BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOẮC HƯƠNG POGOSTEMON
CABLIN (BLANCO) BENTH VÀ TÌM HIỂU MỘT VÀI YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: Gv.ThS. Nguyễn Trần Đông Phương

TP. HCM, 9/2013


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

1. Các thành viên:

- Nguyễn Thanh Thảo
- Nguyễn Thị Thiện Trang
- Đặng Châu Thanh


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: “Nhân giống in vitro cây Hoắc hương Pogostemon cablin (Blanco)
Benth và tìm hiểu một vài yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu”.
- Mã số:
- Chủ nhiệm: Nguyễn Trần Đông Phương
- Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ sinh học
- Thời gian thực hiện: tháng 12/2012 – tháng 12/2013
2. Mục tiêu: Nghiên cứu qui trình nhân giống in vitro cây Hoắc hương; đồng thời
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như: nồng độ khoáng đa lượng lên hàm
lượng tinh dầu cây Hoắc hương in vitro; thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất,
thời gian chưng cất, thời gian để héo nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu của cây
Hoắc hương ex vitro.
3. Tính mới và sáng tạo: Xây dựng qui trình ni cấy hồn chỉnh cây Hoắc hương in
vitro và xác định được thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất, thời gian chưng cất,
thời gian để héo nguyên liệu nhằm đạt được hàm lượng tinh dầu của cây Hoắc hương
ex vitro tối đa.
4. Kết quả nghiên cứu:

4.1. Tạo cây con hoàn chỉnh
Cây con được tạo ra trong mơi trường thích hợp nhằm mục đích đưa ra vườn ươm và
chuẩn bị sinh khối cho sự tạo tinh dầu.

4.2. Sự tạo tinh dầu
Kết quả GC-MS cho thấy có sự gia tăng tinh dầu trong mơi trường có thành phần
khoáng MS thay đổi. Thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất, thời gian chưng cất,
thời gian để héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu của cây Hoắc hương
ex vitro.
5. Sản phẩm:
- Sản phẩm đào tạo:
- Sản phẩm khoa học:

ISCE 2013

Hướng dẫn 03 sinh viên thực hiện khóa luận tốt nghiệp
01 bài báo đăng trên Hội nghị khoa học công nghệ quốc tế


6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
các kết quả trên có thể được sử dụng nhằm tạo một lượng lớn cây giống con Hoắc
hương và áp dụng quy trình thích hợp trong chiết xuất tinh dầu cây.
Ngày

tháng

năm 2013


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
Project title: Propagating patchouli Pogostemon cablin (Blanco) Benth in vitro and
investigate the effect of factors on essential oil content
Code number:
Coordinator: Nguyen Tran Dong Phuong
Implementing institution: Faculty of Biotechnology
Duration: from Dec/2012 to Dec/2013
2. Objective(s): We studied the propagation procedure and effect of macroelements of
Patchouli essential oil in vitro; simutaneously, we investigated the effect of several factors
such as: time for harvest, distilled water, time for distillation and time to wither material on
content of patchouli essential oil ex vitro.
3. Creativeness and innovativeness: We established a complete process to propagate
patchouli in vitro and time for harvest, distilled water, time for distillation and time to wither

material on content of patchouli essential oil ex vitro.
4. Research results:
4.1. Creating the complete sapling
Saplings were created in suitable medium for growing in nursery garden and prepared
biomass for producing essential oil.
4.2. Producing essential oil
GC-MS results showed that there were the increase of essential oil content in medium with
changed mineral components. Time for harvest, distilled water, time for distillation and time
to wither material affected on patchouli essential oil content ex vitro.
5. Products: Tranining: 03 students graduated. Scientific: 01 article is published at The 2013

International Symposium on Chemical Engineering (ISCE2013)
6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability: The results above
can be used to produce a considerable amount of patchouli sapling and apply this suitable
procedure for extracting the essential oil.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TĨM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: Gv.ThS. Nguyễn Trần Đông Phương

