I. SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ
Nguyên tắc – yêu cầu:
Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là một phương pháp
sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản
(chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp chất hấp phụ
(thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng trên nền phẳng (kính, kim
loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc
theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành
một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau. Sau khi khai triển, ta có thể thu được những cấu
tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏi
giá hấp phụ bằng một dung môi thích hợp. Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinh
khiết hóa tiếp tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) hay các phương
pháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc
bằng các phương pháp phân tích cơ bản hay bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinh
học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng như chất chuẩn đối chiếu.
1.
Ưu nhược điểm của PTLC:
Ưu điểm:
Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc sử dụng những
bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng;
TLC 0,2 – 0,25 mm.
So với sắc ký cột:
Nhanh và thuận tiện hơn so với sắc ký cột cổ điển.
Dễ tìm được dung môi thích hợp để tách các chất.
Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lập
Tỉ lệ giữa silicagel và chất tách cao nên tách tốt hơn
Rẻ, đơn giản hơn so với HPLC. Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt và áp dụng.
Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân tách
tốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể triển khai đồng thời
các chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định
hợp chất mong muốn.

Nhược điểm:
Các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí
và ánh sáng.
Sự hiện diện đồng thời của tạp chất khi phản hấp phụ chất mong muốn ra khỏi giá hấp phụ.
2.
Ứng dụng:
Dùng để tách các chất với hàm lượng nhỏ (10 – 1000 mg) trong trường hợp không thể tách bằng
các phương pháp khác.
Có thể phân lập được các đơn chất tinh khiết với khối lượng đủ từ các polymer tổng hợp, các sản
phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô hay từ dược liệu, các sản phẩm chuyển hóa từ dịch sinh học, phân
biệt cấu hình hoá học của các sản phẩm thiên nhiên hay tổng hợp.để khảo sát điểm chảy, phổ
UV, IR, khảo sát cấu trúc và làm chất chuẩn.
3.
Pha tĩnh:
Pha tĩnh hay sử dụng trong PTLC là các chất hấp phụ, các chất hấp phụ này phần lớn có trộn
thêm chất kết dính như CaSO4 5 – 15 %, tinh bột 2 – 5 %, dextran, nhưng cũng có trường hợp
không dùng chất kết dính.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 1


3.1.

Silica gel:

Là một chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo cơ chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ là các nhóm –
OH silanol → hấp phụ các chất có tính kiềm (alkaloid base...) hơn là các chất có tính acid
(polyphenol...)

Mật độ nhóm silanol càng cao (VD: hạt càng mịn), khả năng hấp phụ của silica gel sẽ càng lớn.
Khả năng hấp phụ của silica gel phụ thuộc vào phụ thuộc vào tình trạng ngậm nước của hệ
thống → khi dùng silica gel làm chất hấp phụ thì nên sấy silica gel ở 1050C trong 2h là đủ, đừng
nung quá 4500C
3.2.

Nhôm oxyd:

Có 3 dạng: oxyd nhôm kiềm, trung tính, acid.
Là một chất hấp phụ phân cực mạnh, có tính trao đổi ion lưỡng tính
Trung tâm hấp phụ là các nhóm OH, khi các trung tâm hoạt động này bị hút ẩm, oxyd nhôm sẽ
giảm hoạt tính. Muốn hoạt hóa nó, người ta sấy để loại bỏ lượng nước hấp phụ này đi. Nhiệt độ
sấy càng cao, lượng nước hấp phụ càng giảm đi, oxyd nhôm càng hoạt động.
Oxyd nhôm có nhiều cỡ hạt, hạt càng bé khả năng hấp phụ càng cao.
3.3.

Cellulose:

Cellulose chủ yếu có cơ chế phân bố, thường được dùng để tách những chất phân cực mà khó
tách hoặc không thể tách được bằng cơ chế hấp phụ.
Là chất cao phân tử thiên nhiên được dùng dưới dạng bột mịn và thường không cần chất kết
dính.
3.4.

