ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHẠM PHƯƠNG ĐIỀN
PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN
TRÀ KOMBUCHA
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số : 60420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số : 60420201
PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN
TRÀ KOMBUCHA
Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương
Học viên thực hiện: Phạm Phương Điền – MSHV: 1570254
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018
CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP.
HCM ngày 12 tháng 01 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
2. PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
3. TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
4. TS. VÕ ĐÌNH LỆ TÂM
5. TS. HUỲNH NGỌC OANH
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
TRƯỞNG KHOA…………
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Phạm Phương Điền
MSHV:1570254
Ngày, tháng, năm sinh: 02/12/1982
Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số : 60420201
I. TÊN ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH HỆ VI SINH VẬT LÊN MEN TRÀ KOMBUCHA
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn, định danh hệ vi sinh vật chính lên men trà Kombucha nhằm
làm tiền đề cho lên men công nghiệp.
2. Nội dung nghiên cứu
-
Phân lập và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống.
-
Phân tích và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp PCR-DGGE.
-
So sánh kết quả của hai phương pháp và tuyển chọn giống vi sinh vật.
-
Xây dựng lý lịch bộ giống sau định danh.
-
Lưu trữ và bảo quản bộ giống
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 16/01/2017
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/12/2017
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Tp. HCM, ngày 18 tháng 12 năm 2017
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)
TRƯỞNG KHOA….………
(Họ tên và chữ ký)
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn và sự biết ơn
chân thành, sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thúy Hương. Người đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi, động viên, hướng dẫn sâu sát và giúp đỡ em hoàn thành luận
văn.
Xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy, Cơ trong Bộ môn Công nghệ Sinh
học trường Đại Học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh
nghiệm quý báu; tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành luận văn và chương
trình học này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các em: Ánh, Ngọc Anh, Hậu, Nhân,
Ngọc đã giúp đỡ, động viên anh trong quá trình học và thực hiện luận văn tốt
nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017
Học viên
Phạm Phương Điền
i
TĨM TẮT
Trà lên men Kombucha đã được chứng minh có nhiều ích lợi cho sức khỏe con
người nhờ chứa nhiều hoạt tính sinh học q. Tuy nhiên, vẫn cịn nhiều hạn chế
trong quá trình lên men loại trà này, như: chưa sản xuất ở quy mô công nghiệp, dễ
tạp nhiễm dẫn đến hư hỏng sản phẩm trong quá trình lên men truyền thống; chưa
chủ động được nguồn giống vi sinh vật nên chất lượng không đồng nhất giữa các
lần lên men. Q trình lên men trà Kombucha có sự xuất hiện của nhiều nhóm vi
sinh vật. Thế nhưng, khơng phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều có lợi trong q
trình lên men. Do đó, nghiên cứu tiến hành phân lập, định danh hệ vi sinh vật lên
men có trong trà Kombucha bằng phương pháp truyền thống và hiện đại PCRDGGE là cần thiết nhằm tạo tiền đề quan trọng cho lên men công nghiệp và xây
dựng được lý lịch bộ giống vi sinh vật, bảo quản giống cho các nghiên cứu liên
quan khác. Qua kết quả nghiên cứu, mặc dù có những sự khác biệt về hệ vi sinh vật,
song, cả hai phương pháp vẫn thể hiện sự thống nhất cao. Kết quả nghiên cứu cho
thấy có sự hiện diện của các chủng nấm men: Brettanomyces bruxellensis, Candida
tropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae. Các chủng vi khuẩn
acetic: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata, Acetobacter
tropicalis và các chủng vi khuẩn lactic: Enterococcus faecium, Lactobacillus
pentosus.
ii
ABSTRACT
Kombucha tea has been shown to be beneficial for human thank to its rich bioactive
properties. However, there are still many restrictions on the fermentation process of
this tea, such as: not produced on industrial scale, susceptible to contamination and
damage to the product in the traditional fermentation; not active in control the
source of microorganism so the quality is not uniform between fermentations. There
are many groups of microorganisms appear during the fermentation of Kombucha
tea. However, not all of them are good. Therefore, the study of isolation and
identification of fermentation microorganisms in Kombucha tea using traditional
and modern methods of PCR-DGGE is necessary to create an important premise for
industrial fermentation, construction a biography of microorganisms and
preservation them for other related research. Based on the results, although there are
differences in the microbial population, both methods still show high consistency.