TP. HCM, 9/2013



DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU
- Nguyễn Thanh Thảo

1. Các thành viên:

- Nguyễn Thị Thiện Trang
- Đặng Châu Thanh

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: “Nhân giống in vitro cây Hoắc hương Pogostemon cablin (Blanco)
Benth và tìm hiểu một vài yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu”
- Mã số:
- Chủ nhiệm: Nguyễn Trần Đông Phương
- Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ sinh học
- Thời gian thực hiện: tháng 12/2012 – tháng 12/2013
2. Mục tiêu: Nghiên cứu qui trình nhân giống in vitro cây Hoắc hương; đồng thời
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như: nồng độ khoáng đa lượng lên hàm
lượng tinh dầu cây Hoắc hương in vitro; thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất,
thời gian chưng cất, thời gian để héo nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu của cây
Hoắc hương ex vitro.
3. Tính mới và sáng tạo: Xây dựng qui trình ni cấy hoàn chỉnh cây Hoắc hương in
vitro và xác định được thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất, thời gian chưng cất,
thời gian để héo nguyên liệu nhằm đạt được hàm lượng tinh dầu của cây Hoắc hương
ex vitro tối đa.
4. Kết quả nghiên cứu:

4.1. Tạo cây con hoàn chỉnh
Cây con được tạo ra trong mơi trường thích hợp nhằm mục đích đưa ra vườn ươm và

chuẩn bị sinh khối cho sự tạo tinh dầu.

4.2. Sự tạo tinh dầu
Kết quả GC-MS cho thấy có sự gia tăng tinh dầu trong mơi trường có thành phần
khoáng MS thay đổi. Thời gian thu hoạch, lượng nước chưng cất, thời gian chưng cất,
thời gian để héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu của cây Hoắc hương
ex vitro.


5. Sản phẩm:
- Sản phẩm đào tạo:
Hướng dẫn 03 sinh viên thực hiện khóa luận tốt nghiệp
- Sản phẩm khoa học:
01 bài báo đăng trên Hội nghị khoa học công nghệ quốc tế
ISCE 2013
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
các kết quả trên có thể được sử dụng nhằm tạo một lượng lớn cây giống con Hoắc
hương và áp dụng quy trình thích hợp trong chiết xuất tinh dầu cây.


MỞ ĐẦU
Từ xưa con người đã biết sử dụng tinh dầu để trị liệu, chăm sóc sức khỏe, và
làm đẹp. Tinh dầu Hoắc hương là hương liệu quý giúp làm giảm căng thẳng, cân bằng
tinh thần và có tầm quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất nước hoa. Hoắc hương
được trồng làm thuốc hành khí, giảm đau, tăng tiết dịch dạ dày, tăng tiêu hóa. Do đặc
tính ra hoa và quả thấp, nên Hoắc hương được trồng chủ yếu bằng phương pháp giâm
cành cho hệ số nhân giống không cao, khơng đồng đều và mẫn cảm với virus khảm.
Vì vậy, cần phải tạo được nguồn giống tốt, sạch bệnh đồng thời nâng cao lượng tinh
dầu trong cây. Chúng tôi tiến hành đề tài “Nhân giống in vitro cây Hoắc hương
Pogostemon cablin (Blanco) Benth và tìm hiểu một vài yếu tố ảnh hưởng đến hàm

lượng tinh dầu” nhằm tạo nguồn giống chất lượng cao và tìm ra các điều kiện chưng
cất tinh dầu tối ưu nhất.

NỘI DUNG
1. Tìm mơi trường tối ưu tạo chồi Hoắc hương
2. Nuôi cấy tạo rễ Hoắc hương
3. Chuyển cây Hoắc hương ra vườn ươm
4. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng và thời gian lên hàm lượng tinh dầu
Hoắc hương
5. Yếu tố ảnh hưởng hàm lượng tinh dầu ex vitro trong chưng cất (thời gian thu hái,
lượng nước chưng cất, thời gian chưng cất, thời gian để héo nguyên liệu)

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận
a. Sự tạo cây con hoàn chỉnh


Chồi tái sinh từ lá Hoắc hương in vitro tốt nhất với số lượng chồi 7,29

chồi/mẫu lá cấy trong môi trường nuôi cấy bổ sung BA 0,4 mg.l-1.


Chồi tái sinh từ lá Hoắc hương in vitro tốt nhất với số lượng chồi 2,29

chồi/mẫu lá cấy trong môi trường nuôi cấy bổ sung Kinetin 0,6 mg.l-1.


