ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------

NGUYỄN ĐỨC HOÀNG

THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM TRICHODERMA VIRIDE
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN BÃ KHOAI MÌ
TRONG HỆ THỐNG THÙNG QUAY

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014


Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam,
121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. PHAN NGỌC HÒA

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM,
ngày 15 tháng 08 năm 2014
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

2. Phản biện 1: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

3. Phản biện 2: TS. PHAN NGỌC HÒA

4. Ủy viên: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG

5. Thƣ ký: TS. HOÀNG ANH HOÀNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trƣởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Đức Hoàng

MSHV: 12310733


Ngày, tháng, năm sinh: 30/04/1975

Nơi sinh: Vĩnh Long.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 604280

I. TÊN ĐỀ TÀI:
“Thử nghiệm tạo chế phẩm Trichoderma viride bằng phương pháp lên men bán
rắn bã khoai mì trong hệ thống thùng quay”
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
+ Thiết kế thiết bị hệ thống lên men bán rắn dạng thùng quay
+ Khảo sát một số điều kiện ảnh hƣởng đến khả năng sinh bào tử Trichoderma viride
trên nền bã khoai mì
+ Thực hiện quy hoạch thực nghiệm và kiểm chứng thực nghiệm bằng phƣơng pháp
lên men bán rắn ở quy mơ phịng thí nghiệm và hệ thống thùng quay
+ Khảo sát tỷ lệ sống sót sau sấy và thời gian bảo quản của sản phẩm
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài): 20/01/2014
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài):
20/06/2014
IV. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):
PGS. TS. Nguyễn Thúy Hƣơng
Tp. HCM, ngày tháng năm 2014
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC



LỜI CẢM ƠN
Con xin trân trọng cảm ơn Ba Mẹ đã ni nấng, chăm sóc và dạy dỗ con nên
ngƣời. Cảm ơn Ba Mẹ và những ngƣời thân yêu đã luôn động viên, tạo điều kiện cho
con học tập và luôn bên cạnh con trong suốt thời gian vừa qua.
Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Nguyễn Thúy Hƣơng đã hết lịng hƣớng dẫn, tận tụy giúp đỡ tơi về chuyên môn
cũng nhƣ tinh thần.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến với quý Thầy Cô trong
Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trƣờng Đại học Bách Khoa
Tp.Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến
thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Tiếp theo, tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật
Nơng nghiệp Miền Nam, Phịng Khoa học Đất, anh chị Phòng Nghiên cứu Khoa Học
Đất đã giúp đỡ, chia sẽ công việc. Đặc biệt, tổ Vi sinh đã tạo điều kiện cho tơi hồn
thành tốt đề tài này.
Cuối cùng, tơi chân thành cảm ơn bạn bè lớp CNSH khóa 2012, Đại học Bách
Khoa Tp. Hồ Chí Minh đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tơi trong suốt q trình
thực hiện và hồn thành luận văn này.
Trân trọng.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2014
Nguyễn Đức Hồng


TĨM TẮT
Bã khoai mì là một trong những phụ phế phẩm đƣợc thải ra đƣợc từ các nhà
máy sản xuất tinh bột khoai mì, chứa hàm lƣợng tinh bột và cellulose cao. Ngồi ra
cịn có các thành phần khác nhƣ protein, pectin, lignin, chất b o, tro và các chất
khoáng khác. Do đó, bã khoai mì là một chất mang lý tƣởng cho việc sản xuất chế
phẩm vi sinh bằng phƣơng pháp lên men bán rắn dạng thùng quay mà thiết bị dạng

thùng quay này đƣợc nghiên cứu và thiết kế. Thiết bị này giúp hƣớng tới một sản
xuất chế phẩm vi sinh có giá trị cao ở quy mơ công nghiệp. Đối tƣợng nấm đƣợc sử
dụng là chủng giống Trichoderma viride VTCC-F-754, mà chủng này có nhiều ƣu
điểm nhƣ phát triển nhanh trên môi trƣờng thạch khoảng 9cm sau 3 ngày ni cấy,
có khả năng phân giải cellulose và tinh bột cao với đƣờng kính lần lƣợt là 2cm,
1,07cm sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CMC và tinh bột. Đƣờng cong sinh
trƣởng của Trichoderma viride đã đƣợc khảo sát và thu nhận bào tử vào ngày thứ 3
đạt 1,18x108 bào tử ml . Đặc biệt, các thông số tối ƣu của từng yếu tố là nền tảng
cho thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm thơng qua phần mềm Statgraphics Centurion
XV.

