìm thấy ở đất, đầm lầy, ao, hồ, sơng, biển. Chúng sống đơn
độc hay kết thành đám trên mặt nước. Mơi trường có độ kiềm cao rất thích hợp
cho việc sản xuất Spirulina, nhất là những nơi nhiều ánh sáng mặt trời, vùng cao so
với mực nước biển và có khí hậu nhiệt đới.
Ngồi ra, chúng có thể sống ở môi trường độc hại như nước thải hay
nước ô nhiễm. Chúng sinh sống trong mơi trường có độ mặn và kiềm khá cao

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam



3
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

do đó các lồi vi sinh vật khác khó có thể sống chung.
Do đặc tính của chúng là sinh vật quang hợp vì thế chúng sống thích hợp ở
những nơi có nhiều ánh sáng và nhiệt độ khá cao. (Lê Văn Lăng, 2003).
Về địa lý, Spirulina được tìm thấy ở phạm vi rất rộng: châu Phi (Ethiopia,
Kenya, Nam Phi, Ai Cập), châu Mỹ (Hoa Kỳ, Peru, Mehico), châu Á (Ấn Độ,
Việt Nam), châu Âu (Nga, Ukraina, Hungary). Từng vùng lại có những loài,
giống Spirulina khác nhau, hoặc một loài như Spirulina platensis lại được tìm
thấy ở nhiều nước có khi rất xa nhau. Sự phân bố này có thể do chọn lọc tự nhiên,
do con người chủ động di thực nuôi trồng, cũng có thể do được di thực theo một
số loài chim di trú mà loài hồng lạc (Phoenicoraiasmiror) thường ăn Spirulina ở
châu Mỹ là ví dụ điển hình. (Hồng Nghĩa Sơn, 2000).
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Trong các hồ tự nhiên hay nhân tạo có Spirulina sinh sống thì với mắt
thường có thể nhận thấy nước có màu xanh lục hay xanh lam.
Hình dạng của Spirulina chỉ thấy rõ khi quan sát dưới kính hiển vi. Đó
là những sợi có màu xanh, xoắn kiểu lò xo, với các vòng xoắn khá đều nhau, số
vòng xoắn lớn nhất là 6 đến 8 vịng. Đường kính xoắn khoảng 35 – 50 µm, bước
xoắn 60 µm, chiều dài thay đổi có thể đạt 250 µm.
Spirulina là m ộ t lồi trong họ Phormidiaceae, nghĩa là chúng có khả
năng di chuyển tiến về phía trước hoặc phía sau. Di chuyển này được thực
hiện bởi các lơng ở sườn bên cơ thể chính là các sợi có đường kính 5-7 nm và
dài 1-2 µm nằm quanh cơ thể. Các lông này hoạt động như tay chèo giúp cho
chúng chuyển động. (Phan Văn Dân, 2009).
Tùy điều kiện mơi trường mà hình dạng Spirulina có thể xoắn kiểu chữ
C, S... Sợi Spirulina khơng phân nhánh, khơng có bao và khơng có dị bào. Các
dạng này có chiều dài rất thay đổi, ngay trong một dạng, chiều dài mỗi sợi cũng
khác nhau. Dạng xoắn thường giữ được trong phịng nghiên cứu, sang mơi

trường ni đại trà, nó thường biến thành dạng thẳng. (Robert Henrikson, 2009).
1.1.3 Đặc điểm sinh sản
Spirulina sinh sản theo hình thức tảo đoạn. Tảo đoạn là những đoạn tảo

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


4
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

dược hình thành từ cơ thể mẹ, có kích thước khác nhau, từ 2, 3 tế bào đến nhiều
hơn, có khả năng chuyển động tích cực nhờ trượt trên giá thể do tiết ra chất nhầy.
Spirulina đứt ra nhiều đoạn ngắn, cử động được (trượt), rời cơ thể mẹ và
mọc thành sợi khác. Nhờ cử động trượt mà tảo đoạn lan truyền rất xa.
Cơ quan làm gãy và làm rời tảo đoạn ấy là:
-

Gian bào (disjoncteur): một hay hai tế bào gần nhau hóa nhầy, tế bào

bên cạnh nhờ vậy tách ra dễ dàng, phát triển thành cơ thể mới.
-

Hoại bào (nescridie): tế bào trở nên vàng và vách ngăn của chúng

lõm xuống. Tế bào ấy dần dần tan đi và giúp cơ thể tách thành 2 đoạn rời nhau.
Theo Boussiba (1989) các đoạn tảo con, sau khi tách rời nhau, trượt khỏi cơ
thể mẹ bắt đầu gia tăng bởi sự phân chia tế bào. Qua quá trình này, các sợi kéo dài
tới mức trưởng thành và có dạng xoắn kiểu mẫu.