Mơi trường ni cấy có bổ sung BA chồi hình thành nhiều và nhanh hơn trong

mơi trường có bổ sung Kinetin.





Mơ sẹo Hoắc hương hình thành tốt nhất trong mơi trường MS 0,2 mg.l-1 2,4_D

với khối lượng mô sẹo thu được 0,43 g/ mẫu.


Chồi tái sinh từ lá Hoắc hương in vitro tốt nhất với số lượng chồi 8,70

chồi/mẫu lá cấy trong môi trường bổ sung kết hợp NAA và BA với nồng độ 0,2 mg.l-1
NAA + 0,2 mg.l-1 BA.


Rễ hình thành từ chồi Hoắc hương in vitro tốt nhất với chiều dài rễ 3,24 cm

trong môi trường bổ sung NAA 0,6 mg.l-1.


Cây con Hoắc hương phát triển tốt nhất với nguồn cây được lấy từ nghiệm thức

tạo rễ từ chồi Hoắc hương in vitro trên môi trường bổ sung NAA 0,5 mg.l-1.
b. Sự tạo tinh dầu


Patchouli tạo ra cao trong môi trường MS sau 6 tuần tuổi




Chưng cất tinh dầu Hoắc hương ex vitro đạt hiệu suất cao khi:
 Thời gian thu hoạch: Hoắc hương ex vitro 4 tháng tuổi, thu hoạch buổi trưa, lúc
cường độ ánh sáng bắt đầu cao nhất.
 Lượng nước chưng cất: 200 ml/ 150 g nguyên liệu tươi.
 Thời gian chưng cất: 3 giờ.
 Thời gian lưu trữ nguyên liệu: 40 ngày ở nhiệt độ phòng.



Hiệu suất chưng cất tinh dầu Hoắc hương ex vitro trong điều kiện tối ưu nhất là

0,43 %, tinh dầu màu vàng, sáng đẹp, có mùi hắc đặc trưng.
Kiến nghị
Nếu có thời gian, chúng tơi sẽ tiếp tục nghiên cứu:
Điều kiện môi trường ex vitro lên hàm lượng tinh dầu


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOẮC HƯƠNG
POGOSTEMON CABLIN (BLANCO) BENTH VÀ
TÌM HIỂU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
HÀM LƯỢNG TINH DẦU
MÃ SỐ:

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Trần Đông Phương


Tp. Hồ Chí Minh, tháng9 năm 2013


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh dầu là hợp chất tự nhiên quan trọng, được chiết xuất từ những lồi
thực vật có mùi thơm đặc trưng, đây là nguồn dược liệu dùng trong các phương
pháp điều trị, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trên toàn thế giới. Nhu cầu sử dụng
tinh dầu tăng nhanh do người dân ngày càng có xu hướng trở về dùng những hợp
chất tự nhiên. Cây Hoắc hương được biết đến từ rất lâu đời và là vị thuốc trong y
học dân gian. Bên cạnh đó, tinh dầu Hoắc hương là một nguyên liệu quý, được
sử dụng làm chất định hương trong kỹ nghệ pha chế nước hoa, hương phẩm và
mỹ phẩm.
Trên thế giới, cây Hoắc hương được trồng ở Ấn Độ, Malaysia, Philippines,
Indonesia, Singapore, Trung Quốc,…. Ở nước ta, cây Hoắc hương được trồng
chủ yếu tại các tỉnh phía Bắc, người dân thường sử dụng lá và cành cây để làm
thuốc. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Hoắc hương là một vị thuốc làm mạnh
dạ dày, trợ tiêu hóa, làm thuốc chữa cảm, ho, nhức đầu. Ở Ấn Độ, Hoắc hương
được dùng làm thuốc chữa một số bệnh nhiễm khuẩn. Ở Philippines, nước hãm
lá tươi dùng để diều trị rối loạn kinh nguyệt. Tinh dầu Hoắc hương trong y học
cổ truyền Indonesia dùng để chữa các vết thương, vết nứt, bệnh ngứa, là thành
phần trong các chế phẩm chữa ho, tiêu chảy... Tinh dầu Hoắc hương có tính
kháng khuẩn rộng, thuốc có tác dụng ức chế các loại nấm gây bệnh,
leptospirosis, tụ cầu khuẩn, trực khuẩn mủ xanh, enterocoli, trực khuẩn lị, liên
cầu khuẩn tán huyết tuýp A, phế song cầu khuẩn, rhinovirus.
Từ những công dụng quý giá đó, Hoắc hương đã và đang được các nhà
khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu. Năm 2006, ở Anh đã nghiên cứu
phân tích thành phần hóa học của lá và tế bào nuôi cấy của cây Hoắc hương và
sử dụng tiền chất để cải thiện lượng tinh dầu. Ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều
nghiên cứu về Hoắc hương, năm 2007, trường đại học Khoa học tự nhiên,

