BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACID LACTIC CÓ
KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN
TỪ MEN TIÊU HÓA VÀ THỰC PHẨM LÊN MEN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
HUỲNH THỊ YẾN LY
MSSV: 3062845
LỚP: CNSH TT K32

Cần Thơ, Tháng 11/2010


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(ký tên)

TS. Ngô Thị Phƣơng Dung

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Huỳnh Thị Yến Ly

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

TS. NGUYỄN VĂN THÀNH


LỜI CẢM TẠ
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ và động
viên từ quý Thầy Cô và các bạn sinh viên Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường
Đại học Cần Thơ.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của quý Thầy Cô Viện NC&PT Công nghệ
Sinh học đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy trong quá trình học tập cũng như đã tạo
điều kiện tốt nhất cho đề tài được thực hiện và hoàn thành đúng thời hạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Ngô Thị Phương Dung đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Tôi xin cảm ơn KS. Huỳnh Xuân Phong, Anh Nguyễn Ngọc Thạnh và Bùi Duy
Nhân đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài và giúp đỡ tôi hoàn thành nội dung báo
cáo đề tài luận văn tốt nghiệp.

Tôi cũng biết ơn bạn Yến, Chi, Tú, Mai, Phương, Quyên, Lập, Hồng, Tuấn,
Trinh và các anh, chị Cao học Công nghệ Sinh học K15, các bạn ngành Công nghệ
Sinh học khóa 32 Tiên tiến, các bạn sinh viên khóa 33 và 34, đã tận tình động viên
giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Tôi xin cảm ơn gia đình và người thân luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành luận văn.

Ngƣời thực hi n
Huỳnh Thị Yến Ly


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƢỢC
Vi khuẩn acid lactic là hệ vi khuẩn quan trọng không những phổ biến trong một
số sản phẩm lên men truyền thống và bột men tiêu hóa, mà còn có khả năng sinh chất
kháng khuẩn ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm. Đề tài được thực hiện với mục
tiêu là phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và men tiêu hóa.
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các hợp chất acid lactic, H2O2 và bacteriocin từ
các dòng phân lập bằng hai phương pháp “nhỏ giọt” và “khuếch tán trên giếng
thạch” kết hợp với vi khuẩn chỉ thị Bacillus subtilis. Định danh cấp độ giống các dòng
phân lập có hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin thông qua việc khảo sát sự phát
triển của chúng ở các nhiệt độ, pH, nồng độ muối (NaCl), môi trường có bổ sung natri
azide (NaN3), khả năng sinh khí CO2 khi lên men đường glucose và thử nghiệm indole.
Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn acid lactic đã định danh sơ bộ qua các thử
nghiệm sinh hóa. Kiểm tra tính kháng khuẩn của các dòng phân lập, 23 dòng biểu hiện
tính kháng vi khuẩn chỉ thị B. subtilis, trong đó 10 dòng (6 dòng từ dưa chua và 4
dòng men tiêu hóa) có khả năng tổng hợp bacteriocin, dòng DC213A có tính kháng

mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn là 22mm. Kết quả định danh ở cấp độ giống
10 dòng này thuộc các giống Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus và
Streptococcus.
Từ

khóa:

Bacteriocin,

Enterococcus,

Lactobacillus,

Leuconostoc,

Streptococcus và vi khuẩn acid lactic

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

i

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................
TÓM LƢỢC ...................................................................................................................... i
MỤC LỤC ........................................................................................................................ ii
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................ v
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn acid lactic ........................................................................ 3
2.2. Một số giống điển hình của vi khuẩn acid lactic ................................................. 5
2.2.1. Enterococci ..................................................................................................... 5
2.2.2. Lactobacilli ..................................................................................................... 6
2.3. Định danh vi khuẩn acid lactic bằng phương pháp hình thái học ........................ 6
2.4. Hệ thống phân loại và cơ chế hoạt động của chất kháng khuẩn bacteriocin ........ 9
2.4.1. Nisin ............................................................................................................. 10
2.4.2. Acidolin ....................................................................................................... 11
2.4.3. Lactacin B .................................................................................................... 11
2.5. Các sản phẩm lên men acid lactic....................................................................... 11
2.5.1. Kim chi ........................................................................................................ 11
2.5.2. Sữa chua ....................................................................................................... 12
2.5.3. Dưa cải muối chua ....................................................................................... 13
2.6. Men tiêu hóa ....................................................................................................... 13
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 14
3.1. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................... 14
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện ................................................................... 14
3.1.2. Vật liệu .......................................................................................................... 14
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 14
3.1.4. Hóa chất và môi trường ................................................................................. 14

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

ii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

3.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 15
3.2.1. Thu thập mẫu ............................................................................................... 15
3.2.2. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa và thực phẩm
lên men ......................................................................................................... 15
3.2.3. Thí nghiệm 2: Kiểm tra và chọn lọc những dòng vi khuẩn acid lactic phân
lập có tính kháng khuẩn cao ......................................................................... 16
3.2.4. Thí nghiệm 3: Định danh cấp độ giống của những dòng vi khuẩn acid
lactic đã chọn lọc .......................................................................................... 19
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 20
4.1. Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa và thực phẩm lên men ................ 20
4.2. Kiểm tra và chọn lọc những dòng vi khuẩn acid lactic phân lập có tính kháng
khuẩn cao ........................................................................................................... 29
4.3. Định danh cấp độ giống của những dòng vi khuẩn acid lactic đã chọn lọc ....... 34
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 40
5.1. Kết luận................................................................................................................ 40
5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 41
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Hình ảnh thí nghiệm