ết quả cho thấy chủng giống Trichoderma viride VTCC-F-754 có mật độ bào

tử 2,69x109 bào tử g với các điều kiện tối ƣu nhƣ độ ẩm 60,9 , tỷ lệ giống 1,14
(x108, v w , tỷ lệ bổ sung NH 4)SO4 0,57

và tỷ lệ bổ sung

H 2PO4 0,15 . Tỷ lệ

sống sót sau sấy và bảo quản theo thời gian cũng là một yếu tố quan trọng để đánh
giá chất lƣợng và giá thành của sản phẩm.
Từ khóa: Trichoderma viride, bã khoai mì, hệ thống thùng quay và chế phẩm
vi sinh.


ABSTRACT
Cassava bagasse is a fibrous residue obtained from the tapioca starch
factories, which contains high starch and cellulose. In addition, it comprises some
valuable components like proteins, pectin, lignin, fat, ash, and minerals. Therefore,

cassava bagasse is considered as a rich substance to produce microbial products by
semi-solid fermentation using rotating-drum bioreactor system. Such technique was
designed and made in our study in the laboratory conditions. This equipment helps
towards to have a microbial products of high value in industrial scale. Trichoderma
viride VTCC-F-754, having many advantages to fermentation procedure [e.g.,
rapidly develop (approximately 9 cm agar after 3 days of culture), highly degrade
cellulose and starch under starch and CMC culture (2 cm and 1.07 cm diameter after
5 days, respectively)] were used in this work. The growth curves of T. viride were
measured and the spores were admitted on day 3 at 1.18 x 108 (spore/ml). The
laboratory experimental planning was conducted according to the optimal parameters
obtained in each element through software Statgraphics Centurion XV. The results
showed that the spore density of T. viride VTCC-F-754 strains obtained 2.69 x 109
(spore/g) under optimal culture conditions [i.e., 60.9% moisture, 5.34 pH, rate
strains: 1. 14% (x108, v/w), (NH4)SO4: 0.57%, and KH2PO4: 0.15%]. Survival rates
of microbes after drying and time maintenance are important factors to evaluate the
quality and cost of products.
Key word: Trichoderma viride, cassava bagasse, rotating-drum bioreactor and
microbial products.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi tên Nguyễn Đức Hồng, học viên cao học chun ngành Cơng Nghệ Sinh
Học, khóa 2012, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trƣờng Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí
Minh. Tơi xin cam đoan:
Cơng trình nghiên cứu này do chính tơi thực hiện, dƣới sự hƣớng dẫn khoa
học của PGS. TS. Nguyễn Thúy Hƣơng.
Các số liệu trong luận văn là hồn tồn trung thực và chƣa đƣợc cơng bố ở
các nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phƣơng tiện truyền thơng nào.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt
nghiệp của mình.

Học viên

Nguyễn Đức Hoàng



MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................ i
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ............................................................................ ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 4
1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODEMA VIRIDE ............................................ 4
1.1.1 Phân loại ......................................................................................................... 4
1.1.2 Đặc điểm hình thái của Trichoderma viride ................................................. 5
1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma viride .................................... 6
1.1.4 Các cơ chế phòng trừ sinh học của nấm Trichoderma đối kháng với nấm
bệnh ......................................................................................................................... 7
1.1.5 Ứng dụng của Trichoderma viride .............................................................. 10
1.1.5.1 Ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật........................................ 10
1.1.5.2 Ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ mơi trƣờng .................................. 11
1.2 BÃ KHOAI MÌ ................................................................................................... 13
1.2.1 Thành phần hóa học bã khoai mì ................................................................ 13
1.2.2 Vấn đề ơ nhiễm của bã khoai mì ................................................................. 13
1.2.3 Một số ứng dụng của bã khoai mì ............................................................... 15
1.2.3.1 Sản xuất thức ăn gia súc ................................................................... 15
1.2.3.2 Sản xuất chất thơm ........................................................................... 15
1.2.3.3 Sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh .................................................... 16