ĐHQGHN đã bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hịa sinh trưởng
đến sự phát sinh hình thái của mô lá cây Hoắc hương nuôi cấy in vitro. Năm
xii


2010, ở Ấn Độ đã nghiên cứu tái sinh nhanh chồi và phân tích hàm lượng tinh
dầu vi nhân giống cây Hoắc hương. Năm 2011, ở Đài Loan đã nghiên cứu hoạt
tính giảm đau và chống viêm của methanol chiết từ cây Hoắc hương.
Do đặc tính ra hoa khơng đồng đều, tỉ lệ đậu quả thấp, nên Hoắc hương
được trồng chủ yếu bằng phương pháp giâm cành. Việc nhân giống bằng cách
này dẫn đến dễ thoái hóa giống, hệ số nhân giống không cao. Đặc biệt, Hoắc
hương là cây rất mẫn cảm với virus khảm. Vì vậy, cần phải tạo được nguồn
giống tốt, sạch bệnh đồng thời tìm cách nâng cao lượng tinh dầu trong cây Hoắc
hương. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân giống in vitro cây Hoắc hương
Pogostemon cablin (Blanco) Benth và tìm hiểu một vài yếu tố ảnh hưởng đến
hàm lượng tinh dầu” nhằm tạo nguồn giống chất lượng cao và tìm ra các điều
kiện chưng cất tinh dầu tối ưu nhất..

xiii


DANH MỤC HÌNH ẢNH, BẢNG
Hình 1.1: Cây Hoắc hương ..................................................................................... 2
Hình 1.2: Ba thành phần chính trong tinh dầu Hoắc hương .............................. 3
Hình 1.3: Thành phần hóa học trong lá Hoắc hương .......................................... 4
Hình 1.4: Con đường hình thành sesquiterpenes ở thực vật ............................... 7
Hình 3.1: Ảnh hưởng nồng độ BA lên sự tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro (5
tuần tuổi) ................................................................................................................... 27
Hình 3.2: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin lên sự tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro (5
tuần tuổi) .................................................................................................................. 29

Hình 3.3: Mơ sẹo từ lá Hoắc hương in vitro trong môi trường MS bổ sung 2,4_D
(4 tuần tuổi) .............................................................................................................. 31
Hình 3.4: Mẫu mơ lá Hoắc hương in vitro trong môi trường MS bổ sung NAA (5
tuần tuổi) .................................................................................................................. 33
Hình 3.5: Cây con in vitro trên môi trường MS bổ sung NAA (5 tuần tuổi) ...... 35
Hình 3.6: Chồi Hoắc hương in vitro trong mơi trường nuôi cấy bổ sung kết hợp
NAA và BA (5 tuần tuổi) ......................................................................................... 37
Hình 3.7: Cây con Hoắc hương ex vitro qua từng tuần theo dõi ......................... 39
Hình 3.8: Cây con Hoắc hương ex vitro (4 tuần tuổi) ........................................... 40
Hình 3.9: Tinh dầu Hoắc hương ............................................................................ 45
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ lá Hoắc hương
in vitro ....................................................................................................................... 17
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của nồng độ Kin trong quá trình tạo chồi từ lá Hoắc hương
in vitro ....................................................................................................................... 17
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của 2,4_D trong quá trình tạo sẹo từ lá Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 18
Bảng 2.4: Ảnh hưởng của NAA trong quá trình tạo sẹo từ lá Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 19
Bảng 2.5: Ảnh hưởng của NAA trong quá trình tạo rễ từ chồi Hoắc hương in
vitro ............................................................................................................................ 20
xiv


Bảng 2.6: Ảnh hưởng của NAA và BA trong quá trình tạo chồi từ lá Hoắc hương
in vitro ....................................................................................................................... 21
Bảng 2.7: Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và thời gian lên hàm
lượng tinh dầu ........................................................................................................... 23
Bảng 2.8: Ảnh hưởng của thời gian thu hái nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu
Hoắc hương ex vitro. ................................................................................................. 24
Bảng 2.9: Ảnh hưởng của lượng nước chưng cất lên hảm lượng tinh dầu ex vitro.