Phụ lục 2. Phương pháp phân tích

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

iii

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Vitamin và các chất cần thiết cho vi khuẩn acid lactic ........................................ 4
Bảng 2. Bảng phân loại vi khuẩn acid lactic bằng phương pháp hình thái học của
Axelsson (2004) ................................................................................................................. 8
Bảng 3. Những loại peptide bacteriocin của vi khuẩn acid lactic theo Meyer et al.
(1997)............................................................................................................................... 10
Bảng 4. Tính chất của một số bacteriocin phổ biến theo Soomro et al. (2002) .............. 10
Bảng 5. Thành phần dinh dưỡng của kim chi.................................................................. 12
Bảng 6. Tên mẫu phân lập vi khuẩn acid lactic ............................................................... 15
Bảng 7. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic ....................................... 21
Bảng 8. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic (tt) ................................. 22
Bảng 9. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic (tt) ................................. 23
Bảng 10. Khả năng kháng B. subtilis của dòng vi khuẩn acid lactic phân lập ................ 31
Bảng 11. Kết quả tính kháng khuẩn của bacteriocin từ dòng phân lập ........................... 33
Bảng 12. Kết quả khảo sát sự phát triển của các dòng vi khuẩn acid lactic sinh ra
bacteriocin ....................................................................................................................... 35

Bảng 13. Kết quả định danh cấp độ giống của dòng LAB sinh ra bacteriocin ............... 38

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

iv

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Mẫu nhuộm Gram của dòng phân lập ...............................................................20
Hình 2. Thử nghiệm oxydase trên mẫu phân lập............................................................24
Hình 3. Mẫu nhuộm bào tử dòng phân lập DC213A .....................................................24
Hình 4. Khả năng phân giải CaCO3 của dòng phân lập DC213A ..................................24
Hình 5. Hình thái của dòng DC21322 ............................................................................25
Hình 6. Hình thái của dòng SC123 .................................................................................25
Hình 7. Hình thái của dòng KF12 ..................................................................................26
Hình 8. Hình thái của dòng KC11 ..................................................................................26
Hình 9. Hình thái của dòng YK22 ..................................................................................27
Hình 10. Hình thái của dòng Lac1..................................................................................28
Hình 11. Hình thái của dòng TF31 .................................................................................28
Hình 12. Hình thái của dòng phân lập từ nem chua .......................................................28
Hình 13. Hình thái của dòng phân lập từ dưa chua hỗn hợp ..........................................29
Hình 14. Các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn mạnh ......................................30
Hình 15. Các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn trung bình ..............................30

Hình 16. Các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn yếu .........................................30
Hình 17. Khả năng sinh ra bacteriocin của các dòng lactic phân lập .............................33
Hình 18. Dòng DC2114 thuộc Leuconostocs ................................................................35
Hình 19. Dòng DC2113 thuộc Enterococcus .................................................................36
Hình 20. Dòng DC2112D thuộc Lactobacillus ..............................................................37
Hình 21. Dòng DC213A thuộc Lactobacillus ................................................................37
Hình 22. Dòng DC213 thuộc Lactobacillus ...................................................................37
Hình 23. Dòng DC2132 thuộc Lactobacillus .................................................................37

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

v

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết cần
được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người. Bên cạnh đó, việc dùng chất hóa học
bảo quản thực phẩm đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của
nó đến người tiêu dùng. Vì vậy, việc tìm ra một loại chất bảo quản vừa an toàn, vừa
hiệu quả đang là vấn đề thách thức cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm.
Kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy vi khuẩn acid lactic
không những có thể lên men lactic rau quả tạo ra các món ăn truyền thống thơm ngon,
mà còn có những tác động hiệu quả trong bảo quản thực phẩm. Vi khuẩn lactic có ảnh

hưởng tốt đến sức khỏe con người vì chúng kích thích hệ miễn dịch và giảm sự gia
tăng mật số vi khuẩn có hại trong đường ruột. Hơn nữa, chúng còn được biết đến như
một trong những nguồn vi sinh vật sinh ra bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả
năng chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh và được ứng dụng làm chất bảo quản
thực phẩm. Hầu hết vi khuẩn lactic đều tổng hợp được bacteriocin nên thành phần
kháng khuẩn này rất đa dạng như Latacin, Nisin, Acidolin,... Từ rất lâu các bacteriocin
này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là Nisin. Năm
1953, thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và
đến năm 1969, World Health Organization (WHO) công nhận Nisin là chất bảo quản
an toàn có nguồn gốc sinh học.
Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền
thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số men vi sinh
đông khô. Với mục tiêu bước đầu là có thể phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn
acid lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nguồn sản phẩm lên men và các
men tiêu hóa có sẵn trên thị trường. Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục
nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất
bảo quản thực phẩm tự nhiên nên chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và định danh
vi khuẩn acid lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ men tiêu hóa và thực
phẩm lên men”.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT


1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập những dòng vi khuẩn acid lactic từ
men tiêu hóa và thực phẩm lên men qua đó tuyển chọn những dòng lactic có tính
kháng khuẩn cao để định danh cấp độ giống. Để thực hiện mục tiêu này, đề tài được
tiến hành với các nội dung sau:
- Phân lập những dòng vi khuẩn acid lactic từ nguyên liệu thu thập được.
- Kiểm tra tính kháng khuẩn của các dòng phân lập đối với dòng chỉ thị Bacillus
subtilis.
- Chọn lọc những dòng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn cao.
- Định danh cấp độ giống những dòng vi khuẩn acid lactic đã chọn lọc.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thi u về vi khuẩn acid lactic (Abee et al., 1999)
Vi khuẩn acid lactic (LAB) giữ vai trò quan trọng trong rất nhiều sản phẩm lên
men. Đặc tính của vi khuẩn acid lactic là Gram dương, oxydase âm tính, catalase âm
tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử. Chúng chủ yếu sinh ra lactate bằng lên
men carbohyhrate (bao gồm glucose và lactose). Một vài giống vi khuẩn acid lactic
quan trọng như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus,