Research results show that the presence of yeast strains: Brettanomyces
bruxellensis, Candida tropicalis, Dekkera bruxellensis, Saccharomyces cerevisiae.
Acetic acid bacteria: Komagataeibacter nataicola, Pseudomonas geniculata,
Acetobacter tropicalis and lactic acid bacteria: Enterococcus faecium, Lactobacillus
pentosus.
iii
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa
từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào trước đây.
Người nghiên cứu
Phạm Phương Điền
iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3
1.1. Tổng quan về trà Kombucha ............................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 3
1.1.2. Hệ vi sinh vật trong trà Kombucha ................................................................... 4
1.1.2.1. Nấm men trong trà Kombucha ....................................................................... 5
1.1.2.2. Vi khuẩn acetic trong trà Kombucha ............................................................. 7
1.1.2.3. Vi khuẩn lactic trong trà Kombucha .............................................................. 8
1.1.3. Thành phần hóa học của trà Kombucha ........................................................... 8
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men trà Kombucha ................................... 10
1.1.5. Các hoạt tính sinh học quý và cơng dụng của trà Kombucha ........................ 13
1.1.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................. 14
1.1.5.2. Hoạt tính như probiotic ................................................................................ 15
1.1.5.3. Hoạt tính kháng oxy hóa .............................................................................. 16
1.1.5.4. Hoạt tính chống ung thư ............................................................................... 17
1.1.5.5. Hoạt tính giải độc của acid glucuronic......................................................... 18
1.1.6. Những hạn chế của trà Kombucha truyền thống ............................................ 19
1.2. Các phương pháp phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha ............ 21
1.2.1. Phương pháp vi sinh truyền thống .................................................................. 21
1.2.2. Phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel gradient biến tính (DGGE)............. 21
1.2.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật DGGE ............................................................ 21
1.2.2.2. Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật DGGE ................................... 23
1.2.3 Một số kỹ thuật phân tích khác ........................................................................ 23
1.3. Các nghiên cứu ngoài và trong nước .............................................................. 24
1.3.1. Ngoài nước ...................................................................................................... 24
v
1.3.2. Trong nước ...................................................................................................... 25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 27
2.1 Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 27
2.2 Nguyên liệu, môi trường và trang thiết bị ...................................................... 27
2.2.1 Ngun liệu thực hiện....................................................................................... 27
2.2.2 Hóa chất, mơi trường và trang thiết bị ............................................................ 27
2.2.2.1 Hóa chất, mơi trường .................................................................................... 27
2.2.2.2 Trang thiết bị ................................................................................................. 28
2.3 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 29
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.............................................................................. 29
2.3.2 Phương pháp thí nghiệm .................................................................................. 30
2.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu trà Kombucha ............................................................ 30
2.3.2.2 Phân lập và xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu trà Kombucha .............. 30
2.3.2.3 Kiểm tra khuẩn lạc thuần các nhóm vi sinh vật trong hệ vi sinh vật lên men
Kombucha ................................................................................................................. 31
2.3.2.4 Đánh giá và định danh các chủng vi sinh vật phân lập ................................. 32
2.3.2.5 Phân tích hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR-DGGE ..................................... 33
2.3.2.6 Phân tích, so sánh kết quả và tuyển chọn giống............................................ 36
2.3.2.7 Xây dựng lý lịch bộ giống vi sinh vật phân lập từ trà Kombucha ................ 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................... 37
3.1 Biến động mật độ của hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha ....................... 37
3.2 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha bằng phương pháp
truyền thống ............................................................................................................. 39
3.2.1 Kết quả phân lập nấm men............................................................................... 39
3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn acetic ..................................................................... 43
3.2.3 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic ..................................................................... 47
3.3 Kết quả phân tích hệ vi sinh vật lên men trà Kombucha bằng kỹ thuật PCR
– DGGE .................................................................................................................... 49
3.3.1 Kết quả phân tích nấm men .............................................................................. 49
3.3.2 Kết quả phân tích vi khuẩn............................................................................... 51
vi
3.4 Xây dựng lý lịch và bảo quản bộ giống vi sinh vật......................................... 56
