ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Phƣơng Hà

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG
DƢỢC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG
ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Phƣơng Hà
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG
DƢỢC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG
ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO

Chuyên ngàng: Hóa Phân tích
Mã số: 60 44 29
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. HOÀNG THỌ TÍN

Hà Nội - Năm 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
Chƣơng 1

1
TỔNG QUAN

2

1.1. Giới thiệu chung

2

1.1.1. Giới thiệu về kháng sinh

2

1.1.2. Giới thiệu về cloramphenicol

3

1.1.2.1. Giới thiệu chung

3

1.1.2.2. Tính chất hóa lý

4


1.1.2.3. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng

6

1.1.2.4. Sản xuất

10

1.2. Giới thiệu về phƣơng pháp von-ampe

10

1.2.1. Giới thiệu chung

10

1.2.2. Các cực làm việc thƣờng dùng trong phƣơng pháp von-ampe

11

1.2.3. Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe

13

1.2.3.1. Kỹ thuật von-ampe xung vi phân

13

1.2.3.2. Kỹ thuật von-ampe sóng vuông


15

1.3. Một số phƣơng pháp xác định cloramphenicol
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí

16
16

1.3.1.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng

16

1.3.1.2. Phƣơng pháp sắc kí khí

18

1.3.2. Phƣơng pháp quang

18

1.3.3. Phƣơng pháp điện hóa

19

1


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

1.3.3.1 Cực phổ xung vi phân


19

1.3.3.2. Cực phổ sóng vuông

20

1.3.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng đầu dò vi sợi cacbon

20

1.3.4. Một số phƣơng pháp khác
Chƣơng 2:

21

NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1. Nội dung nghiên cứu

22

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

23

2.2.1. Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp von-ampe xung vi phân


23

2.2.2. Ghi đƣờng von-ampe

23

2.2.3. Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích

23

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

25

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ

25

2.3.2. Hóa chất

26

Chƣơng 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát đáp ứng điện hóa của cloramphenicol trên HMDE

28
28


3.2. Khảo sát tính chất điện hóa của cloramphenicol trong một số
30

nền
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của pH và nồng độ dung dịch đệm

33

3.3.1. Ảnh hƣởng của pH

33

3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch đệm

34

3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ quét thế

35

3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của oxi

38

3.6. Khảo sát ảnh hƣởng của các chất hữu cơ

40

2



Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

3.6.1. Ảnh hƣởng của axit oxalic

40

3.6.2. Ảnh hƣởng của axit citric

41

2.6.3. Ảnh hƣởng của glucozơ

42

3.7. Ảnh hƣởng của các ion vô cơ

43

3.7.1. Ảnh hƣởng của ion Na+ (K+)

43

3.7.2. Ảnh hƣởng của ion Ca2+

44

3.7.3. Ảnh hƣởng của ion Fe3+


45

3.8. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn

45

3.9. Sai số phép đo, độ lặp lại phép đo, độ đúng

48

3.10. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng

50

3.11. Ứng dụng xác định cloramphenicol trong mẫu thực tế

51

3.11.1. Kỹ thuật xử lý mẫu thực tế

51

3.11.2. Phƣơng pháp xử lý kết quả

51

3.11.3. Xác định cloramphenicol trong mẫu thực tế

51


3.11.3.1. Mẫu thuốc nhỏ mắt

51

3.11.3.2. Mẫu thuốc viên 250mg

53

3.11.3.3. Mẫu thuốc tiêm

54

2.12. So sánh kết quả đối chứng

55

KẾT LUẬN

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

58

„

3


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:

Cấu trúc hóa học của cloramphenicol

Hình 1.2:

(a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đƣờng von-ampe

3
14

trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân
Hình 1.3:

(a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đƣờng von-ampe

16

trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông
Hình 2.1:

Thiết bị phân tích điện hóa 757VA Metrohm

26

Hình 3.1:


Đƣờng quét von-ampe vòng của cloramphenicol nồng độ

29

2,5ppm trong nền axetat 0,1M pH 5,5
Hình 3.2:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol nồng độ 2,5ppm

31

trong các nền khác nhau
Hình 3.3:

Đƣờng quét xung vi phân (a) và đồ thị (b) biểu diễn sự ảnh

34

hƣởng của pH đến giá trị chiều cao pic của cloramphenicol nền
đệm axetat
Hình 3.4:

Đƣờng quét von-ampe vòng của cloramphenicol nồng độ

37

2,5ppm trong nền axetat tại các tốc độ quét khác nhau
Hình 3.5:

Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa chiều cao pic


37

cloramphenicol và tốc độ quét
Hình 3.6:

Đƣờng quét xung vi phân của (a) cloramphenicol, oxi và hỗn

38

hợp của chúng và (b) ảnh hƣởng của thời gian xục khí
Hỉnh 3.7:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

40

của axit oxalic tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Hình 3.8:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt
của axit citric tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

4

40


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20


Hình 3.9:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

42

của glucozơ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Hình 3.10:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

43

của ion Na+ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Hình 3.11:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

44

của ion Ca2+ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
HÌnh 3.12:

Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

45

của ion Fe3+ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Hình 3.13:


Đƣờng quét xung vi phân của cloramphenicol tại 11 mức nồng

46

độ khác nhau
Hình 3.14:

Đồ thị xây dựng đƣờng chuẩn tại 11 mức nồng độ

47

Hình 3.15:

Đƣờng quét xung vi phân và đồ thì đƣờng thêm chuẩn của mẫu

52

thuốc nhỏ mắt
HÌnh 3.16:

Đƣờng quét xung vi phân và đồ thì đƣờng thêm chuẩn của mẫu

53

thuốc viên nén
Hình 3.17:

Đƣờng quét xung vi phân và đồ thì đƣờng thêm chuẩn của mẫu
thuốc tiêm


5

55


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1:

Các tính chất vật lý và hóa học của cloramphenicol

Bảng 3.1:

Giá trị Ep và Ip của cloramphenicol 2,5ppm trong một số

5
31

nền khác nhau
Bảng 3.2:

Ảnh hƣởng của pH đến chiều cao pic cloramphenicol trong

33

nền đệm axetat
Bảng 3.3:


Giá trị Ip của cloramphenicol trong các nồng độ nền đệm

35

axetat pH 5,5 khác nhau
Bảng 3.4:

Giá trị Ipa và Ipc thay đổi theo tốc độ quét

36

Bảng 3.5:

Ảnh hƣởng của thời gian xục khí N2

39

Bảng 3.6:

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của axit oxalic

40

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.7

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của axit citric

41


tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.8

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của glucozơ

42

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.9:

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của ion Na+

43

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.10

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của ion Ca2+

44

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.11:

Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của ion Fe3+

45

tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau
Bảng 3.12:


Giá trị Ip của cloramphenicol tại 11 mức nồng độ

6

45


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Bảng 3.13:

Giá trị b‟ trong kiểm tra các hệ số của phƣơng trình hồi quy

47

Bảng 3.14:

Các giá trị liên quan đến hệ số b‟

47

Bảng 3.15:

Các giá trị dùng để khảo sát độ đúng của hệ số a

47

Bảng 3.16:


Số liệu đánh giá sai số đƣờng chuẩn

48

Bảng 3.17:

Các số liệu thống kê đánh giá độ đúng của phƣơng pháp

49

Bảng 3.18:

Các giá trị thống kê về độ chính xác của phƣơng pháp

50

Bảng 3.19:

Giá trị Ip của 10 mẫu cloramphenicol 1,5ppm

50

Bảng 3.20:

Số liệu thống kê về giá trị Ip của 10 mẫu cloramphenicol

50

1,5ppm
Bảng 3.21:


Giá trị Ip của cloramphenicol trong mẫu thuốc nhỏ mắt và

52

các giá trị thêm chuẩn
Bảng 3.22:

Giá trị hàm lƣợng cloramphenicol trong mẫu thuốc nhỏ mắt

52

Bảng 3.23:

Giá trị Ip của cloramphenicol trong mẫu thuốc viên nén và

53

các giá trị thêm chuẩn
Bảng 3.24:

Giá trị hàm lƣợng cloramphenicol trong mẫu thuốc viên nén

54

Bảng 3.25

Giá trị Ip của cloramphenicol trong mẫu thuốc tiêm và các

54


giá trị thêm chuẩn
Bảng 3.26:

Giá trị hàm lƣợng cloramphenicol trong mẫu thuốc tiêm

55

Bảng 3.27:

Tổng hợp so sánh kết quả phân tích mẫu

56

7


MỞ ĐẦU
Ngày nay, cuộc sống hiện đại đòi hỏi con ngƣời phải lao động ở cƣờng độ
cao. Thêm vào đó, môi trƣờng sống ô nhiễm là một trong những nguyên nhân khiến
tỉ lệ mắc các bệnh do nấm và khuẩn ở ngƣời ngày càng tăng. Việc nghiên cứu thuốc
chữa trị các loại bệnh này rất đƣợc quan tâm chú ý. Kháng sinh là chất có khả năng
ức chế hoặc tiêu diệt một số loài nấm, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và sinh vật. Vì
vậy các loại thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và nâng cao
sức khỏe của sinh vật nói chung và con ngƣời nói riêng. Hoạt động kiểm soát hàm
lƣợng thuốc kháng sinh đƣa vào cơ thể sao cho phù hợp với các mức độ nhiễm
khuẩn đóng vai trò quyết định trong pháp đồ điều trị bệnh. Do đó, việc xác định
đƣợc chính xác hàm lƣợng thuốc là điều cần thiết.
Hiện nay, có rất nhiều phƣơng pháp đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng kháng
sinh. Trong số đó, phƣơng pháp cực phổ đƣợc đánh giá là một trong những phƣơng

pháp có rất nhiều thuận lợi, đặc biệt là đối với các chất kháng sinh có tính điện hoạt
nhƣ cloramphenicol. Việc nghiên cứu xác định hàm lƣợng kháng sinh
cloramphenicol đã đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng nhƣ ở trong nƣớc. Tuy
nhiên các phƣơng pháp chủ yếu đƣợc nghiên cứu là các phƣơng pháp sắc ký và các
phƣơng pháp quang. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng
phƣơng pháp cực phổ với kỹ thuật đo xung vi phân để xác định hàm lƣợng kháng
sinh cloramphenicol trong một số loại dƣợc phẩm khác nhau, ở dạng dung dịch
cũng nhƣ ở dạng bột.
Sóng cực phổ của cloramphenicol là sóng cực phố anot, thế xuất hiện pic
nằm xung quanh vị trí 0V, do đó ít bị ảnh hƣởng bởi các hóa chất khác. Việc sử
dụng phƣơng pháp cực phổ một lần nữa khẳng định tính ƣu việt của các phƣơng
pháp phân tích điện hóa, cho phép xác định nhanh hàm lƣợng các chất, việc xử lý
mẫu trƣớc khi tiến hành đo đơn giản và tránh làm mất chất trong quá trình phân
tích.