i


1.3 CHẾ PHẨM VI SINH ........................................................................................ 17
1.3.1 Khái niệm về chế phẩm vi sinh ................................................................... 17
1.3.2 Phân loại chế phẩm vi sinh.......................................................................... 17
1.3.2.1 Chế phẩm vi sinh cố định đạm ........................................................ 17
1.3.2.2 Chế phẩm vi sinh hoà tan lân ........................................................... 18
1.3.2.3 Chế phẩm vi sinh phân giải kali ...................................................... 19
1.3.2.4 Chế phẩm vi sinh phân giải cellulose .............................................. 20
1.3.2.5 Chế phẩm vi sinh đối kháng và kích thích tăng trƣởng cây trồng . 21
1.3.3 Một số điểm cần chú ý khi sử dụng chế phẩm vi sinh vật ......................... 22
1.4 PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT BÁN RẮN ......................................... 23
1.4.1 Khái niệm phƣơng pháp lên men bề mặt .................................................... 23
1.4.2 Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp lên men bề mặt ............................... 24
1.4.3 Phân loại thiết bị nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng bán rắn................. 24
1.4.3.1 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng rắn dạng phịng có các
khay đục lỗ nằm ngang ................................................................................. 25
1.4.3.2 Thiết bị có khay phân bổ đứng ........................................................ 25
1.4.3.3 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng bán rắn dạng rung... 26
1.4.3.4 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật dạng tháp ........................................... 26
1.4.3.5 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng rắn dạng thùng quay.
....................................................................................................................... 27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 29
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................................ 29
2.1.1 Nguyên liệu .................................................................................................. 29
2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 29
2.1.3 Hóa chất và mơi trƣờng ni cấy ................................................................ 29
ii



2.1.4 Dụng cụ và thiết bị....................................................................................... 31
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 32
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 32
2.2.2 Phân tích thành phần hóa học ..................................................................... 33
2.2.3 Thiết kế thiết bị lên men bán rắn dạng thùng quay .................................... 33
2.2.4 Kiểm tra đặc điểm sinh học của Trichoderma viride ................................. 34
2.2.4.1 Kiểm tra đặc điểm đại thể và vi thể nấm Trichoderma viride ....... 34
2.2.4.2 Kiểm tra khả năng phân giải cellulose và tinh bột của nấm
Trichoderma viride ....................................................................................... 34
2.2.4.3 Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của Trichoderma viride .......... 35
2.2.5 Tối ƣu hóa một số điều kiện ảnh hƣởng đến khả năng sinh bào tử
Trichoderma viride trên môi trƣờng bán rắn bã khoai mì .................................. 36
2.2.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh bào tử
Trichoderma viride ....................................................................................... 37
2.2.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm lên khả năng sinh bào tử nấm
Trichoderma viride ....................................................................................... 37
2.2.5.3 Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh bào tử nấm
Trichoderma viride ....................................................................................... 37
2.2.5.4 Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống lên khả năng sinh bào tử nấm
Trichoderma viride ....................................................................................... 37
2.2.5.5 Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung NH4)2SO4 lên khả năng sinh
bào tử nấm Trichoderma viride ................................................................... 37
2.2.5.6 Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung

H2PO4 lên khả năng sinh

bào tử nấm Trichoderma viride ................................................................... 38
2.2.6 Quy hoạch thực nghiệm .............................................................................. 38
2.2.6.1 Thực hiện quy hoạch thực nghiệm .................................................. 38

iii


2.2.6.2 Kiểm chứng thực nghiệm bằng phƣơng pháp lên men bán rắn ở quy
mơ phịng thí nghiệm và hệ thống thùng quay ............................................ 40
2.2.7 Sản phẩm ...................................................................................................... 41
2.2.7.1 Kiểm tra tỷ lệ sống sót của bào tử sau sấy ...................................... 41
2.2.7.2 Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm ............................................ 41
CHƢƠNG 3. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 42
3.1 Các khảo sát tiền đề ............................................................................................ 42
3.1.1 Thành phần hóa học của bã khoai mì ......................................................... 42
3.1.2 Thiết bị lên men bán rắn dạng thùng quay ................................................. 43
3.1.3 Kiểm tra đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma viride ......................... 44
3.1.3.1 Quan sát đại thể của nấm Trichoderma viride ................................ 44
3.1.3.2 Quan sát vi thể của nấm Trichoderma viride .................................. 46
3.1.3.3 Kiểm tra khả năng phân giải cellulase và tinh bột của Trichoderma
viride ............................................................................................................. 47
3.1.3.4 Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của Trichoderma viride .......... 48
3.2 Tối ƣu hóa một số điều kiện ảnh hƣởng đến khả năng sinh bào tử Trichoderma
viride trên mơi trƣờng bán rắn bã khoai mì ............................................................. 50
3.2.1 Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh bào tử nấm Trichoderma
viride ...................................................................................................................... 50
3.2.2 Ảnh hƣởng của độ ẩm lên khả năng sinh bào tử nấm Trichoderma viride
............................................................................................................................... 52
3.2.3 Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh bào tử nấm Trichoderma viride .... 53
3.2.4 Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống lên khả năng sinh bào tử nấm Trichoderma
viride ...................................................................................................................... 55
3.2.5 Ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung NH 4)2SO4 lên khả năng sinh bào tử nấm
Trichoderma viride ............................................................................................... 56
iv



