n
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH: Công nghệ thực phẩm
CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ thực phẩm

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LIPASE TỪ MỦ
ĐU ĐỦ VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE

Người hướng dẫn : PGS. TS. ĐẶNG MINH NHẬT
Th.S
PHAN THỊ VIỆT HÀ
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ QUỲNH
Số thẻ sinh viên : 107120152
Lớp
: 12H2

Đà Nẵng , 06/2017


TÓM TẮT
Tên đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc
tính của lipase”.
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Quỳnh
Số thẻ sinh viên: 107120152

Lớp: 12H2

Nội dung đồ án tốt nghiệp bao gồm:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Mục đích của đề tài là tinh sạch một phần enzyme lipase có trong mũ đu đủ và xác
định các đặc tính vốn có của lipase đu đủ, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ
của lipase như: nhiệt độ, pH.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
✓ Đã xác định được hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ bằng phương pháp chuẩn độ trên
cơ chất cá basa.
✓ Lipase từ mủ đu đủ là một enzyme chịu kiềm, chịu nhiệt tốt. Hoạt động tối ưu đối
với dầu cá ba sa ở nhiệt độ 400C và pH= 8.
✓ Đã tìm được nồng độ hịa tan của enzyme thơ so với dung dịch gồm Tris-HCl
pH=8, muối natri lauroyl sacrcosine 0,5% với tỉ lệ là 0,01 (w/v).
✓ Đã xác định được điểm đẳng điện của lipase là 6,5.
✓ Đã tìm ra được nồng độ muối (NH4)2SO4 cho tủa protein (enzyme lipase) nhiều
nhất là từ 60-70%.
✓ Đã tinh sạch thành công 2 enzyme lipase có trong mủ đu đủ bằng phương pháp sắc
ký trao đổi ion bằng cột Q Sepharose Fast Flow và điện di ở nồng độ muối
(NH4)2SO4 bão hòa từ 50-70% với kích thước phân tử kích thước nằm trong khoảng
35-45 kDa.


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA: HĨA


CỘNG HỊA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ tên sinh viên :
Nguyễn Thị Quỳnh.
Số thẻ sinh viên :
107120152
Lớp :
12H2. Khoa :
Hóa. Ngành : Cơng nghệ thực phẩm .
1. Tên đề tài đồ án:
- “Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của
lipase”
2. Nội dung các phần thuyết minh và tính tốn:
-

Lời mở đầu

-

Chương 1 : Tổng quan

-

Chương 2 : Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

-


Chương 3 : Kết quả và thảo luận

-

Chương 4 : Kết luận và kiến nghị

-

Tài liệu tham khảo

3. Các bản vẽ : Không
4. Cán bộ hướng dẫn
PGS.TS Đặng Minh Nhật
ThS. Phan Thị Việt Hà
7. Ngày giao nhiệm vụ đồ án:
8. Ngày hồn thành đồ án :

02/02/2017.
20/05/2017

Trưởng Bộ mơn ……………………..

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2017
Người hướng dẫn


LỜI CẢM ƠN
Để đồ án tốt nghiệp này đạt kết quả tốt đẹp, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp
đỡ của nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho
phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân và cơ quan đã

tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Trước hết em xin gửi tới các thầy cơ khoa Hóa, trường Đại học Bách KhoaĐại học Đà Nẵng lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc.
Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình chu đáo của thầy cơ, đến nay em đã có
thể hồn thành đồ án tốt nghiệp, đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ
mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase”.
Cảm ơn ba, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và cho em được như ngày hôm
nay.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo PGS. TS. Đặng
Minh Nhật và cô Phan Thị Việt Hà đã quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn
thành tốt đồ án này trong thời gian qua. Trong suốt q trình làm đồ án, thầy và
cơ đã cung cấp cho em rất nhiều kiến thức bổ ích, ln định hướng, góp ý và sửa
chữa những chỗ sai, để từ đó giúp em nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết hơn về nội dung,
cũng như các vấn đề liên quan đến đồ án, và hoàn thành đồ án một cách tốt nhất.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến lãnh đạo Trường Đại học Bách Khoa- Đại
học Đà Nẵng, các Khoa Phòng ban chức năng đã trực tiếp và gián tiếp giúp đỡ
em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực
phẩm – Sinh học, các thầy cơ ở phịng thí nghiệm và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, tạo
mọi điều kiện thuận lợi, khích lệ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài tốt nghiệp của mình.
Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh
viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu sót. Em rất mong nhận được
sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cơ để em có điều kiện bổ sung, nâng
cao ý thức của mình, phục vụ tốt hơn cơng tác thực tế sau này.
Cuối cùng em xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã
dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đồ án của em.
Em xin chân thành cảm ơn!

i



CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng em. Các số liệu, kết quả
trong luận văn là trung thực. Nếu có trích dẫn em đã chú thích rõ ràng. Nếu khơng
đúng như trên, em xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Quỳnh

ii


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ........................................................................ C
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
CAM ĐOAN ................................................................................................................ ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................iii
DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ ..................................................................... v
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................. vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1 Tổng quan về đặc điểm của enzyme lipase ...................................................... 2
1.1.1 Định nghĩa lipase ............................................................................................... 2
1.1.2 Phân loại và cấu trúc lipase ............................................................................... 2
1.1.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 2
1.1.2.2 Trình tự amino acid ......................................................................................... 2
1.1.2.3 Cấu trúc không gian của lipase........................................................................ 2
1.1.3 Tính chất của enzyme lipase .............................................................................. 4
1.1.4 Cơ chế xúc tác ................................................................................................... 4
1.1.5 Một số phản ứng đặc trưng của enzyme lipase ................................................ 5

1.1.6 Ứng dụng của lipase .......................................................................................... 7
1.1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về lipase ........................................ 9
1.1.7.1 Tình hình nghiên cứu về lipase ở ngồi nước ................................................. 9
1.1.7.2 Tình hình nghiên cứu lipase trong nước........................................................ 10
1.2 Tổng quan về đu đủ ............................................................................................ 12
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố ......................................................................................... 12
1.2.2. Hình thái và sinh lý cây đu đủ ......................................................................... 13
1.2.3. Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế và đặc tính dược lý của đu đủ ................. 13
1.2.4. Mủ đu đủ .......................................................................................................... 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 15
2.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ................................................... 15
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 15
2.1.1.1 Nguồn thu nhận: ............................................................................................ 15
2.1.1.2 Thu nhận mủ đu đủ ........................................................................................ 15
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng .............................................................. 16
2.1.3. Thiết bị phục vụ nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19
2.2.1 Phương pháp thu nhận chế phẩm lipase thơ .................................................... 19
2.2.1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .................................................................................. 19
2.2.1.2 Thu nhận enzyme thô .................................................................................... 19
2.2.1.3 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi chế phẩm lipase thô ...................... 20
2.2.2 Phương pháp tinh sạch enzyme thô ................................................................. 20
2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .................................................................................. 20
2.2.2.2 Phương pháp chiết tách và tinh sạch enzyme lipase ra khỏi cấu trúc nhựa đu
đủ………………….. .................................................................................................. 21
2.2.3 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ của lipase ........................................ 21
iii