1


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu chung

1.1.1 Giới thiệu về kháng sinh
Kháng sinh là chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một số loài nấm, vi
khuẩn gây bệnh cho ngƣời và sinh vật.
Thuốc kháng sinh thƣờng đƣợc chiết suất từ môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật
(nấm, vi khuẩn). Ngày nay với công nghệ phát triển, thuốc kháng sinh còn đƣợc

tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học. [8]
 Phân loại:
Hiện có khoảng hơn 12000 chủng loại kháng sinh khác nhau [8], chúng đƣợc chia
thành 10 nhóm chính [29]
- Nhóm phenicol: cloramphenicol, Thiaphenicol, Florphenicol, Florfenicol amin…
- Nhóm sulfonamide: Sulfadimethoxine, Sulfamethoxipyridine, Sulfamoxole,
Sulfisoxazole, Sulfixomidine, Sulfamethazine, Sulfamethoxazole…
-

Nhóm

β-lactam:

Peneciline,

Amoxilline,

Cloxacilline,

Penicilline

G,

Cephalosporin, Cètazidime…
- Nhóm quinolone: Nalidixic acid, Danofloxacin, oxonilic acid, Ciprofloxacin,
Norfloxacine…N
- Nhóm Tetracyline: Tetracyline, Oxy Tetracyline, Clortetracyline…
- Nhóm amino Glycoside: Gentamicin, Gentamicin C, Spectinomycin, Hygromycin
B, Treptomicin, Dihydrotreptomicin…
- Nhóm ionorphore polyether: Semduramicin, Monensin, Salinomycine, Narasine…

- Nhóm Macrolide: Erythromycine A, Cladonose, Spiramicin, Neospiramycin,
Tylosine…
- Nhóm Nitrofuran: Furazolidone, Nitrofurazone, Furaltadone,…

2


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

- Nhóm Miscellaneous: N-acylamico dilactone, 4-butyrolactiones, Antimycin A…
1.1.2. Giới thiệu về cloramphenicol
1.1.2.1. Giới thiệu chung [1,2,11,12,13]
Cloramphenicol là kháng sinh thuộc nhóm phenicol, ban đầu đƣợc phân lập
từ Streptomyces venezuelae vào năm 1947, nay đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp
tổng hợp. Cloramphenicol thƣờng có tác dụng kìm khuẩn, nhƣng có thể diệt khuẩn
ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao. Tên quốc tế của
cloramphenicol là
2,2-dichloro-N-[1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide.
Cloramphenicol có công thức hóa học và cấu trúc nhƣ sau

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cloramphenicol [12]
Cloramphenicol đƣợc tìm thấy vào năm 1948 là chống lại bệnh sốt phát ban
có hiệu quả và trở thành kháng sinh đầu tiên trải qua quy mô sản xuất lớn. Đến năm
1950, cộng đồng y khoa đã nhận thức đƣợc rằng thuốc có thể gây ra thiếu máu bất
sản nghiêm trọng và có khả năng gây tử vong, và nó nhanh chóng bị ghét bỏ.
Cloramphenicol hiện đang đƣợc sử dụng tại Hoa Kỳ chỉ chỉ để chống lại những
nhiễm trùng nghiêm trọng mà các kháng sinh khác không có hiệu quả hoặc bị chống
chỉ định. Cloramphenicol đƣợc liệt kê trong Báo cáo thường niên lần thứ nhất về
chất gây ung thư vào năm 1980 nhƣ là một chất gây ung thƣ cho con ngƣời (NTP
1980). Danh sách này dựa trên báo cáo nghiên cứu trƣờng hợp thiếu máu bất sản ở

ngƣời do sử dụng cloramphenicol kéo theo sự phát triển của bệnh bạch cầu.
Cloramphenicol đã đƣợc sửa lại kể từ Báo cáo thường niên lần thứ hai về chất gây

