ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYL-GLUCOSAMINE TỪ
NANG MỰC ỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018


i

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: .....................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: ............................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2: ............................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ..............................................................
2. ..............................................................
3. ..............................................................
4. ..............................................................
5. ..............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN

MSHV : 1570890

Ngày, tháng, năm sinh: 28/11/1992

Nơi sinh: Đồng Tháp


Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số : 60540101

I. TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE TỪ NANG MỰC
ỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Khảo sát các điều kiện trong quá trình xử lý protein nang mực tách chiết βchitin bằng enzyme alcalase 2.4l: tỉ lệ nang : đệm, pH, nhiệt độ, tỉ lệ E/S và thời gian
xử lý.
 Khảo sát các điều kiện trong quá trình xử lý β-chitin thu nhận Nacetyglucosamine bằng enzyme Viscoenzyme Cassava C: nồng độ chitin huyền phù,
pH, nhiệt độ, tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân.
 Tối ưu hóa q trình thủy phân β-chitin thu nhận N-acetyglucosamine bằng
enzyme Viscoenzyme Cassava C.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 16/01/2017
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)



iii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm, Khoa kỹ
thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi về
trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp tôi thực hiện đề tài đúng tiến độ.
Cảm ơn quý thầy cô Bộ môn công nghệ thực phẩm đã giảng dạy, truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Ngun, quản lý phịng thí
nghiệm B10 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa
chất... trong suốt thời gian làm đề tài nghiên cứu.
Đặc biệt cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cô GS. TS Đống Thị Anh
Đào đã tận tình hướng dẫn và có những định hướng thiết thực giúp tôi giải quyết các
vấn đề nghiên cứu một cách hiệu quả và khoa học nhất.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, các em ở phịng
thí nghiệm B10 đặc biệt là bạn Nguyễn Thị Nhân Bằng, Nguyễn Quang Sáu, em
Nguyễn Trần Ngọc Bích và Lê Thái Luân đã đồng hành, động viên, khích lệ và tạo
mọi điều kiện tốt nhất để tơi thử nghiệm và hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, thầy cơ và bạn bè.
Trân trọng cảm ơn!
TP. HCM, tháng 12 năm 2017
Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Thảo Nguyên


iv

ABSTRACT

The production of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) is indeed important in food
supplements for the treatment of osteoarthritis. N-acetylglucosamine was produced
by partial hydrolysis of the marine biopolymer chitin using industrially bulkproduced enzyme preparations. In this work, N-Acetylglucosamine (GlcNAc) was
produced from colloidal β-chitin (squid pen) by using non-specific action of crude
Viscoenzyme Cassava C enzyme obtained from Trichoderma reesei. The optimal
condition to prepare N-acetylglucosamine was established: Viscoenzyme Cassava C
treatment of chitin at pH 5.0 and 55oC within enzyme/substrate ratio of 3.28%,
yielded 16.67% of N-acetylglucosamine after 4.48 hour-incubation. Concentration of
0.5% colloidal β-chitin was found to be the most suitable ratio. N-acetylglucosamine
product contains 16.67% N-acetylglucosamine, 3.2% ash, 33.33% maltodextrin and
the oligochitins and short chain chitins is 47.8%. Squid pen is claimed as an excellent
source to extract β-chitin. The characteristic of material has been confirmed that the
absence of mineral is negligible, therefore, demineralization is unnecessary
proceeded in order to avoid chain degradation. Deproteinization is performed with
alcalase enzyme from Bacillus licheniformis and the condition to prepare β-chitin was
established: an enzyme/substrate ratio of 390 UI/g for 45 min at 60oC within a
solid/solvent ratio is 1:5 (w/w). After protein hydrolysis, the residual enzyme
contained in product is found to be 0.51%.


v

TĨM TẮT
Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết lập được quy trình thu nhận N-acetyl
glucosamine từ nang mực ống tươi, qua hai cơng đoạn chính: là thủy phân loại protein
của nang mực bằng enzyme alcalase 2.4L thu β-chitin và thủy phân β-chitin bằng
enzyme Viscoenzyme Cassava C thu nhận N-acetylglucosamine với hiệu suất tồn
quy trình là 16.67%. Các thơng số của quá trình xử lý protein thu β-chitin như sau: tỉ
lệ nang : đệm là 1: 5 (w/w), pH: 7.5, nhiệt độ: 60oC, tỉ lệ E/S: 496.35 UI/g và thời
gian thủy phân: 45 phút. Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát và tối ưu hóa các

yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân β-chitin thành N-acetylglucosamine bằng
enzyme Viscoenzyme Cassava C thu được kết quả như sau: Nồng độ chitin huyền
phù thích hợp để thủy phân là 0.5% (w/v), pH: 5.0, nhiệt độ: 55oC, tỉ lệ E/S: 3.28%
(v/v) và thời gian thủy phân: 4.48 giờ.
Từ dịch thủy phân thu được, tiến hành ly tâm và lọc. Sau đó cô quay tách nước
đạt nồng độ chất khô 20%, phối trộn với maltodextrin và sấy phun ở 140oC thu được
bột thô chứa N-acetylglucosamine. Chế phẩm được kiểm tra bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) có hàm lượng N-acetylglucosamine là 15.94%.
Với hiệu suất 21.65% để thu nhận N-acetylglucosamine là chưa cao nhưng đề tài
cũng đã góp ý tưởng phần nào cho việc tận dụng và định hướng khoa học trong quá
trình xử lý phế liệu theo hướng bền vững cho ngành chế biến thủy sản nói chung cho
mực ống nói riêng để tạo ra chế phẩm N-acetylglucosamie có giá trị sinh học cao
đồng thời giảm giá thành sản phẩm, sử dụng chế phẩm enzyme phổ biến trên thị
trường là alcalase và cellulase trong quá trình nghiên cứu nhằm làm giảm dư lượng
hóa chất khi sản xuất bằng phương pháp hóa học ra môi trường.


vi

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn này là do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của Cô GS.TS. Đống Thị Anh Đào. Các kết quả nghiên cứu và
các kết luận trong luận văn này là trung thực và không sao chép từ bất cứ một nguồn
nào, dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện
trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Mọi sao chép không hợp
lệ, vi phạm qui chế đào tạo, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thảo Nguyên



vii

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................1
1.1. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU .............................................................1
1.1.1.

Tình hình xuất khẩu mực ống..............................................................1

1.1.2.

Nguồn phế liệu – nang mực ống .........................................................2

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITIN...........................................................................8
1.2.1.

Cấu tạo .................................................................................................8

1.2.2.

Tính chất của chitin ...........................................................................10

1.2.3.

Các phương pháp sản xuất chitin ......................................................10

1.3. TỔNG QUAN VỀ GLUCOSAMINE .........................................................16
1.3.1.


Tình hình sản xuất glucosamine ........................................................16

1.3.2.

Cấu trúc .............................................................................................17

1.3.3.

Ứng dụng N-acetylglucosamine ........................................................20

1.4. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT GLUCOSAMINE ......................................22
1.4.1.

Phương pháp hóa học ........................................................................22

1.4.2.

Phương pháp enzyme ........................................................................23

1.4.3.

Phương pháp enzyme cải tiến............................................................25

1.5. Tổng quan về enzyme ..................................................................................26
1.5.1.

Enzyme alcalase 2.4L ........................................................................26

1.5.2.


Enzyme cellulase ...............................................................................29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................35
2.1. ĐỐI TƯỢNG ...............................................................................................35
2.1.1.

Nang mực ống ...................................................................................35

2.1.2.

Enzyme ..............................................................................................35


viii

2.1.3.

Hóa chất .............................................................................................35

2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ...........................................................................36
2.2.1.

Dụng cụ .............................................................................................36

2.2.2.

Thiết bị...............................................................................................37

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................39

2.3.1.

Sơ đồ quy trình nghiên cứu ...............................................................39

2.3.2.

Bố trí thí nghiệm khử protein bằng enzyme alcalase 2.4L................42

2.3.5.

Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitin của

enzyme Viscoenzyme Cassava C ......................................................................52
2.3.6.

Phương pháp phân tích ......................................................................53

2.3.7.

Phương pháp xử lý số liệu .................................................................53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................54
3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC NANG MỰC .............................54
3.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHITIN .....................................54
3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME .............................................................54
3.4. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT TỈ LỆ NANG:DUNG DỊCH ĐỆM ẢNH
HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN CÒN LẠI ..........................................55
3.5. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ THỦY PHÂN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU
SUẤT THỦY PHÂN PROTEIN ..........................................................................56
3.5.1.


Thí nghiệm 2: khảo sát pH xử lý protein...........................................56

3.5.2.

Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ xử lý protein..................................58

3.5.3.

Thí nghiệm 4: Khảo sát tỉ lệ E/S xử lý protein ..................................59

3.5.4.

Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian xử lý protein ................................61


ix

3.6. THÍ NGHIỆM 6: KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ CHITIN HUYỀN PHÙ ẢNH
HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE .........62
3.7. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ THỦY PHÂN CHITIN ẢNH HƯỞNG ĐẾN
HIỆU SUẤT THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE ..................................64
3.7.1.

Thí nghiệm 7: Khảo sát pH thủy phân thu nhận GlcNAc .................64

3.7.2.

Thí nghiệm 8: Khảo sát nhiệt độ thủy phân thu nhận GlcNAc .........66


3.7.3.

Thí nghiệm 9: Khảo sát tỉ lệ E/S thủy phân thu nhận GlcNAc .........67

3.7.4.

Thí nghiệm 10: Khảo sát thời gian thủy phân thu nhận GlcNAc ......69

3.8. THÍ NGHIỆM 11: TỐI ƯU HĨA CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
HIỆU SUẤT THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE ..................................70
3.8.1.

Xem xét sự ảnh hưởng của các yếu tố đối với hiệu suất thu nhận

GlcNAc 70
3.8.2.

Tối ưu hóa 2 yếu tố tỷ lệ E/S và thời gian .........................................72

3.9. PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM N-ACETYLGLUCOSAMINE THƠ THU
ĐƯỢC ...................................................................................................................77
3.9.1.

Hình SEM thể hiện cấu trúc bề mặt của nang mực và β-chitin .........77

3.9.2.

Thành phần mẫu chế phẩm N-acetylglucosamine thô ......................77

4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................79

4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................82
PHỤ LỤC ..................................................................................................................89
A.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..........................................................89
A.1. Xác định hoạt độ enzyme Viscoenzyme Cassava C và lượng glucosamine
tạo thành theo phương pháp Elson-Morgan ......................................................89
A.2. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi..........93


x

A.3. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung.....................................94
A.4. Xác định hàm lượng protein thô bằng phương pháp Kjeldahl ..................95
A.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Microbiuret .......99
A.6. Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp Anson ................101
A.6. Cách pha dung dịch đệm .........................................................................104
B.

CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM ........................................106
B.1. Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát tỉ lệ nang:đệm
.........................................................................................................................106
B.2. Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát pH ............107
B.3. Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát nhiệt độ ....107
B.4. Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát tỉ lệ E/S ....109
B.5. Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát thời gian thủy
phân .................................................................................................................111
B.6. Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo nồng độ chitin huyền phù
.........................................................................................................................112

B.7. Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo pH ...............................113
B.8. Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo nhiệt độ .......................114
B.9. Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo tỉ lệ E/S .......................115
B.10. Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo thời gian thủy phân ...117

C.

CÁC KẾT QUẢ GỬI MẪU ......................................................................119


xi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình hình xuất khẩu mực và bạch tuộc của Việt Nam ...............................1
Hình 1.2. Cơ cấu thị trường nhập khẩu mực, bạch tuộc 9 tháng đầu năm 2017 .........2
Hình 1.3. Hình dạng mực ống .....................................................................................5
Hình 1.4. Cấu tạo mực ống .........................................................................................6
Hình 1.5. Nang mực sau khi rửa sạch và để ráo .........................................................8
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của chitin .........................................................................9
Hình 1.7. Sự sắp xếp của chuỗi polime của α-chitin, β-chitin, γ-chitin ....................10
Hình 1.8. Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản ..11
Hình 1.9. Quy trình sản xuất chitin từ vỏ tơm thẻ bằng Bacillus subtilis của
Theruvathil K. Sini (2007) ........................................................................................14
Hình 1.10. Quy trình tách chiết chitin bằng Lactobacillus plantarum .....................15
Hình 1.11. Cấu tạo hóa học của glucosamine ...........................................................17
Hình 1.12. Cấu tạo hóa học của Glucosamine hydrochloride ...................................19
Hình 1.13. Cấu tạo hóa học của Glucosamine sulfate ..............................................19
Hình 1.14. Cấu tạo hóa học của N-acetylglucosamine .............................................20
Hình 1.15. Cấu trúc của proteoglycans .....................................................................21
Hình 1.16. Quy trình sản xuất N-acetyl D-glucosamine của Charles A. Haynes .....24

