BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THIỆN GIÁP

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA PHỨC HỢP
PACLITAXEL, DIHYDROARTEMISININ
VÀ POLYETHYLEN GLYCOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THIỆN GIÁP

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA PHỨC HỢP
PACLITAXEL, DIHYDROARTEMISININ
VÀ POLYETHYLEN GLYCOL
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 8720202
Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
GS. TS. Chul Soon Yong
Nơi thực hiện đề tài: Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia
Bộ môn Công nghiệp Dược
Khoa Dược – Đại học Yeungnam, Hàn Quốc

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đối với:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
GS. Chul Soon Yong
Những người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng, giúp đỡ tôi
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Phùng Cao Đại và các
thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên thuộc viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ
môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện về thiết bị, máy móc, hóa
chất, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo và các Phòng ban
khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn chân thành gia đình tôi, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019

Lê Thiện Giáp



MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin ..................................................................... 2
1.1.1. Tính chất lý, hóa ......................................................................................... 2
1.1.2. Dược động học ........................................................................................... 2
1.1.3. Tác dụng dược lý ........................................................................................ 3
1.1.4 Độc tính của DHA ...................................................................................... 3
1.1.5. Định lượng DHA ........................................................................................ 4
1.1.6. Độ ổn định của DHA .................................................................................. 5
1.2. Tổng quan về Paclitaxel.................................................................................... 6
1.2.1. Tính chất lý, hóa của dược chất.................................................................. 6
1.2.2. Dược động học ........................................................................................... 6
1.2.3. Cơ chế tác dụng .......................................................................................... 7
1.2.4. Chỉ định ...................................................................................................... 7
1.2.5. Liều dùng, cách dùng ................................................................................. 7
1.2.6. Một số phương pháp định tính ................................................................... 7
1.2.7. Một số phương pháp định lượng ................................................................ 8
1.3. Tổng quan về phương pháp PEG hóa ứng dụng trong bào chế thuốc .............. 8
1.3.1. Polyethylen glycol ...................................................................................... 8
1.3.2. Phương pháp PEG hóa ............................................................................... 9


1.3.3. Một số phương pháp PEG hóa hệ tiểu phân nano .................................... 10

1.4. Tổng quan về một số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro và chỉ số
kết hợp giữa hai thuốc............................................................................................ 11
1.4.1. Một số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro............................. 11
1.4.2. Chỉ số kết hợp (Combination index – CI) ................................................ 13
1.5. Một số nghiên cứu liên quan .......................................................................... 14
1.5.1. Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA ...................... 14
1.5.2. Một số nghiên cứu về phương pháp PEG hóa .......................................... 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị.................................................................................. 17
2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 17
2.1.2. Thiết bị ..................................................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 19
2.2.1. Tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol ............................ 19
2.2.2. Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano có chứa PTX và DHA và đánh giá
một số chỉ tiêu .................................................................................................... 19
2.2.3. Thử tác dụng độc tính tế bào in vitro của hệ tiểu phân nano bào chế được
trên dòng tế bào HT-29 ...................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 20
2.3.1. Phương pháp tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol ....... 20
2.3.2. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano có chứa PTX, DHA. ................ 22
2.3.3. Các phương pháp đánh giá ....................................................................... 22
2.2.4. Phương pháp thử tác dụng chống ung thư in vitro trên dòng tế bào HT29 ........................................................................................................................ 26


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 29
3.1. Khảo sát phương pháp định lượng đồng thời DHA và PTX .......................... 29
3.1.1. Độ đặc hiệu ............................................................................................... 29
3.1.2. Độ tương thích hệ thống ........................................................................... 29
3.1.3. Độ tuyến tính ............................................................................................ 30
3.2. Kết quả tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol ...................... 31

3.2.1. Tổng hợp dẫn chất 2’,7-disuccinylpaclitaxel ........................................... 31
3.2.2. Tổng hợp liên hợp PEG và ART .............................................................. 33
3.2.3. Tổng hợp phức hợp hai dược chất gắn polyethylen glycol ...................... 35
3.3. Bào chế tiểu phân nano chứa đồng thời paclitaxel và dihydroartemisinin ..... 37
3.3.1. Bào chế tiểu phân nano chỉ chứa phức hợp PPD ..................................... 37
3.3.2. Bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp PPD và DHA, PTX .............. 38
3.3. Đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân nano PTX – DHA đã lựa chọn. . 42
3.3.1. Xác định hàm lượng dược chất nạp vào hệ nano ..................................... 42
3.3.2. Đánh giá độ hòa tan in vitro của hệ tiểu phân nano đã lựa chọn ............. 42
3.3.3. Đánh giá hình thái cấu trúc hệ tiểu phân nano đã bào chế được bằng kính
hiển vi điện tử truyền qua ................................................................................... 43
3.5. Kết quả đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro.......................................... 44
3.5.1. Kết quả đánh giá độc tính tế bào .............................................................. 44
3.5.2. Xác định hệ số kết hợp giữa hai thuốc ..................................................... 45
3.5.3. Đánh giá khả năng nạp thuốc vào tế bào .................................................. 46
PHẦN IV: BÀN LUẬN ............................................................................................ 47
4.1. Về phương pháp tổng hợp dẫn chất PPD........................................................ 47
4.1.1. Về phản ứng tổng hợp dẫn chất 2’,7-disuccinylpaclitaxel ....................... 47
4.1.2. Về phản ứng tổng hợp dẫn chất DHA-suc-PEG và PPD ......................... 48