3


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

ung thư vào năm 1981 dựa trên một đánh giá lại của Cơ quan Nghiên cứu Ung thƣ
Quốc tế (IARC) trên thuốc này. IARC đã kết luận rằng các dữ liệu gây ung thƣ trên
của cloramphenicol ở ngƣời là không đủ sức mạnh để làm chứng cứ và không có dữ
liệu trên thực nghiệm động vật (IARC 1976). IARC đã xem xét cloramphenicol một
lần nữa vào năm 1987 và vào năm 1990 và kết luận rằng cũng có những bằng chứng
nhất định để kết luận chất này gây ung thƣ ở động vật thực nghiệm nhƣng khả năng
ở ngƣời là rất hạn chế. Trong tổng thể đánh giá, IARC lƣu ý rằng cloramphenicol
gây ra bệnh thiếu máu bất sản và điều này là điều kiện liên quan đến sự xuất hiện
của bệnh bạch cầu. Đánh giá tổng thể của IARC, cloramphenicol là chất có thể gây
ung thƣ cho con ngƣời thuộc Nhóm 2A (1987 IARC, 1990). [13]
1.1.2.2. Tính chất hóa lý
Cloramphenicol tồn tại nhƣ một tinh thể hình kim hoặc tấm kéo dài, nhìn mắt
thƣờng ở dạng bột mịn màu trắng xám, trắng hoặc vàng trắng, với nhiệt độ nóng
chảy vào khoảng 150,5oC đến 151.5oC. Nó thăng hoa trong chân không cao và nhạy
cảm với ánh sáng. Các nhóm nitro là dễ dàng khử thành các nhóm amin. Tính chất
điện hóa của cloramphenicol đƣợc thể hiện một cách rõ ràng ở vị trí cấu trúc này:

→
Trong 4 chất đồng phân lập thể, chỉ có dạng αR, βR (hay còn gọi là dạng D)
là có hoạt tính (IARC 1990). Các thuộc tính vật lý và hóa học của cloramphenicol
đƣợc liệt kê trong Bảng 1.1.[13]


4


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Bảng 1.1: Các tính chất vật lý và hóa học của cloramphenicol

Tính chất
Khối lƣợng phân
tử
Màu sắc
Vị
Trạng thái vật lý
Nhiệt độ nóng
chảy

Thông tin

Tài liệu tham khảo
Budavari et al. 1996, Chemfinder

323,1322 g/mol

2000

Trắng xám hoặc trắng

Budavari et al. 1996, CRC 1998,

vàng


Chemfinder 2000

Đắng

HSDB 1995

Tinh thể hình kim hoặc

Budavari et al. 1996, Chemfinder

tấm kéo dài, bột tinh thể

2000

150,5oC - 151.5oC

Budavari et al. 1996, HSDB 1995

Trung tính đối với giấy

pH

quỳ

HSDB 1995

1,73.10-12 mmHg

HSDB 1995


1,6 – 4,6 giờ

HSDB 1995

Nƣớc 25oC

Tan ít, 2,5 mg/mL

Chemfinder 2000, HSDB 1995

Propylen

150,8 mg/mL

HSDB 1995

5%

HSDB 1995

50% acetamit

Tan

HSDB 1995

Clorofom

Tan tốt


HSDB 1995

Methanol

Tan tốt

HSDB 1995

Áp suất bay hơi
Thời gian bán hủy
trong cơ thể
ngƣời
Tính tan

glycol

5


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Etanol

Tan tốt

HSDB 1995

Butanol


Tan tốt

HSDB 1995

Etyl acetat

Tan tốt

HSDB 1995

Axeton

Tan

HSDB 1995

Ete

Không tan

HSDB 1995

Benzen

Không tan

HSDB 1995

Ete dầu hỏa


Không tan

HSDB 1995

Dầu thực vật
1.1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng[1,2,11]
Cloramphenicol thƣờng có tác dụng kìm khuẩn, nhƣng có thể diệt khuẩn ở
nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao.
Vì cloramphenicol cũng là một loại kháng sinh và cơ chế tác dụng của nó
cũng không nawmg ngoài những quy luật chung của các kháng sinh khác nên trƣớc
hết chúng ta cần tìm hiểu cơ chế tác động chung của kháng sinh, cụ thể nhƣ sau:
• Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn. Các nhóm
kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình
tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp
suất thẩm thấu.
• Ức chế chức năng của màng tế bào. Các nhóm kháng sinh gồm có : colistin,
polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm
cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.
• Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.
- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.

6


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm

ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
• Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao
mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)
- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic.
Đối với Cloramphenicol, cơ chế kháng khuẩn đƣợc cụ thể hóa qua việc ức
chế sinh tổng hợp protein ở những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu thể
50S của ribosom. Thuốc có cùng vị trí tác dụng với erythromycin, clindamycin,
lincomycin, oleandomycin và troleandomycin.
Cloramphenicol cũng ức chế tổng hợp protein ở những tế bào tăng sinh
nhanh của động vật có vú. Cloramphenicol có thể gây ức chế tủy xƣơng và có thể
không hồi phục đƣợc. Cloramphenicol có hoạt tính ức chế miễn dịch nếu cho dùng
toàn thân trƣớc khi kháng nguyên kích thích cơ thể. Tuy vậy, đáp ứng kháng thể có
thể không bị ảnh hƣởng đáng kể khi dùng cloramphenicol sau kháng nguyên.
Nhiều vi khuẩn có sự kháng thuốc cao với cloramphenicol ở Việt Nam.
thuốc này gần nhƣ không có tác dụng đối với Escherichia coli, Shigella flexneri,
Enterobacter spp., Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Streptococcus

