HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
LACTOBACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG SINH H2O2 ĐỊNH
HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................... Error! Bookmark not defined.
LỜI CẢM ƠN ................................................................ Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ ....................................................................................... vi
DANH MỤC VIẾT TẮT.............................................................................................. vii
TÓM TẮT.................................................................................................................... viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa .....................................................................................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................................2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................2
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus ......................................................................2
2.1.1. Phân loại, đặc điểm sinh lý- sinh hóa của Lactobacillus.......................................3

2.1.2. Đặc tính, chức năng sinh học của Lactobacillus ...................................................4
2.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus đối với sức khỏe của con người: .............................6
2.1.4. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh ra hydroxygen
peroxide hiện nay.............................................................................................................7
2.2. Hydro peroxide- H2O2 ..............................................................................................8
ii


2.2.1. Cơ chế, vi khuẩn sinh ra Hydrogen peroxidase .....................................................9
2.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của H2O2.........................................................................10
2.2.3. Cơ chế chống lại H2O2 của vi khuẩn ...................................................................12
2.2.4. Định tính, định lượng H2O2 .................................................................................13
2.2.5. Lactobacillus sản sinh H2O2- vai trò trong y học ................................................14
PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................15
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................................15
3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ...........................................................................15
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................15
3.2.2. Mẫu vật nghiên cứu .............................................................................................15
3.2.3. Máy móc và thiết bị .............................................................................................15
3.2.4. Hóa chất và mơi trường .......................................................................................15
3.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................16
3.3.1. Nội dung 1: ..........................................................................................................16
3.3.2. Nội dung 2: ..........................................................................................................16
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................16
3.4.1. Phương pháp phân lập, làm sạch, nuôi cấy, giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus .16
3.4.2. Phương pháp xác định những đặc điểm sinh lý- sinh hóa của vi khuẩn
Lactobacillus .................................................................................................................18
3.4.3. Định tính H2O2 sinh ra từ vi khuẩn Lactobacillus ...............................................18
3.4.4. Định lượng H2O2 sinh ra từ vi khuẩn Lactobacillus ............................................18
3.4.5. Định danh danh pháp đến mức độ lồi các chủng Lactobacillus có khả năng sinh

H2O2 bằng phương pháp giải trình tự rRNA 16S ..........................................................20
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................21
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus ...............................................................21
iii


4.2. Kết quả làm sạch vi khuẩn Lactobacillus ...............................................................22
4.3. Kết quả xác định đặc điểm sinh lý- sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus .............23
4.3.1. Kết quả nhuộm gram ...........................................................................................23
4.3.2. Kết quả soi kính hiển vi .......................................................................................23
4.3.3. Kết quả thử hoạt tính catalase .............................................................................24
4.4. Định tính và định lượng H2O2 ................................................................................24
4.4.1. Định tính ..............................................................................................................25
4.4.2. Định lượng H2O2 ................................................................................................25
4.5. Xác định lồi Lactobacillus có khả năng sinh H2O2 bằng phương pháp giải trình tự
rDNA 16S ......................................................................................................................28
4.5.1. Kết quả tách DNA tổng số...................................................................................28
4.5.2. Kết quả PCR ........................................................................................................29
4.5.3. Kết quả giải trình tự .............................................................................................30
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................32
5.1. Kết luận...................................................................................................................32
5.2. Kiến nghị ...............................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................33
PHỤ LỤC ......................................................................................................................37

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Phân loại của Lactobacillus.............................................................................3

Bảng 2.2. Phản ứng, chất xúc tác hình thành H2O2 .........................................................9
Bảng 4.1. Giá trị đo OD620nm trên mẫu thực ..................................................................26
Bảng 4.2. Hàm lượng H2O2 sinh ra bởi các chủng vi khuẩn Lactobacillus ...................27
Bảng 4.3. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu.........................................................29
Bảng 4.4. Kết quả so sánh các chủng Lactobacillus với các loài vi khuẩn trong ngân
hàng dữ liệu gen của NCBI. ..........................................................................................30

v


DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ

Hình 2.1. Lactobacillus sp ...............................................................................................4
Hình 2.2. Đồng phân quang học của acid lactic ..............................................................5
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử H2O2 .....................................................................................8
Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập được từ mẫu phân người sau 48
giờ ni cấy kỵ khí tại 370C ..........................................................................................21
Hình 4.2. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ ni cấy kỵ khí ở 37oC .....22
Hình 4.3. Kết quả nhuộm Gram của chủng vi khuẩn Lactobacillus .............................23
Hình 4.4. Hình ảnh Lactobacillus quan sát trên kính hiển vi vật kính x100 .................24
Hình 4.5. Kết quả thử hoạt tính Catalase.......................................................................24
Hình 4.6. Khả năng làm đổi màu của các vi khuẩn Lactobacillus sinh ra H2O2 ...........25
Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ H2O2 và giá trị đo OD620nm ...26
Hình 4.8. Kết quả điện di các mẫu DNA tách từ vi khuẩn Lactobacillus. M: Marker 1kb;
L1, L2, L3 lần lượt là các mẫu tách DNA tổng số của 3 chủng vi khuẩn L1, L2, L3. .28
Hình 4.9. Kết quả sản phẩm PCR các mẫu DNA tách từ vi khuẩn Lactobacillus. M:
Marker 1kb plus; L1, L2, L3 sản phẩm PCR tách từ vi khuẩn L1, L2, L3 ...................29
Hình 4.10. Cây phát sinh chủng lồi của các chủng Lactobacillus và các lồi có liên
quan dựa trên phân tích so sánh các trình tự rRNA 16S ...............................................31