3.2.6 Ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung

H 2PO4 lên khả năng sinh bào tử nấm

Trichoderma viride ............................................................................................... 58
3.3 Quy hoạch thực nghiệm ...................................................................................... 60
3.3.1 Kết quả quy hoạch thực nghiệm ................................................................. 60
3.3.2 Kiểm chứng thực nghiệm bằng phƣơng pháp lên men bán rắn ở quy mơ
phịng thí nghiệm và hệ thống thùng quay ........................................................... 65
3.4 Sản phẩm ............................................................................................................. 66
3.4.1 Kiểm tra tỷ lệ sống sót của bào tử sau sấy ................................................. 66
3.4.2 Ảnh hƣởng thời gian bảo quản sản phẩm đến số lƣợng bào tử ................. 67
CHƢƠNG 4. ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 69
4.1 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 69
4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 71
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ a
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ........................................................................................... m

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hoá học của bã khoai mì ........................................................... 13
Bảng 2.1 Một số hóa chất đƣợc dùng trong thí nghiệm .............................................. 29
Bảng 2.2a Một số loại môi trƣờng nuôi cấy................................................................. 30
Bảng 2.2b Một số loại môi trƣờng nuôi cấy ................................................................ 30
Bảng 2.3 Một số dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ........................ 31

Bảng 2.4 Các mức của ma trận thực nghiệm ............................................................... 38
Bảng 2.5 Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ƣu hóa hàm lƣợng
bào tử sinh ra ................................................................................................................. 39
Bảng 3.1 Kết quả tích thành phần hóa học bã khoai mì .............................................. 42
Bảng 3.2 Mật độ bào tử nấm T.viride theo thời gian trong môi trƣờng dịch thể
Czapek Dox ................................................................................................................... 49
Bảng 3.3 Mật độ bào tử nấm T.viride theo thời gian trong môi trƣờng bán rắn bã
khoai mi ......................................................................................................................... 51
Bảng 3.4 Mật độ bào tử nấm T.viride trong môi trƣờng bán rắn bã khoai mì sau thí
nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố độ ẩm ............................................................. 52
Bảng 3.5 Mật độ bào tử nấm T.viride trong môi trƣờng bán rắn bã khoai mì sau thí
nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố pH .................................................................. 54
Bảng 3.6 Mật độ bào tử nấm T.viride trong môi trƣờng bán rắn bã khoai mì sau thí
nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố tỷ lệ giống ..................................................... 55
Bảng 3.7 Mật độ bào tử nấm T.viride trong mơi trƣờng bán rắn bã khoai mì sau thí
nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung NH 4)2SO4 .......................................... 57
Bảng 3.8 Mật độ bào tử nấm T.viride trong mơi trƣờng bán rắn bã khoai mì sau thí
nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung H2PO4 .............................................. 58
Bảng 3.9 Kết quả tối ƣu hóa giá trị các yếu tố ............................................................. 61
vi


Bảng 3.10 Mức ảnh hƣởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ƣu .................................. 62
Bảng 3.11 Tọa độ điểm tối ƣu ...................................................................................... 64
Bảng 3.12 Điểm tối ƣu của các yếu tố ......................................................................... 65
Bảng 3.13

ết quả kiểm chứng thực nghiệm lên men bằng phƣơng pháp lên men bán

rắn ở quy mơ phịng thí nghiệm và hệ thống thùng quay ............................................ 65

Bảng 3.14 Tỷ lệ sống sót bào tử Trichoderma viride theo thời gian bảo quản .......... 68