Vòng đời của Spirulina đơn giản, chúng phát triển trong điều kiện tối ưu thì
1 ngày cịn trong điều kiện tự nhiên thì từ 3 đến 5 ngày. (Nguyễn Lân Dũng, 2007).
1.1.4 Đặc điểm sinh hóa
Spirulina thuộc nhóm vi khuẩn lam, có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ
chứa sắc tố quang hợp là chất diệp lục a. Quá trình quang hợp của Spirulina là
q trình phosphoryl hóa quang hợp phi tuần hồn có giải phóng oxi như ở
cây xanh. (Nguyễn Lân Dũng, 2007).
1.1.5 Giá trị dinh dưỡng
Những nghiên cứu cho thấy Spirulina là nguồn dinh dưỡng hoàn hảo cho
con người với đặc điểm nổi bật là hàm lượng protein rất cao, cung cấp đầy đủ các
acid amin thiết yếu, hàm lượng β – carotene cao hơn gấp nhiều lần so với các
thực phẩm khác. Spirulina là nguồn thức ăn tốt nhất chứa acid gamma linolenic
(GLA), giàu vitamin B, khoáng chất, nguyên tố vi lượng, chlorophyl và các
enzyme. (Robert Henrikson, 2009 ; Jacques Falquet, 2008).
1.1.5.1 Protein
Hàm lượng protein trong Spirulina chiếm 50-70% khối lượng chất khô.
Hàm lượng protein này thấp hơn 5-10% tùy vào thời gian thu hoạch và môi
trường sống. Giá trị cao nhất thường đạt được khi thu hoạch vào buổi sáng sớm

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


5
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

của ngày nắng.
Hàm lượng protein trong Spirulina cao hơn bất kì một loại thực phẩm nào
khác: thịt động vật và cá tươi (15-25% khối lượng tươi), đậu nành (35% khối

lượng khô), sữa bột (35% khối lượng khô), trứng (12% khối lượng tươi), đậu
phộng (25% khối lượng khô).
Theo quan điểm chất lượng thì protein của Spirulina là hồn hảo vì sự hiện
diện đầy đủ và cân đối của tất cả các acid amin thiết yếu và không thiết yếu.
Thành phần của các acid min này được thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Thành phần acid amin trong Spirulina
mg/1g

Tỉ lệ so với tổng số acid amin (%)

Isoleucine

35

5.6

Leucine

54

8.7

Lysine

29

4.7

Methionine


14

2.3

Phenylalanine

28

4.5

Threonine

32

5.2

Tryptophan

9

1.5

Valine

40

6.5

Alanine


47

7.6

Arginine

43

6.9

Acid aspartic

61

9.8

Cystine

9

1,0

Acid glutamic

91

4.6

Glycine


32

5.2

Histidine

10

1.6

Proline

27

4.3

Tyrosine

30

4.8

Acid amin
Acid amin thiết yếu

Acid amin khơng thiết yếu

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam



6
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

1.1.5.2 Lipid
Lipid chiếm 5-7% khối lượng khô của Spirulina. Một số tác giả cho rằng
lượng lipid có thể nhiều hơn (10-11%) nếu được xác định bằng các thiết bị tốt
hơn và phương pháp chính xác. Lượng lipid này được chia thành 2 nhóm chính:
- Nhóm các lipid có thể xà phịng hóa: gồm chủ yếu monogalactosyl và
digalactosyl diglyceride (23%), sulfoquinovosyl diglyceride (5%), phosphatidyl
glycerol (25,9%), triglyceride (0,3%), các loại phospholipid (chiếm hơn 4,6%).
Phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamin và phosphatidyl inositol chỉ ở
mức không đáng kể.
Các sulfolipid như sulfoquinovosyl diglyceride đang trở thành vấn đề
nghiên cứu mới hiện nay do khả năng kháng lại virus HIV nhiễm các tế bào T trợ
giúp.
- Nhóm các lipid khơng xà phịng hóa được: gồm chủ yếu là paraffin, các sắc
tố, các sterol và các terpene. Các sterol đã được xác định là cholesterol và betasitosterol.
1.1.5.3 Carbohydrate
Nhìn chung, carbohydrate chiếm 15-25% khối lượng chất khô của
Spirulina. Những carbohydrate đơn giản như glucose, fructose và sucrose chỉ có
mặt một lượng rất nhỏ. Các polyol như glycerol, mannitol và sorbitol cũng được
tìm thấy.
Những carbohydrate dạng polymer có thể tiêu hóa được gồm glucosamine
(1,9% lượng chất khô), rhamnosamine (9,7%) và glycogen (0,5%).
Carbohydrate trong Spirulina dễ dàng hấp thụ vào máu và chỉ cần một
lượng nhỏ insuline để chuyển hóa. Nhờ giải phóng năng lượng nhanh mà khơng
cần hoạt động của tuyến tụy nên Spirulina là thức ăn bổ dưỡng phù hợp cho
người bị bệnh tiểu đường.