Bifidobacterium và Carnobacterium. Chúng không có chứa haemins (cytochromes,
catalase) nhưng chúng có thể sinh trưởng trong điều kiện có oxy. Loài vi khuẩn này là
kỵ khí không bắt buộc và lên men bắt buộc.
Vi khuẩn acid lactic có yêu cầu về dinh dưỡng cao nhưng khả năng tổng hợp acid
amin và vitamin là rất hạn chế. Không thành viên nào của loài này có thể phát triển
trong môi trường nghèo muối khoáng với glucose và muối ammoni. Hầu hết chúng
yêu cầu một số lượng lớn vitamin (riboflavin, thiamine, acid folic, biotin và những
vitamin khác), acid amin, purine và pyridine.
Chúng thường sống ở những nơi sản xuất sữa (Lactobacillus brevis, L.
bulgaricus, L. casei, L. fermentum) và trong màng nhầy ruột của người và động vật
(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis, Streptococcus
salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae). Vi khuẩn acid lactic có một số lượng
lớn hệ thống vận chuyển để tích lũy dinh dưỡng từ môi trường. Những hệ thống này
định vị ở màng tế bào chất. Quá trình trao đổi chất chính là đường phân và chu trình
pentose phosphate. Trong hệ vi khuẩn lactic, NADH được oxy hóa thành NAD+. Từ
con đường này, LAB chuyển đổi pyruvate thành lactate với việc sử dụng lactate
dehydrogenase. Có hai kiểu trao đổi chất carbohydrate là homofermentative (lên men
đồng hình) và heterofermentative (lên men dị hình).
Vi khuẩn acid lactic yêu cầu một số lượng cần thiết acid amin trong môi trường
mà chúng không tự tổng hợp được (Bảng 1). Chúng có hệ thống vận chuyển những
acid amin, dipeptide, tripeptide và oligopeptide. Ngoài ra, LAB có enzyme màng tế
bào protease có thể phân giải protein thành những peptide nhỏ hơn. Trong tế bào,
những peptide nhỏ này được phân hủy thành những acid amin bằng enzyme peptidase.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

3



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

Bảng 1: Vitamin và các chất cần thiết cho vi khuẩn acid lactic
Vi sinh vật điển hình

Chất
Acid p- aminobenzoic
Acid folic
Acid 5- focmyl - 5, 6, 7,
8 – tetrahydrofolic
Locovorin
Acid nicotinic
Riboflavin
Acid patothenic
Pantetein
Acid lipoic
Tiamin
Biotin

Lactobacillus platarum, Lactobacillus arabinosus
Lactobacillus casei, Streptococcus faecalis
Leuconostoc citrovorum, S. faecalis
Lactobacillus casei
Leuconostoc mensenteroides, L. arabinosus, S. faecalis,
Streptococcus lactic, L. casei
Leuconostoc mensenteroide, L. casei, S. faecalis
Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus

Streptococcus lactic, L. casei
Streptococcus faecalis, L. fermenti
Leuconostoc mensenteroides, L. platarum, S. lactic, S. faecalis

Nguồn: Buchta (1983)

Đa số vi khuẩn acid lactic trực khuẩn đồng hình, rất kén chọn thành phần dinh
dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ
các acid amin hoặc các hợp chất nitơ phức tạp hơn. Ngoài ra, chúng còn có nhu cầu về
vitamin (B1, B2, B6, PP, các acid pantotenic và folic). Bởi vậy, môi trường nuôi vi
khuẩn acid lactic có thành phần khá phức tạp.
Vi khuẩn acid lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO 2 và
ethanol, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 - 15% ethanol hoặc cao hơn;
một số trực khuẩn bền với 7 - 10% muối (NaCl).
Các dòng LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 25 - 35oC, các loài ưa
nhiệt có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 40 - 45oC, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương
đối thấp (5oC hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 - 80oC hầu hết chúng bị chết sau 10
- 30 phút.
Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác lại có khả năng đối
kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như
vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic thì các loài này còn sinh ra các hợp chất có
hoạt tính kháng khuẩn (điển hình là bacteriocin). Những chất kháng khuẩn này không
được dùng trong y học mà chỉ có tác dụng hiệu quả trong bảo quản thực phẩm.
Vi khuẩn acid lactic có khả năng chuyển hóa đường thành acid lactic. Lên men
lactic có hai dạng: đồng hình và dị hình. Chúng có thể lên men được các đường
monosaccharide và disaccharide, nhưng không lên men được tinh bột (chỉ có loài L.
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học


4


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

delbrueckii là đồng hóa tinh bột). Một số loài không lên men được saccharose, một số
lại không sử dụng maltose.
Phương trình tổng quát của đồng hình như sau:
C6H12O6 + 2 ADP + Pi

2 CH3-CH- COOH + 2ATP
OH

Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2 - 3,5%),
liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 - 4,0. Cầu
khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt tính lên men mạnh nhất của
trực khuẩn ở vùng pH 5,5 - 6,0 (Lương Đức Phẩm, 2002).
2.2. Một số giống điển hình của vi khuẩn acid lactic
2.2.1. Enterococci (Axelsson, 2004)
Enterococci là giống LAB quan trọng trong môi trường và thực phẩm. Chúng
sống khắp nơi bao gồm đất, bề mặt nước, nước thải, cây và chiếm ưu thế trong đường
ruột của người và động vật. Một số loài thuộc giống này được ứng dụng trong thực
phẩm như probiotic nhưng một số loài khác gây bệnh cho người và làm hư hỏng thực
phẩm. Một số loài điển hình như Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium,
Streptococcus bovis, và Streptococcus equinus. Bởi vì Enterococci có thể phát triển ở
pH thấp, nồng độ muối cao, tham gia vào quá trình làm chính và tạo mùi vị cho phô mai nên chúng được sử dụng là nguồn giống cho một số phô - mai ở châu Âu. Chúng
có khả năng chống lại vi khuẩn có hại, kháng đột biến, chống tác nhân gây ung thư,
kích thích hệ miễn dịch và giảm mức độ cholesterol.