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma viride ............................. 4
Hình 1.2 Trichoderma viride trên mơi trƣờng M2YA .................................................. 6
Hình 1.3 Nấm Trichoderma spp. tấn cơng và tiêu diệt nấm bệnh Pythium.................. 8
Hình 1.4 Bã khoai mì phơi và chất thành đống quanh khu dân cƣ tại xã Sa Nhơn,
huyện Sa Thầy, Tỉnh Kon Tum .................................................................................... 14
Hình 1.5 Sự sắp xếp của các hạt rắn với độ ẩm mơi trƣờng trong q trình lên men
bán rắn của nấm ............................................................................................................ 23
Hình 1.6 Thiết bị để nuôi cấy chủng nấm mốc dạng thùng quay của hãng Valerschein
........................................................................................................................................ 28
Hình 2.1 Mơ hình hệ thống lên men bán rắn dạng thùng quay ................................... 33
Hình 3.1 Hệ thống lên men bán rắn dạng thùng quay đƣợc thiết kế .......................... 43
Hình 3.2 Trichoderma viride sau 2 ngày ni cấy ...................................................... 44
Hình 3.3 Trichoderma viride sau 3 ngày ni cấy ...................................................... 45
Hình 3.4 Trichoderma viride sau 4 ngày ni cấy ...................................................... 45
Hình 3.5 Trichoderma viride sau 2 ngày ni cấy ...................................................... 46
Hình 3.6 Trichoderma viride sau 3 ngày ni cấy ...................................................... 47
Hình 3.7 Khả năng phân giải cellulose và tinh bột của Trichoderma viride .............. 48
Hình 3.8 Mặt đáp ứng mật độ bào tử (log bào tử g theo độ ẩm và pH; độ ẩm và nitơ
........................................................................................................................................ 64
Hình 3.9 Chế phẩm Trichoderma viride với mật độ > 109 bào tử g ........................... 68

viii



DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 32
Biểu đồ 3.1 Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm Trichoderma viride ........................... 49
Biểu đồ 3.2 Ảnh hƣởng thời gian lên khả năng sinh bào tử T.viride trong mơi trƣờng
bán rắn bã khoai mì ....................................................................................................... 51
Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng của ẩm độ lên khả năng sinh bào tử T.viride trong mơi
trƣờng bán rắn bã khoai mì ........................................................................................... 52
Biểu đồ 3.4 Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh bào tử T.viride trong môi trƣờng
bán rắn bã khoai mì ....................................................................................................... 54
Biểu đồ 3.5 Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên khả năng sinh bào tử T.viride trong mơi
trƣờng bán rắn bã khoai mì ........................................................................................... 56
Biểu đồ 3.6 Ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung NH4)2SO4 lên khả năng sinh bào tử
T.viride trong môi trƣờng bán rắn bã khoai mì ............................................................ 57
Biểu đồ 3.7 Ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung

H 2PO4 lên khả năng sinh bào tử T.viride

trong mơi trƣờng bán rắn bã khoai mì .......................................................................... 59

ix


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Sản xuất nơng nghiệp ngày nay có vai trò quan trọng và trở thành tiêu điểm
quan tâm khơng những trên phạm vi quốc gia mà cịn trên qui mơ tồn cầu. Theo số
liệu tính tốn từ cục thống kê năm 2012 ngành nơng nghiệp đóng góp 22

GDP


[68], tuy nhiên sản xuất nông nghiệp lâu nay vẫn chƣa chú trọng đúng mức việc bảo
vệ môi trƣờng. Việc sản xuất nông nghiệp sạch, nâng cao chất lƣợng nông sản nhằm
đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm và thân thiện với môi trƣờng đang là mục tiêu
phấn đấu của ngành nơng nghiệp nói chung và nơng dân nói riêng. Một trong những
biện pháp hữu hiệu để sản xuất nông nghiệp sạch là ứng dụng rộng rãi các chế phẩm
vi sinh, phân vi sinh hay các loại phân hữu cơ vi sinh nhằm thay thế các hoá chất bảo
vệ thực vật và các loại phân hoá học đang là xu hƣớng tích cực trong chiến lƣợc phát
triển một nền nơng nghiệp theo hƣớng hữu cơ hiệu quả và bền vững.
Hiện nay nhiều chế phẩm vi sinh đã đƣợc thƣơng mại hóa. Thành phần vi sinh
vật trong các chế phẩm rất đa dạng và khác nhau ở mỗi cơ sở sản xuất nhƣ chế phẩm
Bioactive của Pháp gồm chủ yếu vi khuẩn thuộc giống Bacillus, trong EM-1 của
Nhật lại gồm nhiều chủng thuộc các giống Lactobacillus, Acetobacter, xạ khuẩn,
nấm men, vi khuẩn quang hợp. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng chất mang từ chất
thải khác nhau của ngành nông nghiệp ngày càng tăng và có hiệu quả tƣơng đối tốt
nhƣ bã mía, mụn xơ dừa, bã khoai mì. Trong khi đó tình trạng bã khoai mì thải ra do
các nhà máy, cơ sở sản xuất tinh bột ngày càng nhiều. Tồn quốc năm 2011 có
khoảng 62 nhà máy chế biến tinh bột khoai mì và trên 2000 cơ sở chế biến khoai mì
lát, tinh bột khoai mì thủ cơng có công suất dƣới 10 tấn củ tƣơi ngày nằm rải rác ở
hầu hết các tỉnh trồng khoai mì nhƣ Tây Ninh và Đồng Nai [13] và để sản xuất 250300 tấn củ khoai mì tƣơi thì thải ra khoảng 280 tấn bã khoai mì ƣớt [62].
Quá trình xử lý và lên men bã khoai mì lâu nay vẫn theo những phƣơng pháp
truyền thống nhƣ phơi nắng trên những ngoài đồng ruộng, lên men bề mặt và ủ đống.
Những phƣơng pháp này dễ gây ra mùi hôi thối do bã khoai mì chứa nhiều hàm
1