4.2. Về bào chế hệ tiểu phân nano phức hợp chứa hai dược chất DHA và PTX .. 49
4.2.1. Về ảnh hưởng của thể tích pha ngoại (tỷ lệ pha dầu/pha nước) ............... 49
4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/chất mang ............................................... 49
4.2.3. Ảnh hưởng của lecithin ............................................................................ 50
4.2.4. Ảnh hưởng của chất ổn định pha nước..................................................... 51
4.3. Về tác dụng chống ung thư in vitro của hệ tiểu phân nano ............................ 52
4.3.1. Về việc kết hợp hai dược chất .................................................................. 52
4.3.2. Về việc dung nạp thuốc vào tế bào .......................................................... 52
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Cách viết tắt

Thuật ngữ

ACN

Acetonitril

CI

Combination index

Giải thích

Chỉ số kết hợp
Dược chất

DC
DCC

Dicyclohexyl carbodiimid

DCM

Dicloromethan


DIC

N,N’-Diisopropylcarbodiimid

DHA

Dihydroartemisinin

DMAP

4-dimethylamino pyridin

DMSO

Dimethyl sulfoxid

EE

Encapsulation efficiency

Hiệu suất nano hóa thuốc

FDA

Food and Drug Administration

Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm


FT-IR

Fourier Transform Infraced
Spectroscopy

Phổ hồng ngoại biến đổi

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Kl/tt

Khối lượng/thể tích

KTTP

Kích thước tiểu phân trung bình
Tỷ lệ thuốc nano hóa

LC

Drug loading capacity

MTS

(5-(3-carboxymethoxyphenyl)2-(4,5-dimethyl-thiazoly)-3-(4sulfophenyl) tetrazolium


OD

Optical density

Mật độ quang

PBS

Phosphate bufferred saline

Đệm phosphat đẳng trương

PDI

Polydispersity index

Chỉ số đa phân tán

PEG

Poly ethylen glycol

PLGA

Acid poly (lactic-co-glycolic)


PMS


Phenazine methosulfate

PPD

Paclitaxel-PEGDyhyroartemisinin complex

PTX

Paclitaxel

PVA

Polyvinyl alcol

RSD

Relative standard deviation

SA

Anhydrid succinic

SKLM

Phức hợp PTX-PEG-DHA

Độ lệch chuẩn tương đối

Sắc kí lớp mỏng



DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Một số các nghiên cứu định lượng DHA

44

Bảng 3.1. Kết quả chạy sắc kí hai dược chất

29

Bảng 3.2. Kết quả độ tương tích hệ thống

29

Bảng 3.3. Mối tương quan diện tích pic - nồng độ của DHA và PTX

30

trong pha động.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thực hiện đến hiệu suất

32

phản ứng tổng hợp chất (1)
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất phản ứng tổng


34

hợp chất (2)
Bảng 3.6. Bảng công thức bào chế hệ nano chỉ chứa phức hợp PTX-

37

PEG-DHA
Bảng 3.7. Các công thức bào chế nano với các tỷ lệ DC/chất mang khác

38

nhau
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của lượng lecithin trong pha dầu đến đặc tính tiểu

39

phân của hệ tiểu phân nano phức hợp
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của loại chất ổn định pha nước đến đặc tính tiểu

40

phân của hệ tiểu phân nano
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/pha nước đến đặc tính vật lý hệ

41

tiểu phân nano với các tỷ lệ khác nhau của pha dầu/pha nước
Bảng 3.11. Hàm lượng dược chất nạp vào hệ nano


42

Bảng 3.12. Chỉ số kết hợp giữa DHA và PTX ở các tỉ lệ khác nhau

45


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Tên hình
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic - nồng độ của

Trang
31

DHA và PTX trong pha động.
Hình 3.2. Đặc tính vật lý hệ tiểu phân nano chỉ chỉ chứa phức hợp PPD

37

Hình 3.3. Đặc tính vật lý hệ tiểu phân nano chứa phức hợp PPD và

38

DHA, PTX với các tỷ lệ DC/PPD khác nhau
Hình 3.4. Ảnh hưởng của lượng lecithin trong pha dầu đến KTTP và

39

PDI của hệ tiểu phân nano phức hợp
Hình 3.5. Ảnh hưởng của loại chất ổn định pha nước đến KTTP và PDI


40

của hệ tiểu phân nano phức hợp
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/pha nước đến đặc tính vật lý hệ

41

tiểu phân nano với các tỷ lệ pha dầu/pha nước khác nhau
Hình 3.7. Kết quả thử độ hòa tan in vitro của hệ tiểu phân nano phức