vi


DANH MỤC VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Giải nghĩa

µl

Microlit

DNA

Deoxyribonucleic acid

EtBr

Ethidium Bromide

ĐC

Đối chứng

kb

Kilo basepair

MRS


De man - Rogosa - Sharpe

ml

Milliliter

nm

Nanometer

OD

Optical Density

PCI

Phenol-Chloroform-Isopropanol

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate


TAE

Tris-acetate-EDTA

DMSO

Dimethyl sulfoxit

HRP

Horseradish peroxidase

TMB

3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine

LAB

Vi khuẩn axit lactic

TE

Tris-EDTA

vii


TĨM TẮT
Với mục đích của đề tài là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có

khả năng sinh H2O2 định hướng ứng dụng trong y học, chúng tôi đã tiến hành thu mẫu
phân, phân lập và làm sạch vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân của người trưởng thành,
khỏe mạnh tại Hà Nội. Sau đó, tiến hành kiểm tra một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa và
tuyển chọn được năm chủng vi khuẩn có khả năng sinh ra H2O2. Nồng độ H2O2 sinh ra
từ năm chủng khác nhau: Chủng L1, L2, L3 sinh ra H2O2 lần lượt là 2.067, 2.081, 2.183
(mM) và hai chủng L4, L5 không xác định nên chúng tôi lựa chọn ba chủng L1, L2, L3
để định danh danh pháp đến mức độ loài bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. Kết
quả cho thấy, ba chủng chúng tôi quan tâm gần nhất với loài Lactobacillus plantarum.

viii


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về ứng dụng vi
sinh vật có lợi trong việc ngăn ngừa và điều trị một số bệnh như tiêu chảy, bệnh viêm
ruột ở người, giảm dị ứng thực phẩm, nhiễm trùng và rối loạn đường tiết niệu, các
bệnh liên quan đến đường hô hấp và đường tim mạch…Một trong số những vi khuẩn
có lợi được quan tâm nhiều nhất hiện nay là vi khuẩn Lactobacillus. Chúng được tìm
thấy ở nhiều nơi trong tự nhiên như: thực phẩm; thực vật; chất thải; đường dạ dày –
ruột, đường miệng và đường sinh dục của con người và động vật…Phần lớn các lồi
Lactobacillus có nguồn gốc từ đường dạ dày – ruột người là đối tượng nghiên cứu về
probiotic cho người sử dụng.
Lactobacillus là một trong những vi khuẩn sinh ra probiotic tốt nhất, bởi chúng
có khả năng tạo ra các chất có hiệu quả kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít
béo, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin …có khả năng ức chế sự sinh trưởng của
nhiều lồi vi khuẩn gây bệnh. Trong đó, việc sản xuất hydrogen peroxide bởi
Lactobacillus một trong những đặc tính đang được nhiều nhà nghiên cứu chú ý trong
những năm gần đây. Khả năng kháng khuẩn của hydrogen peroxide là do việc tạo ra
các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự

do hydroxyl. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng hydrogen peroxide được sản xuất bởi
vi khuẩn Lactobacillus có tiềm năng trong việc ngăn ngừa và điều trị một số bệnh như:
chống oxy hóa ( Achuthan và cộng sự, 2012), các bệnh liên liên quan đến đường âm
đạo, đường tiết niệu (Tomas và cộng sự, 2011), giảm dị ứng thực phẩm (Ghaish và
cộng sự, 2011),...Do đó, chúng có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất probiotics.
Chính vì lí do nêu trên, chúng tơi tiến hành thực hiện khóa luận với tiêu đề: ”Phân lập
và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng sinh H2O2 định hướng ứng
dụng trong y học.”

1


1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng sinh H2O2 định
hướng ứng dụng trong y học.
1.2.2. Yêu cầu
 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng sinh H2O2
 Định tính H2O2 sinh ra từ chủng vi khuẩn Lactobacillus
 Định lượng H2O2 sinh ra từ các chủng vi khuẩn Lactobacillus.
 Định danh danh pháp các chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh ra H2O2 và phân tích so
sánh các trình tự nucleotide này với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu.
1.3. Ý nghĩa
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu đề tài nhằm cung cấp và bổ sung nguồn dữ liệu về vi khuẩn
Latobacillus sp có khả năng sinh H2O2.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài sẽ định tính, định lượng H2O2 sinh ra từ vi khuẩn
Lactobacillus sp được phân lập từ từ hệ vi khuẩn đường ruột của người khỏe mạnh,
định danh danh pháp các chủng vi khuẩn quan tâm đến mức độ loài bằng phương pháp

giải trình tự 16S rRNA và phân tích so sánh các trình tự nucleotide này với trình tự
nucleotide trong ngân hàng dữ liệu. Qua đó, bổ sung nguồn dữ liệu cho các nghiên cứu
về vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng sinh H2O2 ở Việt Nam, là tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra các chủng Lactobacillus có tiềm năng trở thành các
chủng sản xuất probiotic.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus
Chi Lactobacillus là nhóm lớn nhất trong số Lactobacteriaceae với hơn 180 lồi
được cơng nhận (Nanda và cộng sự, 2018). Chúng là vi khuẩn gram dương, khơng hình
2


thành bào tử, catalase âm tính, là vi khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí (Davoodabadi và
cộng sự, 2015).
2.1.1. Phân loại, đặc điểm sinh lý- sinh hóa của Lactobacillus
Vi khuẩn Lactobacillus được phân loại như sau:
Bảng 2.1. Phân loại của Lactobacillus