Silica gel ghép:

Là silica gel mà nhiều nhóm Si-OH silanol được biến đổi thành nhóm Si-R, Si-O-R hay Si-O-SiR
Khi –R là mạch hydrocarbon kém phân cực (2C, 6C, 8C, 18C) ta có silica gel ghép pha đảo, đây
là các chất phân bố không phân cực.
Khi –R là mạch phân cực ta có silica gel ghép pha thuận, đây là các chất hấp phụ yếu nếu so với

các silica gel không ghép.
3.5.

Các pha tĩnh khác:

Polyamid, nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ – hữu cơ, Kieselguhr.
4.
Dung môi:
Chọn dung môi:
Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại
Dung môi không quá dễ bay hơi
Thay đổi dung môi:
Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất này
giữa chất hấp phụ và dung môi ly giải
Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn 2
cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ)
Để thay đổi khả năng tách có thể thay đổi dung môi hoặc thành phần dung môi
5.
Chuẩn bị mẫu sắc ký:
Chuẩn bị lớp mỏng chế hóa:
Các bản mỏng chế hóa có thể tự làm trong phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng) hoặc sử dụng
những bản mỏng tráng sẵn.
Độ dày của bản mỏng PTLC thường sử dụng là 0,5 – 2,0 mm, kích thước bản mỏng thường là 5
× 20, 10 × 20, 20 × 20, 20 × 40 hay có thể đến 20 × 100 cm tùy yêu cầu sử dụng.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 2


Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ chất trơ như

thạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có độ dày 0,5 – 2,0
mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng.
Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600C trong 2h rồi mới sấy hoạt hóa
ở 1200C trong 2h.
Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm):
Mẫu thử (đã được sơ bộ loại tạp) được cô ở áp suất giảm đến khô, sau đó hòa vào trong một
lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi) rồi chấm lên bản mỏng.
Chấm mẫu thử:
Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm.
Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên bản mỏng thành băng liên
tục, băng có thể dày từ 1 – 2 mm, cách mép bản 1,5 – 2 cm.
Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm dưới một nguồn
nhiệt), chứa lượng chất thử khoảng 1 – 10 µg.
Khai triển sắc ký:
Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình. Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của
bản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên kính, để khô.
Lưu ý:
Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV)
Những điều kiện để phân tách thành công trên bản mỏng chế hóa:
Bản mỏng phải đồng nhất.
Lượng mẫu chấm trên bản mỏng phù hợp.
Bình triển khai sắc ký được bão hòa tốt: quan trọng nhất vì một hợp chất di chuyển trên bản
mỏng với sự thay đổi vận tốc phụ thuộc vào tỷ lệ bay hơi của dung môi, nó di chuyển nhanh hơn
trên bề mặt của bản mỏng và chậm hơn ở phần bản mỏng gần với giá mang, hiện tượng này
được giảm thiểu tối đa trong một bình sắc ký đã được bão hòa hoàn toàn.
Lượng chất hấp phụ trên bản mỏng thay đổi tùy theo từng trường hợp, đối với silica gel cần 20 –
25 g/ bản mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, những bản mỏng dày có thể bị nứt trong quá
trình sấy do đó phải giảm lượng nước trong hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão của chất hấp phụ,
tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian sấy hoặc có thể sấy bằng tia hồng
ngoại.

Vết chấm phải thẳng, hẹp và phải cách 2 mép hai bên của bản mỏng ít nhất 1 – 3 cm để tránh
hiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh hơn hoặc chậm hơn bình thường ở hai
mép của bản mỏng hơn là ở trung tâm của bản mỏng.
Mẫu thử được hòa tan trong một dung môi không phân cực, dễ bay hơi ở một nồng độ mà tất cả
các cấu tử của mẫu thử được hấp phụ không chỉ trên bề mặt mà phải xuyên suốt chiều dày của
bản mỏng. Có thể chấm bằng tay bằng cách sử dụng micropipette hay syringe và thước kẻ hoặc
có thể sử dụng những dụng cụ được thương mại hóa phục vụ cho việc chấm mẫu.
6.
Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế:
6.1.

Soi UV:

Ưu điểm:
Nhanh, tiện lợi
Không bị hao hụt mẫu như phun xịt bản
Nhược điểm:
Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực của vết → đánh dấu trật vết và không thu được
chất khi cạo rồi ly giải

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 3


Phun xịt bản với thuốc thử đặc trưng:
Tiến hành:
Dùng tấm kiếng hoặc tấm nilon che 1 phần bản
6.2.