Một số Enterococci được phân lập từ môi trường hay thực phẩm có tính kháng
khuẩn. Bacteriocin từ Enterococci thường được gọi là enterocin. Khả năng kháng vi
khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Listeria monocytogenes của những bacteriocin từ
Enterococci được nghiên cứu từ rất lâu và được sử dụng trong bảo quản thực phẩm. E.
faecium, E. faecalis, và E. mundtii là vi khuẩn sinh ra những enterocin được biết đến
nhiều như enterocins A, AS-48 (trong sữa tươi), B, EJ97, L50, P, Q, 1071, enterolysin
A, bacteriocin 31, mundticin và mundticin KS. Loài E. faecium WHE 81, được phân
lập từ phô - mai có thể sinh ra enterocins A và B. Hai bacterioicin này kháng lại L.
monocytogenes.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

2.2.2. Lactobacilli
Khuẩn lạc Lactobacilli trên môi trường thạch thường nhỏ, đường kính 2 - 5mm,
có bờ láng, lồi và mờ đục không chất màu. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi
trường nuôi cấy thông thường nhưng chúng có thể sản xuất ra diacetyl, CO2 và
exopolysaccharide trong một số sản phẩm lên men (Abee et al., 1999).
Lactobacilli cũng góp phần vào bảo quản thực phẩm lên men bằng cách tạo ra
bacteriocin. Bacteriocin là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế những
dòng mẫn cảm. Lactobacilli ức chế sinh trưởng trên 25 loài vi khuẩn gây bệnh đường
ruột. Những loài Lactobacillus được dùng trong chế phẩm sinh học: L. acidophilus, L.

casei, L. fermentum, L. gasseri, L. lactis, L. plantarum. Lactobacilli được sử dụng rộng
rãi trong các thực phẩm lên men. Chúng được dùng trong chế biến phô - mai (L.
delbruekii spp., L. casei), bơ sữa (L. delbruekii), sữa lên men (L. acidophilus), Kefir và
sữa chua (L. delbruekii).
2.3. Định danh vi khuẩn acid lactic bằng phƣơng pháp hình thái học (Axelsson,
2004)
Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương được phân biệt đặc trưng bởi
hình thái, quá trình trao đổi chất. Một số đặc trưng của vi khuẩn là Gram dương, không
bào tử, hình que và hình cầu. Những nhóm đầu tiên của vi khuẩn lactic là
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus nhưng hiện nay có khoảng
20 giống. Tuy nhiên, tổng quan về công nghệ thực phẩm những giống thuộc vi khuẩn
acid lactic bao gồm Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Vagococcus,
Weissella và Tetragenococcus. Vi khuẩn acid lactic được phân loại thành những giống
khác nhau dựa vào hình thái, cách thức lên men đường glucose, phát triển ở nhiệt độ
khác nhau, khả năng sinh ra acid lactic, chịu được nồng độ muối cao và chịu được acid
hay kiềm. Một đặc tính được sử dụng trong định danh LAB ở cấp độ giống là cách
thức lên men đường glucose (không giới hạn nồng độ glucose, bổ sung các amino acid
và vitamin) và hạn chế sự hiện diện của oxygen. Dưới những điều kiện này, LAB có
thể chia thành hai nhóm: lên men đồng hình (chủ yếu sinh ra acid lactic) và lên men dị
hình (sinh ra acid lactic, ethanol hay acid acetic và CO2). Trong nghiên cứu, khả năng
sinh khí của LAB sẽ giúp phân biệt giữa các nhóm trong hệ vi khuẩn lactic.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

6



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

Leuconostocs, Oenococci, Weissellas và một vài Lactobacilli là lên men dị hình còn
những nhóm khác lên men đồng hình.
Sự phát triển tùy thuộc vào nhiệt độ chủ yếu dùng để phân biệt những nhóm vi
khuẩn lactic hình cầu. Nhóm Enterococci phát triển ở cả 10oC và 45oC, Lactococci và
Vagococci phát triển ở 10oC nhưng không phát triển ở 45oC. Ngược lại, Streptococci
thường không phát triển ở 10oC, trong khi đó sự phát triển của Streptococci ở 45oC thì
còn tùy thuộc vào loài. Khả năng chịu mặn (6,5% NaCl) cũng có thể được sử dụng để
phân biệt giữa Enterococci, Lactococci/Vagococci, và Streptococci, mặc dù có nhiều
phản ứng khác nhau để phân biệt giữa những nhóm Streptococci. Khả năng chịu muối
cao (18% NaCl) dùng để nhận biết giống Tetragenococcus. Aerococci, Carnobacteria,
Enterococci, Tetragenococci, và Vagococci được định tính với sự phát triển ở pH cao.
Sự hình thành những dạng đồng phân khác nhau của acid lactic trong quá trình lên
men glucose được sử dụng để phân biệt giữa Leuconostocs và Lactobacilli trong quá
trình lên men đồng hình. Carnobacterium có thể phân biệt với Lactobacillus, chúng có
thể phát triển ở pH 9,0 và không phát triển trong môi trường acetate. Pediococci có
khả năng chịu acid tốt hơn Aerococci. Sự khác nhau của các giống LAB với các kiểm
tra hình thái cơ bản được tổng hợp và trình bày ở Bảng 2. Hơn nữa, hệ thống phân loại
hiện nay chủ yếu dựa vào giản đồ phả hệ. Phương pháp này sử dụng oligonucleotide
probes, kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) và trình tự gene 16S rRNA để phân
loại vi khuẩn lactic. Những phương pháp mới này dùng để phân loại và định danh
LAB có thể được bổ sung, thay thế phương pháp hình thái.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học


7


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

Bảng 2: Bảng phân loại vi khuẩn acid lactic bằng phƣơng pháp hình thái học của Axelsson (2004)

Hình que

Hình cầu

Các nhân tố định tính
Carnob.
- Hình thành tứ cầu (tetrad)
- CO2 từ lên men glucose
- Phát triển ở 10oC
- Phát triển ở 45oC
- Phát triển ở 6,5% NaCl
- Phát triển ở 18% NaCl
- Phát triển ở pH 4,4
- Phát triển ở pH 9,6
- Sinh ra acid lactic

+
ND
ND
L


Lactob.