43

hợp chứa DHA và PTX
Hình 3.8. Hình thái của hệ tiểu phân nano chứa lecithin

44

Hình 3.9. Kết quả khả năng sống sót của tế bào HT-29 trong các nhóm

44

Hình 3.10. Kết quả khả năng sống sót của tế bào HT-29 khi sử dụng hỗn

45

hợp PTX và DHA ở các tỷ lệ khác nhau
Hình 3.11. Khả năng nạp thuốc vào tế bào: A. So sánh hệ nano với mẫu

46


coumarin-153 tự do; B.Sử dụng hệ nano với thời gian khác nhau
Hình 4.1. Cơ chế phản ứng acyl hóa

47

Hình 4.2. Cơ chế phản ứng tạo 2 và 3 sử dụng DIC và DMAP

48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paclitaxel (PTX) là một alkaloid tự nhiên có tác dụng tốt chống lại ung thư buồng
trứng, ung thư vú, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ…Tuy nhiên ứng dụng lâm
sàng của PTX bị hạn chế bởi độ tan thấp, độc tính cao và hiệu quả điều trị thấp [32].
Nhằm cải thiện độ tan cho PTX, các chế phẩm trên thị trường đều được sử dụng chất
diện hoạt là Cremophor với tỷ lệ cao, do đó gây nên các tác dụng có hại.
Dihydroartemisinin (DHA) là một trong những dẫn xuất chính của artemisinin
được chiết xuất từ Artemisia annua L. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng ngoài tác
dụng chống sốt rét, DHA còn có các chống khối u, chống virus và hoạt động ức chế
miễn dịch [36]. Theo nghiên cứu của Yi Chen và các cộng sự, DHA có tác dụng hiệp
đồng tăng cường chống khối u cùng với paclitaxel với giá trị chỉ số phối hợp CI từ
0,6 đến 0,73 [13]. Do vậy nghiên cứu phối hợp DHA và PTX nhằm làm tăng hiệu
quả điều trị chống khối u, đồng thời giảm độc tính của PTX là một hướng đi mới.
Ngày nay, công nghệ nano ra đời đã được ngành Dược ứng dụng để nghiên cứu
bào chế các thuốc điều trị tại đích như nhóm thuốc điều trị ung thư do ưu điểm làm
tăng nồng độ thuốc tại khối u và giảm độc tính tại các mô khỏe mạnh [4]. Việc cải
biến bề mặt bằng polyethylen glycol giúp tiều phân nano tránh được quá trình thực
bào, tăng tính thân nước của hệ tiểu phân nano cũng như tăng thời gian lưu giữ thuốc
trong vòng tuần hoàn [22]. Nhằm ứng dụng công nghệ nano cải biến bề mặt lên các

dạng thuốc, kéo dài thời gian tác dụng cũng như giảm độc tính của thuốc, đề tài
“Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp paclitaxel,
dihydroartemisinin và polyethylen glycol” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Tổng hợp được phức hợp paclitaxel, dihydroartemisinin và polyethylen glycol.
2. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp tổng hợp
được và đánh giá được một số đặc tính lý hóa của hệ.
3. Đánh giá được tác dụng độc tính tế bào in vitro của hệ tiểu phân nano nghiên
cứu trên dòng tế bào ung thư HT-29.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin
1.1.1. Tính chất lý, hóa

Công thức phân tử của DHA: C15H24O5
Tên khoa học (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol.
Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol.
DHA là chất chuyển hóa chính có hoạt tính của các dẫn xuất artemisinin, DHA
là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước và
trong dầu. DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether,
cloroform [34].
Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, DHA bị thủy phân mạnh nhưng
bền vững trong môi trường trung tính, ngoài ra DHA cũng không bền với nhiệt.
Năng suất quay cực [α] = 140-146 (C =1,0026 trong cloroform). C12 là một
cacbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia
X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung
dịch thì tồn tại cả 2 dạng [19].
Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150C [19].

1.1.2. Dược động học
Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm: DHA hấp thu tốt qua đường uống, tỷ
lệ liên kết với protein huyết tương là 50%. Với liều uống là 20 mg/kg kết quả cho
thấy thời gian bán thải là 2,1 giờ và thải trừ hoàn toàn sau 3,04 giờ. DHA phân bố
đến khắp các cơ quan, đặc biệt phân bố nhanh đến gan và tim. DHA thải trừ nguyên

2


dạng qua nước tiểu (82,7%) và 1 phần qua phân. Khi dùng DHA đồng thời với các
thuốc khác có tỷ lệ liên kết với protein huyết tương cao nhận thấy độc tính không
tăng lên.
Nghiên cứu trên cơ thể người: DHA hấp thu tốt qua đường uống với liều 1,1mg
và 2,2 mg/kg, nồng độ trong huyết tương cao nhất đạt được sau 1,33 giờ và t1/2 là
1,63-1,57h [24].
1.1.3. Tác dụng dược lý
DHA được biết đến là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng sốt rét rất hiệu quả
đặc biệt đối với ký sinh trùng P. falciparum. DHA ít tan trong nước và sinh khả dụng
thấp khi dùng đường uống vì thuốc tan chậm và có thể bị phân hủy bởi dịch dạ dày
ruột. Thời gian bán thải của DHA rất ngắn [40], [41].
Ngoài ra, DHA đã được chứng minh có tác dụng chống khối u với hai cơ chế
tiêu diệt tế bào ung thư. Cơ chế thứ nhất nhờ việc tạo ra các gốc tự do thông qua sự
phân cắt cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R), cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị
hợp của cầu nối endoperoxid và nước, dẫn đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc
hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton. Hai cơ chế chống ung thư đều cho thấy tác dụng
dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể. Các gốc tự
do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN, gây ra sự tự
chết của tế bào ung thư [35].
1.1.4 Độc tính của DHA
-