Phun thuốc thử lên phần không bị che

Dựa vào những vết hiện trên bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chất
Ưu điểm:
Biết chính xác vị trí vết
Nhược điểm:
Thuốc thử tạo phức với hợp chất không thể sử dụng để cạo bản, cô lập hợp chất
6.3.

Sử dụng hơi iod:

Tiến hành:
Đặt bản trong buồng hơi iod
Khi thấy vết lấy bản ra khỏi buồng
Đánh dấu vị trí vết
Phơi bản ngoài quạt gió để bay hơi iod
Cạo bản để thu chất

II. SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có
nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại
hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là
nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.
1.
CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ
Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký, người ta
chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:
1.1.

Phương pháp tiền lưu


Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A và B liên tục
chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung
dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy
qua cột. đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong
xuất). Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi. Sau đó trong
dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dung
dịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho trên hình dưới. Trong
phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là
hỗn hợp A+B. Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên
thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 4


1.2.

Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví
dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử
A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa
(thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của
cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên
chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B. Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa
thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng. Các
vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi.
Hình bên dưới biểu diễn đường cong thoát của quá trình rửa giải. Trong phương pháp rửa giải,

người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn
ái lực của các cấu tử cần tách với cột.
1.3.

Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa
chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển
dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát
ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái
lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá
trình sắc ký. Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần
riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu
tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa.
2.
Cột sắc ký
Cột sắc ký làm bằng thép không rỉ , thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo
2.1.

Cột phân tích

Dài: 10-30cm
Đường kính trong: 4-10mm
Cỡ hạt pha tĩnh: 5-10µm
N=40.000-60.000 đĩa /met
Cột nhỏ (microcolumn): 3-7.5cm, 1-2mm, 3-5µm, N=100.000 đĩa/mét
2.2.

Chất nhồi cột:


Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagel
Silicagel bao lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt
Nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion
2.3.

Cột chế hóa

Dài 25-100cm
Đường kính trong 6-50mm, tránh được hiệu ứng thành của cột.
Tốc độ dòng lớn hơn cột phân tích
Sử dụng trong dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất
3.
Pha tĩnh
3.1.

Silicagel(hay kieselgel của acid silicic) pha thuận

- Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là một chất phân cực, thường được dùng làm
pha tĩnh để phân tách các chất. phù hợp với hầu hết các pha động. nó có thể chạy với những
lượng mẫu rất nhỏ như trong sắc ký lớp mỏng.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 5


- Ngày nay, Silicagel có kích thước các lỗ là 40,60 và 100Å(Si-40, Si-60, Si-100) được dùng
tron sắc ký điều chế . Si-60 thường được sử dụng nhất. Trong một vài trường hợp, kích thước hạt
quá nhỏ làm giảm hiệu quả của sự chiết tách.
- Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3, và nhiều nhất là 2.2g/cm3.

Có nhiều kích cỡ silicagel khác nhau phụ thuộc vào nhà sản xuất. Đối với sắc ký chế hóa sử
dụng cho những lượng mẫu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước 1525µm,25-40µmhay 40-63µm.
- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề mặt quyết định. Nhóm OH là các trung
tâm hấp phụ
- Để Silicagel hấp phụ được tốt thì cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được loại bỏ
bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gan loại các hạt nhỏ lơ
lửng, sau đó sấy 120oC trong 48 giờ.( đối với các bảng tráng sẵn thì không cần hoạt hóa) .
Không sấy quá lâu tránh làm mất nhóm silanol→bất hoạt.
- Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác nhau. Ví dụ : khi chạy tịnh dầu thì sấy
silicagel cần lâu càng tốt. còn đối với các chất phân cực mạnh thì sấy hoạt hóa ít đi, them một ít
nước để giảm hoạt tăng Rf.
- Tuỳ theo việc chọn các dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách các hợp chất
base(alkaloid) hay các hợp chất ưa dầu. Phân tách các chất có độ phân cực gần với nó. Silicagel
là sự lựa chọn tốt nhất làm pha tĩnh khi phân tách cá chất có khối lượng phân tử nhỏ(<2000Da)
- Khả năng tách của silicagel tốt hơn khi tẩm nó bằng dung dịch bạc nitrat10-12%, dung dịch
acid boric , ammoniac, dung dịch đệm phosphate..
3.2.

