báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.56 MB, 43 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐHQG TPHCM
KHOA SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH
CNSH Y DƯỢC
GVHD: Các giáo viên của PTN NC&ƯD Tế Bào Gốc
1
Phần 1
NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào là đơn vị cấu tạo cơ bản của sự sống. Là nơi diễn ra hầu hết các hoạt
động cần thiết của sự sống.
Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật cơ bản hỗ trợ đắc lực nhất cho những nghiên cứu về tế
bào.
Nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các nội dung chính sau:
1.Nuôi cấy sơ cấp tế bào từ tủy xương chuột
2. Cấy chuyền và nuôi thứ cấp tế bào tủy xương chuột
3. Đông lạnh và bảo quản tế bào động vật (hUCB – MSC)
4. Giải đông và hoạt hóa tế bào động vật
3
II. TỔNG QUAN
1. Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy sơ cấp sẽ thu nhận một hỗn hợp các dòng tế bào khác nhau trong đó có những tế bào quan tâm.
Quy trình nuôi cấy sơ cấp gồm:
Bước 1
Bước 2
•
Thu nhận mô có chứa tế bào sống
•
Phẫu tích và/tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào.
Bước 3
•
Nuôi cấy (Passage 0)
4
II. TỔNG QUAN
2. Cấy truyền và nuôi cấy thứ cấp
•
•
Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian mới, chất dinh dưỡng mới.
Cấy chuyền được thực hiện khi tế bào chiếm khoảng 80 -90% bề mặt nuôi cấy.
•
Tần số (độ thường xuyên cấy truyền) và độ pha loãng tuỳ vào đặc tính của tế bào
● Các thao tác cấy chuyền:
-
Tách bỏ môi trường cũ.
Rửa bề mặt giá thể nuôi
Tách các tế bào bám khỏi bề mặt nuôi (bằng trypsin/ que cào).
Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới
5
I. TỔNG QUAN
3. Đông lạnh tế bào
Hạn chế biển đổi kiểu gen, biểu hiện gen, cấu trúc, duy trì tính duy truyền.
Hạn chế nhiễm vi khuẩn, và tế bào bị chết.
Giảm thiểu các thao tác, chi phí nuôi cấy.
Ứng dụng cho các nghiên cứu về sau.
Làm ngừng quá trình phân chia và hoạt động trao đổi chất.
6
II. TỔNG QUAN
4. Giải đông tế bào
•
•
Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tế bào.
Sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
7
III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
1.1 Mẫu vật
Chuột nhắt trắng Swiss Albino, tuổi từ 6-8 tuần, nặng 18-22g, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM
1.2 Hóa chất
0
- Cồn 70
- Dung dịch PBS (kháng sinh 5X, 1X)
- Trypsin/EDTA 0,25%/1%
- Môi trường DMEM/F12 FBS 10%
1.3 Dụng cụ
- Erlen 250ml, erlen 50ml
- Becher 50ml
- Kẹp cong, kẹp thẳng
- Kéo thẳng, kéo cong
- Đĩa petri đường kính 9- 10cm
- Ống li tâm loại 15ml
- Buồng đếm hồng cầu, Lamelle
- Đầu tip 1ml, đầu tip 0,1ml
- Micropipette
- Bình Flask 25cm
- Khay rác
-8Kim tiêm 1ml
2
III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2. Phương pháp