Giới

Khởi sinh (Bonera)

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli


Bộ

Lactobacillales

Họ

Lactobacillaceae

Chi

Lactobacillus

Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobacillus: Lactobacillus là vi khuẩn Gram
dương, kích thước lớn (0,5 - 0,7 × 2 - 8 μm), đại bộ phận các loài khơng di động, khơng
sinh bào tử, hình que đơi khi có thể gần giống như hình cầu, thường hình thành dạng
chuỗi hoặc tồn tại đơn độc. Chúng có những nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp và làm
lên men hoàn tồn, hiếu khí hay kị khí, ưa axit. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của
vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 40o C. Nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi
nhiệt độ là 5 – 53o C. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được mơi trường
có tính axít, pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8. Khuẩn lạc của
Lactobacillus thường có hình trịn, màu trắng hay đục sữa. Lactobacillus được đặc
trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic là một sản phẩm phụ của q trình chuyển hóa
glucose.
Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh trưởng
chậm trong khơng khí. Đơi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được kích thích bằng
cách thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy (Phạm Thị Lan Thanh, 2007).
Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt,
chúng phát triển rất tốt trên mơi trường có chứa nhiều phức chất.


3


Lactobacillus có một số đặc tính sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính, khử
nitrate âm tính (đơi khi dương tính với pH > 6), có khả năng lên men glucose…

Hình 2.1. Lactobacillus sp

Dựa vào đặc điểm lên men có thể chia thành ba nhóm: Lên men đồng hình bắt
buộc (Obligately Homofermentative), lên men dị hình tùy ý (Facultatively
Heterofermentative) và lên men dị hình bắt buộc (Obligately Heterofermentative)
(Holzapfel và cộng sự, 1995).
2.1.2. Đặc tính, chức năng sinh học của Lactobacillus
Những đặc tính và chức năng này đều có ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất
probiotic. Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trị rất quan trọng trong khả
năng chữa bệnh.
 Phân giải Protein
Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các
polypeptide mạch ngắn. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein được cơ thể vật
chủ tiêu hố dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus
được đánh giá là nguồn dinh dưỡng có giá trị cao cho các đối tượng: trẻ sơ sinh, người
đang dưỡng bệnh, người già ...
 Phân giải Lipid
Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng
triglyceride thành các axít béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh
dưỡng đối với người và vật ni. Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cho
4


rằng Lactobacillus phân giải được cholesterol trong lipid huyết thanh và muối mật. Cả

hai khả năng này điều có ý nghĩa về mặt lâm sàng.
 Phân giải đường lactose
Lactobacillus

mang

enzyme

beta-galactosidase,

glycolase

và

lactic

dehyrogenase có tác dụng chuyển hố đường lactose thành axít lactic. Đây là một axít
hữu cơ có những đặc tính sinh học đặc biệt.
Vai trị của axít lactic:
Về mặt sinh lý học, axít lactic có những ưu điểm sau:
-

Tăng cường khả năng tiêu hố protein sữa thơng qua sự đơng vón.

-

Tăng cường hoạt tính Ca, P, Fe.

-


Kích thích sự tiết dịch vị.

-

Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày.

-

Là nguồn năng lượng cho q trình hơ hấp.
Chính những ưu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng
Lactobacillus làm probiotic. Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus
sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+). Ở người, cả hai loại đồng phân
này đều được hấp thu trong đường ruột.

Hình 2.2. Đồng phân quang học của acid lactic

L (+) axít lactic: được chuyển hố hồn tồn và nhanh chóng trong q trình
tổng hợp glycogen.
D (-) axít lactic: được chuyển hố ít hơn và phần khơng chuyển hố sẽ được
bài tiết dưới dạng urine. Sự hiện diện của axít khơng được chuyển hố trong ống
tiêu hố sẽ gây tình trạng nhiễm axít trong trao đổi chất ở trẻ sơ sinh.
5


 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh.
Lactobacillus có khả năng sinh ra bacterioxin- là protein hay hợp chất protein
do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp (Svetoslav, 2009). Cơ chất
này giúp vi khuẩn Lactobacillus tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh do sự tạo thành các
kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin cịn có khả
năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế

bào. Bacterioxin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của
chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli; Samonella; Vibrio;
Campylobacter, Shigella, Vibrio, Clostridium, Candida albicans, và một số virus
khác.
Ngoài ra, Lactobacilli tổng hợp nhiều loại chất chuyển hóa (như axit lactic,
H2O2 , bacterciocin và axit phenyllactic) có tác dụng chống vi khuẩn, virus và nấm
( Dec và cộng sự , 2014; Chew và cộng sự , 2015; Shokryazdan và cộng sự, 2014;
Yang và cộng sự, 2015). Hydrogen peroxit ức chế được sự phát triển của cả vi khuẩn
Gram (+) và Gram(-). Diacetyl tác động ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách
sử dụng arginine.
 Khả năng gây đáp ứng miễn dịch
Tác dụng miễn dịch chính của lactobacilli là điều khiển các phản ứng miễn
dịch của vật chủ thông qua sự tương tác với niêm mạc đường tiêu hóa. Lactobacilli
tác động trực tiếp và gián tiếp lên các tế bào biểu mô cũng như các tế bào miễn dịch
khác nhau, bao gồm đại thực bào, tế bào tua và tế bào T,..Các thành phần thành tế
bào của lactobacilli, như LTA, lipopolysacarit, peptidoglycans và lipoprotein, được tế
bào chủ nhận ra thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu, bao gồm thụ thể giống như tế
bào thụ thể (TLR) sự kích hoạt của các ký tự miễn dịch. Tuy nhiên, các chủng
Lactobacillus khác nhau có thể kích hoạt các thành phần khác nhau của phản ứng
miễn dịch, do nó có khả năng tạo ra các phân tử bề mặt cụ thể và bài tiết các protein
và chất chuyển hóa khác nhau ảnh hưởng đến tế bào chủ.
2.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus đối với sức khỏe của con người:
Lactobacillus được ứng dụng trong rất nhiều chế phẩm trong phòng và điều trị bệnh.
-