7


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

pneumoniae và ít có tác dụng đối với Streptococcus pyogenes. Cloramphenicol

không có tác dụng đối với nấm.
Nói chung, cloramphenicol ức chế in vitro những vi khuẩn nhạy cảm ở nồng
độ 0,1 - 20 microgam/ml.
Kháng thuốc
Tỷ lệ kháng thuốc đối với cloramphenicol, thử nghiệm in vitro ở Việt Nam
trong năm 1998: Shigella flexneri (85%), Escherichia coli (83%), Enterobacter spp.
(80%), Staphylococcus aureus (64%), Salmonella typhi (81%), Streptococcus
pneumoniae (42%), Streptococcus pyogenes (36%),Haemophilus influenzae (28%).
Thử nghiệm in vitro cho thấy sự kháng thuốc đối với cloramphenicol tăng dần từng
bƣớc. Sự kháng thuốc này là do sử dụng quá mức và đƣợc lan truyền qua plasmid.
Sự kháng thuốc đối với một số thuốc kháng khuẩn khác, nhƣ aminoglycosid,
sulfonamid, tetracyclin, cũng có thể đƣợc lan truyền trên cùng plasmid.
Dƣợc động học của Cloramphenicol đƣợc hấp thu nhanh qua đƣờng tiêu hóa.
Cloramphenicol palmitat thủy phân trong đƣờng tiêu hóa và đƣợc hấp thu dƣới dạng
cloramphenicol tự do. Ở ngƣời lớn khỏe mạnh, sau khi uống liều 1 g
cloramphenicol, nồng độ đỉnh cloramphenicol trong huyết tƣơng trung bình đạt
khoảng 11 microgam/ml trong vòng 1 - 3 giờ. Ở ngƣời lớn khỏe mạnh uống liều 1 g
cloramphenicol bazơ, cứ 6 giờ một lần, tổng cộng 8 liều, nồng độ đỉnh trong huyết
tƣơng trung bình đạt khoảng 18 microgam/ml sau liều thứ 5 và trung bình đạt 8 - 14
microgam /ml trong 48 giờ.
Sau khi tiêm tĩnh mạch cloramphenicol natri sucinat, có sự khác nhau đáng
kể giữa các cá thể về nồng độ cloramphenicol trong huyết tƣơng, tùy theo độ thanh
thải của thận. Khi tiêm tĩnh mạch liều 1 g cloramphenicol natri sucinat cho ngƣời
lớn khoẻ mạnh, nồng độ cloramphenicol trong huyết tƣơng xê dịch trong khoảng
4,9 - 12 microgam/ml sau 1 giờ, và 0 - 5,9 microgam/ml sau 4 giờ.
Sau khi dùng tại chỗ ở mắt, cloramphenicol đƣợc hấp thu vào thủy dịch.
Những nghiên cứu ở ngƣời bệnh đục thể thủy tinh cho thấy mức độ hấp thu thay đổi

8



Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

theo dạng thuốc và số lần dùng thuốc. Nồng độ thuốc trong thủy dịch cao nhất khi
dùng thuốc mỡ tra mắt cloramphenicol nhiều lần trong ngày.
Cloramphenicol phân bố rộng khắp trong phần lớn mô cơ thể và dịch, kể cả
nƣớc bọt, dịch cổ trƣớng, dịch màng phổi, hoạt dịch, thủy dịch và dịch kính. Nồng
độ thuốc cao nhất trong gan và thận. Nồng độ trong dịch não - tủy bằng 21 - 50%
nồng độ trong huyết tƣơng ở ngƣời bệnh không bị viêm màng não và bằng 45 - 89%
ở ngƣời bệnh bị viêm màng não. Cloramphenicol gắn kết khoảng 60% với protein
huyết tƣơng.
Nửa đời huyết tƣơng của cloramphenicol ở ngƣời lớn có chức năng gan và
thận bình thƣờng là 1,5 - 4,1 giờ. Vì trẻ đẻ non và trẻ sơ sinh có cơ chế liên hợp
glucuronid và thải trừ thận chƣa trƣởng thành, nên những liều cloramphenicol
thƣờng dùng thích hợp với trẻ lớn lại có thể gây nồng độ thuốc trong huyết tƣơng
quá cao và kéo dài ở trẻ sơ sinh. Nửa đời huyết tƣơng là 24 giờ hoặc dài hơn ở trẻ
nhỏ 1 - 2 ngày tuổi, và khoảng 10 giờ ở trẻ nhỏ 10 - 16 ngày tuổi. Nửa đời huyết
tƣơng của cloramphenicol kéo dài ở ngƣời bệnh có chức năng gan suy giảm. Ở
ngƣời bệnh có chức năng thận suy giảm, nửa đời huyết tƣơng của cloramphenicol
kéo dài không đáng kể.
Cloramphenicol bị khử hoạt chủ yếu ở gan do glucuronyl transferase. Ở
ngƣời lớn có chức năng gan và thận bình thƣờng, khoảng 68 - 99% một liều uống
cloramphenicol thải trừ trong nƣớc tiểu trong 3 ngày; 5 - 15% liều này thải trừ dƣới
dạng không đổi trong nƣớc tiểu qua lọc cầu thận và phần còn lại thải trừ qua ống
thận, dƣới dạng những chất chuyển hóa không hoạt tính. ở ngƣời lớn có chức năng
thận và gan bình thƣờng, sau khi tiêm tĩnh mạch cloramphenicol natri sucinat,
khoảng 30% liều bài tiết dƣới dạng không đổi trong nƣớc tiểu; tuy vậy, tỷ lệ liều bài
tiết dƣới dạng không đổi trong nƣớc tiểu biến thiên đáng kể, trong phạm vi 6 - 80%
ở trẻ sơ sinh và trẻ em. Một lƣợng nhỏ cloramphenicol dƣới dạng không đổi bài tiết
trong mật và phân sau khi uống thuốc.