2.2.4 Phương pháp đo quang .................................................................................... 23

2.2.5 Khảo sát đặc tính của chế phẩm lipase thơ từ mủ đu đủ ................................. 23
2.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase ................................................. 24
2.2.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lipase ..................................................... 24
2.2.6 Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ nhựa đu đủ .......................................... 24
2.2.6.1 Q trình hịa tan bằng muối Natri lauroyl sarcosin ...................................... 24
2.2.6.2 Xác định điểm đặng điện ................................................................................ 24
2.2.6.3 Tủa muối (NH4)2SO4 ...................................................................................... 24
2.2.6.4 Nghiên cứu tinh sạch phân đoạn sắc ký ion .................................................. 25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 28
3.1 Thu nhận mủ đu đủ từ trái đu đủ xanh ......................................................... 28
3.2 Thu chế phẩm lipase thô ................................................................................. 28
3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase ........................................... 29
3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lipase .................................................... 31
3.5 Kết quả xác định đường chuẩn....................................................................... 32
3.6 Kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ nhựa đu đủ ....................... 33
3.6.1 Kết quả của q trình hịa tan bằng muối Natri lauroyl sarcosin .................... 33
3.6.2 Điểm đẳng điện ................................................................................................ 34
3.6.3 Kết quả tủa muối Amoni sunfat ....................................................................... 35
3.6.4 Nghiên cứu tinh sạch phân đoạn sắc ký ion .................................................... 36
3.6.5 Kiểm tra lại lipase bằng phương pháp điện di ................................................. 37
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 39
4.1 Kết luận ............................................................................................................... 39
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 40

iv


DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ
Bảng 1.1 Cho biết tính đặc hiệu của một số enzyme lipase ............................................4

Bảng 1.2 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý .................................................................12
Bảng 2.1 Tóm tắt các bước tiến hành để xác định hoạt độ enzyme lipase. ..................22
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ .......................29
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ ...............................31
Bảng 3.3 Kết quả đo quang để xác định đường chuẩn .................................................32
Bảng 3.4 Khối lượng, thể tích và hoạt lực enzyme thô, enzyme sau khi tinh sạch bằng
xử lý hòa tan. .................................................................................................................33
Bảng 3.5 Kết quả đo độ đục của dung dịch enzyme lipase ở bước sóng 620 nm. ........34
Bảng 3.6 Nồng độ muối cần dùng và hàm lượng lipase thu được. ...............................35
Bảng 3.7 Kết quả hoạt lực của lipase đo bằng phương pháp đo quang sau chạy sắc ký
ở nồng độ muối NaCl 0M, pH= 9. .................................................................................37
Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể lipase ..................................................................................3
Hình 1.2 Mơ hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và khơng tan trong nước.
Sự thay đổi hình thể của lipase trong q trình hoạt động xúc tác. Mơ hình này do
Verger đề xuất (1980). .....................................................................................................5
Hình 1.3 Phản ứng thủy phân ........................................................................................6
Hình 1.4 Phản ứng este hóa ...........................................................................................6
Hình 1.5 Phản ứng trao đổi giữa các este .....................................................................6
Hình 1.6 Phản ứng chuyển este .....................................................................................7
Hình 2.1 Vườn cây đu đủ lấy mủ tại Đại Lộc, Quảng Nam..........................................15
Hình 2.2 Máy đồng hóa siêu âm………………………………………………………….…21
Hình 2.3 Máy đo pH .....................................................................................................18
Hình 2.4 Máy đo quang……………………………..……………….................................21
Hình 2.5 Máy sấy thăng hoa .........................................................................................18
Hình 2.6 Máy li tâm lạnh ……………………………………………………………………21
Hình 2.7 Cân phân tích ( bốn số)..................................................................................18
Hình 3.1 Mủ đu đủ sau khi sấy thăng hoa ....................................................................28
Hình 3.2 Lipase thơ .......................................................................................................28
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ. ......................30
Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ ...............................32

Hình 3.5 Đường chuẩn đo quang của hợp chất p-NP ..................................................33
Hình 3.6 Hình ảnh thu được của dung dich lipase sau khi sắc ký trao đổi ion............37
Hình 3.7 Kết quả chạy điện di SDS-PAGE ...................................................................38

v


DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT:
AS

: Amoni sunfat ( NH4)2SO4

p-NP

: p-Nitrophenol.

p-NPP

: p-Nitrophenyl pamitateo

Gly

: acid amin glycine

Ser

: acid amin serine


vi


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lipase (EC 3.1.1.3) là các enzyme đóng vai trị xúc tác sinh học cho phản ứng thủy
phân triglyceride tạo thành các tri-, di-, mono- glyceride, glycerol và các acid béo tự
do nhờ hoạt động trên bề mặt phân pha dầu nước. Lipase là enzyme linh hoạt có thể sử
dụng để xúc tác nhiều loại phản ứng khác nhau, có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt.
Chính vì thế, lipase được ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp như cơng nghiệp thực
phẩm, cơng nghiệp hóa học, công nghiệp mỹ phẩm, công nghiệp thuộc da, trong y học
và các ngành cơng nghiệp khác [7].
Lipase có nguồn gốc rất đa dạng ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật. Dù vi sinh
vật là nguồn cung cấp enzyme chính do giá thành rẻ và tạo được sinh khối nhiều
nhưng các enzyme từ thực vật và động vật đang góp phần làm phong phú nguồn
enzyme [10].
Lipase từ thực vật tuy chưa được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp hiện
nay nhưng với nhiều ưu điểm như giá thành thấp, nguồn nguyên liệu dồi dào như từ đu
đủ, sung, vả, cám gạo, nên gần đây enzyme lipase từ thực vật đang ngày được chú ý và
nghiên cứu của các nhà khoa học [29].
Đu đủ là một loại cây rất thích hợp với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, chính vì
vậy mà ở Việt Nam cây đu đủ được trồng rất nhiều, tuy nhiên đu đủ ở đây trồng chủ
yếu là để lấy papain phần enzyme tan trong nước cịn lipase khơng tan được xem là
chất thải, và đây được xem là nguồn lipase tiềm năng [7].
Từ những nhu cầu sử dụng lipase ngày càng nhiều ở nước ta, cùng với nguồn
nguyên liệu sẵn có, dễ kiếm và tận dụng được nguồn chất thải từ sản xuất papain, và
mỗi cơ chất khác nhau thì lipase thể hiện hoạt độ khác nhau chính vì vậy mà tơi chọn
đề tài “Nghiên cứu tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của