Về mặt trị liệu:
6


+ Nhờ vào khả năng sản xuất axít lactic và bacteriocin trong đường ruột,

Lactobacillus cải thiện được tình trạng tiêu chảy, tăng nhu động ruột, chữa được
chứng táo bón.
+ Lactobacillus duy trì pH âm đạo khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men
glycogen thành axít lactic. Mơi trường này khơng thích hợp cho mầm bệnh phát triển
như Trichomoncisvaginaleic (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men)...
+ Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều là Puramex và Puracal.
Puramex gồm có: almulinium lactat, Fe-lactat (được sử dụng để điều trị bệnh thiếu
máu), Mg-lactat, Zn-lactat. Còn Purical chỉ có lactat canxi. Các chế phẩm này thường
làm cho răng khoẻ hơn.
+ Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị những rối
loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bướu, làm hạ cholesterol
trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện được tình trạng khơng
sử dụng được lactose.
- Về mặt dinh dưỡng: Bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh
nướng hay bánh ngọt để tăng hàm lượng canxi cho cơ thể. Thiếu canxi ảnh hưởng đến
hoạt động cơ tim, sự tạo huyết và đơng máu, là ngun nhân gây cịi xương ở trẻ em
và giịn xương xốp ở người già.
2.1.4. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh ra
hydroxygen peroxide hiện nay
Đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sinh H2O2 của vi khuẩn Lactobacillus trên
thế giới như: “ Effect of Hydrogen peroxidase of bacterial origin of apoptosis and
necrosis of gut mucosa epithelial cells as a possible pathaomechanism of inflammatory
bowel disease and cancer” của Strus và cộng sự ( Nghiên cứu về ảnh hưởng nồng độ
H2O2 trong nuôi cấy vi khuẩn đối với quá trình apoptosis và hoại tử của dịng tế bào
HT-29 đại diện cho biểu mơ ruột người (Strus và cộng sự, 2009). “Hydrogen peroxide
production by lactobacilli promotes epithelial restitution during colitis”của Ashish
K.Singh và cộng sự ( nghiên cứu về việc sản sản xuất Hydrogen peroxide bởi
lactobacilli có khả năng phục hồi biểu mơ trong viêm đại tràng) (Singh và cộng sự,
2018). “ The implausible “in vivo” role of hydrogen peroxide as an antimicrobial factor
7



produced by vaginal microbiota” của Gilda Tachedjian và cộng sự ( nghiên cứu về vai
trò in vitro của hydrogen peroxide- yếu tố kháng khuẩn được sinh ra bởi hệ vi sinh vật
âm đạo ) (Tachedjian và cộng sự, 2018). “Antimicrobial and inflammatory properties
of South African clinical Lactobacillus isolates and vaginal probiotics” của Chetwin
và cộng sự, đánh giá về tiềm năng cải thiện men vi sinh Lactobacillus bằng cách so
sánh các đặc tính viêm và kháng khuẩn (độ bám dính, sản xuất H2O2 , D-lactate và
L-lactate) của 23 chủng Lactobacillus từ âm đạo phụ nữ Nam Phi (Chetwin và cộng
sự, 2019).
Hiện nay, ở nước ta, việc nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus có khả năng
sinh H2O2 đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng
dụng của chúng cịn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. Các đề tài nghiên
cứu tại Việt Nam chủ yếu liên quan đến phân lập và xác định các hoạt tính probiotic
của các chủng Lactobacillus, các mẫu thường được phân lập từ sữa chua, dưa muối,
hay từ phân trẻ sơ sinh,… ( ( Phạm Đình Trúc linh, 2007); (Đoàn Anh Dũng và cộng
sự, 2005) ).
2.2. Hydro peroxide- H2O2
Hydro peroxid, hay Hydro peroxit, Hydro peroxide (tên việt hóa là Hidro peroxit hay
nước oxy già). Hydrogen peroxide:
- Có cơng thức hóa học là H2O2.
- Khối lượng phân tử là 34.01 g/mol.
- Là một chất oxy hóa dạng lỏng trong suốt, nhớt hơn so với nước, có các thuộc tính
oxi hóa mạnh.

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử H2O2

- Được phát hiện vào năm 1818 và đã có sẵn trên thị trường từ thế kỷ XIX.
- Là một trong những chất tẩy trắng phổ biến nhất, chúng rất thân thiện với môi trường,
khơng màu và khơng bị ăn mịn.

