BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HOC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC
GIỐNG SẦU RIÊNG (Durio Zibethinus Murr.)
BẰNG KỸ THUẬT RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. TRẦN NHÂN DŨNG
VIỆN NC & PT CNSH

SINH VIÊN THỰC HIỆN
TRỊNH KIỀU THẾ LOAN
MÃ SỐ SINH VIÊN: 3064459
LỚP CNSH K32

Cần Thơ, 06- 05- 2010


LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành biết ơn:
Thầy Trần Nhân Dũng đã tận tình hướng dẫn, trực tiếp chỉ bảo, động viên,
thăm hỏi tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành tốt đề tài này.
Anh Trần Văn Bé Năm, chị Nguyễn Thị Giáng Đan, anh Nguyễn Vũ Linh,
chị Nguyễn Phạm Anh Thi – Cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học Phân Tử, đã giúp
đỡ chỉ dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Cô Trần Thị Xuân Mai – cố vấn học tập đã chỉ dẫn, khuyên bảo và động viên
em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các Thầy Cô trong Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo
nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài.
Cảm ơn các bạn Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Ngọc Vân Thanh, Nguyễn
Kim Thúy, Nguyễn Thái Học, Phạm Văn Một đã nhiệt tình giúp đỡ động viên tôi
trong suốt thời gian qua.
Con xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Cha Mẹ - những người đã nuôi nấng, dạy
bảo con nên người và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con được học tập.
Xin chân thành biết ơn và cám ơn Thầy, Cô, Ba Mẹ, Anh Chị và các bạn!


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

TÓM TẮT
Dựa vào chỉ thị phân tử RAPD để nghiên cứu và xác định tính đa dạng di truyền
của 20 dòng/giống sầu riêng ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như Bến Tre, Trà
Vinh, Tiền Giang.... Trong đó, khuyếch đại 10 đoạn mồi RAPD (A13, OPR10. OPS14,
OPS11, SN20, OPS05, OPH13, OPH18, OPO05 và OPN09) đã ghi nhận kết quả 111 dấu
phân tử. Dựa trên những kết quả đó cho thấy mức độ đa dạng di truyền giữa 20 dòng/
giống sầu riêng đánh giá là khá cao, được xếp thành 4 nhóm khác nhau có mức độ tương
đồng của các giống biến động từ 64% đến 87,71%,.
Từ khóa: RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), matK, sầu riêng, đa dạng
di truyền, dấu chỉ thị phân tử.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

ABSTRACT
Twenty varieties of durian in some regions of Mekong Delta such as Ben Tre, Tra
Vinh, Tien Giang… were analysed by RAPD. Consequently, ten RAPD primers (A13,
OPR10, OPS14, OPS11, SN20, OPS05, OPH13, OPH18, OPO05 and OPN09) amplified
111 bands. Based on 111 bands, twenty varieties of durian were classified into four
groups with high frequency of genetic diversity. The similarities of varieties were from
64% to 87.71%.
Keyword: RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), matK, durian, genetic
diversity, marker.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

MỤC LỤC


PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT ......................................................................................................................i
ABSTRACT ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ................................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. viii
CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1.
1.2.

Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
Mục tiêu ..............................................................................................................2

CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................3
2.1.

2.2.
2.3.

2.4.
2.5.

Sơ lƣợc về nguồn gốc và phân loại cây Sầu riêng ...........................................3
2.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phân bố .............................................................. 3
2.1.2. Phân loại ...................................................................................................3
Đặc điểm hình thái cây Sầu riêng ....................................................................4
Hiện trạng cây Sầu riêng ..................................................................................5

2.3.1. Trên thế giới ............................................................................................. 5
2.3.2. Ở Việt Nam .............................................................................................. 6
Đặc điểm của lục lạp và vùng gen matK (maturase matK) ........................... 6
Kỹ thuật sinh học phân tử ...............................................................................8
2.5.1. PCR (polymerase chain reaction) ............................................................. 9
2.5.2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ...................................10
2.5.3. Các phương pháp giải trình tự ................................................................ 11
2.5.4. Những nghiên cứu liên quan ..................................................................14

CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............16
3.1.

Phƣơng tiện .....................................................................................................16

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

3.2.

Trường ĐHCT

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................16
3.1.2. Hóa chất ..................................................................................................16
3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 16

Phƣơng pháp thực hiện ................................................................................... 17
3.2.1. Thu mẫu ..................................................................................................17
3.2.2. Trích DNA .............................................................................................. 17
3.2.3. Thực hiện phản ứng PCR .......................................................................18
3.2.4. Giải trình tự ............................................................................................ 21
3.2.5. Phân tích số liệu ..................................................................................... 23

CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 25
4.1. Thu mẫu................................................................................................................25
4.2. Đặc điểm hình thái cây sầu riêng .......................................................................26
4.3. Ly trích DNA mẫu ............................................................................................... 26
4.3.1. Phương pháp định tính DNA ...................................................................26
4.3.2. Phương pháp định lượng DNA................................................................ 27
4.4. Phân tích các sản phẩm khuếch đại ...................................................................28
4.4.1. Kỹ thuật RAPD........................................................................................ 28
4.4.2. Gen matK.................................................................................................40
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 42
5.1. Kết luận ................................................................................................................42
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 43
PHỤ LỤC ........................................................................................................................
Phụ lục 1: Các hình ảnh
Phụ lục 2: Kết quả
1. Bảng 8: Số liệu phân tích các Marker trên các dòng sầu riêng ở một số tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long.
2. Bảng 9: Tương quan di truyền giữa 20 mẫu sầu riêng