lipase”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình tinh sạch enzyme lipase đơn giản nhất.
- Xác định cấu trúc của lipase từ mủ đu đủ.
- Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH, ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm enzyme
lipase từ mủ đu đủ.
- Tinh sạch lipase bằng phương pháp tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký trao đổi
ion.
-

Xác định điểm đẳng điện của enzyme lipase từ mủ đu đủ.

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
1


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đặc điểm của enzyme lipase
1.1.1 Định nghĩa lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) – là enzyme xúc tác cho phản
ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glixerin và các
acid béo tương ứng. Lipase xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết α-ester
trong phân tử chứ không phải cắt đứt cả 3 liên kết cùng lúc [7].
Có hoạt tính mạnh đối với cơ chất không tan trong nước, thể hiện hoạt tính bề mặt.

Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ hóa đảo (nước trong dầu).
Một lipase thực thụ sẽ cắt các este huyền phù của glycerine với các acid béo chuỗi dài
như triolein và tripalmitin [4].
1.1.2 Phân loại và cấu trúc lipase
1.1.2.1 Phân loại
❖ Theo nguồn gốc:
+ Lipase từ động vật: thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế khơng cao.
+ Lipase từ thực vật: đang ngày càng được nghiên cứu và sử dụng nhiều trong đời
sống.
+ Lipase từ vi sinh vật: vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme
với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu nhận chế phẩm cũng dễ dàng và có thể
thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành cơng nghiệp khác nhau [4].
1.1.2.2 Trình tự amino acid
Nhiều trình tự amino acid của lipase được suy ra từ trình tự gen lipase đã tách dịng
cho thấy có những điểm tương đồng giữa những cấu trúc không gian của lipase vi sinh
vật và động vật có vú, tuy nhiên vẫn có rất ít những trình tự giống nhau hồn tồn,
ngoại trừ những trình tự vùng quanh trung tâm hoạt động. Khi so sánh trình tự amino
acid vùng quanh trung tâm hoạt động của nhóm gồm ba enzym xúc tác protease,
lipase, cutinase với esterase, người ta thấy sự tồn tại của trình tự Gly-X1-Ser-X2-Gly
(X là một amino acid bất kỳ). Khác biệt duy nhất đã biết với trình tự trên là sự thay thế
của alanine cho glycine thứ hai trong chuỗi acid amin.
1.1.2.3 Cấu trúc không gian của lipase
Xác định cấu trúc không gian ba chiều của lipase là cơ sở để hiểu được động
học phản ứng, cơ chất đặc hiệu và hoạt tính bề mặt của lipase. Ngồi ra mơ hình cấu
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
2



Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

trúc khơng gian ba chiều cịn cho phép dự đốn các tính chất hóa sinh cũng như cung
cấp cơ sở để biến đổi lipase nhằm cải tiến tính bền của lipase. Sau khi xác định được
cấu trúc của enzyme thì điều quan trọng nhất là ta phải tinh chế được chúng. Vào năm
1990, cấu trúc tinh thể đầu tiên của hai lipase khác nhau đã được xác định: một
enzyme tách từ nấm Rhizomucor miehei, một enzyme tiêu hóa của người là lipase
tuyến tụy. Sau này cấu trúc không gian ba chiều của rất nhiều lipase đã được chứng
minh bằng tinh thể học tia X như lipase của Geotrichum candidum (Schrag et al.,
1991), Fusarium solani (Martinez et al., 1992), Candida rugosa (Grochulski et al.,
1993), Pseudomonas glumae (Noble et al., 1993), Humicola lanuginosa (Lawson et
al., 1994), Pseudomonas cepacia (Kim et al., 1997; Schrag et al., 1997) [7].
Lipase từ các nguồn gốc khác nhau, thì rất khác nhau về kích thước phân tử và
có rất ít các trình tự tương đồng. Tuy nhiên trong các lipase đã được kết tinh và nghiên
cứu đều cho thấy rằng hầu hết chúng là những protein có cấu trúc α/β với một trung
tâm hoạt động là các gấp nếp β được bao quanh bởi một số dải xoắn hilix α (Hình 1.1).
Trung tâm xác tác được tạo bởi bộ ba Ser..His..Asp/Glu, tương tự như ở protease
serine và che đậy bằng một cấu trúc giống như nắp gồm một hoặc hai chuổi xoắn α
(Misset et al.,1994).

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể lipase [32].
Bình thường trung tâm xác tác khơng bộc lộ ra bên ngồi mơi trường, nhưng khi
tương tác với cơ chất ở bề mặt tiếp xúc giữa dầu và nước thì dạng cấu trúc thay đổi và
trung tâm hoạt động lại bộc lộ ra bên ngoài (Misset et al., 1994). Trong cấu trúc của
lipase cịn có một khung trình tự Gly-X1- Ser-X2- Gly (X là một amino acid bất kỳ),
cũng tương tự như ở protease, trình tự này nằm trong phần trung tâm hoạt tính nhưng
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật

Th.S Phan Thị Việt Hà
3


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

nó lại tham gia vào việc nhận biết lipid khi enzyme hoạt động bề mặt. Cấu trúc cuộn
xoắn của lipase được giữ vững bằng các cầu disulfide và nhờ mạng lưới liên kết hydro.
Số lượng cầu disulfide không cố định mà thay đổi tùy theo loại lipase có nguồn gốc
khác nhau [7].
1.1.3 Tính chất của enzyme lipase
Lipase có hoạt tính bề mặt ở phân pha nước/ lipid và chỉ thủy phân chất béo đã
nhũ hóa. Lipase khác các enzyme esterase ở điểm esterase chỉ thủy phân các este tan
trong nước [4].
Lipase có nhiều trong sữa, các hạt có dầu (đậu nành, đậu phộng), ngũ cốc (lúa
mạch, yến mạch), và được tìm thấy chủ yếu trong quá trình nảy mầm trong trái cây và
rau, trong hệ thống tiêu hóa của động vật và nhiều loại vi sinh vật.
Lipase có thể thủy phân 3 liên kết ester trong chất béo hoặc chỉ thủy phân một
số liên kết ester nhất định giữa gốc –OH với các gốc acyl trong phân tử acyl lipid.
Bảng 1.1 Cho biết tính đặc hiệu của một số enzyme lipase.[4]
Liên kết bị thuỷ phân