Hình 1.17. Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine theo các loại enzyme khác nhau
trong cùng một điều kiện...........................................................................................26
Hình 1.18. Cơ chế thủy phân protein của enzyme alcalase ......................................29
Hình 1.19. Cấu tạo phức hợp enzyme cellulase ........................................................31
Hình 1.20. Cơ chế tác động của phức hợp enzyme cellulase....................................33
Hình 1.21. Cơ chế của 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) .................33


xii

Hình 1.22. Cơ chế 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) ......................34
Hình 1.23. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) .............................34
Hình 2.1. Hóa chất cần thiết sử dụng trong quá trình nghiên cứu ............................35
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận N-acetylglucosamine ........................................39
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình nghiên cứu .......................................................................42
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân protein bằng enzyme alcalase
2.4L ...........................................................................................................................44
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm thủy phân chitin huyền phù bằng enzyme Viscoenzyme
Cassava C ..................................................................................................................49
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ nang:đệm đến hàm lượng protein còn lại .................55
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein cịn lại ...................................57
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein cịn lại ...........................58
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hàm lượng protein còn lại ...........................60
Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng protein cịn lại ........61
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù đến hiệu suất thu nhận Nacetylglucosamine .....................................................................................................63
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine ............65
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine ....66
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine ....68
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận Nacetylglucosamine .....................................................................................................69



xiii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của mực ống

4

Bảng 1.2. Thành phần khối lượng mực

6

Bảng 1.3. Một số ứng dụng của các loại phế liệu mực

7

Bảng 1.4. Thành phần hóa học cơ bản của nang từ một số loại mực ống

8

Bảng 2.1.Dụng cụ sử dụng trong quá trình nghiên cứu

36

Bảng 2.2.Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

37

Bảng 3.1. Thành phần hóa học của nang mực ống


54

Bảng 3.2. Thành phần hóa học của chitin

54

Bảng 3.3. Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman

70

Bảng 3.4. Bảng kết quả thí nghiệm theoma trận Plackett-Burman

71

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các biến trong ma trận Plackett-Burman

72

Bảng 3.6.Các mức yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa trong bài tốn tối ưu hóa 2 yếu tố tỷ
lệ E/S và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận N-acetyl glucosamine (%)

72

Bảng 3.7. Kết quả hiệu suất thu nhận GlcNAc (%) theo các yếu tố khi tiến hành thí
nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm.

73

Bảng 3.8. Hệ số phương trình hồi quy và ảnh hưởng của các biến đến HGlcNAc


74

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận
GlcNac thô

76

Bảng 3.10. Kết quả hiệu suất thu hồi GlcNAc thơ (%) từ phương trình hồi quy và
thực nghiệm

76

Bảng 3.11. Thành phần hóa học của chế phẩm

77


xiv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Viết đầy đủ

Cpr

Hàm lượng protein hòa tan còn lại

E/S


Enzyme/cơ chất

GlcNAc

N-acetylglucosamine

GAGs

Glycosaminoglycan

HGluNAc

Hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine

ManNAc

N-acetylmannosamine

Neu5Ac

Acid N-Acetylneuraminic


xv

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sản lượng khai thác mực ống trên toàn vùng biển Việt Nam hằng năm khoảng
24000 tấn. Trong đó lượng nang mực chiếm 0.2 – 0.3% khoảng 48 – 72 tấn là nguồn
phế liệu lớn cho ngành công nghiệp sản xuất chitin và N-acetylglucosamine bởi hàm
lượng khoáng trong nang rất thấp nên hiệu suất thu hồi chitin và N-acetylglucosamine

từ nguyên liệu sẽ cao.
Bệnh viêm khớp là một trong những bệnh lý thường gặp nhất trên thế giới. Nó là
một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tàn phế ở người mắc bệnh. Bệnh khởi
phát từ tuổi ấu thơ, số lượng người bị tàn phế được ước tính ngày càng tăng cao.
Glucosamine là thành phần cơ bản của sụn, tham gia q trình chuyển hóa tổng hợp
nên thành phần của sụn khớp, giúp làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp, nên tăng
độ nhớt, tăng khả năng bôi trơn của dịch khớp. Vì thế các dạng glucosamine khơng
nghững làm giảm triệu chứng của thối hóa khớp (đau, khó vận động) mà cịn ngăn
chặn q trình thối hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp,
hỗ trợ điều trị bệnh.
Trên thế giới, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu thu nhận N-acetylglucosamine
từ nang mực bằng nhiều phương pháp khác nhau và ứng dụng vào trong các sản phẩm
thực phẩm chức năng, hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp cho người. Tuy nhiên,
ở nước ta vẫn chưa có những cơng trình nghiên cứu cụ thể nào về vấn đề này, chủ
yếu là sử dụng phương pháp hóa học và trên ngun liệu là từ vỏ tơm. Các sản phẩm
thực phẩm chức năng trên thị trường đa số đều được nhập khẩu từ nước ngoài với giá
thành khá cao.
Trước thực trạng đó, chúng tơi quyết định nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thu nhận
n-acetylglucosamine từ nang mực ống bằng phương pháp enzyme”. Trong nghiên
cứu này chúng tôi sử dụng enzyme thương mại sẵn có trên thị trường Việt Nam: sử
dụng enzyme alcalase để loại protein thu β-chitin và enzyme cellulase để thủy phân
β-chitin thu N-acetyl glucosamine.