8


2.2.1. Cơ chế, vi khuẩn sinh ra Hydrogen peroxidase
Hydrogen peroxide (H2O2) được tạo ra trong nhiều quá trình sinh học khi nó
tiếp xúc với ánh sáng hoặc oxi, trở chất chất trung gian gây độc đối với tế bào. Nó đóng
vai trị truyền tín hiệu tế bào, góp phần oxy hóa các protein biểu hiện, ngồi ra nó có
thể gây tổn hại cho các tế bào và mô. Phản ứng chính của nó bao gồm phản ứng với
các kim loại trung tâm chuyển tiếp, selenoprotein và protein thiol, glutathione
peroxidase (GPx) và peroxiredoxin (Prxs).
Sự tích lũy H2O2 chủ yếu xảy ra ở những loài thiếu enzyme chủ yếu là hydro
peroxide, như catalase và NADH peroxidase. Chẳng hạn, L. fermentum CS12-1 tích
lũy hydro peroxide khi các tế bào phát triển và nồng độ hydro peroxide cao nhất trong
môi trường nuôi cấy là 3,5 mM ( Kang và cộng sự, 2015). Hydrogen peroxide chủ yếu
được tạo ra trong q trình chuyển hóa cacbon và trao đổi năng lượng, bao gồm
pyruvate oxyase (Pox), lactate oxyase (Lox) và NADH oxyase (Nox) (Hertzberger và
cộng sự, 2014). Hầu hết các tế bào tạo H2O2 một cách tự nhiên hoặc bởi SOD
(superoxide dismutase) được xúc tác bởi superoxide (O2‐). Ngồi ra, H2O2 có thể được
sản xuất trực tiếp bởi các dioxygenase như lysyl oxyase và monoamin oxydase, bởi
xanthine oxyase hoặc NADPH oxyase Nox4 (Flávia Rezende và cộng sự, 2018). Việc
thay thế superoxide dismutase (SOD) bằng Mn2 + dưới dạng anion superoxide ( 0-2 ) là
một tính năng độc đáo của hệ thống diệt khuẩn và nhu cầu mangan cao của lactobacilli
có thể phản ánh chức năng này. Các phản ứng tạo ra H2O2 trong tế bào được tóm tắt ở
bảng sau
Bảng 2.2. Phản ứng, chất xúc tác hình thành H2O2

Cơ chất, phương trình phản ứng

Chất xúc tác


Pyruvate + O2 + phosphate ↔ acetyl- Pyruvate oxidase
phosphate + CO2 + H2O2
Lactate + O2 + ↔ pyruvate + H2O2

L-

NADH + H+ + O2 ↔ NAD + H2O2

NADH oxidase

O2- + 2H+ ↔ H2O2

Phức hợp Mn2+ hoặc SODₐ

Saturated fatty accid + O2 ↔ H2O2

Fatty acyl-Co A
9

Lactate oxidase


α

–

Glycerolphosphate

+


O2 ↔ α – Glycerolphosphate

Dihydroxyactetone phosphate + H2O2

2.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của H2O2
a) Tác dụng ức chế và diệt khuẩn
H2O2 có thể gây ra tác dụng kìm hãm hoặc diệt khuẩn. Một số báo cáo đã chứng
minh rằng hydrogen peroxidase được sản xuất bởi nhóm LAB ức chế sự phát triển một
số mầm bệnh như Staphyloccus aureus ( Dahiya và Speck, 1968; Ocaña và cộng sự
1999) , Salmonella typhimurium (Watson và Schubert, 1969; Pridmore và cộng sự,
2008) và Listeria monocytogenes (Siragusa và Johnson, 1989), Candida (Carola và
cộng sự, 2015).
Một số báo cáo đã chứng minh rằng nồng độ của H2O2 cần thiết cho sự ức chế
vi khuẩn phát triển hoặc cho tác dụng diệt khuẩn, có thể là do sự khác biệt về chủng vi
khuẩn và các yếu tố môi trường khác như pH và nhiệt độ. L. paracasei F2 tạo ra H2O2
2,72 mmol trong khi L. paracasei F28 tạo ra 1,84 mmol, trong điều kiện nuôi cấy khác
nhau, có thể ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus (Oca và cộng sự, 1999).
Các lồi Pseudomonas bị ức chế bởi các chủng lactobacilli ở nồng độ H2O2 từ 0.15mM
đến 0,3 mM H2O2 (Price, R.J và J.S.Lee , 1970). Lactobacillus sinh ra H2O2 ức chế sự
phát triển của mầm bệnh cổ tử cung (Subramanyam Dasari, 2014).
H2O2 còn được coi là một chất diệt bào tử hơn là một chất diệt khuẩn, với tác
dụng diệt bào tử (trong vòng 3 giờ ở pH 5,0 và 6 giờ ở pH 6,5) ở nồng độ trong dung
dịch là 0.88M (Barly, 1983) . Đặc tính diệt bào tử của H2O2 đã được chứng minh bởi
von Bockelmann và von Bockelmann (von Bockelmann, I., và B. von Bockelmann,
1972). Các yếu tố như pH và nhiệt độ có ảnh hưởng đến đặc tính diệt bào tử của H2O2
đã được chứng minh bởi Block (Block, 1991). Nhiệt độ là yếu tố cần thiết để diệt bào
tử của vi khuẩn, H2O2 diệt bào tử yếu ở nhiệt độ phòng nhưng rất mạnh ở nhiệt độ
cao.
Tiêu diệt các tế bào oxy hóa thơng qua hoạt động trao đổi chất bằng H2O2 thường liên
quan đến sự hình thành trao đổi chất của các gốc. Vì các bào tử khơng hoạt động, nên