Nguồn lipase

Các gốc acyl ở vị trí 1,3

Tuyến tụy, sữa, Pseudomonas fragi,
Penicillium roqueforti

Các gốc acyl ở vị trí 1, 2 và 3


Yến mạch, hạt thầu dầu, Aspergillus
flavus

Acid oleic và linoleic ở vị trí 1,2 và 3

Geotrichum candidum

Kích thước của giọt dầu trong hệ nhũ tương càng nhỏ thì tổng diện tích bề mặt
phân pha dầu/nước càng lớn dẫn đến hoạt tính của lipase càng cao.
Hoạt tính lipase trong thực phẩm khơng hồn tồn dự đốn được độ bền của
thực phẩm trong q trình bảo quản, tính đặc hiệu cơ chất của lipase rất khác biệt nên
các acid béo tự do tạo ra trong quá trình thủy phân rất khó xác định. Ngưỡng giá trị
cảm nhận mùi vị của các acid béo cũng thay đổi rất khác nhau nên ảnh hưởng của
lipase lên mùi vị thực phẩm cũng rất khác biệt.
1.1.4 Cơ chế xúc tác
Theo các nghiên cứu lipase có nhóm serin, histidin và acid aspastic ở
trung tâm hoạt động của nó. Với các cơ chất khơng tan trong nước, hoạt
tính của lipase đạt được cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt
phân pha dầu nước. Q trình đó được gọi là q trình hoạt hố phân pha (hình 1.2).
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
4


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

Khi khơng có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng

este hoá và phản ứng este được ưu tiên. Trong trường hợp này, những đặc
tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện
phản ứng và bản chất cơ chất [Paul Woolley & Steffen B. Petersen, 1992].

Hình 1.2 Mơ hình hoạt động của lipase trên cơ chất hồ tan và khơng tan
trong nước. Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc
tác. Mơ hình này do Verger đề xuất (1980).

Trong đó:
E

: Lipase hồ tan khơng hoạt động

E* : Lipase hồ tan dạng hoạt động
Es* : Lipase hoạt động có hấp phụ
Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ
Sw : Cơ chất tan trong nước
S

: Cơ chất không tan trong nước

E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase- cơ chất
Lipase xúc tác cho một phản ứng hóa học qua ba bước (Hình 1.2) (Martinelle,
Hult, 1994).
Bước 1: lipase liên kết với bề mặt tiếp xúc giữa pha dầu và pha nước, đây có
thể là bước hoạt hóa enzyme.
Bước 2: lipase liên kết với cơ chất trên bề mặt để hình thành phức hợp enzyme
- cơ chất.
Bước 3: Tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do
[5].

1.1.5 Một số phản ứng đặc trưng của enzyme lipase
Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng hóa học khác nhau. Phản
ứng thủy phân là một phản ứng đặc trưng với sự tham gia của lipase. Phản ứng thủy
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
5


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

phân được bắt đầu khi nguyên tử O của serine tấn công vào nguyên tử C của nhóm
carboxyl tham gia trong liên kết este để hình thành phức hợp tứ diện trung gian. Tham
gia vào việc tạo thành phức hợp trung gian này cịn có sự tham gia của gốc histidine.
Tiếp đó phức trung gian được phân giải thành phức hệ acyl-enzyme. Cuối cùng nhờ có
sự tham gia của phân tử nước, lipase tự do được giải phóng cùng một acid béo. Quá
trình thủy phân sẽ tạo thành acid béo và glyxerol (Hình 1.3). Phản ứng este hóa (Hình
1.4) là phản ứng giữa một acid béo và rượu tạo ra este [18].

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân [9]

Hình 1.4 Phản ứng este hóa [9].
Phản ứng trao đổi giữa các este (Hình 1.5) là phản ứng trao đổi giữa các este hoặc giữa
este và acid béo.

Hình 1.5 Phản ứng trao đổi giữa các este [9]
Phản ứng chuyển este (Hình 1.6) là phản ứng giữa este với rượu hoặc glyxerol.

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2


GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
6


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

Hình 1.6 Phản ứng chuyển este [9].
1.1.6 Ứng dụng của lipase
Enzyme lipase được ứng dụng một lượng lớn trong các lĩnh vực công nghiệp
cũng như trong nghiên cứu và công nghệ sinh học. Lipase có tầm quan trọng rất lớn
trong ngành cơng nghiệp do sự ổn định trong dung môi hữu cơ, sự đa dạng của chất
nền, tính chọn lọc và khả năng xúc tác phản ứng của chúng mà không cần phải bổ
sung các đồng đẳng đắt tiền. Hơn nữa, chúng cũng dễ dàng được sản xuất trong điều
kiện hiên nay.
Và hoạt động ở điều kiện mơi trường bình thường, khơng yêu cầu cao về điều
kiện của môi trường hoạt động. Vì vậy, lipase được sử dụng trong nhiều lĩnh vực công
nghiệp khác nhau. Trong các lĩnh vực công nghiệp được sử dụng nhiều như: chế biến
thức ăn gia súc, sản xuất bột giấy và giấy, mỹ phẩm, công nghiệp sản xuất bột giặt,
tổng hợp các chất hữu cơ, trong các ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm như công
nghiệp chế biến sữa và pho mát, công nghiệp sản xuất dược phẩm, hóa cơng và các
ngành cơng nghiệp khác [7].
❖ Trong cơng nghiệp dược và hóa chất
Trong những năm gần đây enzyme ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi
trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh. Ở nhiều nước
trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản hàng năm người ta đã sản xuất một lượng lớn chế
phẩm enzyme vi sinh vật có độ tinh khiết cao trong đó có mặt của lipase.
Trong dược phẩm lipase được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất thuốc
chữa bệnh cho người và các loại hoá chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, trừ cỏ). Gần

đây hơn, trong lĩnh vực hoá học tinh khiết, người ta đã dùng lipase để tạo các chất
trung gian tổng hợp qua quá trình thuỷ phân lập thể chọn lọc, ứng dụng trong sản xuất
thuốc trừ sâu Pyretinoidic [10].
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
7