1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU


1.1.1.

Tình hình xuất khẩu mực ống

a. Sản lượng khai thác
Sản lượng khai thác mực ống trên toàn vùng biển Việt Nam hằng năm khoảng
24.000 tấn, trong đó vùng biển miền Nam có sản lượng cao nhất là khoảng trên 16.000
tấn (chiếm 70%), Vịnh Bắc Bộ chiếm sản lượng lớn thứ nhì, khoảng 5000 tấn (20%),
cịn biển miền Trung có sản lượng thấp nhất khoảng 2.500 tấn (10%). (Theo Hội nghề
cá tỉnh Khánh Hoà).
b. Tình hình xuất khẩu mực tại Việt Nam
Tính đến hết tháng 9/2017, tổng giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc của Việt Nam
đạt 457.9 triệu USD, tăng 53.5% so với cùng kỳ năm trước. Giá trị xuất khẩu sang
top 9 thị trường chính đều tăng trưởng tốt so với cùng kỳ năm 2016. (Nguồn Hiệp hội
chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam).

Hình 1.1. Tình hình xuất khẩu mực và bạch tuộc của Việt Nam
năm 2016 và 2017
Các sản phẩm mực tiếp tục là sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam trong
năm nay, chiếm 58.6% tổng giá trị xuất khẩu trong 9 tháng đầu năm. Trong các dòng
sản phẩm mực, bạch tuộc xuất khẩu, mực tươi, sống và đông lạnh chiếm tỷ trọng cao
nhất 38.2%. Các sản phẩm bạch tuộc khô/muối/tươi sống và đông lạnh chiếm 34%.


2

Hình 1.2. Cơ cấu thị trường nhập khẩu mực, bạch tuộc 9 tháng đầu năm
2017
Hiện nay mực, bạch tuộc của Việt Nam xuất khẩu sang 65 thị trường. Trong đó,

tổng giá trị xuất khẩu sang 9 thị trường lớn chiếm 99% bạch tuộc trong 9 tháng đầu
năm nay. Xuất khẩu mực, bạch tuộc trong quý cuối cùng của năm nay vẫn sẽ tiếp tục
khả quan. (Nguồn Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam)
Từ tình hình sản xuất và xuất khẩu như trên thấy được rằng
có một lượng lớn phế liệu nang mực đựợc thải ra trong q trình chế biến và cần có
biện

pháp

xử

lý

một

cách

khoa

học nhằm tận dụng nguồn phế liệu hữu ích này tạo nền móng cho công nghiệp sản
xuất

N-acetyl-glucosamine

và

các

ngành


công

nghiệp khác.
1.1.2.

Nguồn phế liệu – nang mực ống

a. Giới thiệu về mực ống
Phân bố
Biển và đại dương chiếm 70 - 78% diện tích bề mặt Trái Đất (361 triệu km2).
Khoảng 10 - 12 triệu tấn đạm động vật được khai thác hằng năm từ các sinh vật biển,
chiếm gần 1/3 nhu cầu của con người về đạm động vật. Trên 1.5 tỷ người sống ở khu
vực Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương dùng các sản phẩm của biển và Đại dương
là nguồn cung cấp đạm chủ yếu.
Việt Nam có có trên 3200km bờ biển, vùng biển thuộc đặc quyền kinh tế khoảng
1 triệu km2 (gấp 4 lần diện tích đất liền). Theo thơng tin và phân tích của các chuyên
gia nguồn lợi và quản lý, khả năng đánh bắt ở vùng biển ven bờ đạt khoảng 700 000


3

tấn/năm, trong đó mực chiếm bình qn 3.5% sản lượng thuỷ sản. (Theo Hiệp hội
chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam)
Mực phân bố khắp các vùng biển và đại dương trên tồn thế giới. Nó có thể sống
ở vùng biển nóng và có nồng độ muối cao. Mực có tính hướng quang mạnh và rất
nhạy cảm với hiện tượng thời tiết. Khi có hiện tượng sắp giơng bão, mực rút ra xa bờ
và tập trung xuống sâu có thể đến 5000 – 6000m. Những lúc mặt trời lặn, mực thường
nổi lên trên mặt nước để lấy khơng khí, ban ngày thì mực tập trung xuống sâu. Trong
quá trình sinh sản hoặc di cư tìm mồi, mực tập trung thành đàn sống thành quần thể.
Mực di chuyển rất nhanh, khi gặp kẻ thù thì chúng phun túi mực đen ra rồi lẫn vào