10


để tiêu diệt triệt để phải là phi kim và có thể được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển
tiếp, chủ yếu là Fe2+.
b) Cơ chế hoạt động của H2O2
Hydrogen peroxide là sản phẩm phụ của quá trình lên men lactic, có khả năng
oxy hóa mạnh mẽ lớp màng lipid. Khi tiếp xúc với tế bào vi khuẩn, chúng sẽ tiến hành
oxy hoá mạnh mẽ tế bào và phá vỡ cấu trúc cơ bản của protein tế bào. Bên cạnh đó,
hydrogen peroxide cịn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn bằng cách oxy hố các nhóm
sulfhydryl từ đó gây biến tính một số enzyme và peroxy lipid màng làm tăng tính
thấm của màng. Hydrogen peroxide cịn là tiền thân cho việc sản xuất các gốc tự do
như superoxide (O-) và hydroxyl (OH- ), các gốc này có khả năng gây tổn hại DNA
của tế bào vi khuẩn.
Các cách mà H2O2 có thể được chuyển đổi thành các gốc hydroxyl là (i) bằng
các ion kim loại chuyển tiếp (ví dụ: sắt, đồng); (ii) bởi các anion superoxide tương tác
với H2O2 với sự có mặt của Fe2+ để tạo ra các gốc hydroxyl, phản ứng Haber-Weiss
được xúc tác bởi sắt hoặc cơ chế Fenton điều khiển bằng superoxide; và (iii) bằng chiếu
xạ UV ( Waites và cộng sự, 1988 ).
Hoạt tính diệt vi khuẩn của H2O2 là đáng chú ý bởi enzyme peroxidase với sự
có mặt của ion halogenua. Các peroxidase có thể hoạt động theo cách này là sữa và
nước bọt (lactoperoxidase) , bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân
(myeperoxidase), bạch cầu ái toan ( eosinophilperoxide ), dịch tiết đường tiết niệu.
Peroxides và ion halogen làm tăng sự đối kháng của vi khuẩn phụ thuộc vào H2O2 giữa
hai loài vi khuẩn, vi khuẩn với virut, vi khuẩn với tinh trùng, vi khuẩn và động vật có
vú ( Eschenbach và cộng sự, 1989). Lactobacilli và các vi khuẩn sản xuất axit lactic
khác là một trong những sinh vật cần thiết cho sự đối kháng vi sinh vật xúc tác bởi
peroxidase. Trong các tế bào máu thực bào, enzyme myeperoxidase tạo thành axit
hypochlorous ,H2O2 và HOC1 phản ứng với một phân tử thứ hai của H2O2 để tạo ra
một oxy nhóm đơn, tính độc của oxy được hình thành đủ để tiêu diệt các tế bào vi

khuẩn đi vào. Các chất lỏng sinh học chứa hàm lượng clorua cao và các anion khác, ví
dụ, bicarbonate, có thể hình thành các gốc thứ cấp mà từ đó chúng tồn tại lâu để oxy
hóa các mục tiêu tế bào dễ bị tổn thương một cách chọn lọc. Trong phạm vi này,
11


carbonate / bicarbonate đã được báo cáo để tăng cường q trình oxy hóa protein bởi
các gốc HO- và để thúc đẩy q trình quang hóa hồng cầu.
c) Hệ thống kháng khuẩn của H2O2
Ngoài việc tạo ra các gốc hydroxyl, tác dụng diệt khuẩn in vivo của H2O2 có thể
liên quan đến việc kích hoạt hệ thống hydrogen peroxidase, thường được gọi là hệ
thống lactoperoxidase. Hệ thống kháng khuẩn Lactoperoxidase-thiocyanate-H2O2 (hệ
thống LP) là một hệ thống xuất hiện tự nhiên lần đầu tiên được phát hiện trong sữa
tươi. Nó đã được tìm thấy trong nước mắt, nước bọt và các chất lỏng sinh học khác.
Một loạt các vi khuẩn gram âm và gram dương được báo cáo là bị ức chế bởi hệ thống
LP. Trong hệ thống này, enzyme lactoperoxi-dase (LP) xúc tác q trình oxy hóa ion
thiocyanate (SCN-) bởi H2O2, tạo ra một tác nhân oxy hóa tương đối yếu là
hypothiocyanite (OSCN-), có hoạt tính kìm khuẩn (Thomas và cộng sự, 1994). Hệ
thống lactoperoxidase-H2O2, được phát hiện trong đường tiêu hóa trên của bê, được
chứng minh có thể chống lại E. coli mà không ảnh hưởng đến việc sản xuất H2O2 của
lactobacilli (Reiter và cộng sự, 1980).
Trong trường hợp khơng có LP và SCN-, H2O2 có hoạt tính diệt khuẩn hiệu quả
chống lại liên cầu khuẩn đường miệng nếu chúng tiếp xúc trong thời gian tương đối
dài (ví dụ: giá trị LD50 trong 24 giờ với 0,2 mM; 4 giờ với 1,5 mM hoặc 1 giờ với 9.0
mM). Trong thời gian ủ bệnh lên đến 4 giờ, hệ thống LP ức chế từ 50 đến 100 lần đối
với streptococci đường uống so với chỉ có H2O2, trong khi sau 24 giờ tiếp xúc, H2O2
hoạt động như hệ thống LP như một chất ức chế chuyển hóa vi khuẩn. (Thomas và
cộng sự, 1994).
Với sự có mặt của H2O2, khi chiếu tia UV vào bào tử của Bacillus subtilis đã
tạo ra một sự tiêu diệt nhanh chóng, lớn hơn gấp 2.000 lần so với việc chiếu xạ chỉ

