Chương 8
TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR

Tóm tắt: Trong chương này, chúng ta sẽ bàn đến khía cạnh sinh học của việc
tách dòng gene bao gồm việc sử dụng các phân tử vector và hệ thống sống thích
hợp, tức vật chủ mà ở đó vector có thể được nhân lên. Các loại tế bào chủ sẽ
được mô tả đầu tiên, tiếp theo lả các hệ thống vector và các phương pháp dùng
để đưa ADN vào các tế bào. Tế bào chủ và vector là hai đối tượng cực kì quan
trọng trong kĩ thuật tách dòng. Có hai loại tế bào chủ, đó là: Tế bào chủ nhân
sơ, Tế bào chủ nhân chuẩn và E. coli là vật chủ được sử dụng nhiều nhất trong
kĩ thuật tách dòng. Vector tách dòng được phân biệt với vector chuyển gene ở
một số đặc điểm cơ bản. Có nhiều loại vector được sử dụng trong kĩ thuật di
truyền, nhưng được sử dụng rộng rãi nhất là plasmid.
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1) Tế bào chủ; (2). Vector, (3).
Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bảo chủ.


§1. TẾ BÀO CHỦ
Loại tế bào chủ sử dụng trong một ứng dụng cụ thể chủ yếu phụ thuộc vào
mục đích của thí nghiệm tách dòng. Nếu mục đích đó là tách ra một gene để
phân tích cấu trúc thì yêu cầu ở dây chỉ là một hệ thống đơn giản, dễ sử dụng.
Nếu mục đích là biểu hiện thông tin di truyền ở một sinh vật nhân chuẩn bậc
cao, chẳng hạn ở thực vật, thì đòi hỏi phải có một hệ thống đặc thù hơn. Thường
thì một vật chủ ban đầu đơn giản được sử dụng để tách một đoạn trình tự mà
đoạn này sau đó được đưa vào một hệ thống phức tạp hơn để biểu hiện. Các loại
tế bào chủ yếu được nêu trên bảng 8.1.
1.1. Các vật chủ nhân sơ
Một tế bào chủ lí tưởng là một tế bào dễ nuôi cấy và dễ nhân giống, dễ thu
nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng các yêu cầu này và được
sử dụng trong rất nhiều kĩ thuật tách dòng. E. coli được nghiên cứu rất tỉ mỉ, rất
nhiều loài khác nhau đã được các nhà di truyền học vi sinh vật phân lập khi

nghiên cứu các cơ chế di truyền của sinh vật nhân sơ này. Các nghiên cứu đó đã
cung cấp những thông tin khoa học giá trị làm cơ sở cho kĩ thuật di truyền.

109
Bảng 8.1. Các loại tế bào chủ dùng trong kĩ thuật di truyền
Vi khuẩn Nhân sơ Gram âm
Gram dương
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Streptomyces spp.
Nấm Nhân chuẩn Vi sinh vật
Có khuẩn li
saccharomces cerevisiae
Aspergillus nidulans
Thực vật Nhân chuẩn Tế bào trần
Tế bào nguyên
Cả cơ thể
Các loại khác nhau
Các loại khác nhau
Các loại khác nhau
Động vật Nhân chuẩn Tế bào sâu bọ
Tế bào động vật
Tế bào trứng
Cả cơ thể
Drosophiia melanogaster
Các loại khác nhau
Các loại khác nhau
Các loại khác nhau
E. coli là vi khuẩn gram âm có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm trong một
cấu trúc gọi là vùng nhân (nucleoit). Kích thước của hệ gene vào khoảng 4 x 10

6
bp. Các quá trình biểu hiện gene (phiên mã và dịch mã) đi đôi với nhau, sinh ra
sợi mARN được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quá trình dịch mã. Vì
vậy, E. coli có thể được coi là một trong những tế bào vật chủ đơn giản nhất, cho
nên các thí nghiệm tách dòng gene đều sử dụng E. coli làm vật chủ với nhiều nòi
khác nhau về mặt di truyền và cho những ứng dụng đặc biệt.
Ngoài E. coli, các vi khuẩn khác cũng được dùng làm vật chủ cho các thí
nghiệm tách dòng gene, chẳng hạn: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces.
Các loại vi khuẩn này có những hạn chế nhất định đối với các vật chủ, đó là có
rất ít vector thích hợp để sử dụng trong các tế bào đó và đưa ADN tái tổ hợp vào
các tế bào đó có thể gặp khó khăn, đặc biệt khó khăn khi dối mặt với các thí
nghiệm tách dòng ban đầu.
1.2. Các vật chủ nhân chuẩn
Một trong những nhược điểm sử dụng E. coli làm vật chủ để tách dòng là
là sinh vật nhân sơ không có màng nhân như ở các tế bào nhân chuẩn. Các tế
bào nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật như nấm men và tảo
cho đến các tế bào của các sinh vật đa bào phức tạp, như con người chẳng hạn.
Các tế bào vi sinh vật nhân chuẩn có nhiều đặc tính của vi khuẩn như dễ nhân
giống, dễ tạo ra các đột biến. Trong khi các sinh vật nhân chuẩn bậc cao gây ra
hàng loạt khó khăn đòi hỏi phải có những cách giải quyết đặc hiệu.