lƣợng tinh bột và cellulose cao mà những chất này ở độ ẩm cao sẽ thích hợp cho
những vi sinh vật có hại, gây độc xâm nhập, sinh sản và phát triển. Dẫn chứng cho
việc ô nhiễm môi trƣờng, “Theo UBND tỉnh Tây Ninh thì ngày 20/09/2013 đã ban
hành quyết định tạm đình chỉ hoạt động đối với 11 doanh nghiệp, cơ sở chế biến tinh
bột khoai mì trên địa bàn, nguyên nhân là do các doanh nghiệp không thực hiện

đúng và đầy đủ quy trình xử lý chất thải và gây ô nhiễm môi trường” [73]. Với số
lƣợng bã khoai mì thải ra lớn nhƣ vậy, việc tìm ra phƣơng pháp lên men, xử lý nhanh
và có hiệu quả nguồn nguyên liệu này không những theo yêu cầu cho các nhà máy,
cơ sở sản xuất tinh bột khoai mì mà cịn có ý nghĩa kinh tế - xã hội đáng kể, vì đây là
một loại chất thải có hàm lƣợng cơ chất sinh học cao với tiềm năng và triển vọng
ứng dụng của nó.
Bên cạnh đó, nấm Trichoderma viride đƣợc xem nhƣ là nguồn kiểm soát sinh
học, chúng tiết ra nhiều loại kháng sinh để ngăn ngừa và tiêu diệt một số nấm bệnh
nhƣ Pseudoperonospora, Pythium ultimun, Phytophthora, Rhizoctonia solani,
Rhizopus. Thêm vào đó, chúng cịn có khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ
cellobiase, cellulase, endo ß-1-4-hydrolase, endo 1,3 ß-cellulase, endo 1,3 ßglucanase, endo 1,3 ß-xylanase, exo-glucanase, xylanase, chitinase, protease,
amylase và pectinase. Do đó, Trichoderma viride đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh
vực bảo vệ thực vật, kích thích tăng trƣởng cây trồng và lĩnh vực bảo vệ mơi trƣờng.
Vì vậy trong đề tài “Thử nghiệm tạo chế phẩm Trichoderma viride bằng phương
pháp lên men bán rắn bã khoai mì trong hệ thống thùng quay” đƣợc nghiên cứu
sâu về các đặc điểm sinh học, tối ƣu hóa các điều kiện nuôi cấy để thu nhận số lƣợng
bào tử nấm Trichoderma viride cao nhất và thử nghiệm sản xuất chế phẩm
Trichoderma viride trong hệ thống thùng quay nhằm hƣớng tới một sản xuất chế
phẩm có giá trị cao ở quy mơ cơng nghiệp. Đồng thời đề tài cũng góp phần một giải
pháp xử lý bã khoai mì đang gây ơ nhiễm môi trƣờng hiện nay.
Mục tiêu nghiên cứu
Tạo chế phẩm Trichoderma viride trên chất thải bã khoai mì có giá trị cao
Góp phần một giải pháp xử lý bã khoai mì
2


Nội dung nghiên cứu
Phân tích thành phần hóa học: Độ ẩm, pH, cacbon tổng số, đạm tổng số, hàm
lƣợng cellulose, tinh bột và các chất khoáng trong nguyên liệu bã khoai mì trƣớc khi
ni cấy tạo sinh khối.