9


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Thẩm tách phúc mạc không ảnh hƣởng đến nồng độ cloramphenicol trong
huyết tƣơng và thẩm tách thận nhân tạo chỉ loại trừ một lƣợng thuốc nhỏ.
1.1.2.4 Sản xuất [11]
Cloramphenicol đƣợc sản xuất một cách tự nhiên từ Streptomyces
venezuelae. Hiện nay nó đƣợc sản xuất theo phƣơng thức tổng hợp hóa học. Quá
trình lên men đã đƣợc mô tả là không cần phân tách lập thể (IARC 1990). Năm
1948, cloramphenicol đƣợc sản xuất một cách thƣơng mại hóa lần đầu tiên tại Hoa
Kỳ. Mỹ sản xuất của cloramphenicol đƣợc ƣớc tính là lớn hơn 908 kg (2.002 lb)
vào năm 1977 và 1979. Mỹ nhập khẩu cho những năm này đƣợc ƣớc tính khoảng
8.150 kg (£ 17.970) và 8.200 kg (18.080 £), (HSDB 1995). Hiện tại mức độ sản
xuất cho cả hai loại dùng trong thú y và con ngƣời không đƣợc công bố trong các tài
liệu.
1.2.

Giới thiệu về phƣơng pháp von-ampe [3,4,5,6,7,10]

1.2.1. Giới thiệu chung
Phƣơng pháp von–ampe là nhóm các phƣơng pháp phân tích dựa vào việc
nghiên cứu đƣờng von–ampe hay còn gọi là đƣờng phân cực, là đƣờng biểu diễn sự
phụ thuộc của cƣờng độ dòng điện vào điện thế khi tiến hành điện phân dung dịch
chất phân tích.
Quá trình điện phân đƣợc thực hiện trong một bình điện phân đặc biệt gồm 3
điện cực:
+ Cực làm việc: thƣờng là cực giọt thuỷ ngân tĩnh, cực rắn đĩa hay cực màng

(màng thủy ngân; màng vàng; màng bitmut;...)
+ Cực so sánh: là cực có thế không đổi thƣờng là cực calomen hoặc cực bạc
clorua có bề mặt lớn
+ Cực phù trợ glassy carbon hoặc Pt

10


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Nắp bình điện phân còn có một lỗ để dẫn một luồng khí trơ vào với mục
đích để đuổi khí oxy hoà tan trong dung dịch ra khỏi bình điện phân. Để vẽ đƣợc
đƣờng phân cực ngƣời ta liên tục theo dõi và đo cƣờng độ dòng điện chạy qua mạch
khi tăng dần điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân, sau đó vẽ đồ thị biễu diễn
sự phụ thuộc của I–E, trong đó I là cƣờng độ dòng điện chạy qua mạch, E là điện
thế đặt vào hai cực của bình điện phân. Ta sẽ đƣợc một đƣờng cong đó chính là
đƣờng cong von-ampe hoà tan.
1.2.2. Các cực làm việc thường dùng trong phương pháp von-ampe
a. Cực giọt thủy ngân treo (HMDE)
Cực HMDE là loại cực đƣợc dùng phổ biến nhất trong phƣơng pháp vonampe. Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thƣớc nhỏ đƣợc treo trên đầu cuối của
một mao quản có đƣờng kính trong 0,15 † 0,50 mm. Sau mỗi phép đo, giọt thủy
ngân bị cƣỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó đƣợc thay thế bằng một giọt mới
tƣơng tự. Một kiểu cực giống với cực HMDE cũng thƣờng đƣợc dùng là cực giọt
thủy ngân tĩnh (SMDE) do hãng PAR (USA) chế tạo. Cực HMDE và SMDE cho
kết quả đo có độ chính xác và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V
trong môi trƣờng kiềm và trung tính, -1,2 V trong môi trƣờng axit, nên các cực này
có khoảng điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta nghiên cứu đƣợc các chất trong
một khoảng thế rộng. Chúng đƣợc dùng rộng rãi để xác định hàng chục kim loại và
á kim nhƣ Cd, Cu, Pb, Zn, In, Bi, Sb, Se, các halogenua,… và nhiều hợp chất hữu
cơ theo phƣơng pháp ASV hoặc CSV. Điểm hạn chế của cực HMDE và SMDE là

khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các giọt thủy ngân có kích thƣớc lặp lại một cách hoàn
hảo. Ngoài ra, chúng không cho phép xác định các kim loại có thế hòa tan dƣơng
hơn nhƣ Au, Ag,…
b. Cực màng thủy ngân (MFE)
Cực MFE là một màng mỏng thủy ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ (thƣờng
là cực rắn đĩa quay) có đƣờng kính 2 † 4 mm và làm bằng các loại vật liệu trơ nhƣ
than thủy tinh (glassy carbon), graphit, than nhão (paste carbon),... Cực MFE đƣợc