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

Ngồi ra trong phịng thí nghiệm các lipase cũng được nhà hố học hữu cơ
dùng làm công cụ tổng hợp một số chất khác như phân giải Raxemic epoxieste nhờ
lipase của Rhizopus arhisus [J.A Laitte (Pháp)]. Với mong muốn có thể sản xuất một
loại thuốc làm giãn động mạch vành, người ta dựa vào tính chất chọn lọc thuỷ phân
của lipase trong mơi trường dung mơi hữu cơ [10].
Các lipase có thể xúc tác este hoá, chuyển đổi este hoá và este hố tương tác
trong các dung mơi hữu cơ với lượng nước thấp [Kazlaus kas và Bornscheuer, 1998;
Godberg và cộng sự, 1989], ứng dụng chính của các lipase trong hố hữu cơ là sự
phân giải các hỗn hợp enantiomeric. Có một vài nhóm phân tử liên quan đến sự truyền
tính trạng dấu hiệu làm gia tăng những căn bệnh dị ứng, viêm là những lipid hay lipid
aqnalogues. Sự truyền tín hiệu ở giữa và trong nội bào ở sinh vật liên quan gần gũi với
những loại lipid đơn lẻ như phosphatidylinositol, lipase cũng như photpholipase đều
có thể được sử dụng để tổng hợp trên phạm vi lớn [10].
❖ Trong công nghệ thực phẩm
Trong công nghiệp thực phẩm người ta sử dụng lipase để cải biến các
triacyglyxerol, nâng cao chất lượng các loại dầu thực vật rẻ tiền, chất lượng thấp bằng
cách thay thế các acid béo no bởi các acid béo khơng no, trong dung mơi hiếm nước.
Ví dụ: Lipozyme (Novo) được dùng để sản xuất bơ Cocoa tương đương từ dầu

cọ và các acid stearic để sử dụng trong công nghiệp chế biến đồ hộp [Bjorkling, 1991].
Đối với thực phẩm được chế biến từ sữa, lipase được sử dụng rộng rãi để làm
tăng mùi vị, làm tăng độ chín của phomat, hoặc chế biến những sản phẩm như phomat
và phân giải lipid [Bech, 1992]. Những acid béo tự do mạch ngắn (chủ yếu là C4, C6)
được thuỷ phân ra do tăng lipase vào sữa béo dẫn đến sự tăng hương vị đặc trưng cho
sữa. Trong khi đó nếu các acid béo mạch trung bình (C12, C14) được tạo ra sẽ có xu
hướng tạo ra mùi vị tựa như xà phịng cho sản phẩm. Thêm vào đó những acid béo tự
do này có thể tham gia vào các phản ứng hố học đơn giản với vi sinh vật dẫn đến việc
tổng hợp những gia vị có mùi thơm khác nhau. Những nguồn lipase dùng cho việc
tăng hương vị ở phomat trên mơ của những lồi động vật nhai lại (dê non, cừu, bê).
Một số chế phẩm lipase được sử dụng làm tăng mùi vị và làm chín phomat được thu từ
một số chủng như: M.miehei, A.niger hay A. oryzae.
❖ Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Hiện nay thị trường lớn nhất cho các loại lipase là việc sử dụng nó như những
chất cấu thành trong các loại bột giặt ở công nghệ giặt khô. Ngày nay lipase được
dùng trong bột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ mà con người tiết ra quần áo, chăn
đệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt tính bề
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
8


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

mặt [Gormen & Malmos, 1991]. Một số lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng
trong ngành thuốc tẩy là: Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hoặc lipase
P.glumace của Unilever [Estell và cộng sự, 1985] được sử dụng trong ngành công
nghiệp tẩy rửa. Nhưng những lipase dùng làm bột giặt cho những hộ gia đình giữ ổn

định với các protease và hoạt động có hiệu quả trong điều kiện kiềm [10].
❖ Trong cơng nghiệp thuộc da
Q trình thuộc da u cầu phải bỏ lớp chất béo dưới da. Sử dụng phối hợp
lipase với các enzyme thuỷ phân khác như protease đã mở ra con đường mới cho công
nghiệp thuộc da. Một quá trình enzyme mới cho sản xuất từ da sống đến thuộc da bao
gồm việc giặt, rũ lông và rửa sạch trong bể nước có pH khoảng 8-13 chứa một enzyme
ưa kiềm. Rõ ràng cần sử dụng phối hợp lipase với các protease kiềm hay trung tính và
một chất hoạt động bề mặt khác. Tại Nga đã có bằng sáng chế sử dụng chế phẩm
enzyme để thuộc da cừu với các đặc tính ưu việt hơn như độ bền, độ co giãn tăng và
giảm cứng.
❖ Trong công nghiệp mỹ phẩm
Lipase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các chất
hoạt động bề mặt và các hợp chất thơm. Những thành phần chủ yếu trong mỹ phẩm và
nước hoa được điều chế bằng phản ứng este hoá glyxerol được xúc tác bởi lipase. Việc
chuyển este hoá của 3,7- dimethyl 4,7- octadien- 1- ol bởi lipase từ nhiều nguồn vi
sinh vật khác nhau để điều chế oxit hoa hồng là một hương liệu quan trọng trong sản
xuất nước hoa.
1.1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về lipase
1.1.7.1 Tình hình nghiên cứu về lipase ở ngồi nước
Hiện nay trên thế giới Lipase được sử dụng rộng rải nên việc nghiên cứu về
lipase rất được xem trọng và phổ biến và được thực hiện từ lâu, tiêu biểu như các đề
tài nghiên cứu sau:
Năm 1935, hoạt động của lipase trong mủ đu đủ đã được báo cáo. Tuy nhiên
mãi đến năm 1991, sự quan tâm vào nghiên cứu enzyme này mới bắt đầu. Những năm
gần đây, lipase từ mủ đu đủ càng ngày càng thu hút và quan tâm nhiều.
Năm 2008, PAQUES, F. W. và các cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch enzyme
lipase từ hạt và vỏ quả đu đủ,thu được kết quả enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ
500C và pH= 8 [17].
Năm 2011, Slim Abdelkali và cộng sự đã nghiên cứu lipase từ đu đủ Carica, thu
được kết quả enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 500C và pH=9 [29].