Aeroc.

±
±
±
±
±
D, L, DL

+
+
+
+
L

Enteroc. Lactoc.
Vagoc.
+
+
+
+
+
±
+
L
L

Leucon.

Oenoc.
+
+
±
±
D

Pedioc.
+
±
±
±
+
L, DL

Streptoc.
±
L

Tetragenoc.
+
+
+
+
+
L

Weissella
+
+

±
±
D, DL

Nguồn: Salminen et al., (2004)
Chú thích: (+): phát triển; (±): có thể phát triển; (-): không phát triển; ND: không xác định; L, D, DL: sự hình thành các dạng acid lactic L, D, DL khác nhau giữa các giống

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

8


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

2.4. H thống phân loại và cơ chế hoạt động của chất kháng khuẩn bacteriocin
Theo Ouwehand và SatuVesterlund (2004), bacteriocin được tổng hợp như tiền
peptide protein. Quá trình sinh chất bacteriocin của LAB là sự sinh trưởng kết hợp và
thường xuất hiện qua phase sinh trưởng. Tổng hợp bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tùy
loài, mức độ của nguồn carbon, nitrogen, phosphate và chất ức chế. Chất kháng khuẩn
này có thể được sinh ra trong môi trường chứa nhiều nguồn carbohydrate. Cấu trúc
gene của bacteriocin mã hóa dạng tiền chất bacteriocin chứa một trình tự kết thúc đặc
biệt và hiện nay chỉ có cặp đôi glycine của trình tự amino kết thúc được tìm thấy ở
nhóm bacteriocin II. Chúng có chức năng bảo vệ bacteriocin khỏi những tác động sinh
học và có chức năng làm tín hiệu cho hệ thống vận chuyển. Một số lượng lớn gene
tham gia vào quá trình hình thành chất kháng khuẩn lantibiotics. Trong đó, gene cấu
trúc là lanA và gene miễn dịch (lanI và một vài trường hợp thường là lanE, lanF và

lanG) mã hóa những protein có chức năng bảo vệ gene sản xuất lantibiotic. Gene lanT
mã hóa những thành phần cấu tạo màng mà có thể kết hợp với nhân tố vận chuyển đưa
lantibiotic qua màng tế bào, gene lanP mã hóa một proteinase serine. Hai gene lanB,
lanC mã hóa enzyme hình thành lanthionine, methyl lanthionine và hai gene lanK,
lanR mã hóa hai thành phần protein điều hòa quá trình tổng hợp lantibiotic.
Bacteriocin, được sinh ra từ vi khuẩn Gram dương như LAB, là những peptide
nhỏ. Dựa trên những nghiên cứu cơ bản, bacteriocin được chia thành ba loại nhất định.
Nhóm I, lantibiotic; nhóm II, bền nhiệt hẹp không lantibiotic; và nhóm III, bền nhiệt
rộng (Bảng 3). Nhóm thứ tư của bacteriocin được cấu thành từ những thành phần
không xác định của hỗn hợp protein, lipid và carbohydrate. Sự tồn tại của nhóm thứ tư
là được bổ sung chủ yếu bằng cách quan sát sự hoạt động của một vài bacteriocin
trong dịch nước đã loại bỏ tế bào vi khuẩn. Theo tổng hợp nghiên cứu của Salminen et
al. (2004) cho thấy hoạt tính của L. plantarum LPCO 10 được ngưng hoạt động không
những bằng cách xử ký protease, mà còn bằng enzyme thủy phân và enzyme phân giải
lipid.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

9


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

Bảng 3: Những loại peptide bacteriocin của vi khuẩn acid lactic theo Meyer
et al. (1997)
Nhóm I: Lantibiotic

Nisin
Lactosin S
Lactosin 481
Carnosin UI 49
Cytolysin

Nhóm II: Những bacteriocin không chuyển đổi
Bacteriocin 1 peptide
Bacteriocin 2 peptide
Bacteriocin giống pediocin: Pediocin PA1,
Lactococcin G
Leuciosin A, Sakacin P, Curvacin A,
Lactacin F
Mesentericin Y105
Plantaricin E/F
Plantaricin J/K
Carnobacteriocin BM1,
Carnobacteriocin B2,
Enterocin A, Piscicolin 126, Bavaricin MN,
Piscicocin V1a

Lactobin A
Plantaricin S
Pediocin L50
Thermophilin 13

Bacteriocin không giống pediocin
Lactococcin A và B, Crispacin A,
Divergicin 750, Lactococcin 972, Enterocin
B, Carnobacteriocin A

Nguồn: Aly et al. (2006)

Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương là những hợp chất hoạt hóa màng
làm tăng tính thẩm thấu của màng sinh chất. Chúng thường có hoạt tính kháng khuẩn
phổ rộng hơn colicins (một bacteriocin Gram âm được sinh ra từ Esherichia coli). Một
số bacteriocin phổ biến được trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4: Tính chất của một số bacteriocin phổ biến theo Soomro et al. (2002)
Bacteriocin
Nisin

Vi khuẩn sản xuất
Lactococcus lactis subsp.lactis
ATCC11454

Tính chất
Lantibiotic, phổ rộng, kháng vi khuẩn,
sinh ra cuối vòng phát triển phổ rộng,

Pediocin A
Pediocin AcH
Leucosin

Pediococcus Pentosaceus
FBB61và L-7230
Pediococcus Acidilactici H
Leuconostoc gelidum UAL 187

Phổ rộng
Phổ rộng, sinh ra sớm ở vòng phát triển


Helveticin J
Carnobacteriocin

L. Helveticus 481
Carnobacterium piscicola LV17

Phổ hẹp, sinh ra sớm ở vòng phát triển

Nguồn: Aly et al. (2006)