Độc tính : LD50 của DHA dùng đường uống là 834,5 mg/kg đối với chuột thí

nghiệm [29].
- Độc tính trường diễn: cho chuột uống liên tục với liều 20 mg/kg và 60mg/kg
hàng ngày thấy chuột vẫn bình thường. Khi tăng liều đến 180 mg/kg (gấp 100 lần liều
điều trị ở người) mới thấy khối lượng chuột giảm sút, kém ăn. Các thử nghiệm về
bệnh lý, huyết học, máu ngoại vi đều bình thường [29].
- Độc tính với bào thai: DHA có độc tính với bào thai chuột ở giai đoạn đầu và
cuối của chuột mang thai. Kết quả nghiên cứu trên, không thể suy ra đối với người.
Tuy nhiên cũng nên thận trọng khi dùng DHA đối với phụ nữ có thai.

3


1.1.5. Định lượng DHA
Theo Dược điển Trung Quốc 2010, DHA nguyên liệu được định lượng bằng
phương pháp HPLC, sử dụng cột C18, pha động ACN: nước= 60:40, bước sóng phát
hiện 210 nm. Hòa tan 1 lượng DHA và Artemisinin chuẩn vào pha động sao cho thu
được 1 dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Tiêm 20 µl vào cột sắc ký C18. DHA thể hiện
2 pic, độ phân giải giữa pic Artemisinin và pic DHA không thấp hơn 2,0, số đĩa lý
thuyết không thấp hơn 6000 được tính với pic tham khảo của DHA. Trong khi đó đối
với viên nén chứa DHA, Dược điển Trung Quốc 2010 quy định định lượng theo
phương pháp đo UV, đo độ hấp thụ tại bước sóng 238 nm, với mẫu trắng là dung dịch
hỗn hợp natri hydroxid 2%: ethanol=4:1. Tính toán hàm lượng DHA bằng cách so
sánh dung dịch chuẩn cùng nồng độ.
Ngoài Dược điển Trung Quốc 2010 hướng dẫn định lượng DHA còn rất nhiều
các nghiên cứu của các tác giả định lượng DHA, có thể kể ra một số nghiên cứu sau:
Bảng 1.1. Một số các nghiên cứu định lượng DHA
Tên các


Đối tượng

Phương pháp

nghiên cứu

định lượng

định lượng

Điều kiện định lượng

Nghiên cứu

Nano DHA

Phương pháp

- Sử dụng cột C18 (4,6mm x

của Zhang và

sử dụng chất

sắc kí lỏng

150mm x 5µm)

cộng sự [40]


mang thân

hiệu năng

- Pha động bao gồm ACN:dung

lipid

cao

dịch amoni sulfat 0,2M:dung dịch
triethylamin 12% = 100:100:0,15
(v/v/v).
- Tốc độ dòng 1ml/phút
- Bước sóng phát hiện 213 nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C
- Thể tích tiêm mẫu là 50µl.

Nghiên cứu

DHA trong

của Attih EE

viên nén

Chuẩn độ iod - Dựa trên phản ứng của DHA với
kali iod (1:1), iod giải phóng được


và cộng sự [8]

4


hoặc trong

chuẩn độ bằng dung dịch natri

thuốc bột

thiosulfat với chỉ thị hồ tinh bột
- Phạm vi định lượng 5-70mg/ml
DHA

Nghiên cứu

Viên nén

Quang phổ

- Tạo phản ứng giữa dung dịch

của Babalola

DHA

UV sử dụng

methanol của DHA và p-


p-nitroanilin

nitroanilin trong môi trường acid

làm tác nhân

HCl 1M ở nhiệt độ cao và thời

tạo dẫn xuất

gian phản ứng ngắn, tỷ lệ giữa

và cộng sự [9]

DHA: p-nitroanilin là 2:1.
- Đo độ hấp thụ của sản phẩm tại
bước sóng 290 nm.
Zhu Kai và

DHA và

Phương pháp

- Cột C18 (250 mm x 4,6mm x

cộng sự [43]

piperaquin


sắc kí lỏng

5µm)

phosphat

hiệu năng

- Pha động gồm: ACN:methanol:

trong viên

cao

dung dịch amoni sulfat 0,2M =

nén

50:10:40 (v/v/v)
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện 210nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C.