Khảo sát đặc điểm sinh học của chủng giống Trichoderma viride: Kiểm tra
khả năng phân giải cellulose, tinh bột và xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của nấm
Trichoderma viride trên môi trƣờng dịch thể Czapek Dox.
Khảo sát các điều kiện tối ƣu của Trichoderma viride cho quá trình lên men
bán rắn.
Quy hoạch thực nghiệm các điểm tối ƣu.
Thử nghiệm quá trình sản xuất chế phẩm Trichoderma viride bằng phƣơng
pháp lên men bán rắn bã khoai mì trong hệ thống thùng quay.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODEMA VIRIDE
1.1.1 Phân loại
Trichoderma viride là loài nấm khá phổ biến trong tự nhiên, chúng sống trong
đất, xác bã thực vật, vật liệu tổng hợp, giấy, các sản phẩm thực phẩm và dệt may.
Theo phân loại khoa học Trichoderma viride đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Sordariomycetes
Phân lớp: Hypocreomycetidae
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Chi: Trichoderma
Lồi: Trichoderma viride [67].

Hình 1.1: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma viride [39]
4



Chủng nấm Trichoderma đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794,
vào thời điểm đầu tiên này ông đã mơ tả đƣợc 3 lồi:
Trichoderma caesium Pers. (1794).
Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến nay
đã có trên 150 lồi nấm Trichoderma đƣợc mơ tả.
1.1.2 Đặc điểm hình thái của Trichoderma viride
Trichoderma viride là một loại nấm bất tồn, khơng có giai đoạn sinh sản hữu
tính, mà là sinh sản vơ tính bằng cách bào tử phân bào. Hầu hết các lồi nấm
Trichoderma có hình thái rất giống nhau và đƣợc xem xét nhiều năm đó là
Trichoderma viride [44]. Tuy nhiên, mức độ giống nhau về hình thái khơng liên
quan mật thiết về mặt phát sinh chủng loài.
Khuẩn lạc của nấm Trichoderma viride ban đầu có màu trắng trong suốt, sau
đó có màu xanh lục do bào tử đƣợc hình thành. Khuẩn lạc phát triển nhanh trên mơi
trƣờng thạch, có thể đạt từ 2 – 9cm sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C. Sự hình
thành khuẩn lạc kết lại thành chùm hoặc tỏa rộng ra hơn, màu xanh xám. Mặt trái
khuẩn lạc không màu hoặc màu vàng nhạt. Nhánh thƣờng ở dạng đơi hoặc đơn hoặc
mọc vịng, thƣờng ngoằn ngo.
Sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, thƣờng đƣợc hình thành ở dạng gần
nhƣ vòng tròn đồng tâm. Các nhánh sợi nấm thƣờng mọc tạo gốc với trục chính
khoảng 90 độ. Phần ngọn sợi nấm thƣờng có dạng nhƣ ngọn cây thơng hay kim tự
tháp.
Cuống bào tử có hình dạng chùm, phân nhánh liên tục, ở cuối nhánh phát
triển thành một khối tròn mang các bào tử trần khơng có vách ngăn, liên kết với nhau
thành chùm nhỏ ở đầu nhánh nhờ chất nhầy và mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình.
Đính bào tử hình cầu, đƣờng kính 3,6 - 4,5m, có màu xanh lục, có vách xù xì. Bào
tử hình cầu, màu xanh đậm, kích thƣớc từ (4 - 5)x(2,5 - 3)m [16].
5



Hình 1.2: Trichoderma viride trên mơi trƣờng M2YA [66]
1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma viride
Trichoderma là một giống nấm hoại sinh trong đất và nó có khả năng sử dụng
hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon và năng lƣợng đƣợc Trichoderma
sử dụng là monosaccharide và disaccharide, cùng với hỗn hợp polysaccharide,
purine, pyrimidine, axit amin, tannin và catechin. Trichoderma viride có thể sử dụng
cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp, và tăng trƣởng mạnh khi sử dụng nitơ ở
các dạng ion amon [39].
Các ion kim loại khác với nồng độ thấp cũng rất quan trọng cho sự tăng
trƣởng, trong khi nồng độ cao lại ức chế sự tăng trƣởng. Thêm vào đó, nồng độ Cd2+
và Hg2+ ở 1 – 10mM sẽ ức chế Trichoderma viride tăng trƣởng và hình thái khơng
bình thƣờng [39].
Ngồi ra, muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp nhƣ vitamin cũng có ảnh
hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của Trichoderma. Đặc biệt, muối NaCl sẽ làm giảm
sự sinh trƣởng và phát triển một số loài Trichoderma [71].
Trichoderma viride sinh trƣởng ở nhiệt tối thiểu 00C, tối ƣu 20 đến 280C, tối
đa 30 - 370C và pH từ 1,5 đến 9, pH tối ƣu tại 4,5 đến 5,5 [71].