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 58
4.1 Kết luận .............................................................................................................. 58
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 59
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Nội dung
AAB
Vi khuẩn acetic
LAB
Vi khuẩn lactic
DGGE
Phương pháp điện di trên gel gradient biến tính
FDA
Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm của Mỹ
Chứng nhận tuyệt đối an tồn và khơng gây tác dụng phụ kể cả
GRAS
đối với trẻ em, phụ nữ mang thai hoặc cho con bú, cho phép sử
dụng trong thức ăn và thức uống, do FDA công nhận
PCR - DGGE
VSV
PCR và điện di trên gel gradient biến tính - Polymerase chain
reaction denaturing gradient gel electrophoresis
Vi sinh vật
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh nồng độ khoáng anion của trà Kombucha và trà đen ................ 10
Bảng 1.2. Một số thành phần của trà Kombucha lên men từ trà xanh và trà đen liên
quan đến sức khỏe .................................................................................................... 14
Bảng 1.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật điện DGGE .............................................. 23
Bảng 3.1. Các chủng nấm men được phân lập ......................................................... 39
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn acetic được phân lập ............................................... 43
Bảng 3.3. Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập ................................................ 47
Bảng 3.4. Lý lịch bộ giống vi sinh vật lên men trà Kombucha ............................... 56
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Trà Kombucha truyền thống. ..................................................................... 4
Hình 1.2. Nấm giống ................................................................................................. 4
Hình 1.3. Vi khuẩn acetic (a) và nấm men (b) trong mạng cellulose ........................ 5
Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiea ........................................................ 6
Hình 1.5. Vi khuẩn Acetobacter aceti ....................................................................... 8
Hình 1.6. Các acid hữu cơ phổ biến và amino acid trong quá trình lên men trà
Kombucha ................................................................................................................... 9
Hình 1.7. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men ....................................... 11
Hình 1.8. Q trình chuyển hóa glucose thành cellulose ........................................ 13
Hình 1.9. Một số polyphenol trong trà .................................................................... 16
Hình 1.10. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol .................. 17
Hình 1.11. Q trình tổng hợp acid glucuronic ......................................................... 19
Hình 1.12. Nấm trà giống bị hỏng (nhiễm mốc) ....................................................... 20
Hình 1.13. Sơ đồ chung về quy trình kỹ thuật DGGE ............................................... 22
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ..................................................................... 29
Hình 3.1. Biến động của hệ vi sinh vật trong quá trình lên men trà Kombucha ..... 37
Hình 3.2. Trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng NM1 (Brettanomyces
bruxellensis) .............................................................................................................. 41
Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng NM2 (Brettanomyces
bruxellensis) .............................................................................................................. 41
Hình 3.4. Trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng NM3 (Candida tropicalis) ...... 42
Hình 3.5. Trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng NM4 (Saccharomyces
cerevisiae) ................................................................................................................. 42
Hình 3.6. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng A1 (Komagataeibacter
nataicola) .................................................................................................................. 45
Hình 3.7. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng A2 (Komagataeibacter
nataicola) .................................................................................................................. 45
Hình 3.8. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng A3 (Komagataeibacter
nataicola) .................................................................................................................. 46
x
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng A4 (Pseudomonas geniculata) 46
Hình 3.10. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng L1 (Enterococcus faecium) ... 48
Hình 3.11. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng L2 (Lactobacillus pentosus).. 48
Hình 3.12. Kết quả phân tích nấm men trong mẫu trà Kombucha lên men bằng
phương pháp PCR-DGGE ......................................................................................... 49
Hình 3.13. Kết quả phân tích vi khuẩn trong mẫu trà Kombucha lên men bằng
phương pháp PCR-DGGE ......................................................................................... 52
xi
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Kombucha đã được Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm của Mỹ (FDA)
chứng nhận là an tồn đối với con người. Hoạt tính sinh học trong Kombucha giúp
làm tăng hiệu quả của tuyến nước bọt, dạ dày và đường ruột; hỗ trợ chống xơ cứng
động mạch, thải độc, giảm lo âu và lão hóa [33], giảm triệu chứng bệnh trĩ, bệnh gút
và bệnh thấp khớp, giảm táo bón và khó tiêu [14]. Thành phần acid lactic trong
Kombucha cần thiết cho hệ tiêu hóa, giúp lưu thông máu và cân bằng độ acid và
kiềm trong cơ thể. Acid acetic trong trà giúp chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có
hại. Acid glucuronic giúp giải độc gan [20][23]. Các hợp chất tanin trong trà có khả
năng giúp cơ thể kháng khuẩn và phịng chống bệnh ung thư, làm chậm q trình
lão hóa.