1.1.6. Độ ổn định của DHA
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu nói về độ ổn định của DHA. Năm 2015, tác
giả Silvia Parapini và các cộng sự đã nghiên cứu về khả năng phân hủy của DHA
trong các môi trường pH khác nhau. Kết quả cho thấy tại nhiệt độ 37oC, DHA ổn định
trong khoảng pH từ 2,2 đến 7,0. pH càng acid hoặc càng kiềm thì DHA càng dễ bị
phân hủy. Tuy nhiên, trong huyết tương, DHA có độ ổn định cao hơn. [30]


5


1.2. Tổng quan về Paclitaxel

1.2.1. Tính chất lý, hóa của dược chất
Công thức cấu tạo.

Tên khoa học: 5b,20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-ene-2a,4,10b,13atetrayl 4,10-diacetate 2- benzoate 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3phenylpropa noate].
Công thức phân tử: C47H51NO14.
Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [10], [33].
Tính chất vật lý: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể.
Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và dễ tan
trong methylen clorid [10], [31].
Góc qay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực từ -49,00
đến -55,00 ở dạng khan [10], [33].
1.2.2. Dược động học
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh
mạch và giảm theo đồ thị có 2 pha. Tỷ lệ liên kết với protein là 89% (in vitro). Ở
giai đoạn ổn định, thể tích phân bố là 5 - 6 lít/kg thể trọng cho thấy thuốc phân bố
nhiều ở ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô. Thời gian bán
thải khoảng 6 - 13 giờ. Sau khi truyền tĩnh mạch, có khoảng 2 - 13% lượng thuốc
được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu. Trên động vật thí nghiệm, paclitaxel
được chuyển hóa tại gan. Ðộ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg [1].

6


1.2.3. Cơ chế tác dụng
Paclitaxel, hoạt chất có trong vỏ cây thông đỏ Taxux brevifolia, là một thuốc

chống ung thư. Paclitaxel làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành
các vi quản và làm ổn định các vi quản do ức chế quá trình giải trùng hợp. Sự ổn
định này ức chế sự tổ chức lại bình thường của mạng vi quản rất quan trọng ở gian
kỳ của quá trình phân bào giảm nhiễm, và cả với hoạt động của ty lạp thể. Ngoài
ra, paclitaxel gây nên hiện tượng tạo thành các cấu trúc bất thường trong các vi
quản trong quá trình phân bào [1].
1.2.4. Chỉ định
Ðiều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường
bằng các muối anthracyclin, và muối platinum đã thất bại hay bị chống chỉ định
[1].
Ðiều trị ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã
thất bại hoặc không thích hợp [1].
Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [38].
1.2.5. Liều dùng, cách dùng
Truyền tĩnh mạch với liều 175 mg/m2 trong 3 giờ. Có thể lặp lại sau một khoảng
thời gian ít nhất là 3 tuần. Chỉ dùng liều mới khi số lượng bạch cầu hạt trung tính
lớn hơn 1,5 x 109/lít (1.500/mm3) và số lượng tiểu cầu lớn hơn 100 x 109/lít
(100.000/mm3) [1].
Ở người bệnh có số lượng bạch cầu hạt bị giảm nặng (dưới 0,5 x 109/lít)
(500/mm3) trong quá trình điều trị dài hơn bằng paclitaxel thì nên giảm 20% liều
dùng.
1.2.6. Một số phương pháp định tính
1.2.2.1. Đo góc quay cực của paclitaxel
Hòa tan 0,25 g paclitaxel trong methanol và pha loãng thành 25,0 ml với cùng
dung môi. Góc quay cực phải nằm trong khoảng từ - 49,00 đến - 55,00 [10].
1.2.2.2. Phương pháp đo quang - phổ hồng ngoại IR

7



Tiến hành đo phổ hồng ngoại của paclitaxel rồi so sánh với phổ hồng ngoại của
paclitaxel chuẩn. Yêu cầu phổ hồng ngoại của chất thử và chất chuẩn phải tương
ứng với nhau [10], [33].
1.2.7. Một số phương pháp định lượng
1.2.3.1. Phương pháp đo quang UV - VIS:
Paclitaxel được định lượng bằng phương pháp UV-VIS trong môi trường đệm
phosphat pH 7,4 và tại bước sóng 230 nm.
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn là dung dịch có nồng độ paclitaxel chính
xác khoảng 10µg/ml trong dung dịch pha loãng gồm methanol và đệm phosphat
pH 7,4 với tỷ lệ thể tích là 30:70 [21].
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC.
Dung môi hòa tan: Hỗn hợp của methanol và acid acetic (200:1).
Pha động: Hỗn hợp của nước và acetonitril (11:9).
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch có nồng độ dược chất khoảng
1mg/ml trong dung môi hòa tan.
Điều kiện sắc ký:
+ Cột sắc ký: L 43 (cột 4,6 mm x 25 cm; kích thước hạt nhồi 5µm).
+ Detector: 227 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl [33].