đá. Đời sống của mực rất ngắn, riêng mực cái thường chết sau khi đẻ xong. Tuy nhiên,
số lượng mực con được bổ sung thường xuyên. Mực có khả năng lớn nhanh, đạt đến
cỡ trưởng thành khoảng 6 tháng đến 1 năm tùy loại.
Mực thường sống ở vùng ven thềm lục địa, gần sát dốc ngang bờ, ở nơi có chất
đáy là cát trộn lẫn với vỏ sò, hến, đá vụn hay những vùng đá ngầm bằng phẳng có độ
sâu nước từ 100 ÷ 300m, chỗ có nhiệt độ thay đổi đột ngột. Ngồi ra, mực cịn sống
ở những chỗ nước sủi bọt và nước xoáy. Đây chính là chỗ tập trung của sinh vật phù
du, đồng thời cũng là nguồn thức ăn hấp dẫn cho mực.
Mùa vụ của mực rộ nhất là từ tháng 4 đến tháng 9. Đặc biệt là các tháng 7, tháng
8 và 9. Thơng thường, người ta có thể đánh bắt mực quanh năm và lúc thuỷ triều thay
đổi là tốt nhất. Mực thường kiếm ăn vào ban đêm, còn ban ngày mực chìm xuống
đáy. Mực lớn lên hình thành tuyến sinh dục ở ngồi khơi, đến khi sinh sản thì chúng
kéo vào bờ. Vì vậy, con người dựa vào những đặc điểm trên để đánh bắt mực có hiệu
quả và sản lượng cao. (Theo FAO – Tổ chức lương thực là nơng nghiệp Liên Hiệp
Quốc)
Phân loại
Lồi mực là nhóm động vật thân mềm trong các siêu bộ mười chân
(Decapodiformes) và một phần của siêu bộ Bạch tuộc (Octopodiformes). Mực chia
làm các bộ như: Mực ống, mực nang, mực bánh bao (mực lùn mập), mực khổng lồ.
Siêu bộ Mười chân, danh pháp khoa học: Decapodiformes, là một siêu bộ trong
lớp Chân đầu (Cephalopoda), bao gồm tất cả các loài mực với 10 chi; tên gọi của nó


4

có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là mười chân. Mười chi của chúng được
chia ra thành 8 tay và 2 xúc tu. Người ta giả định rằng Coleoidea tổ tiên có 5 cặp chi
giống nhau và một nhánh đã tiến hóa để biến đổi cặp tay thứ IV và trở thành các loài
của siêu bộ Decapodiformes. Một nhánh khác cũng tiến hóa và cuối cùng mất đi cặp
tay thứ II, trở thành các loài của siêu bộ Octopodiformes.

Siêu bộ Decapodiformes bao gồm các bộ sau:
-

Bộ Spirulida: Mực ống sừng cừu

-

Bộ Sepiida: Mực nang

-

Bộ Sepiolida: Mực ống đuôi cụt, mực ống lùn

-

Bộ Teuthida: Mực ống

Mực ống là tên thường gọi của các thành viên thuộc Bộ Mực ống (danh pháp khoa
học: Teuthida), bao gồm 304 loài. Giống như các lồi thân mềm khác, mực ống có
phần thân và đầu rõ ràng, cơ thể đối xứng hai bên, một lớp áo và có nhiều “xúc tu”.
Tương tự như mực nang, mực ống có tám xúc tu sắp xếp theo cặp và hai xúc tu dài
hơn cả. Mực ống là lồi bơi khỏe, một số lồi cịn có khả năng phi ra khỏi mặt nước
một khoảng cách ngắn. Mực ống có chứa hợp chất mực màu đen trong cơ thể, khi
gặp nguy hiểm, mực phun ra tạo màn đen dày đặc, qua đó lẫn trốn khỏi nguy cơ đe
dọa.
Mực ống thuộc lớp Cephalopoda, phân lớp Coleoidea, bộ Teuthida. Phân bộ
Teuthida gồm hai phân bộ chính là Myopsina và Oegopsina (bao gồm mực khổng lồ
như Architeuthis dux). Bộ mực ống Teuthida là bộ lớn nhất với hơn 300 loài được
phân vào 29 họ.
Teuthida là thành viên của siêu bộ Decapodiformes (tiếng Hy Lạp: “mười chân”).