.................................................................................................................................... 25
Bảng 2.10: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất lên hàm lượng tinh dầu Hoắc
hương ex vitro. ........................................................................................................... 25
Bảng 2.11: Ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu
Hoắc hương ex vitro. ................................................................................................. 26
Bảng 3.1: Ảnh hưởng nồng độ BA lên sự tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro .... 27
Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin lên sự tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 29
Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên sự tạo mô sẹo từ lá Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 30
Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự tạo mô sẹo từ lá Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 32
Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự tạo rễ từ lá Hoắc hương in vitro .... 32
Bảng 3.6: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro . 33
Bảng 3.7: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự tạo rễ từ chồi Hoắc hương in vitro 35
Bảng 3.8: Ảnh hưởng nồng độ NAA và BA lên sự tạo chồi Hoắc hương in vitro
.................................................................................................................................... 36
Bảng 3.9: Sự tăng trưởng về chiều cao của cây con Hoắc hương ....................... 39
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và thời gian lên hàm
lượng tinh dầu ........................................................................................................... 41
Bảng 3.11. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian thu hái. ........................................ 42
Bảng 3.12. Hàm lượng tinh dầu theo lượng nước chưng cất. ............................... 43
Bảng 3.13. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất. ................................... 43
xv


Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian để héo nguyên liệu. .................... 44

xvi



MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................1
I.1. Giới thiệu cây Hoắc hương Pogostemon cablin Benth .................................................. 1
I.1.1. Họ hoa môi Lamiaceae .........................................................................................1
I.1.2. Mô tả cây Hoắc hương .........................................................................................1
I.1.3. Phân bố, sinh thái .................................................................................................2
I.1.4. Thành phần hóa học: ............................................................................................3
I.2. Nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................................................... 4
I.2.1. Trong nước ...........................................................................................................4
I.2.2. Ngoài nước ...........................................................................................................4
I.3. Tác dụng dược lý của tinh dầu Hoắc hương ..................................................................... 5
I.4. Hợp chất thứ cấp ....................................................................................................................... 5
I.4.1. Giới thiệu ..............................................................................................................5
I.4.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp .............................................6
I.5. Tinh dầu, tách chiết tinh dầu ................................................................................................. 7
I.5.1. Tinh dầu................................................................................................................7
I.5.2. Các phương pháp tách chiết tinh dầu ...................................................................7
I.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng chính trong chưng cất hơi nước .......................................9
I.6. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS-Gas Chromatography Mass Spectometry) .... 10
I.6.1. Sắc ký khí (GC_Gas Chromatography) .............................................................11
I.6.2. Khối phổ .............................................................................................................12
I.6.3. Phân tích kết quả ................................................................................................12
I.6.4. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) 12
I.7. Nuôi cấy mô ............................................................................................................................. 13
I.7.1. Khái niệm ...........................................................................................................13
I.7.2. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật ..................................................13
I.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mô ..............................................14
I.8. Mô sẹo ....................................................................................................................................... 16
I.8.1. Định nghĩa ..........................................................................................................16

I.8.2. Sự tạo mô sẹo nhờ auxin, thuộc về một trong ba quá trình ...............................16
xvii