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Danh sách các mồi sử dụng trong phương pháp RAPD ...................................... 19
Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR của mồi RAPD......................................................... 19
Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR của cặp mồi matK-390F/matK-132R ...................... 20
Bảng 4: Thành phần hóa chất cho một phản ứng Cycle Sequencing ................................ 22
Bảng 5: Danh sách 20 mẫu Sầu riêng thu mẫu ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long
.......................................................................................................................................... 24
Bảng 6: Kết quả đo nồng độ các mẫu DNA ở bước sóng 260nm và 280nm ................... 26
Bảng 7: Trình tự mồi và tổng số băng từng mồi .............................................................. 34

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Các đặc điểm hình thái của Sầu Riêng ................................................................ 4
Hình 2: Cấu tạo lục lạp ..................................................................................................... 7
Hình 3: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA ................................................................. 14
Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR của cặp mồi RAPD ....................................... 20
Hình 5: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR của cặp mồi matK-390F/matK-132R ........... 21
Hình 6: Chu kỳ nhiệt phản ứng Cycle Sequencing ........................................................ 23
Hình 7: Kết quả kiểm tra nhanh DNA sau khi trích ....................................................... 25
Hình 8: Primer OPO05 từ mẫu sầu riêng thứ 1 đến 18 .................................................. 27
Hình 9: Primer OPH18 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18......................................................... 27
Hình 10: Primer OPN09 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18....................................................... 27
Hình 11: Primer OPS14 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ....................................................... 28
Hình 12: Primer A13 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ............................................................ 28
Hình 13: Primer OPR10 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ....................................................... 28
Hình 14: Primer OPS11 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ....................................................... 29
Hình 15: Primer SN20 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ......................................................... 29
Hình 16: Primer OPH13 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18....................................................... 29
Hình 17: Primer OPS05 từ mẫu sầu riêng 1 đến 18 ....................................................... 30
Hình 18: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPO05 trên gel Agarose 1.5%. .............. 31
Hình 19: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPN09 trên gel Agarose 1.5%. .............. 31
Hình 20: Phổ điện di sản phẩm PCR với mồi OPH18 trên Agarose 1.5%..................... 33
Hình 21: Giản đồ phả hệ của 20 mẫu sầu riêng .............................................................. 35
Hình 22: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi matK-390F/matK-132R trên Sầu riêng
từ mẫu 1- 16 so với thang chuẩn 1Kb ............................................................................ 38
Hình 23: : Một đoạn giản đồ peak của gen matK Sầu riêng Mon Thong ở Ngũ Hiệp, Tiền
Giang, 2010 .................................................................................................................... 39
Hình 24: Một đoạn giản đồ peak của gen matK Sầu riêng Lựu đạn (Mẫu 2) ở Ngũ Hiệp,
Tiền Giang, 2010. ........................................................................................................... 39

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
PCR (Polymerase Chain Reaction)
cpDNA (chloroplast DNA)
ddNTP (dideoxynucleotide)
EtBr (Ethidium Bromide)
CTAB (Cetyl Trimetyl Amoni Bromua)
EDTA (Ethylenediaminetetra Acetic Acid)
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
TE (Tris Edta)
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
EB (Extraction Buffer)
OD (Optical Density)
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, Arithmethic Average)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn đề
Những năm gần đây diện tích trồng cây ăn trái ở nước ta đã được mở rộng rất

nhiều do sự phát triển các loại cây ăn trái có tiềm năng xuất khẩu như bưởi, măng cụt,
sầu riêng, xoài… Đặc biệt diện tích trồng sầu riêng đã chuyển biến khởi sắc, trồng
nhiều ở các tỉnh Đồng Nai (Long Thành, Long Khánh), Lâm Đồng (Bảo Lộc - Di
Linh) nhưng diện tích trồng mỗi vườn không lớn, chưa khai thác hết tiềm năng hiện có
(Miền Đông Nam Bộ có hơn 120.000 ha với các chủng loại trái cây đa dạng phong
phú, trong đó có hơn 10.000 ha sầu riêng) ( www.rauhoaquavietnam.vn).
Sầu riêng là loại cây ăn trái nhiệt đới khá đặc biệt, có giá trị dinh dưỡng cao,
nhiều chất béo, chất đường, nhiều lượng protein, nhiều viatmin A, C và canxi (Việt
Chương, 1999). Ở Việt Nam, sầu riêng được xem là trái cây đặc sản của vùng Nam Bộ
tập trung trồng nhiều ở Lái Thiêu- Đồng Nai, Cái Mơn-Bến Tre, Ngũ Hiệp- Tiền
Giang... với nhiều giống sầu riêng nổi tiếng như Monthong, Ri-6, cơm vàng hạt lép…
Tuy nhiên, trong quá trình trồng nông dân thường chọn các giống cây từ nhiều nguồn
khác nhau chủ yếu dựa vào cây bố mẹ cho năng suất cao và sinh trưởng tốt mà không
phải là các giống đã được tuyển chọn từ các trung tâm sản xuất giống. Những tồn tại
trên không những gây cho nhà vườn rất nhiều bất ổn trong việc lựa chọn các giống sầu
riêng sản xuất theo qui mô hàng hóa lớn, khó khăn trong quá trình nghiên cứu tạo
giống mới mà còn ảnh hưởng đến việc đăng ký thương hiệu khi xuất khẩu quốc tế.
Vấn đề được đặt ra là phải xác định được giống sầu riêng cho năng suất cao, đồng bộ,

ổn định, sinh trưởng tốt tạo tiền đề cho việc chọn giống mới sau này. Vì thế việc đánh
giá chất lượng giống sầu riêng và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của chúng là
vấn đề cấp thiết.
Ngày nay, ngoài việc phân biệt các giống bằng đặc điểm hình thái nông học, thì
với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, các dấu phân tử (molecular
marker), cùng với sự hỗ trợ đắc lực của các phần mềm tin sinh học, … giúp việc
nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống loài sinh vật ngày càng đơn giản và chính
xác hơn. Trong đó, kỹ thuật RAPD (Random Amplified polymorphisms DNA) với
đoạn mồi ngắn (10 nucleotide) khuếch đại trình tự ngẫu nhiên của đoạn DNA là một
kỹ thuật đơn giản, bước đầu nghiên cứu sự khác biệt di truyền của các giống một cách
nhanh chóng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Với những lý do trên, đề tài “NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CÁC GIỐNG SẦU RIÊNG (Durio zibethinus Murr.) BẰNG KỸ THUẬT RAPD”
được thực hiện và sẽ góp phần giải quyết một phần những vấn đề khó khăn đã nêu.
1.2.