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
9


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

Năm 2011, N. Annamalai và cộng sự đã nghiên cứu lipase chịu kiềm và chịu
nhiệt từ Bacillus licheniformis sử dụng bánh dầu đậu phộng là chất nền. Enzyme ổn
định 100% ở 600C, và vẫn giữ được hoạt động hơn 80% sau 1h ủ ở 700C và pH 911,5. Các ion như Ca2+, Ba2+ và Mg2+ tăng cường trong khi Ni2+ và Fe3+ ức chế hoạt
động enzyme [12].
Năm 2011, Muhannad I. Massadeh và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất và đặc
tính của lipase từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus, nghiên cứu cho thấy lipase
này ổn định ở pH=8,0. Trong khi nó bị mất ổn định của nó gần như hồn tồn ở pH 6,0
và 10,0. Enzyme này còn thể hiện một sự ổn định trong các dung môi hữu cơ và dường
như được kích hoạt bằng isopropanol ở nồng độ 25 và 100% [19].
Năm 2013, Christoph Brunschwiler và cộng sự đã khảo sát hoạt độ lipase cám
gạo và ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt lực lipase, nghiên cứu này tác giả
đã sử dụng phương pháp đo quang để đo hoạt lực lipase cám gạo và so sánh với
phương pháp chuẩn độ. Bên cạnh đó, nghiên cứu cịn cho thấy lipase được giữ nguyên
hoạt lực trong thời gian bảo quản dưới 3 tháng [14].
1.1.7.2 Tình hình nghiên cứu lipase trong nước
Tại nước Việt Nam, việc nghiên cứu thu nhận và ứng dụng enzyme lipase chưa
nhiều. Tuy nhiên vào những năm gần đây, các nghiên cứu về enzyme lipase đang
được nhiều người quan tâm hơn. Các nghiên cứu đã đạt được những thành quả nhất
định, giúp cho chúng ta hiểu hơn về enzyme lipase và các ứng dụng của lipase trong
đời sống. Một số nghiên cứu điển hình như sau:
Nghiên cứu ứng dụng lipase trong sản xuất một số loại dầu béo của Đặng Thị

Thu và cộng sự, 2004. Lại Thị Mai Hương và cộng sự 2008 đã nghiên cứu thu nhận
chế phẩm enzyme lipase từ 12 chủng vi sinh vật (2008) và chủng Rhizopus sp. Sinh
tổng hợp lipase có nhiệt độ tối ưu là 400C và pH tối ưu là 8-9. Ngoài ra, tác giả Lê
Quang Huy và các cộng sự, 2009 thu nhận lipase từ nấm men Schizosaccharomyces
pombe có trọng lượng phân tử khoảng 51-55 kDa [7].
Nhóm nghiên cứu của Quyền Đình Thi đã nghiên cứu tương đối nhiều về lipase
từ phân lập các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp lipase (Quyền Đình Thi et al., 2003),
Quyền Đình Thi và đồng tác giả (2007) cũng đã nhân dòng, biểu hiện và đánh giá một
enzyme có hoạt tính thủy phân lipid là esteaza EstM cũng từ chủng Ralstonia M1
(Quyen et al., 2007) [9].
Năm 2004, Đặng Thị Thu, nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo
bằng lipase đã khảo sát khả năng thủy phân dầu đậu tương của lipase cố định thu được
dầu có chỉ số acid đạt 80,5 và sử dụng lipase trong sản xuất phomat kết quả cho thấy
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
10


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

phomat có bổ sung lipase đã làm tăng các chỉ tiêu chất lượng cảm quan so với sản
phẩm phomat không bổ sung lipase [10].
Năm 2011, Dương Minh Lam và Vũ Thị Lý, Nghiên cứu tuyển chọn Bacillus
sinh lipase kiềm từ rừng ngập mặn, đã chọn được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh
lipase kiềm mạnh trong số 250 chủng vi khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn. Cả 8 chủng
biểu hiện hoạt tính mạnh tại giá trị pH= 9 và mơi trường 3% NaCl [7].
Năm 2013, Vương Bảo Thi, Trần Bích Lam và Lưu Duẩn, nghiên cứu tính chất
động học và đặc điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá tra (PANGASIUS),

cho kết quả Km= 1,381 mM và Vmax= 0,063 mM/min với cơ chất triolein. Lipase tinh
sạch có hoạt tính ổn định ở khoảng pH = 7-9, nhiệt độ 35-500C [4].
Năm 2016, Trần Thị Bích Hà đã nghiên cứu đặc tính, và các yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt độ của lipase nhưng chưa hoàn thiện được phần tinh sạch lipase ra khỏi
enzyme thô.
Kết luận
Qua những nghiên cứu điển hình ở trên ta thấy việc nghiên cứu về enzyme
lipase trong nước và trên thế giới ngày càng được chú trọng,tuy nhiên những nghiên
cứu trên hầu hết là nghiên cứu về lipase có nguồn gốc vi sinh vật và động vật là chủ
yếu chứ chưa có nhiều nghiên cứu về lipase có nguồn gộc thực vật, đặc biệt là lipase
từ mủ đu đủ thì rất hiếm. Lipase từ mủ đu đủ có nguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền,
là một enzyme “cố định tự nhiên” chưa được khám phá nhiều qua các nghiên cứu.
Enzyme này có thể được sử dụng ở dạng thô khi cho vào thực phẩm hoặc dược phẩm
và vẫn đảm bảo được tính an tồn. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu chiết tách và tinh
sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ gặp rất nhiều khó khăn do nó được bao bọc trong “lớp
vỏ nhựa cao su tự nhiên”. Từ thực tiễn đó, chúng tơi đề nghị phương án: “Nghiên cứu
tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase” với các nội
dung sau:
- Xây dựng quy trình tinh sạch enzyme lipase đơn giản nhất.
- Xác định cấu trúc của lipase từ mủ đu đủ.
- Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH, ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm enzyme
lipase từ mủ đu đủ.
- Tinh sạch lipase bằng phương pháp tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký trao đổi
ion.
- Xác định điểm đẳng điện của enzyme lipase từ mủ đu đủ.