2.4.1. Nisin
Nisin chống lại sự hư hỏng của quá trình sản xuất, ngăn chặn sự phát triển của
một vài vi khuẩn ưa lạnh và kéo dài hạn sử dụng sữa ở những nước nhiệt đới. Hơn
nữa, chất này còn chống lại sự phát triển của Lactobacilli gây hại trong lên men bia,
rượu và hỗ trợ sự bảo vệ chống lại bào tử của Bacillus và Clostridium trong thực phẩm
đóng hộp. Hiện nay Nisin là chất phụ gia thực phẩm được cho phép sử dụng hơn 50
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

quốc gia trên thế giới bao gồm Mỹ và châu Âu dưới thương hiệu là Nisaplin . Nisin
trong tự nhiên, thường gặp ở các sản phẩm sữa chua và các loại rau muối chua với một
lượng rất nhỏ. Nó được tạo thành trong quá trình sống của nhóm vi khuẩn lên men

lactic Streptococcus lactis. Phân tử lượng của Nisin khoảng 1 kDa, cấu tạo phân tử gần
giống như phân tử protein, trong thành phần có các acid amin như leucine, valine,
alanine, glycine, proline, histidine, lysine, acid glutamate, acid aspartate, serine và
methionine. Nisin có tác dụng với vi khuẩn, không có tác dụng đối với nấm men và
nấm mốc. Trong sản xuất đồ hộp, bổ sung Nisin để tiêu diệt vi khuẩn có thể làm thay
đổi chế độ thanh trùng. Nếu kết hợp Nisin và acid sorbic vừa tiêu diệt được vi khuẩn,
vừa ức chế được nấm men và nấm mốc. Nisin bị phá hủy bởi pancreatin ở pH 8,0 nhiệt
độ 37oC trong 15 đến 30 phút, nghĩa là bị phá hủy trong khi tiêu hóa thức ăn (Lương
Đức Phẩm, 2002).
2.4.2. Acidolin
Acidolin là kháng sinh có tính acid trong tự nhiên, có trọng lượng phân tử thấp,
màu vàng nâu, có tính hút ẩm và chịu nhiệt. Nó tăng cường khả năng kháng khuẩn,
chống lại các vi sinh vật gây bệnh, chống lại sự hình thành bào tử của chúng. Đặc biệt,
nó không gây độc đối với mô tế bào và giúp chống lại các loại virus, vaccine,
poliovirus.
2.4.3. Lactacin B
Lactacin B có trọng lượng phân tử từ 6 - 6,5 kDa, là đoạn protein có khả năng ức
chế hoạt động của vi khuẩn. Lactacin B bền với nhiệt tồn tại ở 100oC trong 60 phút,
không bị phá hủy bởi catalase, nhưng dễ bị phá hủy bởi enzyme proteolysic và hoạt
động ở pH trung tính. Sự hoạt động của lactacin B chống lại bốn dòng vi khuẩn
Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus và
Lactobacillus lactis. Bởi vì phổ hoạt động của Lactacin B rộng nên nó chống lại các vi
khuẩn Proteus, Salmonella, Escherichia, Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus và
Lactobacillus có trong đường ruột của người và động vật.
2.5. Các sản phẩm lên men lactic
2.5.1. Kim chi
Kim chi (gimchi hoặc kimchee) là một món ăn truyền thống của người Triều Tiên
(Hàn Quốc và Bắc Triều Tiên). Món ăn này được làm bằng cách lên men từ các loại
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học


Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

rau củ (chủ yếu là cải thảo) và ớt, có vị chua cay. Mặc dù, kim chi có hàng trăm loại
khác nhau nhưng hầu hết kim chi đều có mùi thơm nồng và cay. Theo cách truyền
thống, kim chi được chế biến đơn giản từ cải thảo và nước muối, nhưng hiện nay thành
phần kim chi có thêm nhiều gia vị khác để tạo ra sự đa dạng trong hương vị và màu
sắc. Thành phần nguyên liệu để chế biến kim chi gồm: cải thảo, củ cải, tỏi, ớt, hành, cá
mực, tôm, sò hoặc hải sản khác, gừng, muối ăn và đường. Nhiều món kim chi có thành
phần khác nhau, trong đó kim chi kkakdugi làm bằng củ cải và không dùng cải thảo,
và kim chi oisobaegi làm từ dưa chuột. Kim chi kkaennip làm bằng lá kkaennip (một
loại cây tương tự cây tía tô), muối trong xì dầu, ớt, tỏi, hành và các gia vị khác
(www.wikipedia.com.vn). Kim chi là đã từng được gọi là một trong "năm thực phẩm
có lợi cho sức khỏe nhất" của thế giới,vì món ăn này giàu vitamin, giúp tiêu hóa tốt, có
tác dụng phòng bệnh ung thư (www.health.com/2008/02/01/worlds-heathiest-foods/).
Một số thành phần dinh dưỡng của kim chi được trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5: Thành phần dinh dƣỡng của kim chi
Chất dinh dƣỡng
Năng lượng (Kcal)
Đạm thô (g)
Đường (g)
Tro (g)
Phospho (g)
Vitamin B1 (mg)

Vitamin B3 (mg)

Trong 100g
32
2,0
1,3
0,5
28
0,03
2,1

Chất dinh dƣỡng
Nước (g)
Béo thô (g)
Xơ thô (g)
Canxi (mg)
Vitamin A(IU)
Vitamin B2 (mg)
Vitamin C(mg)

Trong 100g
88,4
0,6
1,2
45
492
0,06
21

Nguồn: www.wikipedia.com.vn


2.5.2. Sữa chua
Sữa chua (yoghurt) là sản phẩm sữa lên men phổ biến nhiều trên thế giới hơn bốn
nghìn năm qua. Quá trình lên men lactose sinh ra acid lactic trong protein sữa, tạo
thành dạng sữa chua. Sản phẩm lên men này có rất nhiều loại với những hương vị khác
nhau. Hầu hết sản phẩm được sản xuất bằng vi khuẩn lactic điển hình là Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus và Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Quá
trình sản xuất sữa chua cũng phức tạp bao gồm nhiều bước. Sữa được thanh trùng ở
80oC để loại bỏ những vi khuẩn có hại mà ảnh hưởng đến khả năng đông sữa. Sau đó
sữa được làm dịu dần về 45°C, vi khuẩn được chủng vào sữa, và quá trình lên men sản
phẩm được giữ với nhiệt độ cố định trong 4 đến 7 giờ (www.eatyoghurt.com).