Mesoinositol phosphate là carbohydrate chứa phosphorus nên Spirulina sẽ
là nguồn cung cấp phospho hữu cơ ưu việt. Trong sinh khối Spirulina cũng có
inositol (350-380 mg/kg khối lượng khô), hàm lượng này cao gấp 8 lần trong thịt
bị và vài trăm lần trong loại rau có mức inositol cao nhất.

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


7
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

Đáng chú ý là polysaccharide trong Spirulina đã được khẳng định là có tác
động kích thích cơ chế sửa chữa ADN, nhờ vậy có thể giải thích cho chức năng
bảo vệ đối với ảnh hưởng của bức xạ mặt trời của Spirulina.
1.1.5.4 Sắc tố
Sắc tố là yếu tố rất quan trọng giúp tổng hợp các loại hormon cần thiết để
điều khiển các hoạt động của cơ thể. Hàm lượng sắc tố trong sinh khối Spirulina
platensis rất cao, được thể hiện trong bảng sau.
Bảng 1.2: Hàm lượng sắc tố tự nhiên trong sinh khối Spirulina platensis
Sắc tố

mg/ g tảo khô

Phycocyanin

140

Chlorophyll


10

Carotenoids

3.7

. Carotenes

2

Beta-caroten

1.7

Các caroten khác

0.3

. Xanthophylls

1.7

Myxoxanthophylls

0.7

Zeaxanthin

0.6


Cryptoxanthin

0.1

Echienone

0.1

Các xanthophyll khác

0.2

Phycocyanin là sắc tố đóng vai trị quan trọng trong sinh khối Spirulina
platensis và tồn tại dưới dạng một protein phức hợp. Trong phycocyanin có cả
nguyên tố Fe và Mg vì vậy nó rất có ý nghĩa dinh dưỡng ở người có nhu cầu bổ
sung các loại khoáng này.
1.1.5.5 Vitamin
Spirulina rất giàu các vitamin. Một lượng 10g sinh khối Spirulina cung cấp
một lượng lớn vitamin cần thiết cho sự sống hằng ngày của chúng ta.
Thành phần các vitamin trong Spirulina được thể hiện trong bảng 1.3

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


8
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina


Bảng 1.3: Thành phần các vitamin trong Spirulina
Vitamin

Khối lượng (mg/1g)

Vitamin A (betacaroten)

1.7 mg

Vitamin E (α-tocopherol)

0.1 IU

Vitamin K

20 mcg

Vitamin B1

0.035 mg

Vitamin B2

0.040 mg

Vitamin B3

0.14 mg

Vitamin B6


8 mcg

Vitamin B12

2 mcg

Acid folic

0.1 mcg

Biotin

0.05 mcg

Acid panthothenic

1 mcg

Inositol

0.64 mg

1.1.5.6 Khoáng chất
Spirulina chứa nhiều nguyên tố khoáng có ý nghĩa dinh dưỡng đối với người.
Thành phần các khoáng được thể hiện trong bảng 1.4
Hàm lượng rất cao của sắt trong Spirulina đặc biệt có ý nghĩa vì tình trạng
thiếu máu do thiết sắt rất phổ biến hiện nay, đặc biệt là ở phụ nữ mang thai và trẻ
em. Sắt rất cần thiết cho sự hình thành các tế bào máu và hệ miễn dịch.
Bảng 1.4: Thành phần các khoáng trong Spirulina

Khoáng

Khối lượng (mg/1g)