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà

11


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

1.2 Tổng quan về đu đủ
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố
Đu đủ là một trong những loại trái cây phổ biến của vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới. Sản lượng thế giới năm 2004 đạt 6,8 triệu tấn trên 389.990 hecta (FAO 2004),
trong đó 47% sản lượng có nguồn gốc từ khu vực Trung và Nam Mỹ (chủ yếu ở
Brazin), 30% từ Châu Á và 20% thuộc về Châu Phi. Mặc dù được trồng (>90%) và
tiêu thụ chủ yếu tại các nước đang phát triển, nhưng đu đủ đã nhanh chóng trở thành
một loại trái cây quan trọng của thế giới, ngang tầm với nhiều loại trái cây và sản
phẩm nông sản khác [31].
Bảng 1.2 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý [31].
Vùng

Diện tích thu hoạch (ha)

Sản lượng (tấn)

Châu Phi

128.807

1.344.230

Châu Á và Thái Bình
Dương


157.203

2.063.352

Úc

403

5.027

Caribê

9.179

179.060

Trung Mỹ

28.966

1.057.024

Bắc Mỹ

500

16.240

Nam Mỹ


65.546

2.120.370

Đu đủ có xuất xứ từ vùng bờ biển Caribbean thuộc Trung Mỹ, trải dài từ
Argentina và Chile tới nam Mehicô (Manshardt 1992) thông qua lai tạo tự nhiên giữa
Carica peltata và một số loài hoang dại khác (Purseglove 1968) [31].
Lịch sử phát hiện đu đủ được ghi nhận lần đầu tiên bởi Oviedo, giám đốc vùng
mỏ Hispaniola (Antilles) từ năm 1513 tới 1525. Ông đã mô tả cách thức Alphonso de
Val verde thu nhận hạt đu đủ từ bờ biển Panama tới Darien, sau đó tới San Domingo
và các hòn đảo khác của miền tây Ấn Độ cũng như các vùng lân cận. Người Tây Ban
Nha đặt tên cho nó là “papaya” và mang tới trồng ở Philipine, sau đó lan rộng ra khắp
Malaya và cuối cùng là Ấn Độ vào năm 1598 (Schery 1952). Năm 1874, cây đu đủ đã
nhanh chóng được phân bố rộng khắp các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới [31].
Cây đu đủ ở Việt Nam
Ở Việt Nam đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam, chúng
được trồng nhiều ở tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa, dốc
tụ, phù sa cổ và nhiều loại đất khác, những vùng đu đủ có thể kể đến là Hà Tây, Hà
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
12


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

Nam, Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc (Miền Bắc), Lái Thiêu, Tiền Giang, Sông
Bé (cũ), các tỉnh Tây nguyên… (Miền Nam). Diện tích trồng đu đủ của cả nước ước
khoảng 10.000-17.000 ha với sản lượng khoảng 200-350 ngàn tấn quả [11].

Năm 2008 vùng Daklak Việt Nam đã được công ty BPI.SA (Vương quốc Bỉ)
tài trợ dự án phát triển cây đu đủ. Toàn bộ mủ đu đủ được xuất sang Bỉ ở dạng thô
để dùng làm thuốc và chất xúc tác trong ngành hóa thực phẩm. Một đời cây đu đủ
giống Solo (lai giữa đu đủ Châu Phi và Thái Lan) trong điều kiện chăm sóc tốt có thể
cho 1-1,5 kg mủ khơ [2].
1.2.2. Hình thái và sinh lý cây đu đủ
Thân đu đủ có thể cao 2-10m, là một cây nhiệt đới, thân thảo to, thẳng, có
nhanh hoặc khơng phân nhánh. Rễ chùm, đâm nhánh ngang mạng khi gặp điều kiện
thuận lợi thì đâm sâu rễ xuống sâu. Đu đủ khơng có rễ cái mà chỉ có rễ con và mọc lan
tỏa khắp gốc, và đâm sâu xuống đất. Lá đơn to, phân thùy hình chân vịt. Quả đu đủ có
hình oval hoặc gần tròn, dài 15-50cm, bề dày 10- 20cm và trọng lượng có thể đạt 9 kg
( Morton 1987). Khi còn xanh, quả đu đủ chứa rất nhiều mủ, vỏ quả xanh và cứng. Khi
chín, vỏ quả chuyển thành màu vàng nhạt đến vàng đậm, đến cam. Trái đu đủ già chứa
rất nhiều hạt hình trứng, màu xám đen, bám nhẹ vào lớp thịt quả nhờ lớp mô sợi mềm.
Đu đủ thường được trồng từ hạt. Sau 2-4 tuần gieo, hạt bắt đầu nảy mầm. Đây
là loại cây phát triển nhanh và cho nhiều quả. Khoảng 10-12 tháng từ lúc nảy mầm,
cây bắt đầu ra hoa, kết quả, trái chín sau khoảng 5 tháng [31].
Giới tính của cây đu đủ gồm có đu đủ đực, đu đủ cái và đu đủ lưỡng tính, ở mỗi
giới tính thì cây đu đủ lại có những đặc điểm về hoa và quả khác nhau [2].
1.2.3. Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế và đặc tính dược lý của đu đủ
Gía trị dinh dưỡng: kết quả phân tích hóa học cho thấy rằng trong 100g phần
ăn được của đu đủ có chứa 85-88% nước; 0,6% protein; 0,1% lipid; 8,3% đường; 60122 mg vitamin C; 0,33 mg vitamin B1; 0,04 mg vitamin B2; 0,33 mg vitamin PP và
đặc biệt rất giàu vitamin A [2].
Đu đủ được làm mứt, đồ chua, món tráng miệng. Quả đu đủ xanh được dùng
phổ biến ở Thái Lan, Việt Nam như một loại rau, lên men làm dưa chua hoặc ngâm
đường ( Sankat, Maharaj 1997). Năm 1994 Chinoy và cộng sự đã thí nghiệm trên
chuột, đã chứng minh dịch trích từ hạt đu đủ có thể được dùng như thuốc tránh thai
[7].
Đu đủ thường được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền. Theo Reed ( 1976),
mủ đu đủ rất cơng dụng cho việc điều trị chứng khó tiêu, đắp vết bỏng ngồi da.