II. VẬT LIỆU VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ...........................................................17
II.1. Vật liệu .................................................................................................................................... 17
II.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài ..............................................................17
II.1.2. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................17
II.2. Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Hoắc hương ................................................................. 17
II.2.1. Môi trường nuôi cấy .........................................................................................17
II.2.2. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................17
II.2.3. Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô .....................................................................17
II.3. Nuôi cấy in vitro cây Hoắc hương Pogostemon cablin Benth. ................................ 18
II.3.1. Tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro ...................................................................18
II.3.2. Tạo sẹo từ lá Hoắc hương in vitro ....................................................................19
II.3.3. Tạo rễ từ chồi Hoắc hương in vitro...................................................................21
II.3.4. Tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro ...................................................................22
II.3.5. Theo dõi sự sinh trưởng của cây con Hoắc hương in vitro chuyển ra vườn ươm
.....................................................................................................................................23
II.3.6. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng trong môi trường ni cấy đến sự
hình thành tinh dầu của lá Hoắc hương in vitro. .........................................................24
II.3.7. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu Hoắc
hương ex vitro ..............................................................................................................25
II.4. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................28
III. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................................................28
III.1. Tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro ................................................................................ 28
III.1.1. Môi trường MS bổ sung BA ............................................................................29
III.1.2. Môi trường MS bổ sung Kinetin .....................................................................30
III.2. Tạo sẹo từ lá Hoắc hương in vitro .................................................................................. 32
III.2.1. Môi trường MS bổ sung 2,4-D ........................................................................32

III.2.2. Môi trường MS bổ sung NAA .........................................................................33
III.3. Tạo rễ từ chồi Hoắc hương in vitro ................................................................................ 36
III.4. Tạo chồi từ lá Hoắc hương in vitro trong môi trường kết hợp................................ 38
III.5. Theo dõi sự sinh trưởng cây con Hoắc hương in vitro chuyển ra vườn ............... 40
xviii


III.6. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng trong mơi trường ni cấy đến sự
hình thành tinh dầu của lá Hoắc hương in vitro .................................................................... 43
III.7. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu Hoắc hương
ex vitro .............................................................................................................................................. 44
III.7.1. Ảnh hưởng của thời gian thu hái lên hàm lượng tinh dầu Hoắc hương ex vitro
.....................................................................................................................................44
III.7.2. Ảnh hưởng của lượng nước chưng cất lên hàm lượng tinh dầu Hoắc hương ex
vitro ..............................................................................................................................45
III.7.3. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất lên hàm lượng tinh dầu Hoắc hương ex
vitro ..............................................................................................................................45
III.7.4. Ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu Hoắc
hương ex vitro ..............................................................................................................46
IV. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ........................................................................................48
IV.1. Kết luận ................................................................................................................................. 48
IV.2. Đề nghị................................................................................................................................... 49

xix


I.
I.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu cây Hoắc hương Pogostemon cablin Benth. [4]

I.1.1. Họ hoa mơi Lamiaceae
Họ hoa mơi có 200 chi và 3500 loài, phân bố ở khắp nơi thế giới. Ở Việt
Nam có trên 40 chi và khoảng 145 lồi. Họ hoa mơi Lamiaceae gồm những cây
thảo thân vng; lá đơn, mọc đối chéo chữ thập hay mọc vòng, thường có mùi
thơm. Hoa thường tập trung ở kẽ lá gồm những xim 2 ngả tạo thành những bó ở
nách lá. Hoa đối xứng 2 bên, lưỡng tính, hoa mẫu 5. Các lá đài và cánh hoa hợp
thành ống có 2 môi, môi trên 2 răng, môi dưới 3 răng. Nhị có 4 cái, trong đó 2
cái dài và 2 cái ngắn hoặc bằng nhau, dính trên ống tràng và xếp xen kẽ với thùy
tràng. Bầu trên gồm 4 ô tách thành 4 thùy rõ. Vòi mọc ra giữa 4 thùy bầu và đính
ở gốc bầu. Quả gồm 4 hạch nhỏ "tứ bế quả", ở đáy có các đài tồn tại, mỗi hạch
có 1-2 hạt.
Một số cây thuốc thuộc họ hoa mơi: Hoắc hương, bạc hà, hương nhu, râu
mèo, tía tơ, kinh giới, ích mẫu.
I.1.2. Mơ tả cây Hoắc hương
Cây Hoắc hương có vị trí phân loại:
Giới: Plantae

Họ: Lamiaceae

Ngành: Magnoliophyta

Chi: Pogostemon

Lớp: Magnoliopsida

Loài: Pogostemon cablin Benth.