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

12


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

2.5.3. Dƣa cải muối chua
Dưc cải muối chua là quá trình bảo quản thực phẩm bằng cách lên men kỵ khí
lactic trong dung dịch nước muối hoặc ngâm trong giấm (acid acetic). Đặc trưng của
sản phẩm lên men này là chua (pH 4,6), cay và chứa một số gia vị tỏi, ớt, rừng, những
thành phần gia vị này giúp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại. Một số sản phẩm
truyền thống như sauerkraut, kimchi Hàn Quốc và cải chua của Việt Nam cũng được
sản xuất bằng cách ngâm muối các rau quả để lên men lactic và một số khác được

ngâm giấm. Khi nồng độ muối và nhiệt độ lên men thấp thì Leuconostoc
mesenteroides phát triển mạnh và loài này sinh ra hợp chất acid, cồn và hợp chất vòng
thơm. Ở nhiệt độ cao hơn, Lactobacillus plantarum phát triển trội hơn và chủ yếu sinh
ra acid lactic (www.wikipedia.com.vn).
Một số nghiên cứu đã chứng minh lợi ích của những sản phẩm lên men truyền
thống đối với sức khỏe con người. Sun (2009) đã nghiên cứu về đặc tính chống oxy
hóa của sản phẩm bắp cải lên men của Trung Quốc và Đài loan bao gồm những tác
động loại bỏ Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) và khả năng kết tụ ion kim loại. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, dịch trích methanol của bắp cải lên men có những tác động loại
bỏ DPPH cao nhất.
2.6. Men tiêu hóa
Hầu hết men tiêu hóa trên thị trường là những loài vi khuẩn acid lactic có tác
động tích cực đến sức khỏe con người và động vật. Một số vi khuẩn lactic là thành
phần phổ biến trong men tiêu hóa như: L. acidophilus, Bifidobaterum longum,
Streptococcus thermophilus,... Năm 2002, tổ chức lương nông và y tế thế giới, United
Nations/World Health Organization (FAO/WHO), đã xác nhận S. themophilus và L.
delbrueckii ssp. bulgaricus là những probiotic vì chúng có những tác dụng cải thiện
tiêu hóa đường lactose cho những người không dung nạp được lactose.
Theo PGS.TS Lê Bạch Mai, Phó viện trưởng Viện Dinh Dưỡng, Việt Nam, men
vi sinh là những loại vi khuẩn sống có lợi cho đường ruột. Khi những thành phần vi
sinh này được bổ sung vào cơ thể với những liều lượng thích hợp, chúng sẽ có vai trò
tái thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, làm tăng sức đề kháng, chống nhiễm
trùng, giúp tiêu hóa thức ăn, hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn và góp phần điều trị rối
loạn tiêu hóa (www.dantri.com/16/08/2008).

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

13



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng ti n nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hi n
Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC & PT
Công Nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Thời gian: Từ tháng 6 năm 2010 đến tháng 11 năm 2010
3.1.2. Vật li u
Nguồn mẫu dùng để phân lập: Dưa cải muối chua, kim chi, sữa chua Vinamilk,
sữa chua uống Yakult, nước tàu hủ, nem chua, men tiêu hóa (Lactominplus,
Bioacimin, Zincibio, Antibio, Probio và Probactil).
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Đĩa Petri, eppendorf 1,5ml, thanh kim loại (d=6mm)
- Tủ lắc ủ (incubator shaker) Innova 4200, New Brunskick Scientific, USA.
- Tủ ủ (incubator) Sanyo, MTR - 162
- Tủ cấy Telstar, model AV - 100
- Kính hiển vi quang học Olympus DP12 BX41
- Nồi khử trùng pbi international 22793
- Tủ lạnh Sanaky Tokyo, Japan
- Eppendorf centrifuge 5417R.
3.1.4. Hóa chất và môi trƣờng
- MRS agar (De Man, Rogosa and Sharpe), MRS broth, yeast extract, beef

extract, peptone, glucose, K2HPO4, diamonium citrate, MnSO4, MgSO4, Tween 80,
natri acetate, CaCO3, môi trường Cá peptone (Phụ lục 2).

- Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, dung dịch iod, dung dịch khử màu
(ethanol và aceton theo tỷ lệ 1:1), fushin. Hóa chất nhuộm bào tử: dung dịch xanh
methylen 1% và đỏ trung tính 0,5%. Thuốc thử catalase H2O2 3%, thuốc thử oxidase
(sản phẩm của công ty Nam Khoa Biotek) và thuốc thử indole.
- Natri azide (NaN3), manitol, NaCl, NaOH 0,1N, NaOH 1N, H2SO4 1N, giấy đo
pH.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

14


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thu thập mẫu
- Sữa chua Vinamilk, Yakult, Kefir và các mẫu sản phẩm lên men bao gồm kim
chi, dưa cải muối chua, nem chua được thu thập tại siêu thị Coopmart, TP. Cần Thơ.
- Men tiêu hóa bao gồm: Lactominplus, Bioacimin, Zincibio, Antibio, Probio và
Probactil được thu thập tại nhà thuốc tây trên địa bàn TP. Cần Thơ.
- Nước tàu hủ được thu mẫu tại cở sở sản xuất nước tàu hủ, TP. Cần Thơ.
Các mẫu thu về được dùng làm nguồn nguyên liệu để phân lập vi khuẩn acid
lactic và được mã hóa thành tên dòng vi khuẩn đã phân lập được (Bảng 6).
Bảng 6: Tên mẫu phân lập vi khuẩn acid lactic
Mẫu phân lập
Kim chi