Nhôm oxyd

- Ít được sử dụng hơn silicagel. Thường được dùng trong sắc ký hấp phụ
- Là chất hấp phụ phân cực.
- Trong sắc ký có 3 dạng nhôm oxyd: nhôm trung tính, acid, base.Tùy vào chất cần tách mà lựa
chọn loại oxyd nhôm sử dụng cho phù hợp(chiết các acid amin có tính base cần dùng oxyd
nhôm base, khi cần tách các chất trung tính thì dùng oxyd nhôm trung bình)
- Để tách tốt hơn người ta xử lý nhôm với các dung dịch acid hoặc base.
Hoạt tính của nhôm oxyd tùy thuộc lượng nước nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng nước gia
tăng. Trước khi dùng cần hoạt hóa ở 120oC trong 1 giờ.Bậc hoạt tính của nhôm được chia làm 5
bậc:
Bậc

hoạt I
II
III
IV
V
tính
% nước
0
3
6
10
15
- Diện tích bề mặt của oxyd nhôm khoảng 0.9g/cm3 đến khoảng 4.0g/cm3.
- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách các
hợp chất thơm( có ái lực mạnh với OH phenol) và các hợp chất đồng phân của nó. Oxyd nhôm
còn được dùng để tách các chất : hydrocacbon, alkaloid, chất màu thực phẩm, lipid.
3.3.

Kieselguhr

- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại là các oxyd kim loại.
- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất phân cực như đường, các triglyceric, các acid
béo bậc cao, cetoacid, lacton. Nhưng thường được dùng chủ yếu làm giá mang cho pha tĩnh
trong sắc ký phân bố.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 6



3.4.

Polyamide

- Ít được dùng làm chất hấp phụ , chủ yếu được dùng để tách các chất có chứa nhóm chức
phenol( flavon) , đường.
3.5.

Silicagel pha đảo

- Có nhiều loại mẫu kị nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp được lựa
chọn sử dụng cột silicagel C-18.
- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh có bản chất khác với pha động(pha tĩnh không phân cực ,
phân động phân cực)
- Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon dài thường là 18C(c-18) hay 8C(C-8) :Si-O-Si- nối
Carbon.
- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→ alcol/phenol
→amin→ eter/aldehyd→ cetone→hợp chất halogen→alkan
- Mặc dù sắc ký pha đảo có mắc tiền hơn sắc ký pha thuận nhưng nó có nhiều ưu điểm hơn như:
Không cần phải hoạt hóa trước khi dùng.
Hệ được thiết thiết lập cân bằng nhanh chóng
Dung dịch thân nước có thể đi qua
Tách tốt đối với các chất phân cực
- Thường được áp dụng trong HPLC
3.6.

Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử

- Rây phân tử thường dùng các chất như :dextran, agarose hay polyacrylamide( Sephadex,
Sepharose, Fraktogel, Bio-gel…)

- Có các loại gel như gel cứng và gel bán cứng. Các gel cứng được cấu tạo từ các hợp chất vinyl
và divinyl styren polymer. Còn các gel cúng thì được cấu tạo bởi các hạt thủy tinh xốp và
silicagel xốp. Tùy vào tính chất của từng loại gel ma chia ra hai loại là gel thân nước
(hydrophilic gel) và gel thân dầu (lipophilic gel)
- Các Shephadex thông dụng:
Sephadex G(20.50.75)
Sephadex LH-20
3.7.

Cellulose

- Là chất cao phân tử thiên nhiên có công thức [C6H7O2(OH)3]3, dạng bột mịn , dùng không
cần chất kết dính.
- Tách các hợp chất thân nước.
- Tăng hoạt tính của cellulose xử lý với hỗn hợp methanol, acid formic và nước hoặc bằng
isopropanol, acid acetic và nước.
Nhược điểm của cellulose không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử mạnh như NaOH,
H2SO4.
4.
Kỹ thuật nhồi cột sắc kí
4.1.