Canxi

7 mg

Sắt

1 mg

Phospho

8 mg

Magie

4 mg

Kẽm

30 mcg

Selen

1 mcg

HVCH: Lê Thị Bích Phượng


GVHD: TS. Trần Bích Lam


9
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

Đồng

12 mcg

Mangan

50 mcg

Crom

2.5 mcg

Natri

9 mg

Kali

14 mg

1.1.5.7 Enzyme
Trong sinh khối Spirulina có một số các enzyme, trong số đó quan trọng
nhất là enzyme superoxide dismutase (SOD). Nó xúc tác khử các sản phẩm của
phản ứng peroxide hóa và loại thải các yếu tố thúc đẩy q trình lão hóa cơ thể

sống. Trong 10g Spirulina có từ 10000 đến 37000 đơn vị hoạt động của SOD.
1.2 Phycocyanin trong tảo spirullina
1.2.1 Giới thiệu về phycocyanin (Niels, 2008)
Phycobiliprotein là một nhóm nhỏ của chromoproteins để tạo thành
phycobilisome, đây là một phức hợp protein có chức năng chính thu nhận ánh sáng
để quang hợp. Phycobiliprotein là loại protein có nhiều nhất trong hợp chất màu lam
của các loại vi tảo, phycobiliprotein khơng đóng vai trị thiết yếu trong hoạt động
sống của tế bào nhưng khi tế bào thiếu nitơ thì Phycobiliprotein là chất thay thế cần
thiết để cung cấp nitơ cho tế bào.
Thành phần chính của phycobiliproteins bao gồm: allophycocyanin,
phycocyanin và phycoerythrin. Tất cả đều là các đồng phân của α, β protein . Các
chất này khác nhau về vị trí sắp xếp liên kết đơi, vị trí gắn của các nhóm màu. Các
nhóm mang màu được gắn vào polypeptide thông qua các mối liên kết thioether,
cysteinyl .
Phycocyanin

mà chỉ mang một loại nhóm màu phycocyanobilin

chromophores được gọi là C- phycocyanin (C-PC).
Phycocyanin là sắc tố màu xanh lam, có cấu tạo gồm 2 tiểu phần α, β protein
có khối lượng lần lượt là 17000 và 19500 Da. Các nhóm mang màu được gắn vào
một vị trí ở α 84, và hai vị trí ở β 84, β 155 . (Sun et al, 2003).

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


10
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina


Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của phycocyanin

Hình 1.2: cấu trúc của phycocyaninbilin chromophore (a) và bilirubin (b).
Cấu trúc hóa học của nhóm mang màu chromophorebilin trong PC tương tự
như bilirubin. Bilirubin được coi là một chất chống oxy hóa quan trọng trong cơ thể
sống. nó ức chế và sửa đổi các q trình oxy hóa của protein huyết tương và amino
acid thơm. Bilirubin đã được cơng nhận có khả năng bắt các gốc tự do để bảo vệ
albumin huyết thanh cũng như các mục tiêu sinh học khác.

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


11
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

Hình 1.3: So sánh mối tương quan của bilirubin và phycocyanorubin
Phycocyanorubin được xem như một chất chống oxy hóa trong cơ thể giống
như bilirubin là một chất chống oxy hóa tự nhiên trong huyết tương. Bilirubin được
tổng hợp từ biliverdin nhờ enzyme biliverdin reductase làm giảm liên kết đôi giữa
các nguyên tử carbon 10 và 11 sử dụng NADPH làm chất trợ điện tử. Bilirubin sau
khi oxi hoá các gốc tự do thì chuyển về thành biliverdin.
Trong khi đó ở cyanobacteria, phycocyanobilin cũng được tổng hợp từ
biliverdin: enzyme ferredoxin oxidoreductase (PcyA) cùng với ferredoxin (Fd) xúc
tác phản ứng chuyển hoá biliverdin thành phycocyanobilin. Sau đó tương tự như
trên enzyme biliverdin reductase và NADPH làm chất trợ điện tử để chuyển
phycocyanobilin thành phycocyanorubin. Phycocyanorubin Bilirubin sau khi oxi
hoá các gốc tự do thì chuyển về thành phycocyanobilin.

Trong phân tử PC chủ yếu là các chuỗi xoắn α và có cấu trúc bậc 3 giống
như các sinh vật khác,ngoài ra trong phân tử PC cịn có 2 loại monomers liên kết
kiểu αβ là α3β3 và α6β6 cả hai đều là các đơn vị chức năng của PC.