Dưa cải muối chua
Kefir
Sữa chua Vinamilk
Sữa chua uống Yakult
Nem chua
Dưa chua hỗn hợp khác

Ký hi u
KC
DC
KF
SC
YK
NC
A, B, C

Men Lactominplus
Men Bioacimin
Men Probio
Men Zincibio
Men Antibio
Men Probactil

Lac
Bio
Probio
Zin
Anti
Probactil


Nước chua tàu hủ

TF

Xuất xứ
Siêu thị Coopmart, TP. Cần Thơ

Nhà thuốc tây, TP. Cần Thơ

Cơ sở sản xuất tàu hủ, TP. Cần Thơ

3.2.2. Thí nghi m 1: Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa và thực
phẩm lên men
a. Mục đích: Phân lập được những dòng vi khuẩn acid lactic thuần chủng
b. Phƣơng pháp:
* Phƣơng pháp phân lập
- Men tiêu hóa dạng đông khô: Cho 1 gói men tiêu hóa 1g vào bình tam giác
250ml chứa 100ml môi trường lỏng MRS, lắc đều hòa tan bột men. Sau đó, dung dịch
này được lắc ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

15


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT


- Mẫu sữa chua (Vinamilk, Yakult), Kefir và nem chua: Đồng hóa mẫu, sau đó
lấy 20ml dung dịch của mỗi mẫu cho vào 100ml môi trường lỏng MRS. Các dung dịch
này cũng được lắc ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Kim chi, dưa cải muối chua, nước chua tàu hủ: Cho 20ml dung dịch nước chua
của mỗi sản phẩm vào 100ml môi trường lỏng MRS, lắc ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Sau khi ủ, lấy 0,1ml các dung dịch mẫu tiến hành trải trên đĩa chứa môi trường
thạch MRS, lật ngược các đĩa, ủ trong 37oC. Sau 48 giờ, quan sát và chọn những
khuẩn lạc tiêu biểu tiến hành cấy chuyển vi khuẩn theo hình zigzac sang đĩa môi
trường MRS agar. Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường thạch được lặp lại nhiều
lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định.
- Tiến hành kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic. Những
dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, không màu, bờ
láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. Khuẩn lạc phân lập nằm trên đường cấy chuyển
và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ.
- Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và
quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất
vô trùng, đặt trên miếng lam đã khử trùng bằng cồn 96o thực hiện quan sát mẫu dưới
kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100.
- Sau khi tạo dòng thuần từ nguồn phân lập, tiến hành nhuộm Gram, thử catalase,
thử oxydase, nhuộm bào tử và kiểm tra khả năng phân giải CaCO 3 để xác định vi
khuẩn acid lactic (Phụ lục 2).
Vi khuẩn acid lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn và hình
que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải
được CaCO3.
3.2.3. Thí nghi m 2: Kiểm tra và chọn lọc những dòng vi khuẩn acid lactic phân
lập có tính kháng khuẩn cao
a. Mục đích: Kiểm tra tính kháng khuẩn những dòng LAB phân lập được nhằm
chọn lọc những dòng có hoạt tính kháng khuẩn cao.
b. Phƣơng pháp kiểm tra kháng khuẩn:

Dựa theo Herna´ndez. D. et al. (2004), tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai
phương pháp “agar spot” (nhỏ giọt) và “well diffusion agar” (khuếch tán trên giếng
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

16


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

thạch). Tuy nhiên, trong thí nghiệm này hai phương pháp trên đã được thay đổi và bổ
sung thêm các bước thực hiện mới để kiểm tra tính kháng khuẩn của những dòng lactic
phân lập.
Vi khuẩn chỉ thị là Bacillus subtilis đã được phân lập thuần từ bột men tiêu hóa
Biosutyl II. B. subtilis là một trong những loài vi khuẩn được sử dụng như men tiêu
hóa và rất nhạy với chất kháng khuẩn. Khi chúng phản ứng với vi khuẩn sinh chất
kháng khuẩn thì những vùng sáng vô khuẩn sẽ xuất hiện. Loài vi khuẩn này an toàn
hơn so với những dòng chỉ thị khác như: E. coli hay Salmonella.
Phương pháp “nhỏ giọt”
 Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả năng tiết ra các chất ức chế sự phát triển
của các vi sinh vật khác. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của các chất
(bao gồm acid lactic, H2O2, bacteriocin và một số thành phần khác) do vi khuẩn acid
lactic tạo ra trên môi trường nuôi cấy với vi khuẩn chỉ thị. Nếu các chất do vi khuẩn
lactic sinh ra có khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị thì vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện xung
quanh khuẩn lạc acid lactic kiểm định.
 Quy trình thực hiện:
- Những dòng lactic phân lập được nuôi trong 5ml MRS lỏng ở 30oC trong 16

giờ.
- Sau khi nuôi, lấy 10µl nhỏ giọt trên đĩa có chứa 10ml MRS agar.
- Tiến hành ủ các mẫu đã nhỏ giọt vi khuẩn ở 30oC trong 18 giờ.
- Sau khi ủ, đĩa nhỏ giọt vi khuẩn đã phát triển và được trộn chung với 5ml agar
chứa 10% dịch huyền phù của dòng chỉ thị B. subtilis.
* Dịch huyền phù của dòng chỉ thị B. subtilis có mật số tế bào là 109 tế bào/ml được
xác định bằng phương pháp đếm hồng cầu (Phụ lục 2).
- Sau khi trộn phủ dung dịch chỉ thị lên đĩa đã chứa những dòng lactic phân lập.
Những đĩa này được ủ trong 48 giờ ở 35oC. Quan sát và ghi nhận kích thước vùng
sáng vô khuẩn xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn lactic.
Phương pháp “khuếch tán trên giếng thạch ”
 Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của bacteriocin với
vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic trên môi trường nuôi cấy. Bacteriocin có khả năng
khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn acid lactic
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học

Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học

17