Dụng cụ:

- Cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần
vạch chia độ)
- Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là silicagel pha thuận
và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính các nhóm OH,
silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng alumin) Chất nhồi cột
quyết định quá trình sắc kí.


Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 7


- Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực, các chất
không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất phân cực hơn sẽ ra
sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu có mà sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó sẽ chọn
kích cỡ cột sắc kí. Dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel
phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra tốt. Dung môi: thông
thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột.
- Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến phân
cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi. Chú ý dung
môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy bản mỏng vì hạt silicagel
dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một chút.
(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản mỏng, TLC, thin
layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để "dò tìm" thông tin về hỗn hợp của mình
cũng như biện pháp tách chất cần lấy).
4.2.

Thực hiện

Bước 1: nhồi cột.
Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan
silicagel vào dung môi đó trong một erlen. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy cột để
chặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý dùng ít bông
gòn. Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì không cần làm
việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lần
cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột xong chỉ cần vứt bông gòn.

Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không phân cực) đã
pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel lắng đều, nhớ để 1
erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi cho hết lượng silicagel vào,
tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi
hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa cột lại.
Bước 2:
Nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp mẫu ướt là hỗn hợp
chất phân tích cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào. Còn nếu mẫu không
tan trong dung môi chạy cột thì phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1 erlen. Sau đó
dùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình cô quay để cô
quay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu. Lúc này nạp hết silicagel đó vào cột
và cho dung môi chạy cột vào: gọi là nạp mẫu khô. Khi cô quay thì nhớ lót miếng bông gòn ở
miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên. Cô quay là chưng cất trong áp suất kém (chân
không).
Bước 3:
Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi
tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý không được thay đổi đột
ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại quay lại không phân cực, làm
như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu.
Bước 4:
Mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theo chất đã tách
được bằng ống nghiệm nhỏ, mỗi lần hứng khoảng 1/3ống nghiệm. Sau đó đem chấm bản các
ống nghiệm, những ống có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì
cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn.
Ghi chú
- Mỗi lần tách cần khoảng 50-200ống nghiệm, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày.
Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này quyết định

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3


Trang 8


quá trình tách có tốt hay không. Nếu thận trọng quá cho chạy chậm thì phải chờ lâu, nếu nôn
nóng quá cho chảy nhanh thì silicagel chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy cũng không
tách được.
Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống nhanh thì dùng
máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá). Nó sẽ sục không khí vào để tăng tốc quá trình đẩy dung
môi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới khoảng 3 giọt/phút). Chú ý chất không dễ bị oxi hóa
thì mới dùng phương pháp này được. Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết chất phân tích.
- Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm, nhưng nhược
điểm là phải ngồi canh nó liên tục. Chú ý khi đã chạy pha đảo thì không được dùng máy đẩy, vì
bản chất pha đảo là chậm. Nếu dùng máy đẩy thì như đã nói ở trên, silicagel không tách
được.Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu. Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì phải
khóa cột lại ở cuối ngày, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu để quá lâu thì chất bị giữ lại
trong cột lâu sẽ khó tách ra hơn.
5.
Pha động
Pha động là một thông số dễ điều chỉnh nhất khi tối ưu hóa hệ thống sắc ký. Trong khảo sát pha
động, vấn đề đặt ra là làm sao để tìm dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù hợp nhất trong thời
gian ngắn nhất có thể và sử dụng ít nhất vật liệu.
5.1.