Mục tiêu đề tài

 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống sầu riêng thu thập được.

 Giải trình tự một số giống sầu riêng đặc trưng.
 Nội dung nghiên cứu
 Thực hiện phản ứng PCR với 10 mồi RAPD và 1 cặp mồi matK.

 Dựa vào phổ điện di trên gel với các đoạn mồi RAPD phân tích tính đa dạng di
truyền của các giống sầu riêng và giải trình tự một số giống sầu riêng.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.

Sơ lƣợc về nguồn gốc và phân loại cây Sầu riêng

2.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phân bố
Sầu riêng là một trong những loại cây sống lâu đời nhất tại các khu rừng nhiệt
đới Đông Nam Á, nhất là tại bán đảo thuộc quần đảo Malaysia. Cây sầu riêng tự nhiên
được phát hiện ở Borne và Sumatra (Lim et al, 1990). Sầu riêng là loại cây ăn trái đặc
sản được trồng phổ biến ở vùng Đông Nam Á (Mendoza, 1941; Lim et al, 1990).
Sầu riêng gốc ở vùng Đông Nam Á và mọc dại trong rừng ở Malaysia, có tên
khoa học là Durio zibethinus. Chi Durio gồm nhiều loài, có không ít loài có cùi quanh

hạt ăn được nhưng loại sầu riêng được trồng hiện nay cùi dày và có hương vị tốt thì
không tìm thấy trong rừng do vậy mà nhiều người cho rằng sầu riêng đã được thuần
hóa từ lâu, ở nước nào trước thì chưa rõ nhưng có nhiều nhất là ở Malaysia, tại đây có
khoảng 100 dòng vô tính đã được đăng ký. Ngoài ra, sầu riêng được tìm thấy ở phía
Đông Nam Ấn Độ, Sri Lanka và New Guineva. Ở Úc, phía bắc lãnh thổ và
Queensland là những vùng trồng nhiều sầu riêng (Nanthachai, 1994). Theo O’Gara et
al (2001) sầu riêng còn được trồng ở Hawaii, Dominica và đảo Hải Nam, Trung Quốc.
Ở Việt Nam, sầu riêng chưa biết đã trồng từ bao giờ. Ở miền Bắc và miền
Trung không thấy loại cây này. Trước đây, sầu riêng ở Việt Nam được trồng nhiều ở
Lái Thiêu, nhưng hiện nay được phát triển mạnh trên các vùng đất đỏ, lượng mưa
nhiều như Di Linh, Bảo Lộc và các tỉnh miền tây như Vĩnh Long, Tiền Giang, Bến
Tre.
2.1.2. Phân loại
-

Giới: Plantae

-

Ngành: Magnoliopsida

-

Lớp: Malvales

-

Họ: Bombacaceae

-


Chi: Durio

-

Loài: Durio Zibethinus

-

Danh pháp khoa học: Durio zibethinus Murr. (Phạm Hoàng Hộ, 2000).

Tên chi Durio (chi sầu riêng) có nguồn gốc từ ngữ hệ Nam Á: người Việt gọi là sầu
riêng, người Khơmer gọi là turen và người Mã Lai - Nam Dương gọi là Djoerian (về
sau viết là Doerian). Ngày nay hầu hết các quốc gia trên thế giới gọi loài trái này là
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Durian. Trong 30 loài đã biết của chi Durio, có 9 loài cho trái ăn được. Trong đó, loài
Durio zibethinus Murr. được trồng với số lượng lớn vì cho hiệu quả kinh tế cao
(Nanthachai, 1994).
2.2.


Đặc điểm hình thái cây Sầu riêng

Hình 1: Các đặc điểm hình thái của Sầu Riêng
Thân: Sầu riêng là loại cây thân gỗ, cao lớn. Cây trồng từ hạt khi trưởng thành
cao khoảng 25-40m, trồng từ cây ghép, cây chiết cao khoảng 8-10m. Thân thẳng, cành
nằm ngang, phân cành thấp.
Lá: Sầu riêng thuộc loại lá đơn, mọc cách, dạng tròn hơi dài, gốc lá tròn hay tù,
có lông hình vẩy, mặt trên màu xanh sáng, mặt dưới có lông mịn, màu hơi vàng nâu
óng ánh. Chiều dài khoảng 12-20 cm, rộng 4-6 cm. Cuống lá dày, dài 1,5-3 cm.
Hoa: Hoa sầu riêng mọc thành cụm ở cành chính, màu trắng hay vàng nhạt. Hoa
mọc nhiều ở cành lớn và ít khi ở đầu cành. Có 5 lá đài chính và 3 lá đài phụ. Nhị đực 5
thùy rời, mỗi thùy có 4-8 chỉ nhị. Bầu noãn thượng, chia làm 4-5 ngăn. Vòi nhụy hình
ống, có phủ lông dày.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Trái: Trái sầu riêng chín sau khi thụ phấn 3 tháng. Trái có dạng quả nang, khi
chín nứt ra làm năm mảnh. Quanh hạt có thịt mềm là phần ăn được. Trái có thể dài tới
40 cm và có đường kính 30 cm. Màu của trái có thể từ xanh sang nâu, hình dạng thuôn
đến tròn. Bên ngoài phủ lớp vỏ cứng với gai nhọn và mùi đặc trưng tỏa ra từ phần cơm
thịt bên trong (Nanthachai, 1994; O’Gara et al, 2001).