11


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch HgII 10-4 - 10-5 M trên cực rắn
đĩa ở thế thích hợp (khoảng -0,8 † -1,3 V so với cực Ag/AgCl/KClbh hoặc
Hg/Hg2Cl2/KClbh) và trong thời gian thích hợp (thƣờng khoảng 3 - 5 phút). Bằng
cách nhƣ vậy, cực MFE có thể đƣợc hình thành theo 2 kiểu: in situ và ex situ.
- Theo kiểu in situ, dung dịch HgII đƣợc thêm vào dung dịch phân tích và
nhƣ vậy, khi điện phân làm giàu, cực MFE đƣợc hình thành đồng thời với quá trình
tập trung chất phân tích lên cực MFE.
- Theo kiểu ex situ, cực MFE đƣợc tạo ra trƣớc bằng cách điện phân dung
dịch HgII nhƣ trên, sau đó tia rửa cực cẩn thận bằng nƣớc sạch, rồi nhúng cực vào
dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu. Cực MFE dạng ex situ thƣờng có bề
dày màng thủy ngân lớn hơn so với dạng in situ.
Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là vấn đề hấp dẫn các nhà
nghiên cứu. Khi khảo sát các cực MFE đƣợc tạo ra theo kiểu in situ và ex situ, H.
Ping Wu cho rằng: cực MFE nhƣ một màng mỏng gồm các giọt thủy ngân nhỏ li ti
và liên tục trên cực rắn đĩa , kích thƣớc các giọt thuỷ ngân đó phụ thuộc vào lƣợng
thủy ngân trên bề mặt cực rắn đĩa và thƣờng khoảng từ < 0,1 † 1 μg.
Ngoài những ƣu điểm giống nhƣ đối với cực HMDE, cực MFE còn có một

số ƣu điểm khác: do nồng độ của kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao hơn,
tốc độ khuếch tán của kim loại ra khỏi cực MFE nhanh hơn và có đặc điểm của quá
trình điện phân hóa lớp mỏng. Mặt khác, có thể sử dụng cực MFE quay, nên điều
kiện đối lƣu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực MFE có độ nhạy và
độ phân giải cao hơn so với cực HMDE, đặc biệt là khi phân tích các kim loại tan
đƣợc trong thủy ngân tạo hỗn hống. Tuy vậy, cực MFE cũng có nhƣợc điểm là các
hợp chất “gian kim loại” (intetmetallic) dễ dàng hình thành trên nó khi phân tích các
kim loại theo phƣơng pháp ASV và do đó, có thể làm biến dạng tín hiệu von-ampe
hào tan và gây sai số, trong khi đó cực HMDE và SMDE lại khắc phục đƣợc điều
này. Mặt khác, độ hồi phục của các phép đo khi đi từ cực MFE này đến cực MFE
khác thƣờng kém hơn so với cực HMDE và SMDE.

12


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

c. Cực đĩa rắn
Cả cực HMDE và MFE đều không cho phép xác định các kim loại có thế
oxy hóa–khử tƣơng đối dƣơng nhƣ Ag, Au,… hoặc các kim loại không tan trong
thủy ngân nhƣ As, Mn,... Nhƣng các kim loại đó lại có thể xác định đƣợc trên các
cực rắn đĩa. Cực rắn đĩa là một mặt phẳng tròn (hình đĩa) có đƣờng kính khoảng 2 †
4 mm và đƣợc làm bằng các kim loại vật liệu trơ nhƣ than thủy tinh (glassy carbon),
than nhão (paste carbon), graphit, graphit ngâm tẩm (wax-impregnated graphite),...
Các cực rắn đĩa thƣờng dùng để xác định các kim loại khác nhƣ Ag, Au, Hg theo
phƣơng pháp ASV và phân tích một số kim loại khác nhƣ Mn, Co, Ce, Sb, As,…
theo phƣơng pháp CSV. Cực rắn đĩa có nhƣợc điểm là các hợp chất “gian kim loại”
dễ hình thành trên nó và cực dễ bị biến đổi do các kim loại, oxit kim loại,… kết tủa
trên bề mặt cực và do đó, kết quả của phép đo trƣớc ảnh hƣởng đến phép đo sau,
dẫn đến làm giảm độ lặp lại hoặc gây sai số.

1.2.3. Các kỹ thuật ghi đường von-ampe
Trong phƣơng pháp SV, để ghi đƣờng von-ampe, ngƣời ta có thể dùng các
kỹ thuật khác nhau nhƣ von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Khi đó,
một cách tƣơng ứng, phƣơng pháp von-ampe cũng đƣợc gắn thêm tên của các kỹ
thuật đó nhƣ: von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Dƣới đây sẽ giới
thiệu nguyên tắc của một số kỹ thuật von-ampe thƣờng dùng trong phƣơng pháp
von-ampe.
1.2.3.1. Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (Differential Pulse Voltametry)
Kỹ thuật von-ampe xung vi phân là một trong những kỹ thuật đƣợc dùng phổ
biến hiện nay. Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ nhƣ nhau khoảng 10
†100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30 † 100 ms đƣợc đặt chồng lên mỗi
bƣớc thế (xem hình 1.2.a). Dòng đƣợc đo hai lần: trƣớc khi nạp xung (I1) và trƣớc
khi ngắt xung (I2), khoảng thời gian đo dòng thông thƣờng là 10 † 30 ms. Dòng thu
đƣợc là hiệu của hai giá trị dòng đó (I = I1 - I2) và I đƣợc ghi là hàm của thế đặt lên