bằng cách chiếu xạ (Bayliss và Waites, 1979).
2.2.3. Cơ chế chống lại H2O2 của vi khuẩn
Các loại oxy phản ứng ROS như H2O2 (hydrogen peroxide), O2- (anion
superoxide), gốc hydroxyl (OH-) được tạo ra bởi các q trình sinh học. Chúng đóng
vai trị quan trọng trong việc truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển gen, và vận chuyển
ion . Tuy nhiên các phân tử này tạo ra quá mức hoặc các tế bào thiếu các phân tử sinh
12


học bao gồm protein, lipid, và axit nucleic có thể bị phá hủy do q trình stress oxi
hóa. Điều đó gây nguy hiểm đối với tế bào vi khuẩn. Vì vậy, vi khuẩn đã trang bị cho
mình một hệ thống bảo vệ để chống lại độc tế bào bao gồm glutathione, các enzyme
và catalase liên quan. Đối với nhiều loại vi khuẩn, catalase có thể quan trọng nhất trong
việc bảo vệ chống lại nồng độ H2O2 cao vì các chất xúc tác thường có tốc độ quay vịng
cao. Sự vắng mặt hoặc mức độ thấp của catalase thường dẫn đến sự hình thành H2O2
với số lượng vượt quá khả năng của sinh vật làm nó suy giảm.
Các tế bào tự bảo vệ mình khỏi độc tính oxy hóa bằng cách quét sạch các chất
oxy hóa bằng các enzyme như catalase, hoặc trong trường hợp làm hỏng DNA, chúng
có thể sửa chữa thiệt hại sau khi nó xảy ra..
2.2.4. Định tính, định lượng H2O2
Các xét nghiệm để định tính và định lượng H2O2 trong nuôi cấy tế bào dựa trên:
(i) quá trình oxy hóa phụ thuộc catalase của formate tạo thành CO2, (ii) tạo ra các sản
phẩm huỳnh quang do phản ứng oxy hóa qua trung gian H2O2, (iii) mất huỳnh quang
khi oxy hóa scopoletin, (iv ) thay đổi độ hấp phụ khi oxy hóa phenol đỏ, hoặc (v) hình
thành phức chất với peroxidase (Benjamin J.Juven and Merle D.PierSon , 1996).
Việc định tính, định lượng hydrogen peroxide trở nên thiết yếu trong các nghiên
cứu dược phẩm, sinh học, lâm sàng, và môi trường. Các phương pháp phát hiện thông
thường H2O2 như đo màu, chuẩn độ, sắc ký, quang phổ, huỳnh quang hóa, phát quang
hóa nhưng phương pháp đơn giản nhất và dễ làm nhất là đo màu.
Các xét nghiệm đo màu dựa trên enzyme Horseradish peroxidase/3,3, 5,5′tetramethyl-benzidine (HRP / TMB) gần đây đã thu hút được nhiều sự chú ý do độ

nhạy cao, độc tính thấp và cách sử dụng đơn giản (Xianyu và cộng sự, 2013). HRP
là một protein có chứa heme có thể sử dụng hydro peroxide để oxy hóa nhiều loại
hợp chất. Một số chất nền phổ biến được sử dụng trong các xét nghiệm oxy hóa kết
hợp HRP và H2O2 là benzidine, o- tolidine, o-toluidine và o-dianisidine, chúng là chất
gây ung thư. Một trong những xét nghiệm dựa trên các chất nền ít nguy hiểm hơn là
xét nghiệm 4-aminoantipyrine / phenol đỏ; với sự có mặt của HRP. Vì vậy, để giảm
tính độc hại mà vẫn mang được hiệu quả cao cho phản ứng các nhà nghiên cứu đã lựa
chọn chất nền TMB- 3,3’,5,5’-tetramethylbezidine.
13


2.2.5. Lactobacillus sản sinh H2O2- vai trò trong y học
Hydrogen peroxidase - H2O2 là một chất diệt khuẩn hiệu được nhiều bệnh viện,
bác sĩ và nha sĩ sử dụng trong việc vô trùng, làm trắng răng.
Một số vi khuẩn Lactobacillus sinh ra H2O2 có thể làm giảm sự tái phát của
bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile, có tác dụng hỗ trợ điều trị
bệnh viêm ruột (IBD) (Ashish K. Singh và cộng sự, 2018), ngăn ngừa ung thư đại trực
tràng, ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng âm đạo (Mijac và cộng sự, 2006)...
Ngoài ra, một số báo cáo đã báo cáo rằng vi khuẩn lactobacilli bản đia ở âm đạo
tạo ra hydrogen peroxide có thể giảm tỷ lệ sinh non và nhiễm HIV (Caroline Mitchell
và cộng sự , 2015).

14


PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian: từ tháng 01/ 2019 đến tháng 05/2019.