Hai bộ khác thuộc siêu họ Decapodiformes cũng được gọi là mực, mặc dù theo thang
phân loại chúng nằm khá xa bộ Teuthida và cấu trúc giải phẫu tổng kết cũng khác
biệt. Chúng là mực đuôi cụt thuộc bộ Sepiolida và mực ống sừng cừu, loài duy nhất
thuộc bộ Spirulida. Loài mực ma cà rồng lại giống bạch tuộc hơn là mực.
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của mực ống


5

Phân loại khoa học
Giới (regnum)

Animalia

Ngành (phylum)

Mollusca
Cephalopoda

Lớp (class)
Phân lớp (subclass)

Coleoidea

Liên bộ (superordo)
(không phân hạng)

Decapodiformes
Neocoleoidea
Teuthida


Bộ (ordo)

(Theo FAO – Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)
b. Cấu tạo mực ống
Phần thân mực được bao phủ bởi lớp áo mực, với một vây bơi mỗi bên. Khơng
giống các lồi sinh vật biển khác, ở hầu hết các loài mực, vây bơi khơng phải là cơ
quan vận động chính.
Da mực chứa nhều sắc tố có khả năng thay đổi màu sắc theo mơi trường xung
quanh, khiến nó gần như vơ hình. Màu sắc phần mặt dưới luôn nhạt màu hơn mặt
trên, giúp mực ngụy trang, đánh lừa cả kẻ thù lẫn con mồi.

Hình 1.3. Hình dạng mực ống
Bên dưới thân mình là khoang áo, chứa mang, các cơ quan bài tiết và sinh sản.
Đối diện khoang áo là ống phễu, giúp mực di chuyển bằng cách đẩy nước ra khỏi cơ
thể. Ở hình thức vận động này, nước được hút vào khoang áo và được đẩy ra qua ống
phễu tạo ra dòng nước phản lực nhanh và mạnh. Hướng của ống phễu có thể được
thay đổi phù hợp với hướng di chuyển.
Dưới khoang áo, ngoài ống phễu là các nội quan, được bao phủ bởi một lớp biểu
bì mỏng. Dưới đó là các nội quan lớn của mực.


6

Hình 1.4. Cấu tạo mực ống
Thành phần khối lượng của mực ống
Thành phần khối lượng của nguyên liệu mực là tỉ lệ phần trăm về khối lượng của
từng bộ phận hoặc từng cơ quan trong cơ thể nguyên liệu. Sự phân chia này dựa vào
hình thái học của nguyên liệu cũng như phần ăn được của chúng trong công nghệ chế
biến. Thành phần khối lượng của mực phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: giống loài, độ

thành thục sinh lý, ngư trường khai thác…
Bảng 1.2. Thành phần khối lượng mực
Thành phần

Phần trăm khối lượng (%)

Thân mực

51.9 – 54.46

Đầu mực

17.6 – 20.1

Túi mực

6.3 – 10.6

Gan mực

2.4 – 6.4

Nang mực

0.3 – 0.5

Phần cịn lại

11.8 - 15.1


c. Lồi mực ống tại Việt Nam
Cũng như mực nang, ở vùng biển phía Bắc, mực ống tập trung ở các vùng đánh
bắt mực chính là quanh đảo Cát Bà, Cái Chiên, Cơ Tơ, Hịn Mê - Hòn Mát và khu


7

vực Bạch Long Vĩ, nhất là vào mùa xuân. Ở vùng biển phía nam, các vùng tập trung
mực chủ yếu là ở Phan Rang, Phan Thiết, Vũng Tàu, Cà Mau và quanh Cơn Đảo, Phú
Quốc.
d. Phế phẩm của q trình sản xuất mực
Trong quá trình chế biến mực, một số phế phẩm có thể kể đến như nội tạng, đầu,
nang mực, vây, da, mực… và lượng phế phẩm đó có thể lên đến 24% tổng khối lượng
mực nguyên liệu. [1]
Bảng 1.3. Một số ứng dụng của các loại phế liệu mực [1]
Nguyên liệu
Gan mực

Sản phẩm
Tinh thể lỏng, mồi câu cá, Omega – 3 (EPA, DHA), thức
ăn cho cá hoặc vật nuôi

Mực

Thuốc nhuộm, thực phẩm tốt cho sức khoẻ, vật liệu
chống ung thư

Da mực

Thuốc nhuộm, colagen, một số sản phẩm mỹ phẩm


Nang mực

Chitin, sợi thiên nhiên

Nội tạng

Chất điều vị trong quá trình lên men sản xuất nước mắm,
sản xuất một số đa chất nhất EPA, DHA và acid béo
khơng bão hồ khác, áp dụng trong q trình sản xuất
lecithin và enzyme.