2.3.

Hiện trạng cây Sầu riêng

2.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới sầu riêng được trồng nhiều ở một số quốc gia: Thái Lan, Malaysia,
Indonesia, Brunei…
 Thái Lan: Vùng sản xuất sầu riêng chủ yếu ở Thái Lan là phía Đông, chiếm
73% diện tích cả nước, trong khi đó vùng Bắc Thái Lan chỉ chiếm 24%. Các
tỉnh có diện tích trồng Sầu riêng lớn là: Chanthaburi (45%), Chumphonn (17%),
và Rayong (15%).
 Malaysia: Sầu riêng được xem là cây ăn trái được trồng nhiều tại đây. Năm
1998 sản lượng sầu riêng của Malaysia đạt 128.555 tấn. Giống lai được trồng
phổ biến nhất là D24 chiếm hết 70% diện tích đất trồng sầu riêng
 Indonexia: Sầu riêng được trồng chủ yếu ở Sumatra (39%), Java (36%),
Kalimantan (13%)…Các giống sầu riêng được trồng chủ yếu ở Indonexia là
Sunan, Monthong, Sukun, Sitokong, Simas, Petrack, Chanee. Năm 2005,
Indonesia đã đạt 0,56 triệu tấn sầu riêng.
 Brunei: Brumei cũng là quê hương của sầu riêng nhưng diện tích sản xuất lại
không lớn chỉ vài trăm hecta sản xuất sầu riêng.
 Philippine: Sầu riêng được trồng chủ yếu trồng ở Tây và Nam Mindanao. Giống
trồng chủ yếu là Chanee và Monthong.
Hiện nay, sản xuất sầu riêng thương mại của thế giới tập trung ở Thái Lan,
Malaysia và Indonexia. Philippine và một số nước khác ở Đông Nam Á cũng có sản
xuất sầu riêng nhưng chỉ ở mức cung cấp cho thị trường nội địa ít khi xuất khẩu.
2.3.2. Ở Việt Nam
Những năm gần đây, diện tích trồng sầu riêng tăng mạnh tại các tỉnh Nam bộ,
với diện tích khoảng 12.000 ha, sản lượng 150.000 tấn (www.agu.edu.vn). Thời gian
gần đây, một số hộ nông dân miền Trung đa mạnh dạn đem loài cây này về trồng bước
đầu mở rộng địa bàn trồng cây sầu riêng của đất nước.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Những giống sầu riêng có năng suất cao và đƣợc thị trƣờng ƣa chuộng
nhƣ:
 Sầu riêng Monthong: có phẩm chất ngon, năng suất thu hoạch khá cao, trọng
lượng quả lớn, vỏ mỏng, hột lép, mùi thơm nhẹ điều này có lợi cho việc xuất
khẩu sang các nước mà sầu riêng chưa được xem là món ăn quen thuộc vì đa số
các nước phương tây và Nhật Bản không chịu được mùi nặng của sầu riêng.
 Sầu riêng sữa cơm vàng hạt lép: quả khi chín có mùi thơm dịu, cơm ăn ngọt vừa
phải, đặc biệt loại sầu riêng này có mang một chút vị béo của bơ Đà Lạt.
 Sầu riêng Ri 6: có nguồn gốc từ Mianma, được nhập vào nước ta từ năm 1998.
Được trồng khá phổ biến ở các tỉnh Nam Bộ như Vĩnh Long, Cần Thơ, Tiền
Giang, Bến Tre, Đồng Tháp... Cây cho trái có phẩm chất ngon, năng suất cao,
thịt màu vàng tươi rất đẹp, vỏ mỏng, cơm dày, quả to.
 Sầu riêng Khổ qua xanh: là giống sầu riêng dễ trồng, khả năng thụ phấn rất cao
năng suất cao (khoảng 200-300 trái/cây/năm). Trái dạng hình thoi, vỏ màu xanh
nhạt, thịt mềm, ráo, thơm nhưng hột hơi lớn và dễ bị sượng trong mùa mưa nên
diện tích trồng giống sầu riêng đang ngày càng bị thu hẹp thay vào đó là những
giống sầu riêng mang lại hiệu quả kinh tế cao như Ri6, Monthong.
2.4.


Đặc điểm của lục lạp và vùng gen matK (maturase matK)
Trong tế bào thực vật, ngoài nhân ra còn có những nội bào quan có chứa DNA

làm vật liệu di truyền, như plasmid, ty thể và lục lạp. Lục lạp là sắc lạp có chứa diệp
lục (chlorophyll), và các sắc tố vàng hay cam gọi là carotenoid. Dưới kính hiển vi điện
tử, một lục lạp được bao bọc bởi hai màng và vô số các túi dẹp có màng bao bọc được
gọi là thylakoid nằm trong chất cơ bản gần như đồng nhất gọi là stroma. Thylakiod
hoặc phân bố khắp trong stroma, hoặc xếp chồng chất lên lên nhau gọi là grana. Diệp
lục tố và carotenoid gắn trên màng thylakoid và các hột ribosome nằm rải rác bên
trong (Bùi Tấn Anh và Phạm Thị Nga, 2002).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Hình 2: Cấu tạo lục lạp
(*Nguồn: thpt-camthuy1-thanhhoa.violet.vn.../1727079, ngày 08-02-2010 )
Ngoài những thành phần trên, lục lạp có chứa gen mã hóa cho các chức năng
chuyên biệt của nó. Ở đây, các gen lục lạp có liên quan đến việc tổng hợp ATP nhờ sự
quang hợp. Số lượng gen trong DNA của lục lạp tương đối nhỏ so với số lượng gen
trong nhân. Xét về cấu trúc và chức năng, những gen ngoài nhân nói chung, gen trong
lục lạp nói riêng, có nhiều điểm tương đồng với các gen trong nhân, nhưng có rất
nhiều điểm khác biệt trong hoạt động và phương thức di truyền của chúng. Điểm đặc

biệt là các DNA ngoài nhân thường có dạng vòng không phải dạng chuỗi xoắn kép
như