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


12
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

Hình 1.4: Cấu trúc α, β - dimer phycocyanin từ Spirulina platensis
Phycocyanin tan trong nước, có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh, có khả
năng chống oxi hố.
Bước sóng hấp thu cực đại của các chất trong phycobiliprotein:
phycoerythrin hấp thu cực đại ở 565nm, phycocyanin ở 620nm, allophycocyanin ở
650nm . Ở các bước sóng này độ hấp thu của chlorophyll thấp nhất. Sự hấp thu cực
đại ánh sáng ở các bước sóng khác nhau là do có các liên kết đơi trong
chromophores. Phycoerythrobilin có 6 liên kết đơi nên có bước sóng hấp thu thấp
hơn so với phycocyanobilin có 8 liên kết đôi.
1.2.2 Cơ chế tổng hợp C-PC
Cyanobacteria mang 2 loại gen cpcA và cpcB mã hoá cho hai chuỗi xoắn α, β
trong C-PC. Cả 2 gen này có cùng operon cpc được phiên mã cùng một loại mRAN.
Gen mã hóa cho các các liên kết protein, enzym tham gia tổng hợp
phycobilin và phycobiliproteins thường là gen hình thành trực tiếp liền kề nhau ở
cpc operon. Trong Arthrospira platensis cũng có loại gen này để tổng hợp C- PC.
Liu và các cộng sự. (2005) đã tìm thấy bốn promoter giải trình tự 427- bp
của gen cpcB trong A. Platensis. Trong khi đó nghiên cứu của Guo et al. (2007) cho
rằng có sáu promoter giải trình tự trong gen này. Và ít nhất bốn trong số này

có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây khi cấy chuyển vào vi khuẩn E. coli.
Phycocyanobilin được tổng hợp từ heme và gắn vào phần apo-protein của
phycocyanin sau ba bước chuyển hoá bằng enzyme (Cornejo and Beale, 2007 ;
Tooley et al. 2001 ).
HVCH: Lê Thị Bích Phượng

GVHD: TS. Trần Bích Lam


13
Nghiên cứu phương pháp thu nhận Phycocyanin từ tảo Spirulina

Đầu tiên vịng heme được oxy hố thành dạng thẳng biliverdin IX α nhờ xúc
tác của enzyme heme oxygenase và tiếp tục chuyển đổi sang 3Z-phycocyanobilin, là
một dạng đồng phân của phycocyanobilin, bởi enzyme ferredoxin oxidoreductase.
Sau đó enzyme phycocyanobilin lyase xúc tác cho quá trình gắn 3Zphycocyanobilin vào apo-protein của C-PC thơng qua hình thành liên kết thioether.
Trong tảo xanh và tảo đỏ các promoter giải trình tự các phản ứng ở operon
cpc đã điều chỉnh khả năng tổng hợp C-PC phù hợp với nhiều điều kiện môi trường.
Biểu hiện của các gen cpcA và cpcB phụ thuộc bởi ánh sáng. (Lu and Zhang, 2005 )
Cường độ ánh sáng thấp kích thích tổng hợp PC và các hợp chất màu khác,
cường độ ánh sáng cao giảm khả năng tổng hợp các chất màu. Ngoài ra nhiệt độ
cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các loại chất màu, đối với C-PC và APC thì ở
36oC được tổng hợp với hàm lượng cao nhất.
1.2.3 Sản xuất PC
Phycocyanin được sản xuất chủ yếu từ các loại vi tảo như sau. (Belay, 2004).
Bảng 1.5: Các lồi tảo và điều kiện ni cấy sản xuất ra phycocyanin
Lồi

Kiểu ni cấy


Px,max
-1

YC-

PC-PC
-2

-1

-2

PC/x

gL
day-1

gm
day-1

gL
day-1

gm
day-1

g g-1

Tự dưỡng
ni cấy liên

tục
S. platensis

Raceway

0.05

14

0.003

0.85

0.061

A. platensis

Raceway

0.15

12.2

0.01

0.82

0.067

A. platensis


Raceway/panel

0.32

19.4

0.024

1.43

0.074

Anabaena sp

Raceway

0.24

23.5

0.013

1.32

0.056

nuôi cấy
gián đoạn
A. platensis


Tubular reactor

1.32

47.7

0.092

3.33

0.07

A. platensis

Bubble column

0.91

_

0.064

_

0.07

S. platensis

Alveolar panel


1.26

15.8

0.089

1.11

0.07

HVCH: Lê Thị Bích Phượng

Jiménez et al.
(2003 )
Pushparaj et al.
(2007 )
Pushparaj et al.
(2007 )
Moreno et al.
(2003 )

Carlozzi (2003 )
Zitelli et al.
(2006 )
Tredici et al.
(2008 )

GVHD: TS. Trần Bích Lam