Lựa chọn dung môi:

Dung môi lựa chọn không được ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp phát hiện.
Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý đến khả năng trộn thành hỗn hợp của các
dung môi:

Điểm sôi của các dung môi cũng là một yếu tốt rất quan trọng. Nhiệt độ sôi thấp sẽ dễ dàng và

tiết kiệm cho việc thu hồi. Tuy nhiên dung môi sử dụng không nên có điểm sôi quá thấp (T s >
400C) nhằm tránh sự bay hơi trong quá trình phân lập.
Dung môi với độ nhớt thấp cũng được ưu tiên vì giúp giảm áp lực phải đặt lên cột.
Tính bền vững và tính trơ phải được quan tâm để tránh hư mẫu.
Độc tính thấp, khả năng cháy nổ và giá cả cũng cần quan tâm.
Độ mạnh của dung môi
Snyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá trị độ mạnh của dung môi:

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3

Trang 9


Độ phân cực của dung môi
Độ phân cực của dung môi có thể lựa chọn dựa trên tam giác chọn lọc được xây dựng bởi
Snyder:

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
10

Trang


Độ tinh khiết của pha động:
Không có hoạt chất nào 100% tinh khiết. Độ tinh khiết càng cao, giá càng cao. Cần phù hợp yếu
tố chi phí với độ tinh khiết nhằm đưa các ảnh hưởng của nó về giới hạn phù hợp.
5.2.

Dung môi cho sắc ký pha thuận:


5.3.

Dung môi cho sắc ký pha đảo:

5.4.

Dung môi cho sắc ký gel:

(Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực)
Ngược lại với các loại sắc ký khác, sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính tan
do sự thay đổi pha động. Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí:
Khả năng hòa tan tốt mẫu
Độ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp)
Không làm phá hủy pha tĩnh.
Tài liệu cung cấp từ nhà sản xuất gel cần phải được nghiên cứu kĩ lưỡng nhằm tránh cho gel bị
phá hủy do tương tác với dung môi không phù hợp.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
11

Trang


6.
Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế:
Phương phát ghi nhận sắc ký bằng detector UV thường được sử dụng nhất. Trong khi việc phun
thuốc thử giống để phát hiện là không khả thi thì sử dụng máy đo UV lại tỏ rõ hiệu quả, sự chọn
lọc và tính khả dụng.
6.1.


UV detector

Áp dụng được cho các hợp chất có nhân thơm, có nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, có chứa iod,
brom, sulfur,…
Nhìn chung UV detector có thể sử dụng được cho sắc ký gel mà không cần rửa giải.
6.2.

Refractive detector (RI)

Bộ phận phát hiện nhờ chỉ số khúc xạ. Bộ phận phát hiện này tuy có độ nhạy thấp hơn so với bộ
phát hiện UV nhưng nó có ứng dụng nhất định trong sắc ký điều chế. Với độ nhạy thấp, khi lựa
chọn dung môi sẽ dựa vào RI để lựa chọn được loại dung môi nào chạy ra kết quả có nồng độ
cao nhất.
7.
Định tính một cột sắc ký
Vì nhiều lý do, cần thiết phải có sự đánh giá những đặc thù nhất định của cột tự làm.
Thông tin nào quan trọng nhất cho việc đánh giá một cột sắc ký chế hóa?
Thông tin về hiệu lực cột, thông tin này cho phép đưa ra kết luận về kết quả phân lập của sắc ký.
7.1.

Sắc ký đồ

Nếu đầu ra của cột được ghi nhận bởi một bộ phận phát hiện thích hợp trong quá trình phân lập
sắc ký, và tín hiệu từ bộ phận phát hiện được ghi nhận dạng nồng độ theo thời gian, sẽ ghi nhận
được đường cong điển hình. Đường cong Gausian
Toàn bộ các ghi nhận của các tín hiệu được gọi là sắc ký đồ. Dữ liệu sau đâu có thể thu trực tiếp
từ một sắc ký đồ:

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
12


Trang


to = thời gian chết của cột, thời gian cần thiết cho dung môi chảy qua hết cột với tốc độ dòng xác
định
tR = Thời gian lưu, thời gian từ khi triển khai mẫu đến pic cực đại
W = Độ rộng cơ bản của pic
B0,5 = độ rộng pic tại ½ chiều cao.
Sẽ không thực sự hợp lý nếu đánh giá một cột dựa vào thời gian lưu hoặc độ rộng của pic.
Những thông số này phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố như tốc độ dòng, thành phần dung môi,
chiều dài cột… Tuy nhiên, việc đánh giá cột một cách thích hợp đối với sắc ký điều chế là dựa
vào SI (symmetry index - chỉ số đối xứng) và số đĩa lý thuyết hay chiều cao đĩa lý thuyết.
SI mô tả sơ lược hình dáng của pic và do đó là một thông số có ích cho việc đánh giá đặc tính
chảy của cột. SI được định nghĩa:
SI = b/a
Sự bất đối xứng trở nên rõ ràng, tuy nhiên, một điều kiện tiên quyết cho loại thử nghiệm này
phải sử dụng đối với chất có khả năng tách rửa tốt nhất.