Hạn chế về sản lượng so với nhu cầu con người: ở Việt Nam, phần lớn trà
Kombucha chỉ sản xuất nhỏ lẻ ở quy mơ gia đình, dễ bị tạp nhiễm, cũng như q
trình lên men cịn mang tính truyền thống, chưa có sự kiểm soát chất lượng. Thành
phần hệ vi sinh vật lên men thay đổi tùy vùng, điều kiện khí hậu, chưa chủ động
được nguồn giống vi sinh vật. Vì thế chưa thể lên men công nghiệp một cách ổn
định.
Trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về phân lập, định danh hệ vi sinh vật
lên men trà Kombucha. Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào, đặc biệt là nghiên cứu
phân lập, định danh bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân
tử. Do đó, sự hiểu biết đầy đủ về hệ vi sinh vật cộng sinh này trong Kombucha còn
nhiều hạn chế. Phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử đều có
các thế mạnh khác nhau. Phương pháp truyền thống cho phép bẫy được chủng vi
sinh vật, trong khi phương pháp PCR-DGGE cho phép hình dung tồn cảnh tổ hợp
hệ vi sinh vật trong mẫu.
Q trình lên men trà Kombucha có sự xuất hiện của nhiều nhóm vi sinh vật.
Thế nhưng, khơng phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều có lợi trong quá trình lên
1
men. Do đó, nghiên cứu tiến hành phân lập, định danh hệ vi sinh vật lên men trà
Kombucha bằng phương pháp truyền thống và hiện đại PCR-DGGE là cần thiết,
nhằm cung cấp hiểu biết và cơ sở lý thuyết quan trọng về hệ vi sinh vật lên men trà
Kombucha ở Việt Nam, nhằm tạo tiền đề quan trọng cho lên men công nghiệp; các
nghiên cứu liên quan khác.
Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn, định danh hệ vi sinh vật chính lên men trà Kombucha
nhằm làm tiền đề cho lên men công nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
Dựa vào mục tiêu trên, nghiên cứu tiến hành các nội dung sau:
-
Phân lập và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống.
-
Phân tích và định danh hệ vi sinh vật bằng phương pháp PCR-DGGE.
-
So sánh kết quả của hai phương pháp và tuyển chọn giống vi sinh vật.
-
Xây dựng lý lịch bộ giống sau định danh.
-
Lưu trữ và bảo quản bộ giống.
2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về trà Kombucha
1.1.1 Nguồn gốc
Kombucha có nguồn gốc ở Đơng Bắc Trung Quốc (Mãn Châu), khoảng năm
220 trước cơng ngun. Sau đó, Kombucha được biết đến ở Nga với tên gọi
Teakwas. Năm 414, nhà vật lí Kombu đã đưa nấm trà đến Nhật Bản và sử dụng để
chữa các bệnh về tiêu hóa của hồng đế Inkyo. Trong thế chiến thứ II, Kombucha
được đưa vào sử dụng ở Đức. Những năm 1950, Kombucha được tiêu thụ phổ biến
ở Pháp, Ý, Bắc Phi. Những năm 1960, trà Kombucha trở nên phổ biến hơn nữa khi
các nghiên cứu của các nhà khoa học Thụy Sĩ đã báo cáo việc uống trà Kombucha
có lợi như khi ăn sữa chua. Ngày nay, trà Kombucha được thương mại trên toàn thế
giới với những hương vị khác nhau [27].
Trà Kombucha được lên men và sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều địa
phương như những sản phẩm đồ uống lên men truyền thống khác do nhiều ích lợi
đối với sức khỏe con người, đặc biệt là dễ dàng thực hiện lên men tại nhà với những
nguyên liệu và dụng cụ đơn giản. Hương vị của trà Kombucha cũng đặc trưng tùy
nguyên liệu trà ban đầu thêm vào. Độ ngọt cũng dễ dàng điều chỉnh theo ý thích của
người sử dụng. Điều này góp phần đa dạng số người sử dụng loại trà lên men này.
Lượng trà, đường và nấm trà giống cũng khác nhau ở mỗi vùng, mỗi địa phương.