13


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

cực làm việc. Biến thiên thế theo thời gian và dạng đƣờng von-ampe hòa tan đƣợc
nêu ở hình 1.2.
Khi xung thế đƣợc áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng
dòng Faraday (If) và dòng tụ điện (Ic). Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với
dòng Faraday vì: Ic~ e-t/RC* và If ~ t-1/2; ở đây t là thời gian, R là điện trở, C* là điện
dung vi phân của lớp kép. Theo cách ghi dòng nhƣ trên, dòng tụ điện ghi đƣợc trƣớc
lúc nạp xung và trƣớc lúc ngắt xung là gần nhƣ nhau và do đó, hiệu số dòng ghi
đƣợc chủ yếu là dòng Faraday. Nhƣ vậy, kỹ thuật von-ampe xung vi phân cho phép
loại trừ tối đa ảnh hƣởng của dòng tụ điện [14].


(a)

Error!

(b)

Hình 1.2. (a). Sự biến thiên thế thời gian,
(b). Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân:

Pulse amplitude - Biên độ xung

Voltage step

- Bƣớc thế

Start potential

- Thế bắt đầu

Voltage step time - Thời gian mỗi bƣớc thế

Pulse time

- Bề rộng xung

Peak height

Peak voltage

- Thế đỉnh pic


- Chiều cao pic

Lund và Onshus đã đƣa ra phƣơng trình dòng đỉnh hòa tan xung vi phân (khi
phân tích theo phƣơng pháp ASV) trên cực HMDE nhƣ sau:
Ip = k. n2. r. ∆E.ω1/2 . tdp.C

14


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

Trong đó: k

- Hằng số

∆E (mV)

- Biên độ xung

ω(vòng/giây)

- Tốc độ khuấy khi điện phân làm giàu

r (cm)

- Bán kính của điện cực HMDE.

Các đại lƣợng khác
Nghiên cứu trên cực MFE, Osteryoung đã đƣa ra phƣơng trình

Ip = 0,138. Q/tpulse
Trong đó, Q (C: culong) - Điện lƣợng cần thiết để hòa tan toàn bộ kim loại
trong màng thủy ngân; tpulse (ms) - Bề rộng xung
So sánh với kỹ thuật von-ampe quét tuyến tính, kỹ thuật von-ampe xung vi
phân đạt giới hạn phát hiện (GHPH) thấp hơn khoảng 1000 lần khi dùng cực
HMDE. Mặt khác, với kỹ thuật von-ampe xung vi phân, cực MFE đạt đƣợc GHPH
thấp hơn khoảng 3 † 5 lần so với cực HMDE.
1.2.3.2. Kỹ thuật von-ampe sóng vuông (Square – wave Voltammetry)
Kỹ thuật von-ampe sóng vuông đƣợc Barker đề xuất từ năm 1958 và sau đó
đƣợc Ostryoung cải tiến vào những năm 1977-1980 [24]. Theo kỹ thuật này, những
xung sóng vuông đối xứng có biên độ nhỏ và không đổi (khoảng 50/n mV) đƣợc đặt
chồng lên mỗi bƣớc thế (xem hình 1.3). Trong mỗi chu kỳ xung, dòng đƣợc đo ở 2
thời điểm: thời điểm 1 (dòng dƣơng I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu đƣợc
là hiệu của hai giá trị dòng đo (I = I1 - I2) và I đƣợc ghi là hàm của thế đặt lên cực
làm việc. Theo cách ghi dòng nhƣ vậy, kỹ thuật này loại trừ đƣợc tối đa ảnh hƣởng
của dòng tụ điện.
Trong một số trƣờng hợp, kỹ thuật von-ampe sóng vuông có độ nhạy cao
hơn so với kỹ thuật von-ampe xung vi phân, nhƣng về GHPH, nói chung là tƣơng
đƣơng nhau.

15


Luận văn Cao học – Nguyễn Phƣơng Hà K20

(a)

(b)

Hình 1.3. (a) Sự biến thiên thế thời gian

(b) Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông:

Start potential

- thế bắt đầu

Peak height

Voltametry step - bƣớc thế
Amplitude
1.3.

- chiều cao pic

Peak voltametry - thế đỉnh pic

- biên độ

Một số phƣơng pháp xác định cloramphenicol

1.3.1. Phương pháp sắc kí
1.3.1.1.

Phân tích bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao [28,36,38,40]:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp sắc ký lỏng chủ yếu đƣợc
sử dụng để xác định cloramphenicol, đặc biệt là trong thực phẩm. Phƣơng pháp này
cho phép xác định cloramphenicol ở cấp độ siêu vết. Trên thế giới có rất nhiều các
nhóm nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp này, trong đó pha tĩnh đƣợc sử dụng là pha
tĩnh không phân cực C8 hoặc C18 [36,38]

Dung

môi

động

có

tính

phân

cực

cao

nhƣ:

Hỗn

hợp

H2O/Acetonitril(75/25,v/v) hay hỗn hợp axit axetic 1% trong methanol/H2O
(55/45,v/v). Tốc độ pha động 1ml/phút

16