Bộ: Asteridae


1


Hình 1.1: Cây Hoắc hương
Hoắc hương là cây thảo, sống lâu năm, thân vng màu nâu tím, mọc thẳng
có phân nhánh, cao chừng 30-60 cm, thân có lơng. Lá mọc đối có cuống dài,
phiến lá hình trứng, hai mặt đều có lơng, mép lá có răng cưa thơ, lá dài 5-10 cm,
rộng 2, 5-7 cm. Hoa mọc thành xim co ở tận cùng ngọn hoặc ở kẽ lá, hoa nhỏ, có
màu hồng hoặc tím nhạt. Tồn cây có mùi thơm dễ chịu.
I.1.3. Phân bố, sinh thái
Hoắc hương được trồng ở nhiều nước châu Á như Ấn Độ, Malaysia,
Philippines, Indonesia, Singapore, Trung Quốc, Việt Nam…
Thời gian gieo trồng vào mùa xuân ở các tỉnh phía Bắc và vào mùa mưa ở
các tỉnh phía Nam, 5 đến 6 tháng sau khi trồng có thể thu hoạch lứa đầu tiên. Thu
hái lá cây quanh năm, chủ yếu là trước khi cây ra hoa, đem rửa sạch, phơi khô.
Hoắc hương là cây ưa ẩm và chịu bóng, nên thường trồng xen với chuối,
chanh hoặc các cây ăn quả khác. Trong điều kiện cây trồng ở các tỉnh phía Bắc,
mùa sinh trưởng mạnh bắt đầu khoảng cuối mùa xn. Đến đầu mùa đơng lạnh,
cây có hiện tượng rụng lá nhiều và bị tàn lụi. Gốc và thân sẽ tái sinh lại vào giữa
mùa xuân. Hoắc hương được nhân giống chủ yếu bằng thân cành. Chọn cành
khỏe mập rồi cắt thành từng đoạn 12-15cm làm hom giống, thực hiện vào tháng
3-4 hằng năm. Lên luống cao 20-30cm, mặt luống rộng 70-80cm. Trồng theo
hốc, khoảng cách 20x 30cm, hốc sâu độ 10cm. Mỗi hốc trồng 1 hom. Khi trồng,
nên dùng phân hoai mục để bón lót. Sau khi trồng 20-25 ngày, hom bắt đầu lên
chồi. Hoắc hương cần đất tốt, luôn sạch cỏ, được vun xới và bón phân thúc 3-4

2



lần trong năm. Mùa đông, cây sinh trưởng chậm, không thu hái. Tiến hành vệ
sinh đồng ruộng, chăm sóc cho cây.
I.1.4. Thành phần hóa học:
Cây chứa tinh dầu (1,2%) có thành phần chủ yếu là alcohol patchouli
(45%), patchoulen (50%) và một số thành phần khác như benzaldehyde,
aldehyde cinnamic, eugenol, cadinen, sesquiterpen và epiguaipyridin.
Alcohol patchouli là một rượu bậc 3, kết tinh dưới dạng tinh thể hình lục
lăng, có khi kết tinh ngay trong tinh dầu.
Năm 1989, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự khi ly trích tinh dầu lá Hoắc
hương mọc ở Hà Nội đã thấy alcohol patchouli chiếm 32-38%.
Năm 2006, ở Anh, khi phân tích thành phần hóa học của tinh dầu được
chưng cất từ lá Hoắc hương in vitro bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS), cho thấy
22 hợp chất gồm có 18 sesquiterpenes và ba sesquiterpenes oxy hóa. Trong số
đó, alcohol patchouli (chiếm 60,30%) là thành phần chính.

Hình 1.2: Ba thành phần chính trong tinh dầu Hoắc hương [18]

3


Hình 1.3: Thành phần hóa học trong lá Hoắc hương

I.2.

Nghiên cứu trong và ngoài nước [7, 18]

I.2.1. Trong nước
Năm 2007, Tạ Như Thục Anh (Viện dược liệu, 3B Quang Trung, Hà Nội,
Việt Nam), Trần Dụ Chi, Vũ Văn Vụ (Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học
tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam) đã bước đầu nghiên

cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của
mơ lá cây Hoắc hương ni cấy in vitro.
I.2.2. Ngồi nước
Năm 2003, Ika Mariska dan Endang G. Lestari (Indonesia) đã nghiên cứu
ứng dụng của nuôi cấy mô trong cải tiến biến đổi gene của cây Hoắc hương.
Năm 2006, ở Anh đã có nghiên cứu phân tích thành phần hóa học của lá và
tế bào ni cấy của cây Hoắc hương và sử dụng tiền chất để cải thiện lượng tinh
dầu.