Quy trình lên men truyền thống như sau: Đun sơi 1 lít nước, sau đó bổ sung 5 gam
trà. Lọc bỏ xác trà sau 10-15 phút. Bổ sung 50 gam đường sucrose, khuấy tan và để
nguội ở nhiệt độ phịng. Sau đó cho hỗn hợp dịch trà đường vào bình chứa tiệt
trùng, bổ sung 24 gam nấm trà giống và 0,2 lít dịch trà Kombucha đã lên men (lần
lên men trước) nhằm ức chế sự phát triển của những vi sinh vật tạp nhiễm, giúp sự
lên men thuận lợi. Đậy miệng bình bằng vải sạch, ủ 7-10 ngày ở nhiệt độ ấm 260C300C. Trong 1-2 ngày đầu, 1 màng mỏng trên bề mặt bình chứa được hình thành,
dịch trà bắt đầu có mùi lên men và có bong bóng khí CO2 xuất hiện. Sau 10 ngày
lên men, một lớp nấm trà mới che kín bề mặt bình chứa và dày khoảng 2 cm
[14][27].
3
Hình 1.1. Trà Kombucha truyền thống
Hình 1.2. Nấm giống
1.1.2 Hệ vi sinh vật trong trà Kombucha
Kombucha được lên men nhờ sự cộng sinh của tổ hợp hệ vi sinh vật phong
phú, chủ yếu giữa vi khuẩn acetic (AAB) và nấm men. Hệ vi sinh vật cộng sinh này
còn gọi là SCOBY (symbiotic culture of bacteria and yeast) [27]. Trà Kombucha
gồm hai phần: lớp màng cellulose ở bề mặt của bình nuôi cấy (do vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo nên) và chất dịch lỏng có vị chua [4][12].
Các loại nấm men chủ yếu được tìm thấy trong Kombucha như:
Saccharomyces cerevisiae, Dekkera bruxellensis, Saccharomycodes ludwigii,
Schizosaccharomyces
pombe,
Zygosaccharomyces
bailii,
Brettanomyces,
Torulospora delbrueckii, Brettanomyces spp; Pichia sp; Torulosis sp [33].
Các vi khuẩn acetic chủ yếu được tìm thấy trong trà Kombucha gồm:
Gluconacetobacter spp (chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 85%) [4]. Các chủng vi khuẩn
acetic khác như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter aceti,
Acetobacter oxydans, Gluconobacter oxydans, Bacterium gluconicum [6][33]. Nấm
men và vi khuẩn acetic là hai nhóm vi sinh vật chủ đạo giúp lên men trà Kombucha.
Ngồi ra, nhóm vi khuẩn lactic mặc dù chiếm một số lượng rất nhỏ nhưng cũng góp
phần quan trọng tạo nên thức uống có nhiều giá trị ích lợi cho sức khỏe con người
[35].
Thành phần hệ vi sinh vật trong trà Kombucha không thể xác định chính xác
vì chúng rất đa dạng và thay đổi tùy vào nguồn cơ chất sử dụng để lên men và thời
gian lên men khác nhau ở mỗi địa phương, vùng miền [8].
4
Hình 1.3. Vi khuẩn acetic (a) và nấm men (b) trong mạng cellulose [33].
1.1.2.1 Nấm men trong trà Kombucha
Phân loại nấm men
Nấm men có hai nhóm chủ yếu: nhóm nấm men có bào tử (lớp Ascomycetes)
và nhóm nấm men khơng tạo thành bào tử (lớp Fungi imperfect). Trong công
nghiệp thường sử dụng nhóm nấm lớp Ascomycetes như các giống: Saccharomyces,
Zygosaccharomyces, Toruiaspors…
Giống Saccharomyces quan trọng nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được
dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như: men nở bánh mì, cơng nghiệp bia,
men thức ăn chăn ni, rượu, sản xuất glyxerol, enzym invertase. Saccharomyces
fragilis lên men đường lactose đóng vai trò quan trọng trong sản xuất sữa và sản
phẩm từ sữa [40].
Hình thái, cấu tạo nấm men
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng: hình cầu, oval, elip, hình quả chanh,
hình trụ, hình chùy, hình tam giác hoặc đơi khi kéo dài ra thành sợi… Nấm men có
5
thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi
trường xung quanh. Kích thước tế bào nấm men rất lớn (gấp từ 5-10 lần tế bào vi
khuẩn). Kích thước trung bình khoảng dài (3µm-5µm) và rộng (5µm-10µm) [37].