1.3. Tổng quan về phương pháp PEG hóa ứng dụng trong bào chế thuốc
1.3.1. Polyethylen glycol
Polyethylen glycol (PEG) là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo

8


PEG là một polyme trơ, tan trong nước, không gây độc, không gây đáp ứng miễn
dịch khi vào cơ thể, được tạo ra bằng cách liên kết nhiều đơn vị ethylen oxid. Các

loại PEG hiện có khác nhau về hình thể (ở dạng thẳng hoặc phân nhánh) và có khối
lượng phân tử thường từ 500 – 20000 Da. PEG có khối lượng phân tử nhỏ thường ở
dạng lỏng trong khi PEG có khối lượng phân tử lớn thường ở dạng rắn .
PEG được ứng dụng nhiều trong y học và công nghệ sản xuất dược phẩm với
nhiều ứng dụng khác nhau. Trong đó có việc làm tăng độ tan và độ hòa tan của dược
chất. Ngoài ra, ứng dụng PEG hóa sẽ làm thay đổi các thông số dược động học của
thuốc, giúp cải thiện bề mặt các hệ đưa thuốc để tránh quá trình thực bào và tăng thời
gian lưu thuốc trong hệ tuần hoàn.
1.3.2. Phương pháp PEG hóa
Định nghĩa: PEG hóa (PEGyl hóa) là quá trình gắn kết cộng hóa trị hoặc không
cộng hóa trị của chuỗi polyme polyethylen glycol (PEG) với phân tử hoặc các hệ đưa
thuốc (thuốc, protein điều trị hoặc hệ vi cầu/vi nang).
Ưu điểm của PEG hóa [22],[39]:
-

Ưu điểm nổi bật của PEG hóa giúp hạn chế hiện tượng thực bào của hệ thống

miễn dịch, do đó kéo dài thời gian của hệ mang thuốc trong vòng tuần hoàn và cải
thiện được sự phân bố dược chất tới các đích tác dụng
-

PEG là phân tử thân nước, có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt và giúp tăng

cường độ ổn định của các hệ mang thuốc, giảm sự kết tụ của các hệ hỗn dịch chứa
tiểu phân nano.
-

Việc PEG hóa có thể làm tăng kích thước của hệ mang thuốc, tùy thuộc vào tỷ

trọng polyme sử dụng mà có thể hạn chế được việc thải trừ của thuốc, qua đó góp

phần tạo nên tác dụng kéo dài.
Nhược điểm của PEG hóa [22],[39]:
-

PEG là một polyme không phân hủy sinh học, do đó trong các hệ đưa thuốc

có thể cản trở quá trình giải phóng thuốc. Ngoài ra, việc tránh kháng các đại thực bào
bị ảnh hưởng rất nhiều bởi tỷ lệ PEG được gắn vào hệ đưa thuốc.
-

Việc tăng thời gian lưu của thuốc trong hệ tuần hoàn cũng đồng nghĩa với khả

năng làm tăng tác dụng không mong muốn của thuốc.
9


Với đặc điểm cấu tạo của PEG gồm có hai đầu là hai nhóm hydroxyl, các nhóm
nghiên cứu có thể tiến hành ứng dụng thay các nhóm này bằng các nhóm thế khác
nhau để tạo nên các chuỗi PEG có khả năng liên kết với polyme/dược chất, vừa có
khả năng tương tác với dung môi. Qua đó, hệ đưa thuốc trở nên ổn định hơn.
1.3.3. Một số phương pháp PEG hóa hệ tiểu phân nano
Nhằm thực hiện PEG hòa tiểu phân nano, loại phân tử PEG phù hợp sẽ được lựa
chọn, sau đó đưa lên bề mặt tiểu phân nano bằng các phương pháp sau:
- Dùng phương pháp vật lý thông thường để hấp phụ PEG lên bề mặt hệ đưa thuốc.
Đây là phương pháp cổ điển nhằm đưa PEG lên bề mặt tiểu phân nano. Nhằm tăng
độ ổn định cho hệ tiểu phân nano được PEG hóa đồng thời giúp quá trình PEG hóa
diễn ra thuận lợi hơn, một số nhóm chức của PEG đã được thay đổi sao cho phù hợp
như nhóm thiol, nhóm sulfurhydrin [20].
Với phương pháp này, quá trình PEG hóa hệ tiểu phân nano được thực hiện sau
khi hệ tiểu phân nano đã được tạo thành. Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano, sau

đó các hạt nano này sẽ được ngâm trong dung dịch PEG. Sau đó tiến hành tinh chế
và thu sản phẩm PEG hóa.
- Tổng hợp các đồng polyme PEG – chất mang. Đây là phương pháp mới hiện nay
nhằm giúp quá trình PEG hóa diễn ra dễ dàng hơn do một số hệ tiểu phân nano rất sơ
nước và khó hấp phụ PEG. Tiểu phân PEG tan tốt trong nước, rất dễ bị rửa trôi trong
quá trình tinh chế hệ tiểu phân nano. Do đó, việc gắn PEG với các chất mang giúp
giữ được PEG trên bề mặt hệ tiểu phân nano và thuận lợi hơn trong quá trình tinh chế
[20].
Ở hai đầu của PEG là hai nhóm hydroxyl, đây là hai nhóm hoạt động để có thể
tác động, từ đó có thể gắn thêm các chất mang khác, hoặc thay đổi nhóm chức này
với các nhóm chức khác nhằm hỗ trợ khả năng gắn dược chất lên PEG [20]. Với các
chất/chất mang có nhóm amin hoặc acid; có thể thực hiện một phản ứng với chất xúc
tác là các diimin. Sản phẩm của quá trình trên là các phân tử PEG gắn với dược
chất/chất mang bằng liên kết ester hoặc amid.
10