2.1. Nuôi cấy thứ cấp
Xương đùi sau của chuột
- Phẫu tích
PBS + kháng sinh 5x, 1x
Mẫu mô
- Rửa sạch mô bằng PBS
- Loại bỏ mẫu cơ, mỡ,… khỏi xương
Tủ an
toàn
sinh
Mẫu mô đã xử lý
học
- Cắt bỏ hai đầu xương
- Bơm môi trường (DMEM/F12 FBS 10%) để dội rửa tuỷ xương
Dịch tuỷ xương
Tủ nuôi
(37◦C, 5% CO2)
9
Quan sát dưới kính hiển vi
2.2 Cấy chuyền
Tách bỏ môi trường cũ
1
1
Rửa bề mặt giá nuôi
PBS
2
Tách tế bào bám khỏi bề mặt
2
3
Pha loãng bằng môi trường nuôi cấy mới
3
DMEM/F12 FBS
10
2.3. Đông lạnh tế bào
TB máu cuống rốn đã nuôi cấy
PBS
0
37 C,5%CO2, 1 min
2
1
4
(1) Loại mt cũ
(2) Rửa bề mặt giá nuôi
(3) Tách tb
(4) Ủ
(5) Loại bỏ trypsin
(6) Ly tâm
(7) Bỏ dịch nổi, bổ sung mt đông lạnh
(8) Đông lạnh 3 bước
33
5
DMEM/F12 FBS
1ml Trypsin
6
0
4 C, 30m
0
-20 C,1h
0
-80 C
7
8
11
DMEM/F12 FBS
DMSO
2.4. Giải đông tế bào
1ml
1
2
Dd giải
500rpm
đông
5 min
3
0
Ủ 37 C
4
(1) Đặt vào bình ổn nhiệt
(2) Bổ sung dd giải đông
(3) Ly tâm
(4) Bỏ dịch nổi, bổ sung mt mới
(5) Chụp hình và đếm mật độ tb
5
12
DMEM/F12
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.Nuôi cấy sơ cấp
Các tế bào trong tủy xương sau khi thu được là một tập hợp gồm nhiều loại tế bào.
3
1
2
13
Loại tế
Mật độ so với quần thể tế bào
Hình dạng
Kích thước
Dự đoán loại tế bào
Nhiều
Tròn, không lõm trung
10- 15μm
Nhóm bạch cầu,tế bào
bào
1
tâm
gốc tạo máu, nhóm tiền
thân bạch cầu, tế bào
gốc trung mô
2
Nhiều
Tròn, lõm trung tâm
5- 10μm
Hồng cầu
3
Ít
Tròn không đều, nhìn
25-30μm
Nguyên mẫu tiểu cầu
thấy nhân bên trong
14
●Phân tích mật độ tế bào sau khi thu
32
2
1
30
5
31
4
30
3
31
Tổngsốtếbào :
Z= (1)+(2)+(3)+(4)+(5)= 154 tếbào
Số tế bào trung bình:
a== 30 tế bào
Mật độ tế bào:
4
4
6
A=ax10 xđộ phaloãng=30x10 x20=6x10 (tế bào/ml)
15
2. Cấy chuyền và nuôi cấy thứ cấp
-
Màu sắc môi trường: màu cam => Tế bào phát triển bình thường.
- Không bị nhiễm.
- Tế bào phần lớn đông nhất về hình dạng.
- Mật độ tế bào khoảng 70 – 80%
16
Trước cấy chuyền
Hình a: Bình cũ
Hình b: Bình mới
Sau khi đã cấy chuyền
17
Sau nuôi cấy thứ cấp 6 ngày
18
2.3. Giải đông tế bào động vật
TB không tròn đều, bị
móp méo TB chết
TB tròn đều TB
sống
Hình ảnh đánh giá 19
trực quan dưới kính hiển vi
Kết quả đếm tế bào bằng buồng đếm sau khi giải đông
Hiệu suất giải đông
Zdeath
1
H = 1−
× = 1 − = 92.31%
Z
13
20
Phần 2
THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM
21
Các nội dung chính
1
1
Một số thao tác cần lưu ý
2
Các quy trình chung
3
Kết quả và giải thích
4
Kết luận
5
Những điểm cần lưu ý
22
Một số thao tác cơ bản cần lưu ý
•
Lọc dầu khoáng
•
Kéo pipette Pasteur
•
Tạo các vi giọt trong dầu khoáng
•
Gây mê chuột
23
Lọc dầu khoáng
Click to edit Master text styles
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
24
Kéo pipette Pasteur
25