Hình 1.4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men là sinh vật đơn bào. Vách tế bào khi cịn non mỏng sau đó dày lên
dần. Vách tế bào chủ yếu là glucan, mangan, protein, lipid, kitin. Màng tế bào chất
gồm các hợp chất phức tạp như protein (50%), lipid (20%), còn lại là
polysaccharide. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn
thẩm thấu, điều chỉnh các chất dinh dưỡng, muối khoáng vào trong tế bào và ngược
lại cho các chất trao đổi chất ra ngoài tế bào; nơi khu trú của một số enzym và cơ
quan của tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào. Tế bào chất
có cấu trúc khơng đồng nhất và ở thể keo chứa ty thể, ribosome, mạng lưới nội chất,
không bào, các thể vùi của hợp chất lipoit, hydratcacbon tự nhiên trong nội bào. Tế
bào chất có độ nhớt cao tương ứng với glyxerin, khi tế bào già độ nhớt giảm. Tế bào
già có khơng bào lớn hơn tế bào non. Tế bào nấm men có nhân thật, có hình trịn
hoặc elip, đường kính của nhân khoảng 2µm [40].
Sinh sản nấm men
Nấm men có 2 hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vơ tính (nảy chồi
hoặc phân cắt tế bào). Tùy thuộc điều kiện nuôi cấy, tế bào nấm men sẽ sinh sản vô
6
tính hay hữu tính. Sinh sản bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản từ tế bào
trưởng thành, mọc ra một chồi nhỏ, một phần nhân chuyển sang chồi và nhân lớn
lên cùng với sự lớn lên của chồi. Sinh sản bằng nảy chồi là hình thức khi hai tế bào
nằm sát vách nhau, hợp ghép để phối nhân phối chất thành túi bào tử, rồi tách thành
các tế bào mới. Nấm men có thời gian thế hệ rất ngắn (khoảng 30 phút), do đó, con
người đã và đang khai thác tối đa loại vi sinh vật này cho nhiều ứng dụng trong đó
có lĩnh vực tạo dịng [40].
1.1.2.2 Vi khuẩn acetic trong trà Kombucha
Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, chia thành 2 nhóm: Acetobacter
và Gluconobacter [27]. Hình dạng chung của vi khuẩn acetic có hình que thẳng
hoặc hơi cong, hình elip. Tế bào đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Kích thước tế
bào khoảng (0,3-0,6) x (1-4,2) µm. Khuẩn lạc có kích thước khoảng 3-5 mm, trịn,
nhỏ, đều, bề mặt trơn bóng, phần giữa lồi và sẫm màu hơn vùng xung quanh. Vi
khuẩn acetic là lồi hiếu khí bắt buộc, Gram âm, những tế bào già và môi trường
ni cấy làm cho Gram của chúng có thể thay đổi, có thể di động hoặc khơng di
động, khơng sinh bào tử. Đa số vi khuẩn acetic chịu được môi trường ethanol và
nồng độ acid cao. Các chủng Gluconobacter chịu nồng độ ethanol và acid kém hơn
chủng Acetobacter. Nhiệt độ sinh trưởng từ 9-40oC, nhiệt độ tối ưu là 30 oC. pH
thuận lợi sinh trưởng là 5-6. Khi pH =3, nhiều chủng acetic vẫn tồn tại (nhất là
chủng nhóm Acetobacter). Các chủng nhóm Acetobacter đều có khả năng chuyển
hóa ethanol thành CO2 và H2O, nhóm Gluconobacter thì đa số khơng có khả năng
này. Các chủng acetic có khả năng tạo màng cellulose trên bề mặt môi trường lỏng.
Tùy chủng mà màng cellulose tạo ra có khác nhau, như: Acetobacter xylinum tạo
màng cellulose dày, chắc; Acetobacter orleanoe tạo màng mỏng, chắc; Acetobacter
suboxydans tạo màng mỏng, dễ phân tách; Acetobacter pasteurianum tạo màng khơ,
nhăn nheo. 5 chủng vi khuẩn acetic đã tìm thấy trong trà Kombucha: Acetobacter
aceti, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter intermedius và
Acetobacter nitrogenifigen [13].