DNA

trong

nhân

(h ngày 17-12-2009 )
Lục lạp là cơ quan giữ chức năng tổng hợp trong tế bào thực vật. Ngoài sự
quang hợp, ở lục lạp còn diễn ra nhiều hoạt động biến dưỡng quan trọng khác như sản
xuất tinh bột, acid amin, lipid và vitamin, rồi tạo nên một vài sắc tố trong hoa. Đồng
thời, nó còn đóng vai trò chủ chốt trong biến dưỡng sulfur và nitơ. Lục lạp có bộ gen
(genome) riêng của nó và bổ sung đầy đủ trong bộ máy phiên mã (trascription) và dịch
mã (translation) để biểu hiện thông tin di truyền. Đặc biệt bộ máy biểu hiện gen của
lục lạp là thành phần để phân biệt nhóm sinh vật sơ hạch, sinh vật chân hạch và cơ thể
giống phage. Năm 1963, Sager đã chứng minh được sự hiện diện của acid nucleic
trong lục lạp. Theo Sugina (2003), DNA lục lạp được coi như là một trong những
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT


trình tự của toàn bộ gen. Bộ gen lục lạp được sử dụng ở mức độ loài bởi vì nó có sự
thay đổi nhanh trong cấu trúc, kích thước, hình dạng và trình tự gen. Nói cách khác, bộ
gen trong lục lạp thích hợp nhất trong nghiên cứu sự tiến hóa và phát sinh loài đặc biệt
ở mức độ loài, bởi vì cpDNA có thành phần DNA tương đối nhiều nên dễ phân tích,
thêm vào đó lục lạp chủ yếu chứa những gen sao chép đơn và thông tin phân tử về bộ
gen trong lục lạp có phạm vi rộng. Vì vậy mà việc xây dựng lại hệ thống phát sinh loài
trong phân loại cây trồng được sắp xếp cơ bản dựa trên các số liệu phân tử từ gen
cpDNA (Liang, 1997).
Ngày nay bộ gen lục lạp (chloroplast DNA: cpDNA) đang là vấn đề được nhiều
nhà khoa học quan tâm và họ đã giải mã thành công bộ gen của lục lạp ở một số loài
thực vật. Ở thực vật bậc cao, bộ gen của lục lạp có kích thước khoảng 120.103 đến
200.103 bp (base pairs). Trong đó, gen matK (trước đây thường được gọi là orfK ) có
chiều dài xấp xỉ 1500 bp (Miller và Bayer, 2001).
Gen matK được tìm thấy trong intron của gen trnK của lục lạp. trnK là gen mã
hóa cho maturase-enzyme tham gia vào quá trình cắt nối (splicing) các intron của tiền
RNA vận chuyển acid amin Lysine – tRNALys (UUU) (Liang, 1997). Ngoài gen
matK, intron của gen trnK còn chứa các vùng lân cận (flanking) không mã hóa; hợp
thành intron nhóm II (intron tạo thành thòng lọng trong quá trình tự cắt nối tiền RNA,
lariat – forming intron). Toàn bộ intron dài khoảng 2300 bp (Miller and Bayer, 2001).
Trong lục lạp, thành phần trình tự của gen matK được xác định có sự biến đổi
khác nhau giữa các loại cây trồng đa dạng hơn bất kỳ đoạn trình tự nào khác mã hóa
cho protein. Tỉ lệ đột biến cao, sự tiến hóa có thể đạt nhanh hơn gấp 3 lần rbcL và
cũng do sự bảo tồn cấu trúc thấp matK đã được khai thác như marker trong việc tìm
hiểu sự phát sinh loài. Gen matK được sử dụng phổ biến trong phân loại cây trồng,
không chỉ ở cấp độ khác loài mà còn ở cấp độ trong cùng bộ, họ (Hilu và Liang, 1997).
2.5.

Kỹ thuật sinh học phân tử
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền về hình thái học, sinh lý học và đặc tính


nông học của cây trồng, nhiều nhà khoa học cho rằng khi sử dụng cái dấu phân tử
DNA sự thay đổi DNA rất ít chẳng hạn như phương pháp RFLPs (Restriction
Fragment Length Polymorphism) (Fang và Roose, 1997), RAPD (Random Amplified
Polymorphism DNA) (Targon et al., 2000)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

2.5.1. PCR (polymerase chain reaction)
a. Giới thiệu
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn
trình tự đặc hiệu in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào; chỉ với sự hiện diện của
một cặp mồi (primers pair) chuyên biệt, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự
do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt (Phạm Thành Hổ, 2005).
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kally Mullis và cộng tác
viên phát minh vào năm 1985 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998); là kỹ thuật được sử
dụng phổ biến trong Công nghệ sinh học hiện đại và đóng góp rất lớn vào sự phát triển
của sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ
nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào.
b. Nguyên tắc
Taq polymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (được ly trích từ vi
khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới

trong môi trường có 4 deoxynucleotide tự do và hai đoạn mồi, trên cơ sở của một đoạn
DNA nhất định làm khuôn mẫu. Sau n chu kỳ, số lượng DNA nói trên được nhân lên
2n-1 bản copy, nhờ vậy có thể đủ số lượng hiển thị trên gel, hoặc sử dụng trong giải mã,
đồng hóa…
c. Thực nghiệm PCR: Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại và nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước
 Bước 1 (Biến tính DNA): Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA, thường là 94-950C trong vòng 0,5-2
phút. Nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Ở điều kiện này thì mẫu
DNA sẽ tháo xoắn thành dạng sợi đơn. Nếu như khuôn DNA chứa GC cao thì
có thể tăng thời gian biến tính lên 3-4 phút.
 Bước 2 (Gắn mồi): Nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các mồi khoảng 50C, cho phép
mồi bắt cặp với mạch khuôn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C tùy
thuộc Tm của mồi sử dụng và kéo dài từ 0,2-2 phút. Sử dụng sai nhiệt độ trong
giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay
gắn một cách tùy tiện.
 Bước 3 (Kéo dài): Giai đoạn các mononucleotide sẽ nối dài vào đuôi primer
theo chiều 5’-3’ ở 70-750C. Ở khoảng nhiệt độ này thì Taq DNA polymerase
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian kéo dài khoảng 1 phút đối với các đoạn

DNA có trọng lượng phân tử khoảng 2kb. Nếu đoạn DNA cần khuếch đại có
trọng lượng phân tử lớn thì có thể tăng 1 phút cho 1000bp. Sau chu kỳ cuối
cùng thường thì mẫu được giữ ở 720C trong 5-15 phút để ngưng sự tổng hợp.
Một chu kỳ gồm 3 bước nêu trên được lặp đi lặp lại nhiều lần làm tăng số bản
sao của đoạn DNA tổng hợp.
2.5.2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA
Trước đây việc phân tích đa dạng di truyền thường dùng phương pháp RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism), (Bostein et al., 1980). Nhưng vào năm
1990, kỹ thuật RAPD được ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác
nhau (Williams and Kubelik, 1990; Welsh and McClelland, 1990) đã được ứng dụng
để phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền của các giống. Đây là một trong những kỹ
thuật phân tích đa dạng về bộ gen của giống.
RADP là dấu dựa trên việc sử dụng phản ứng PCR để khuếch đại các trình tự
chuyên biệt mà chúng có thể thấy được bằng cách nhuộm gel với Ethidium Bromide
(EtBr) mà không cần “thấm” và “lai”. Kỹ thuật bao gồm việc sử dụng những mồi đơn
có chiều dài khoảng 10 base, các mồi sẽ bắt cặp “lai” với chuỗi DNA genome tương
đồng sau khi DNA genome bị biến tính bởi nhiệt. Một sợi DNA mới khởi sự với đoạn
mồi (primer) có thể được tổng hợp bằng cách dùng DNA genome như sợi khuôn.
Kỹ thuật RAPD không dùng đồng vị phóng xạ, dễ thực hiện cho kết quả nhanh
và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên
cứu. Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao và chỉ sử dụng một lượng
mẫu DNA rất nhỏ (25 ng) (Ferreira and Grattapalia, 1995). Thêm vào đó chi phí thực
hiện thấp hơn so với các kỹ thuật khác, khả năng nhân bản cao, không đòi hỏi việc
phân lập và đọc trình tự, cho phép phát hiện nhiều locus cùng một lúc.
Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm kỹ thuật này vẫn có khuyết điểm là tính lập
lại không cao do các mồi ngẫu nhiên, không phân biệt được cá thể đồng hợp hay dị
hợp tử gây trở ngại trong công việc giải thích các băng có cùng tốc độ di chuyển.
Hiện nay kỹ thuật RAPD được sử dụng khá phổ biến như xây dựng bản đồ di
truyền, xác định cấu trúc di truyền của quần thể, vẽ bản đồ các tính trạng, đánh giá tính
đa dạng hay đồng dạng di truyền. Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng nhiều trong nghiên


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

cứu nhóm cây có múi như phân tích đa dạng về bộ gen, hệ thống phát sinh loài, xây
dựng bản đồ di truyền...
2.5.3. Các phương pháp giải trình tự
Muốn nghiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc cả
phân tử DNA cần tiến hành giải trình tự DNA. Hiện nay có một số phương pháp giải
trình tự DNA khác nhau.
a. Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gillbert)
Phương pháp giải trình tự các nucleotide (sequencing) của Maxam và Gilbert
(1977) còn được gọi là phương pháp hóa học.
 Nguyên lý
 Các đoạn DNA (hoặc gen) có số lượng trình tự nucleotide giống nhau được
đánh dấu bằng đồng bị phóng xạ P23 ở đầu 5’. Các đoạn DNA đã mang dấu
phóng xạ được chia làm 4 nhóm. Mỗi nhóm được xử lý bằng chất hóa học, hoặc
hỗn hợp hóa học khác nhau nhằm bẻ gãy các đoạn DNA ở các vị trí khác nhau
ở một hay hai loại bazơ nitơ khác nhau.
 Kết quả sau khi xử lý tạo thành các đoạn DNA bị cắt ngẫu nhiên có kích thước
khác nhau. Bốn nhóm sau khi cắt được đem điện di trên gel polyacrylamid và
thu được các băng DNA khác nhau theo thứ tự. Tùy theo đoạn nucleotide dài,

ngắn khác nhau sẽ thu được trật tự band khác nhau. Các đoạn nucleotide ngắn
chạy nhanh, ở xa điểm xuất phát; cá đoạn nucleotide dài chạy chậm, ở gần điểm
xuất phát. Nhờ phương pháp phóng xạ tự ghi, chúng ta thu được các băng khác
nhau trên bảng gel sau điện di.
 Các bước giải trình tự theo phương pháp Maxam-Gilbert
 Tách chiết DNA từ các mẫu nghiên cứu.
 Cắt DNA từ các mẫu và tạo đoạn DNA giống nhau bằng kỹ thuật tạo dòng
DNA
 Gắn đồng vị phóng xạ P32 vào đầu 5’ của các đoạn DNA.
 Xử lý hóa chất thành 4 nhóm riêng biệt sao cho mỗi đoạn nucleotide chỉ bị
hỏng ở một bazơ nitơ. Kết quả sau khi xử lý, mỗi nhóm chứa một số đoạn
nucleotide có chiều dài khác nhau.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