Đi mực (tai mực)

Nguyên liệu thô cho một số sản phẩm ướp gia vị hoặc
chế biến.

Nang mực
Nang mực là bộ phận cứng trong cơ thể của mực, có hình lơng chim và kéo dài
dọc theo chiều dài thân. Nang mực chiếm tỉ lệ khoảng 0.3 - 0.5% trọng lượng của
toàn thân mực ống nguyên liệu tươi.Nang mực linh hoạt nhưng vững chắc, trong suốt,


8

có gờ dọc và chủ yếu bao gồm chitin, có vai trò hỗ trợ cho lớp áo mực và làm chỗ
bám cho các cơ. Nang mực chứa nhiều chitin nên được ứng dụng trong công nghệ
sản xuất chitin hoặc một số dẫn xuất khác như chitosan, glucosamine [2]…

Hình 1.5. Nang mực sau khi rửa sạch và để ráo

Bảng 1.4. Thành phần hóa học cơ bản của nang từ một số loại mực ống
Hàm lượng* (%)

Thành phần
hoá học
Loligo

Mực

Todarodes

Illex

Ommastrephes

Chenisis

ống [4]

pacifica

argentines

Bartrami [7]

[5]

[6]

[3]

β-Chitin

80

49

25.5

31

35 - 40

Protein

8.3

46.2

74.6

64

58

Khoáng

1.2

4.5


0.8

0.1

-

Lipid

-

-

0.2

2.3

-

1.2.

TỔNG QUAN VỀ CHITIN

1.2.1.

Cấu tạo

Chitin là polime hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được tách chiết lần
đầu tiên vào năm 1811 bởi nhà dược hóa học người Pháp Henri Braconnot từ nấm.
[8]



9

Trong tự nhiên chitin được tồn tại trong nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau bao
gồm vỏ các loài giáp xác, cơn trùng và vi sinh vật. Trong các lồi giáp xác như tơm,
cua, ghẹ,… lồi chân đầu như mực,…và vỏ tơm hùm có hàm lượng chitin cao chiếm
60 – 75%. Từ cơn trùng thì có ở vỏ các lồi như muỗi, gián, ong mật, nhộng tằm,…
Chitin cũng tồn tại phổ biến trong giới vi sinh vật như: vi nấm, nấm mốc, nấm men,
một số loài tảo và một số loài xạ khuẩn Streptomyces. Nhưng nguồn khai thác chính
là từ phế liệu thủy sản, vỏ của các loài giáp xác đặc biệt là từ tôm và cua.
Công thức phân tử là (C8H13O5N)n. Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loại ngun
liệu (ntơm thẻ = 400÷500, ntơm hùm = 700÷800, ncua = 500÷600).
Chitin là poly (β-(1→4)- N-acetyl-D-glucosamine), một polisaccarit mạch thẳng
khơng phân nhánh, được cấu tạo bởi các monosaccharit N-acetyl-β-D-glucosamine
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 -glucoside, tạo nên một mạng lưới các sợi có tổ
chức, có cấu trúc tương tự như xenlulozo, ở carbon C-2 xenlulozo chứa nhóm
hydroxyl (–OH) cịn chitin thì chứa nhóm acetyl (–COCH3). (Hình 1.5) [9], [10], [3],
[11]

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của chitin
Trong các lồi giáp xác, chitin là thành phần cấu tạo chính tạo nên độ cứng chắc
của vỏ giáp xác, chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn kết hợp với protein dưới dạng phức
hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác.
Dựa vào nguồn tách chiết chitin người ta chia thành 3 dạng: α-chitin (từ tôm và
cua), β-chitin (từ mực) và γ-chitin. (Hình 1.7)
-

α-chitin là phổ biến nhất, được tìm thấy trong nấm và thành tế bào nấm men,

nhuyễn thể, gân và vỏ tôm hùm, cua, trong vỏ tôm và trong lớp biểu bì của cơn trùng,

có độ rắn phân tử cao nhất và ở dạng rắn chắc và các mạch chitin sắp xếp song song
nhưng ngược chiều nhau.