110
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một vi sinh vật nhân chuẩn được
ưa thích để nghiên cứu kĩ thuật di truyền. Nó đã được sử dụng nhiều thế kỉ trong
sản xuất bánh mì và bia, và được nghiên cứu rất tích cực. Sinh vật này có thể sử
dụng dễ dàng để phân tích di truyền học kinh điển, chúng có nhiều loại tế bào
đột biến. Hệ gene của S. cerevisaae có khoản 1,35 x 10
7
; bazơ nitơ, nhiều hơn
E.coli khoảng 3,5 lần. Các nấm khác cũng được dùng trong các thí nghiệm tách

dòng gene là Aspergillus nidulans và Neurospora crassa.
Các tế bào thực vật và động vật cũng có thể được sử dụng như các vật chủ
trong các thí nghiệm thao tác gene. Các tế bào thực vật và động vật khác thường
được nuôi cấy trong các môi trường thích hợp và ở điều kiện này, để sử dụng
trong các thí nghiệm thao tác gene so với các tế bào trong cơ thể.


§2. VECTOR
2.1. Khái niệm
Để thu nhận gene dưới dạng tinh sạch với hàm lượng lớn người ta phải
tách dòng (clone) gene đó. Việc tách dòng cơ bản là tiến hành gắn trình tự ADN
vào vector. Vector cũng là một ADN dạng vòng, có khả năng xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn và mượn tế bào vi khuẩn để tạo ra những bản sao khác giống hệt
vector ban đầu.

Hình 8.1. Sơ đồ plasmid
Vector có các ứng dụng chủ yếu sau:
- Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự ADN xác định.
- Tạo sinh vật chuyển gene (chuyển các gene vào tế bào hay cơ thể).
- Sản xuất ARN với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng.
- Sản xuất protein với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng.
Đặc tính cần có của một vector:

111
- Vector có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào vật chủ. Độc lập
với sự sao chép của bộ gene vật chủ.
- Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt.
- Vector phải được phát hiện rõ ràng trong vật chủ.
- Phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ.
- Vector chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzyme.

Vector được sử dụng trong kĩ thuật tách dòng phân tử ADN đối với tế bào
E. coli: (1) Plasmids; (2) Bacteriophage l, (3) Cosmids; (4) Bactenophage M13;
(5) Phagemids và một số loại vector đặc biệt khác như: (i) Ti plasmid; (ii)
YACS; (iii) BACS; (iv) Retrovirus; (iiv) Baculovirus. (iiiv) Yeast 2 micron
plasmid.
Việc lựa chọn sử dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn ADN
cần tạo dòng và mục đích tạo dòng.
Vector được sử dụng với mục đích tách dòng gene (vector tách dòng) và
chuyển gene (vector chuyển gene).

Hình 8.2. Plasmid pBR322 (a) và plasmid pUC18 (b)
(theo Nông Văn Hảí, 2002)
2.2. Các vector plasmid dùng cho E. coli
Có một số đặc điểm quan trọng mà các vectơ cần phải có, chúng phải
những phân tử ADN nhỏ giúp cho việc phân tách và bảo quản chúng dễ dàng.
Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication), để cho ADN nó được
nhân lên và do vậy được duy trì trong quần thể tế bào khi sinh vật chủ sinh
trưởng và phân chia. Cần có một loại dấu chuẩn, chọn lọc (selectable marker)
tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện và cũng cần phải có ít nhất một
điểm cắt bởi enzyme giới hạn để tạo điều kiện cho ADN xen vào trong quá trình
tạo ra các thể tái tổ hợp. Các plamid có các đặc điểm phù hợp với yêu cầu trên
và chúng được sử dụng thường xuyên như các vector trong các thí nghiệm tách
dòng.
2.2.1. Plasmid

112
Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên ở các vi khuẩn và trong
một số nấm men. Chúng là những phân tử AND mạch vòng tương đối nhỏ so
với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở trạng thái
ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid cos khả năng truyền các tính trạng cho vật chủ

(chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh), do vậy giúp cho việc lựa chọn dễ
dàng trong những điều kiện xác định. Các gene bền vững với kháng sinh do
AND plasmid mã hóa thường được sử dụng trong việc thiết kế các vector dùng
cho kĩ thuật di truyền vì chúng cung cấp một phương tiện thuận lợi để lựa chọn
các tế bào có mang plasmid.
Các plasmid có thể phân chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp.
Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông
qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn đặc thù
tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid. Các plasmid không tiếp hợp
thì không tự truyền đi được. Một cách phân loại khác dựa trên số lượng các bản
sao của plasmid có trong tế bào chủ. Các plasmid có số bản sao thấp có khuynh
hướng kiểm soát chặt chẽ việc sao chép ADN, thường ADN plasmid loại này
phải sao chép bắt buộc cùng với sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của vật chủ.
Các plasmid có số bản sao cao gọi lào các plasmid thoải mái, việc sao chép
ADN của chúng không phụ thuộc vào sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của tế
bào chủ. Nói chung, các plasmid tiếp hợp thường lớn, có cơ chế kiểm soát chặt
chẽ việc sao chép ADN và tồn tại trong tế bào với số lượng bản sao thấp. Trong
khi đó, các plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép ADN một cách thoải
mái và tồn tại trong tế bào với số bản sao cao.
2.2.2. Các plasmid cơ bản dùng để tách dòng
Trong kĩ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa
đổi nhiều để tạo ra các vector có đặc điểm mong muốn. Để đặt tên plasmid, chữ
p được dùng để chỉ plasmid và tiếp theo đó thường là tên của những người đã
phân lập hoặc thiết kế plasmid. Các con số cũng có thể được sử dụng để phân
loại các chủng cụ thể. Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi là
pBR322, nó được hoàn thiện bởi Francisco Bolivar và đồng nghiệp. Việc thiết
kế pBR322 bao gồm một loạt những thao tác để có được những đoạn ADN cần
thiết cùng nối với nhau với kết quả cuối cùng là một ADN có 3 nguồn gốc.
Plasmid này có tất cả các đặc tính của một vector tốt, chẳng hạn như: trọng
lượng phân tử thấp, có các gene kháng kháng sinh, có điểm khởi đầu sao chép,

và có một số điểm cắt riêng biệt bởi các enzyme giới hạn.
Có một số plasmid trong nhóm pBR mang các đặc điểm khác nhau chút ít.
Tuy nhiên, plasmid bắt nguồn từ pBR322 được sử dụng rộng rãi, vì chúng có

113
một số đặc điểm ưu việt so với plasmid ban đầu. Ví dụ: plasmid pAT153, là một
dẫn xuất mất đoạn của pBR322. Plasmid này được tạo ra bằng các loại bỏ 2
đoạn ADN từ pBR322 sau khi dùng enzym giới hạn Hael. Lượng ADN bị loại
bỏ rất nhỏ (705 cặp bazơ), nhưng hiệu quả đã làm tăng số bản sao lên 3 lần và
đã loại bỏ các đoạn trình tự cần thiết cho quá trình huy động (mobilisation). Như
vậy, pAT153 về một số phương diện là vector "tốt hơn" pBR322, vì nó có nhiều
bản sao hơn trong tế bào và nó có mức độ bền vững sinh học cao hơn do mất
khả năng huy động.

Hình 8.3. Vector pBluescript (theo Nông Văn Hải, 2002)
Sự có mặt của 2 gene kháng kháng sinh (Ap
r
và Tc
r
) cho phép lựa chọn
các tế bào có mang plasmid, vì các tế bào đó sẽ kháng với cả ampicilin và
tetracylin. Một ưu việt nữa là các điểm cắt giới hạn duy nhất nằm trong các gene
kháng sinh cho phép lựa chọn được các ADN tách dòng, và do vậy được gọi là
bất hoạt do xen đoạn (insertional inactivation), khi mà đoạn ADN xen vào làm
gián đoạn đoạn mã hoá của gene kháng và vì vậy làm thay đổi kiểu hình của tế
bào mang ADN tái tổ hợp.
2.2.3. Các vectorplasmid khác
Mặc dù các plasmid pBR322 và pAT153 được sử dụng rộng rãi trong
nhiều ứng dụng của tách dòng gene, còn có các vector plasmid khác cũng được
sử dụng. Nói chung, chúng dược thiết kế sao cho có được những đặc tính cụ thể,

không thấy có trong các vector đơn giản. Chúng có thể mang những khởi điểm
đặc hiệu để biểu hiện các gene xen vào hoặc chúng có thể có những ưu việt khác
như tạo ra khả năng chọn lọc trực tiếp các thể tái tổ hợp. Một nhóm các vector
plasmid cũng rất phổ biến là các plasmid thuộc họ PUC. Các plasmid này có

114