Trong trường hợp dược chất có các nhóm chức khác, hoặc khó gắn, ta có thể biến
đổi nhóm chức hoặc gắn thêm các chất trung gian lên PEG và qua đó phản ứng giữa
dược chất và PEG xảy ra dễ dàng với hiệu suất cao hơn. Với phương pháp thứ hai,
sau khi tổng hợp PEG gắn với chất mang thu được chất mang mới, sau đó tiến hành
sử dụng chất mang mới bào chế hệ tiểu phân nano thu được tiểu phân nano PEG hóa.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chất mang PEG hóa như: PEG-PLGA, PEG-40stearat,…
1.4. Tổng quan về một số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro và chỉ
số kết hợp giữa hai thuốc
1.4.1. Một số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro
Hiện nay, có rất nhiều yếu tố ảnh hướng đến độc tính tế bào gồm các tác nhân vật
lý và hóa học. Các tác nhân này có thể gây độc cho tế bào thông qua các cơ chế khác
nhau như phá hủy màng tế bào, ngăn chặn quá trình tổng hợp protein, ức chế quá
trình tổng hợp nucleotid hoặc thông qua các phản ứng enzyme gây độc tế bào. Việc

đánh giá độc tính tế bào in vitro được sử dụng rộng rãi trong việc sàng lọc thuốc hiện
nay. Các xét nghiệm này hay được sử dụng trong các nghiên cứu ung thư để đánh giá
cả độc tính hợp chất và ức chế tăng trưởng của tế bào khối u với các ưu điểm như
nhanh, rẻ tiền, có thể làm với lượng lớn mẫu và không cần sử dụng động vật. Việc
xác định độc tính tế bào dựa trên các chức năng khác nhau của tế bào như tính thấm
của màng tế bào, hoạt động của enzym, sự kết dính của tế bào, sản xuất ATP, sản
xuất đồng enzym và hoạt động hấp thu nucleotid. Tuy nhiên, phương pháp này cũng
có một số nhược điểm khi sử dụng để thay thế các thử nghiệm trên động vật.
Hiện nay để xác định độc tính tế bào có rất nhiều phương pháp chính đang được
chấp nhận sử dụng gồm:
- Phương pháp định lượng MTT
Nguyên tắc: Phương pháp sử dụng muối tetrazolium (MTT - (3-(4,5dimethylthiazol-2 - yl)- 2, 5 - diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong phép so màu,
qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào. Vòng tetrazolium
của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động. Dưới tác dụng của enzym

11


dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan
[23].
Ưu điểm: Phương pháp này dễ sử dụng, an toàn, có độ lặp lại cao và được sử
dụng rộng rãi để xác định cả xét nghiệm khả năng sống sót của tế bào [7].
Nhược điểm: MTT không hòa tan trong nước, và nó tạo thành các tinh thể hình
kim màu tím trong các tế bào. Do đó, trước khi đo độ hấp thụ, cần phải có một dung
môi hữu cơ như dimethyl sulfoxid (DMSO) hoặc isopropanol để hòa tan các tinh thể.
Ngoài ra, độc tính tế bào của MTT gây nên hiện tượng tế bào chết và nổi lên gây nên
sai số khi loại bỏ môi trường nuôi cấy [7].
Do đó, đối với phương pháp này, cần thực hiện các thí nghiệm kiểm soát bổ sung
để loại bỏ sai số kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả gây ra bởi nhiễu nền do các
tiểu phân MTT kết tủa [7].

- Phương pháp định lượng MTS
Nguyên tắc: Tương tự phương pháp MTT, phương pháp này cũng sử dụng muối
tetrazolium (MTS - (5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyl-thiazoly)-3-(4sulfophenyl) tetrazolium ) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự
sống sót và khả năng phát triển của tế bào. Xét nghiệm này dựa trên sự chuyển đổi
một loại muối tetrazolium thành formazan có màu nhờ hoạt động của ty thể của các
tế bào sống. Lượng formazan được sản xuất phụ thuộc vào số lượng tế bào sống sót
trong môi trường nuôi cấy và có thể được đo bằng máy đo quang phổ ở 492nm [7].
Ưu điểm: Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng xét nghiệm độc tính tế bào
trong ống nghiệm MTS dễ sử dụng, độ chính xác cao và các thể xác định độc tính tế
bào nhanh chóng, kết quả đáng tin cậy và phương pháp không tốn kém. Do đó, nó có
thể được sử dụng để đánh giá độc tính mà không cần sử dụng các dung môi hữu cơ
hay loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào [7].
Nhược điểm: Mức độ hấp thụ đo được ở 492nm bị ảnh hưởng bởi thời gian ủ ấm,
loại tế bào và số lượng tế bào sống sót. Tỷ lệ thuốc thử phát hiện MTS cho các tế bào
trong nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến mức độ hấp thụ đo được. Các nghiên cứu trước
đây cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa thời gian ủ và độ hấp thụ trong thời gian ủ

12


ngắn lên đến 5 giờ. Do đó, thời gian ủ thích hợp cho xét nghiệm này là 1 giờ 3 giờ
[7].
- Phương pháp định lượng Luciferase
Nguyên tắc: Adenosin triphosphat nucleotid (ATP) là chất cung cấp năng lượng
chính của tế bào, được sử dụng trong các hoạt động chuyển hóa của tế bào. Do đó,
bằng cách đo lượng ATP ta có thể xác định tình trạng sống của 1 tế bào. Bằng cách
cho phản ứng với luciferin và luciferase để tạo ra sự phát quang hóa học lượng tử cao.
Cường độ ánh sáng phát ra liên quan tuyến tính với nồng độ ATP. Từ đó có thể tính
toán được tỷ lệ sống sót của tế bào. Phương pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện
khả năng tồn tại của các tế bào khi số lượng tế bào thấp [23].