4


Năm 2009, ở Thái Lan đã nghiên cứu phát triển việc kiểm sốt chất lượng
tách chiết tinh dầu và cơ lập các thành phần có hoạt tính kháng khuẩn.
Năm 2010, ở Ấn Độ đã nghiên cứu tái sinh nhanh chồi và phân tích hàm
lượng tinh dầu cây Hoắc hương vi nhân giống.
Năm 2011, ở Đài Loan đã nghiên cứu hoạt tính giảm đau và chống viêm
của methanol chiết từ cây Hoắc hương.

I.3.

Tác dụng dược lý của tinh dầu Hoắc hương[4]
Tinh dầu Hoắc hương là chất lỏng, sánh, màu vàng, sáng đẹp hoặc có màu
sáng xanh, mùi hắc, rất dễ tan trong ethanol 90%. Tinh dầu chiết xuất từ lá là chủ
yếu, trong thân và rễ có hàm lượng tinh dầu nhỏ, tinh dầu được chưng cất theo
phương pháp lôi cuốn hơi nước hoặc trích ly phân đoạn.
Tinh dầu Hoắc hương có tác dụng kháng khuẩn rộng: thuốc có tác dụng ức
chế các loại nấm gây bệnh, leptospirosis, tụ cầu khuẩn, trực khuẩn mủ xanh,
enterocoli, trực khuẩn lị, liên cầu khuẩn tán huyết tuýp A, phế song cầu khuẩn,
rhinovirus. Thuốc còn có tác dụng chống thối. Tinh dầu Hoắc hương tăng tiết

dịch dạ dày, tăng tiêu hóa. Hoắc hương có tác dụng làm mạnh dạ dày – ruột, giúp
sự tiêu hoá, hành khí, giảm đau. Lá có tác dụng hạ nhiệt. Chữa cảm mạo, nhức
đầu, đau mình mẩy, sổ mũi, đau bụng ỉa chảy, nôn mửa, ăn uống không tiêu, hôi
miệng.
Trong công nghiệp, tinh dầu Hoắc hương là hương liệu quý dùng làm chất
định hương trong kỹ nghệ pha chế nước hoa. Với vai trị là chất định hương, nó
có tác dụng làm chậm quá trình bốc hơi của các tinh dầu khác. Tinh dầu Hoắc
hương có thể được thêm vào trong hỗn hợp các loại tinh dầu, làm hương thơm
trở nên sâu và đặc biệt hơn. Tinh dầu này còn là chất thơm trong kỹ nghệ thực
phẩm, pha chế rượu mùi, thức uống.

I.4.

Hợp chất thứ cấp[3, 5, 6]

I.4.1. Giới thiệu
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia
thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ
cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao
5


đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng là sản phẩm của các phản ứng hóa học
của thực vật với mơi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và
động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã
phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs, 2002). Các chất trao
đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Tinh dầu là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau: các hydrocacbon béo
hoặc thơm, các dẫn xuất của chúng như alcohol, andehyde, ceton, ester… Nhưng
có hai nhóm chính là terpenoid và các dẫn xuất của phenol. Nhóm terpenoid chủ

yếu là monoterpen và sesquiterpen (Lee, 2001).
I.4.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp
Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào,
vì thế chúng được tìm thấy trong các mơ có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và
hoa.
I.4.2.1.

Điều kiện ni cấy
Các thơng số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều

hịa sinh trưởng, nhiệt độ ni cấy, sự thơng khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng
ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp ( Wang và cs, 1999).
I.4.2.2.

Dịng tế bào
Các tế bào thực vật trong ni cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc

lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao
trong ni cấy (Berlin; Sasse, 1985) và sau đó phương thức này đã được ứng
dụng rộng rãi.
I.4.2.3.

Cung cấp tiền chất
Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào mơi trường

ni cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung
gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng
lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có
giá thành rẻ (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993).
I.4.2.4.


Sự kháng bảo vệ thực vật

6