Okeniyi và cơng sự (2007) cho rằng trái và hạt đu đủ có thể tẩy giun sán và amip. Gần
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
13


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

đây, một cơng trình nghiên cứu trên chuột cho thấy ở giai đoạn phát triển của bào thai,
việc tiêu thụ đu đủ chín lại khơng gây nên nguy cơ nào ( Adebiyi et al. 2002 ). Ngoài
ra, quả, mủ, phấn hoa đu đủ cũng gây dị ứng tùy vào sự nhạy cảm của mỗi người (
Blanca et al. 1998). Mủ đu đủ dùng ngồi da có thể gây kích ứng, làm rộp da, nhưng
khi vào cơ thể, nó lại có tác dụng trị viêm loét dạ dày [29].
1.2.4. Mủ đu đủ
Mủ cây đu đủ nằm trong các ống dẫn mủ trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ
rễ. Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều mủ nhất [7].
Mủ cây đu đủ là một chất lỏng màu trắng đục được tạo thành bởi các hợp chất
khác nhau như: protein, nhựa, đường, chất béo, gum… tất cả phân tán trong môi
trường nước và đông lại khi tiếp xúc với môi trường không khí. Nó được tiết ra sau khi
làm mơ tổn thương. Trong đó có khoảng 15% chất khơ, 85% nước, và nhiều enzyme
thủy phân, chủ yếu là các protease. Hơn nữa, các thành phần protein khác nhau đã
được báo cáo là phụ thuộc vào độ tuổi hay giới tính của cây, cũng như trên thời gian
trong ngày mà việc khai thác mủ được thực hiện. Hỗn hợp các enzyme khác nhau có
mặt trong mủ được cho là đóng vai trị bảo vệ cây chống lại các tác nhân bên ngoài
[26]
Mủ đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế sự tăng trưởng của nấm, đặc biệt là
nấm Candida albicans (Giordani và Siepai 1991), vì thế thường được sử dụng trị bệnh
eczema trên da do nấm gây ra. Ở Mauritius, khói từ lá đu đủ khơ có tác dụng cắt các

cơn hen suyễn, trong khi ở Úc, người ta cho rằng một số bệnh ung thư có thể được cải
thiện sau khi uống dịch trích lá đu đủ.
Mủ đu đủ có chứa papain và chymopapain, hai enzyme phân giải protein quan
trọng của ngành cơng nghiệp. Nhìn chung, mủ đu đủ từ quả của cây cái chứa nhiều
papain hơn quả từ cây lưỡng tính (Madrigal et al. 1980). Mủ đu đủ xanh là chất làm
mềm thịt kỳ diệu, sử dụng trong điều trị vết bỏng, vết thương bị hoại tử (Starley 1999;
Hewitt et al 2000), ngồi ra, cịn được dùng trong sản xuất mỹ phẩm (Singh và Sirohi
1977; Knight 1980), công nghệ thực phẩm [7].
Ngồi papain và chymopapain, mủ đu đủ cịn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính
sinh học khác như lipase, hydrolase [30].
Trong thực tế, hoạt động của lipase trong mủ đu đủ, đã được báo cáo vào năm
1935. Tuy nhiên mãi đến năm 1991, sự quan tâm vào nghiên cứu enzyme này mới bắt
đầu [30].

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
14


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1 Nguồn thu nhận:
Mủ đu đủ: được thu từ một số vườn đu đủ trồng tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng
Nam.


Hình 2.1 Vườn cây đu đủ lấy mủ tại Đại Lộc, Quảng Nam
2.1.1.2 Thu nhận mủ đu đủ
• Điều kiện lấy nhựa
Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0,3-1 kg là
tốt nhất. Quả non quá cho ít mủ, quả già quá hoặc quả to vừa cho nhựa ít vừa khơng
sánh sệt, hoạt tính enzyme khơng cao. Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho ít nhựa.
Để thu chế phẩm enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy mủ ở quả đang độ 10 tuần
tuổi.
Thời gian lấy mủ: bắt đầu thu nhận từ sáng sớm và kết thúc vào giữa buổi sáng
(giai đoạn độ ẩm khơng khí cao). Khi độ ẩm khơng khí thấp, dịng mủ chảy chậm và
đặc, khó thu nhận. Mùa khơ: mủ ít, đặc, nồng độ protein cao. Mùa mưa: mủ nhiều,
loãng, nồng độ protein thấp [7].
SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
15


Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch enzym lipase từ mủ đu đủ và xác định đặc tính của lipase.

• Tiến hành
Mủ đu đủ lấy ở quả xanh còn trên cây.
Dùng dao lam rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính to nhất, các lát
khía cách nhau 3-5 cm (không rạch sâu quá 2 mm, nếu không dịch nước và tinh bột từ
quả sẽ trộn lẫn vào mủ và làm giảm chất lượng dịch mủ thu được).
Hứng lấy mủ chảy ra bằng lọ, miệng rộng trong 4-6 phút, sau khi lấy mủ xong
đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh. Sau khi thu nhận sử dụng ngay hoặc đóng
băng ở -200C để sử dụng sau này.
Bảo quản lạnh mang về phịng thí nghiệm, mục đích để tránh cho mủ khơng

tiếp xúc lâu với khơng khí và đảm bảo hoạt tính của lipase có trong mủ.
Khơng nên trộn mủ khơ với mủ tươi vì nó làm giảm chất lượng.
Khi tiến hành các thao tác với mủ tươi tránh khơng cho nhựa tiếp xúc vào da vì
nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để mủ tiếp xúc với các dụng cụ làm bằng
kim loại nặng như sắt, đồng…vì nó làm biến màu và giảm hoạt tính của enzyme. Lọ,
dao, muỗng…phải làm bằng thép không rỉ hoặc nhựa.
Khi lấy mủ cần tránh không cho các chất bẩn hoặc cơn trùng lẫn vào.
Quả có thể được rút mủ trong suốt khoảng thời gian từ 4-7 ngày. Lần đầu tiên
có thể chỉ một lần rạch là đủ, ở những lần thu mủ sau, rạch 2-3 đường giữa những
đường rạch trước đó.
Sau 2-3 tháng quả đu đủ chín, có thể lấy ra khỏi cây. Đu đủ chín có thể ăn được
nhưng khó bán vì bề ngồi khơng đẹp. Tuy nhiên vỏ quả đu đủ xanh có chứa khoảng
10% pectin, do đó có thể dùng quả để thu nhận pectin [7].
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng

Hóa
chất

Tên

Xuất xứ

Dầu cá Ranee

Cơng ty cổ phần dầu cá
châu Á

Triton X-100, 2-propanol

Hóa chất hãng Merck


p-nitrophenyl pamitate (p-NPP),
p-Nitrophenol (p-NP)

Hóa chất hãng Sigma Mỹ

Các loại muối: NaCl độ tinh khiết 99%.

Phịng thí nghiệm trường

Các loại hóa chất khác: Tris Base, acid HCl
0,5%, NaOH 0,05N, muối (NH4)2SO4, Gum

Đại Học Bách Khoa Đà
Nẵng, trường đại học Duy

SVTH:Nguyễn Thị Quỳnh -12H2

GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật
Th.S Phan Thị Việt Hà
16