 Điện di sản phẩm của 4 nhóm trên gel polyacrylamid. Đoạn nucleotide ngắn sẽ
chuyển động xa hơn và ngược lại đoạn nucleotide dài sẽ chuyển động chậm và
ở gần điểm xuất phát.
 Chụp ảnh kết quả điện di bằng phương pháp phóng xạ tự ghi. So sánh kết quả
thu được ở các mẫu khác nhau theo 4 nhóm
b. Phương pháp dideoxy

 Nguyên lý
 Phương pháp xác định trình tự DNA dideoxy của Sanger (1977) là phương
pháp sử dụng enzyme DNA polymerase và các dideoxy. Dideoxy là các
nucleotide mất cả hai nhóm OH ở vị trí số 2 và 3 trên phân tử đường pentose.
 Phương pháp này dựa trên nguyên tắc DNA polymerase xúc tác cho việc kéo
dài chuỗi poly nucleotide khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTPs) thì dừng lại.
Do vậy các đoạn polynucleotide sẽ có chiều dài khác nhau.
 Nguyên nhân của hiện tượng này là đầu 3’ OH cần cho việc hình thành liên kết
phospho dieste ở chuỗi polynucletide đang hình thành với các nucleotide kế
tiếp. Việc thiết nhóm 3’OH ở dideoxynucleotide dẫn đến chuỗi polynucleotide
dừng lại. Người ta chỉ bổ sung các ddNTPs với nồng độ khoảng 1% so với các
dNTPs. Do vậy khả năng gắn liên kết với các dNTPs nhiều hơn so với khả năng
gắn với ddNTPs. Từ đó sẽ cho các đoạn polynucleotide dài ngắn khác nhau.
Nếu chia làm bốn nhóm với việc bổ sung 1% các loại ddNTPs riêng biệt
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) khi chạy điện di sẽ có bốn bảng điện di khác
nhau. Các băng DNA xác định được nhờ vào việc gắn đồng vị phóng xạ vào
mồi hoặc vào các dideoxy.
 Các bước tiến hành dideoxy
 Biến tính DNA bổ sung mồi có đánh dấu phóng xạ P32, Taq DNA polymerase,
bổ sung đủ các loại dNTPs cho vào dung dịch đệm thích hợp để thực hiện phản
ứng tổng hợp DNA, sau đó chia làm bốn lô (bốn ống eppendorf).
 Bổ sung vào mỗi lô một loại ddNTPs với tỉ lệ 1%. Với tỉ lệ này thỉnh thoảng
mới có một ddNTP được gắn ngẫu nhiên. Trường hợp không đánh dấu bằng P32
ở mồi thì có thể đánh dấu P32 ở ddNTPs.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

 Điện di các nhóm phản ứng bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
ở điều kiện biến tính để được các băng của các đoạn oligonucleotide có kích
thước khác nhau.
 Thu kết quả các băng bằng phóng xạ tự ghi. Chụp ảnh và phân tích kết quả. Có
thể tiến hành giải trình tự cả hai mạch DNA khuôn để tránh sai sót.
c. Giải trình tự DNA tự động
 Nguyên lý
Giải trình tự DNA tự động dựa theo phương pháp dideoxy được cải tiến dựa
vào các thiết bị tự động hóa, nhanh và chính xác hơn. Sự tự động hóa đã cải tiến tốc độ
giải trình tự của mẫu, đặc biệt có ý nghĩa cho việc giải trình tự các nguồn mẫu lớn.
Trong kỹ thuật này người ta không đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ mà đánh dấu
bằng chất huỳnh quang (fluochrome). Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng
một fluochrome có màu khác nhau (ví dụ xanh da trời, da cam, xanh lục và đen...).
Như vậy các phân đoạn DNA được đánh dấu phân biệt bởi các màu khác nhau khi sử
dụng bốn loại dideoxynulceotide có bốn màu khác nhau thì có thể giải trình tự mẫu
nghiên cứu trong một phản ứng (một giếng điện di) thay vì cho bốn phản ứng tong bốn
giếng riêng biệt như phương pháp dideoxy. Phần mềm máy tính sẽ tự động giải trình
tự dữ liệu từ gel điện di và cho hình ảnh kết quả giải trình tự DNA.
 Các bước tiến hành
 Giải trình tự DNA tự động bao gồm các thành phần chủ yếu sau:
 DNA mẫu chứa 1010 phân tử hoặc 1010 đoạn DNA dài khoảng 103-104bp.
 Các deoxynucleotide (dNTPs)
 Bốn loại dideoxynucletide (ddNTPs) có gắn huỳnh quang khác nhau, mỗi loại
gắn một màu riêng biệt

 Các enzyme cần thiết
 Dung dịch đệm
 Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho đoạn cần nhân bản. Thể tích chung của
mỗi phản ứng là 20µl
 Tiến hành chạy PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch, sau đó tiến hành điện di
trên gel polyacrylamide. Kết quả thu được nhờ máy đọc trình tự và được xử lý
bằng các phần mềm chuyên dụng. Những phần mềm sẽ cung cấp dữ liệu in ra
từ máy tính. (Trịnh Đình Đạt, 2007).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Hình 3: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA
(*Nguồn: ,ngày 17-12-2009)