- Phương pháp định lượng Ethidium bromid hoặc propidium iodid.
Nguyên tắc: Ethidium bromid và propidium iodid là 2 loại thuốc nhuộm huỳnh
quang cation, được biết chỉ truyền qua màng tế bào không còn sống sót. Tiến hành
nhuộm tế bào ung thư với 2 loại thuốc trên. Các tế bào được ủ và số lượng các tế bào
không có khả năng sống sót được đánh giá bằng việc phát hiện huỳnh quang sau đó
(lần đo đầu tiên). Đo lần thứ 2 được thực hiện sau khi đóng băng các tế bào trong 24
giờ ở -20C. Sự khác biệt giữa 2 lần đo sẽ cho số lượng các tế bào sống sót. Ưu điểm
của phương pháp: Tiến hành đơn giản, nhanh chóng, chính xác [23].
1.4.2. Chỉ số kết hợp (Combination index – CI)
Hai hoặc nhiều thuốc khác nhau khi được sử dụng kết hợp có thể tạo ra các hiệu
ứng tăng cường tác dụng đáng kể, sự kết hợp này được gọi là tác dụng hiệp đồng.
Việc sử dụng kết hợp các thuốc có tác dụng hiệp đồng cho phép sử dụng liều thấp
hơn của các thành phần kết hợp, qua đó làm giảm tác dụng không mong muốn. Sự
kết hợp các thuốc có tác dụng hiệp đồng khá phổ biến trong điều trị ung thư, nhiễm
trùng, đau và nhiều bệnh và tình huống khác [14]. Hiệu quả của việc kết hợp thuốc
được đánh giá dựa trên chỉ số kết hợp (combination index – CI). Khi CI > 1, các thuốc
có tác dụng đối kháng. Khi CI < 1, các thuốc có tác dụng hiệp đồng [15]. Với hai
thuốc, CI được tính theo công thức[42]:

13


𝐶𝐼 =

𝐷1
𝐷2
+
(𝐷𝑥 )1 (𝐷𝑥 )2

Trong đó:

(Dx)1 là liều sử dụng của mình chất thứ nhất để đạt tác dụng trên x% mẫu
(Dx)2 là liều sử dụng của mình chất thứ hai để đạt tác dụng trên x% mẫu
D1 và D2 là liều sử dụng của từng chất sao cho hỗn hợp sau khi kết hợp ở liều này
có tác dụng ức chế x% mẫu.
Hiện nay, sau khi đánh giá độc tính tế bào in vitro của từng thuốc, dựa trên tác
dụng ức chế tế bào ung thư có thể tính toán chỉ số kết hợp dựa vào các phần mềm
như: CompuSyn.
1.5. Một số nghiên cứu liên quan
1.5.1. Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA
Năm 2018, tại Trường Đại học Dược Hà Nội, tác giả Trịnh Thị Hằng và Vũ Thị
Kim Phượng khảo sát, nghiên cứu về phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano chứa
đồng thời PTX và DHA. Nội dung nghiên cứu gồm: Khảo sát phương pháp định
lượng đồng thời PTX và DHA, tiền hành bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa đồng
thời PTX, DHA và đánh giá một số chỉ tiêu. Kết quả: Nhóm nghiên cứu đã khảo sát
được phương pháp định lượng đồng thời PTX-DHA bằng phương pháp HPLC sử
dụng cột C18 với điều kiện sắc kí như sau: ACN:Đệm phosphat pH 3,0 tỷ lệ 58:42,
tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 50 µl và bước sóng phát hiện 210 nm. Hệ
nano bào chế được có KTTP nhỏ dưới 160 nm và chỉ số PDI dưới 0,4. Tuy nhiên, các
hệ tiểu phân nano này có nhược điểm là sử dụng hệ chất mang lớn, do đó chỉ số LC
của hệ tiểu phân nano rất thấp dưới 3%. [2], [5].
Năm 2010, Zhang Xiaoyun và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ nano lipid của
DHA bằng phương pháp khuếch tán dung môi. Pha dầu gồm monostearat, Miglyol
812 và DHA được hòa tan trong 5 ml hỗn hợp dung môi ethanol và aceton (1/1, v/v)
trong bể điều nhiệt ở 55°C. Sau đó pha dầu được phân tán nhanh vào 20 ml pha nước
có chứa Tween 80 (1%, w/v) và Poloxamer 188 (1%, w/v) ở nhiệt độ phòng dưới điều
kiện khuấy từ 3000 vòng/phút trong 30 phút cho tới khi hỗn dịch nano lipid được tạo
thành. Loại dung môi hữu cơ bằng cách sấy chân không ở nhiệt độ phòng trong 24
14