7
Hình 1.5. Vi khuẩn Acetobacter aceti
1.1.2.3 Vi khuẩn lactic trong trà Kombucha
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Hình dạng tế bào của chúng có
dạng hình que hay hình cầu. Kích thước thay đổi tùy lồi. Điều kiện mơi trường
ni cấy, thời gian ni cấy, nồng độ oxy có liên quan đến sự khác nhau của hình
dạng tế bào vi khuẩn lactic. Tất cả các chủng vi khuẩn lactic đều có Gram dương,
catalase âm tính, khơng sinh bào tử và hầu hết không di động. Vi khuẩn lactic là vi
khuẩn lên men bắt buộc, có thể lên men đồng hình hay dị hình. Chúng sinh trưởng
được cả ở mơi trường hiếu khí lẫn yếm khí, nhưng sinh trưởng tốt trong điều kiện
yếm khí. Nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển từ 30oC – 40oC, pH tối ưu là 5,5 – 5,8.
Tùy thuộc vào hình dạng và cách sắp xếp tế bào, người ta chia vi khuẩn lactic thành
4 chi: Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus và Leuconostoc [13]. Vi khuẩn
lactic có khả năng sinh bacteriocin, góp phần ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh
vật tạp nhiễm cho sản phẩm lên men. Một số chủng vi khuẩn lactic đã được tìm thấy
trong trà Kombucha chủ yếu thuộc loài Lactobacillus như Lactobacillus plantarum
[20].
1.1.3 Thành phần hóa học của trà Kombucha
Các nghiên cứu phân tích về thành phần hóa học của trà Kombucha đều thấy
có sự hiện diện của các acid hữu cơ như: acetic, gluconic, glucuronic, L-lactic,
citric, malic, tartalic, oxalic, malonic, pyruvic, usnic. Nhiều loại đường như:
sucrose, glucose và fructose. Ngoài ra, trong thành phần hóa học của Kombucha có
nhiều vitamin thiết yếu cho cơ thể như B1, B2, B6, B12, C; 14 loại amino acid
8
(trong đó theanine chiếm 50% tổng số amino acid) [5]; Protein, lipid, ethanol, một
số enzyme thủy phân, nhiều anion, hoạt chất kháng khuẩn, D-Saccharic acid 1,4Lactone (DSL) và các chất chuyển hóa của vi khuẩn và nấm men [27].
Acid glucuronic
Acid oxalic
Acid gluconic
Acid L-lactic
Acid usnic
Acid malic
Acid citric
Theanine
Hình 1.6. Các acid hữu cơ phổ biến và amino acid trong quá trình lên men
trà Kombucha [5][18].
9
Bảng 1.1. So sánh nồng độ khoáng anion của trà Kombucha và trà đen.
Anion
Trà Kombucha (mg/g)
Trà đen (mg/g)
Fˉ
3.20 ± 0.16
1.20 ± 0.06
Clˉ
0.96 ± 0.04
3.12 ± 0.13
Brˉ
0.04 ± 0.01
0.04 ± 0.01
NO3ˉ
0.18 ± 0.01
0.34 ± 0.02
HPO42ˉ
0.04 ± 0.01
0.08 ± 0.01
SO42ˉ
1.02 ± 0.04
4.20 ± 0.17
Iˉ
1.04 ± 0.08
0.44 ± 0.04
[30].
1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men trà Kombucha
Quá trình lên men trà Kombucha xảy ra các quá trình: lên men ethanol, lên
men acetic và lên men lactic.
Lên men ethanol và vai trò của nấm men
Enzyme invertase do nấm men tiết ra thủy phân đường sucrose thành glucose
và fructose. Phần lớn đường fructose sau thủy phân được nấm men sử dụng chuyển
hóa theo chu trình đường phân tạo thành acid pyruvic. Sau đó, acid pyruvic chuyển
hóa thành ethanol và giải phóng khí CO2. Quá trình lên men tạo ethanol và CO2
trong điều kiện yếm khí như hình 1.7
Phương trình tổng qt của q trình lên men tạo ethanol trong mơi trường pH
acid như sau:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên
men và nhiều sản phẩm phụ khác như glycerol, aldehyde, acid hữu cơ, este… giúp
trà Kombucha có mùi thơm đặc trưng.
10