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở của phương
pháp Sanger. Cái khác của máy giải trình tự ABI 3130 so với phương pháp của Sanger
là vật liệu đánh dấu. Trong phương pháp của Sanger, vật liệu đánh dấu là đồng vị
phóng xạ P32, đồng vị phóng xạ này được nhận biết trên gel polyacrylamine. Còn với
máy giải trình tự, chúng ta sử dụng vật liệu đánh dấu là 4 màu huỳnh quang cùng gắn
vào các dNTPs. Hệ thống đọc huỳnh quang của máy sẽ ghi nhận các tín hiệu từ các
màu hùynh quang của các đọan DNA đã được đánh dấu. Như vậy chúng ta cũng thu
được những đoạn DNA với chiều dài ngắn khác nhau. (Quyền Đình Thi và Nông Văn

Hải, 2008).
2.5.4. Những nghiên cứu liên quan
Trước đây việc phân tích đa dạng di truyền thường dùng phương pháp phân tích
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Bostein et al., 1980; Burr et al.,
1983). Hiện nay nhờ vào sự phát hiện ra PCR (Polymerase Chain Reaction) đã mở ra
nhiều triển vọng trong việc phát hiện và phân tích di truyền. Phương pháp này có một
ưu điểm là dựa trên sự tự động hóa dây chuyền phản ứng so với những kỹ thuật cổ
điển trước đây, đồng thời cũng đơn giản trong việc thực hiện.
Trong những năm 1990, phương pháp RAPD đã được sử dụng thành công trong
việc nhận ra các giống hoặc dòng vô tính của lúa mì (He et al., 1992); lúa mạch
(Tinker et al., 1993); bông cải xanh và cải bắp bông (Hu và Quiros, 1991; Kresovich,
1992)…
RAPD và microsatellites đã được sử dụng để phân tích mối liên hệ di truyền
giữa các giống cây có múi đã được sưu tập và đang bảo tồn tại SOFRI, nhằm đánh giá
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

và sử dụng nguồn gene cây có múi về sau. Với 15 mồi được chọn ra từ 150 mồi
primers của Operon kits B, D, C, F (Operon technologies, Inc) cho kết quả đa hình cao
trên 37 giống/ dòng cây có múi ở Việt Nam (Phan Đình Pháp, 2004).
Bùi Minh Trí (2005) đã sử dụng 4 đoạn mồi (primer) là OPA 02, OPA 03, OPN
03 và OPN 06 trong đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Điều (Anacardium

occidentale L) tại tỉnh Ninh Thuận bằng phương pháp RAPD. Kết quả cho thấy với
mồi OPN 06 thu được hệ số đồng dạng di truyền trong khoảng 0.65-1.00 được ghi
nhận.
Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2004). Sử dụng 4 mồi là A-02, A-04, A-11 và A-13
trong phân tích đa dạng di truyền các giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên
Giang bằng phương pháp RAPD cho kết quả 49 dấu phân tử (marker) được ghi nhận.
Nguyễn Thị Lang et al. (2005) chọn 13 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng
PCR kết quả cho thấy được sự đa dạng và phân nhóm khác nhau trong tập đoàn dứa
Cayene gồm 50 dòng có nguồn gốc khác nhau bằng phương pháp RAPD.
Nguyễn Thị Thanh Bình et al. (2004) đã sử dụng 5 đoạn mồi trong nghiên cứu
đa hình một số giống tầm dâu bằng kỹ thuật RAPD và kết quả cho thấy các giống tằm
nghiên cứu có mối tương đồng di truyền trong khoảng 0,547 đến 0,984.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Phƣơng tiện

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị

Máy đo quang phổ Beckman Coulter DU 640B (Mỹ), máy li tâm Eppendorf
5417 C (Đức), máy PCR BIO-RAD C1000 (Hoa Kỳ), máy đọc gel và chụp hình gel
BioRad UV 2000, máy nghiền mẫu MM 200 (Đức), máy sấy chân không Eppendorf
Concentrator 5301, bộ điện di nhanh Run-one (Mỹ), máy giải trình tự ABI 3130 (Mỹ),
các loại ống tuýp đựng mẫu và phản ứng PCR, cân điện tử, lò vi sóng, bộ Micropippet
và một số dụng cụ khác: kéo, kẹp, dao, cốc thủy tinh, máy ảnh…
3.1.2. Hóa chất
 Hóa chất dùng để trích DNA lá: nitơ lỏng, Extraction Buffer (EB), CTAB
(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide), Isopropanol, Chloroform, TE, RNase,
βeta-mercapto ethanol, Ethanol, SDS 10%…
 Hóa chất phản ứng PCR và chạy điện di: Bi H2O, PCR Buffer, MgCl2, dNTPs,
primer, Taq DNA polymerase, Ethdium Bromide (EtBr), Agarose…
3.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
 Thời gian: từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 05 năm 2009
 Địa điểm: phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.
3.2.

Phƣơng pháp thực hiện

3.2.1. Thu mẫu
Khảo sát các vườn trồng sầu riêng, mỗi vườn chọn cây cho trái ổn định, phát
triển tốt để thu mẫu lá non, mỗi cây thu từ 5-10 lá.
3.2.2. Trích DNA
 Trích mẫu
DNA được trích theo quy trình được mô tả bởi Rogers và Bendich (1988) (quy trình
CTAB).
 Dùng Ethanol 70% khử trùng bề mặt lá; cắt nhuyễn 1mg lá cho vào tube 2.2ml,
cho bi sắt vào và làm lạnh bằng cách ngâm trong nitơ lỏng 10 phút (có thể lâu
hơn). Nghiễn mẫu bằng máy nghiền 2-3 lần, mỗi lần 1 phút 30 giây. Cho vào

mỗi ống một 1ml Extraction Buffer (EB+ PVP 40 2%) + 50μl SDS 10%. Ủ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

16

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học