6


Trichoderma viride có khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ cellobiase,
cellulase, endo ß-1-4-hydrolase, endo 1,3 ß-cellulase, endo 1,3 ß-glucanase, endo 1,3
ß-xylanase, exo-glucanasexylanase, chitinase, protease, amylase và pectinase [71].
1.1.4 Các cơ chế phòng trừ sinh học của nấm Trichoderma đối kháng với nấm
bệnh
Trichoderma có khả năng sống trên nhiều loại nấm bệnh quan trọng trên
nhiều loại cây trồng nhƣ Fusarium spp., Pythium, Rhizoctonia solani, Scerotium

rolfsii. Sự tƣơng tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác đƣợc theo các
cơ chế nhƣ ký sinh lên cơ thể của nấm bệnh, tiết ra các chất kháng nấm bệnh, cạnh
tranh dinh dƣỡng và không gian với nấm bệnh. Những cơ chế này không tách biệt
nhau và cơ chế đối kháng thực tế là một trong những loại cơ chế này.
Theo Pates và ctv 1999 , cho rằng chủng Trichoderma viride có một hoạt
động quan trọng là tiết ra enzyme để tấn công hoặc loại bỏ độc tố đƣợc tổng hợp bởi
các tác nhân gây bệnh [57].
Cơ chế ký sinh: là một quá trình phức tạp qua 4 giai đoạn:
+ Khi nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh thì nó tăng nhanh về hƣớng nấm
bệnh để tiếp xúc với nấm bệnh.
+ Nhận dạng đặc hiệu, có lẽ trung gian bởi lectin trên bề mặt tế bào của cả tác
nhân gây bệnh và nấm đối kháng.
+ Tiếp theo xảy ra quá trình “giao thoa sợi nấm” của sợi nấm Trichoderma
quấn quanh và tăng trƣởng dọc theo sợi nấm bệnh.
+ Cuối cùng là sự bài tiết các enzyme phân giải thành vách tế bào chất của
nấm bệnh, nhờ đó mà nấm đối kháng Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm
bệnh, phá vỡ và tiêu diệt nấm bệnh. Các hệ enzyme ngoại bào phân giải vách tế bào
nấm ký sinh thực vật gồm chitinase, β-glucanase và protease. Trong đó, nhóm
endochitinase thuộc enzyme chitinase đóng vai trị quan trọng trong cơ chế enzyme
này vì sự cảm ứng đa dạng và thƣờng xuyên hơn những nhóm exochitinase,
chitobiosidase, chitobiase trong toàn hệ chitinase [28].
7


Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra: endochitinase, glucanase 1,3beta-glucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrysin, cellulase, protease và lipase.
Trong đó endochitinase và glucanase 1,3-beta-glucosidase là 2 enzyme quan trọng
trong việc phân hủy vách tế bào của các loài nấm, làm tăng khả năng đối kháng của
Trichoderma.

Hình 1.3: Nấm Trichoderma spp. tấn công và tiêu diệt nấm bệnh Pythium [48]

Cơ chế tiết kháng sinh
Chất kháng sinh đƣợc dùng để chỉ các chất biến dƣỡng thứ cấp gồm các hợp
chất cần thiết cho sự sống của chúng, bao gồm khả năng cộng sinh hoặc cạnh tranh
chống lại vi sinh vật khác. Khả năng tiết kháng sinh của lồi Trichoderma phụ thuộc
vào tính kháng nấm và nhóm hóa chất mà chúng gắn kết vào.
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh rằng Trichoderma có thể ký sinh
nấm gây bệnh và sản xuất chất kháng sinh. Weindling (1932) mô tả chi tiết các
mycoparasitism của một tác nhân gây bệnh nấm giảm xóc (Rhizoctonia solani) bởi
các sợi nấm của Trichoderma bao gồm: cuộn xung quanh các sợi nấm, xâm nhập,
phân hủy tế bào chủ. Ông cũng mô tả một loại kháng sinh gây độc cho cả
Rhizoctonia solani và Sclerotinia americana, và đặt tên là gliotoxin. Chất kháng sinh
glovirin từ Trichoderma virens đã ức chế mạnh mẽ loài Pythium ultimun và các loài
Phytopthora [7].
8