3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Lactobacillus sp được phân lập từ từ hệ vi khuẩn đường ruột của người khỏe
mạnh.
3.2.2. Mẫu vật nghiên cứu
Các mẫu phân sẽ được người tham gia tại khu vực Hà Nội tự thu thập phân của
mình sau đó để trong hộp vơ trùng. Mẫu sau đó sẽ giữ lạnh ở 4°C và chuyển ngay lập
tức đến phịng thí nghiệm để phân tích.
3.2.3. Máy móc và thiết bị
Box cấy vơ trùng. Pipetman (hút được dung dịch ở các thể tích: 1000, 200, 100,
20, 10 µl). Máy li tâm cỡ lớn (Sorvall-Legend XTR). Máy li tâm Heraeus Fresco. Tủ
ni cấy. Đĩa cấy. Kính hiển vi phân cực (Nikon Eclipse 50i), lam kính, lamen. Bể ổn
nhiệt. Bộ điện di DNA, máy soi gel. Máy đo NanoDrop Lite Spectrophotometer. Máy
đo quang phổ. Máy PCR Thermocycler.
3.2.4. Hóa chất và mơi trường
 Các hóa chất sử dụng trong khn khổ khóa luận bao gồm : Nước muối sinh lý NaCl
0.9%. Bộ hóa chất nhuộm Gram: Gentians, Lugol, Fucshin. Glyxerol. Hóa chất làm
định tính, định lượng H2O2: Dung dịch gốc H2O2 thương mại 30%, TMB (3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine, sigma), DMSO (Dimethyl sulfoxide), HRP (Horseradish
peroxidase (Sigma). Agarose, đệm TAE 50X, Ethidium bromide (10mg/ml), đệm
tra mẫu Loading Dye. Tris base, Tris HCl, EDTA, Methanol, Phenol, Chloroform,
Isopropanol, và các hóa chất thơng dụng khác.
 Thành phần hóa chất (xem phần phụ lục 2)
15


 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này được mua tại Thermo Scientific.
 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus, môi trường MRS (xem phần phụ lục
1)
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1:

Thu mẫu phân, phân lập và làm sạch vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân của
người trưởng thành, khỏe mạnh tại Hà Nội.
3.3.2. Nội dung 2:
-

Tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng sinh H2O2.

-

Định tính H2O2 sing ra từ các chủng vi khuẩn Lactobacillus.

-

Định lượng H2O2 sinh ra từ các chủng vi khuẩn Lactobacillus.

-

Định danh danh pháp các chủng vi khuẩn quan tâm đến mức độ lồi bằng
phương pháp giải trình tự 16S rRNA và phân tích so sánh các trình tự nucleotide
này với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu.

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp phân lập, làm sạch, nuôi cấy, giữ chủng vi khuẩn
Lactobacillus
a) Phương pháp phân lập
Mẫu phân sau khi thu thập được đưa về phịng thí nghiệm. Sau đó, mẫu được
pha loãng theo dãy thập phân đến nồng độ 10-7 bằng nước cất vơ trùng. Dùng
micropipette có đầu cơn vô trùng hút 0,1 ml dịch ở các độ pha loãng 10-5, 10-6, 107

cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường thạch MRS (de Man, Rogosa &


Sharpe) và được ni cấy trong điều kiện kị khí ở 37°C trong vịng 48 đến 72 giờ. Điều
kiện kỵ khí được tạo ra bằng cách dùng một túi khí kỵ khí Anaerocult®A (Merek) trong
một bình ủ kị khí chứa các đĩa môi trường.
b) Phương pháp làm sạch và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus
 Vi khuẩn sẽ được làm sạch bằng cách ria cấy pha loãng trên đĩa thạch.
16


 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MRS: Với các chủng vi khuẩn đã
ria cấy tinh sạch, ta tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường MRS trong các lọ
Penicillin để nhân nhanh số lượng tế bào vi khuẩn, các thao tác thực hiện trong box
cấy.
- Các bước thực hiện: Sử dụng các lọ penicillin rỗng vô trùng. Dùng pipet hút vào
mỗi lọ 3 ml môi trường MRS lỏng. Khử trùng đầu que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn,
để nguội. Chọn một khuẩn lạc đơn có kích thước lớn nhất, dùng đầu que cấy chạm
vào khuẩn lạc vừa chọn. Nhúng đầu que cấy chứa vi khuẩn vào dung dịch MRS trong
ống penicillin, khuấy đều. Bọc miệng ống penicillin bằng giấy bạc hoặc nút cao su,
ghi tên mẫu và ngày vào mẫu. Nuôi lắc các chủng trong tủ ở 37oC, trong vòng 24-48
giờ.
c) Phương pháp giữ chủng
Phương pháp giữ chủng được thực hiện theo hai phương pháp: giữ chủng trong
glyxerol và giữ chủng trong ống thạch ( Lương Đức Phẩm , 2004).
 Giữ chủng trong glyxerol: Với các chủng vi khuẩn sau 24-48 giờ nuôi cấy trong
ống penicilline, thu lấy 700 µl dịch ni vi khuẩn cho vào ống eppendorf. Hút 300
µl Glyxerol 100% cho vào ống eppendorf đó. Búng đều cho dịch trong ống tan đều.
Ghi tên mẫu lên nắp ống eppendorf. Bọc miếng ống eppendorf bằng Parafilm và giữ
ở tủ -80oC. Tất cả các thao tác thực hiện trong box cấy vô trùng.
 Giữ chủng trong ống thạch: Thao tác thực hiện trong box cấy: Chuẩn bị lọ penicillin,
hút 3 ml môi trường MRS agar cho vào các lọ penicillin đó. Đợi cho thạch khơ hoàn

toàn. Khử trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn. Để cho nguội. Dùng đầu que cấy
chạm vào phần dịch nuôi vi khuẩn trong các ống penicillin. Ria phần vi khuẩn vừa
thu lên phần thạch MRS trong các lọ penicillin. Đậy lọ penicillin bằng nút cao su,
bọc nắp bằng parafilm. Ghi tên mẫu: Đem nuôi các chủng giữ trên ống thạch ở 37oC
trong vòng 24-48 giờ. Bước 7: Quan sát thấy phần thạch trong ống lên khuẩn lạc thì
giữ các ống thạch trong tủ lạnh 4oC.

17