Ví dụ của một pic tốt (trái) và một pic xấu (phải)
SI được đo không phải tại đường nền mà ở vị trí 5% hoặc 10% của chiều cao pic. (trong ví dụ
này là 5%)
7.2.

Số đĩa lý thuyết

Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cột
Công thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong Gaussian. Để
đơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian.
Số N lớn tương ứng với cột tốt.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
13

Trang


Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lý thuyết do đó nó là
thông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp phụ, tốc độ dòng, chiều dài
cột,…)
7.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết:

Các yếu tố do pha động:
Độ nhớt
Hóa chất tự nhiên
Tốc độ đưa vào cột
Tốc độ khuếch tán vào pha tĩnh
Các yếu tố hòa tan
Hóa chất tự nhiên
Mẫu nạp vào cột
Dung môi nạp mẫu
Nồng độ của mẫu
Tốc độ khuếch tán ở mỗi pha
Yếu tố dung tích k’
Yếu tố do pha tĩnh
Đường kính cột
Kích thước hạt
7.4.


Phân bố hạt
Hình dạng hạt
Bề mặt
Kích thước và hình dạng lỗ
Các yếu tố thuộc tính toán
Hình dạng pic
Độ bất đối xứng của pic
Phương pháp tính toán
Độ chính xác và độ đúng của các phương pháp đo, ghi
nhận
Các yếu tố thuộc về máy móc thiết bị
Tính đồng nhất của cấu trúc lớp nhồi cột
Khoảng trống và các kênh giữa các lớp nhồi cột
Thể tích chết quá mức trong hệ thống LC

Chiều cao tương ứng với một đĩa lý thuyết

Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của đĩa lý thuyết
H (H=L/N với L là chiều dài của cột)
7.5.

Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm

Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao đã làm giảm h
h = H/d (d là đường kính của cột)
Trong một vài trường hợp, số đĩa lý thuyết phụ thuộc chặt chẽ và hoạt chất sử dụng để kiểm tra.
Thông tin chính xác về chất thử và điều kiện thử cần phải được cung cấp.
7.6.

Độ phân giải


Độ phân giải mô tả mối liên hệ của 2 pic, đây là thông số đóng vai trò quan trọng trong việc
phân lập một hỗn hợp các chất.
R = 2(tR2 – tR1)/(w1 + w2) = 1,177(tR2 – tR1)/(b0,5(1) + b0,5(2))

7.7.

Thể tích chết

Thể tích chết V0 được định nghĩa là khoảng trống trong cột sắc ký.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
14

Trang


V0 = tR . Fm (Fm là tốc độ phân phối hay lưu lượng dòng)
G. Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V0
Cột được làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1). Cột sau khi
triển khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2). V 0
được tính theo công thức
V0 = (G2 – G1)/(d2 – d1)
Biết được V0 có thể tính toán được thời gian chết to
t o = V 0 / Fm
8.
Phân lập kết quả sắc ký:
Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên khó khăn
Mặc dù không lý tưởng nhưng sự
phân lập của các chất tinh khiết vẫn
có thể thực hiện được với độ phân

giải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏi
một điểm cắt trong các phân đoạn
thu được. Chỉ các phân đoạn rìa tùy
theo mỗi pic được thu thập và phần
còn lại nằm giữa chúng có thể được
thu hồi và tái phân lập.
Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải
có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi,
cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập
để tránh lẫn phần kéo đuôi của pic
trước.
8.1.

Yếu tố phân giải alpha

α = (tR2 – t0) / (tR1 – t0)
(tR2 >= tR1)
Nếu hai thời gian lưu bằng nhau, α
= 1 khi đó không thể phân lập được.
Giá trị α càng lớn, việc phân lập càng dễ dàng.
9.
Sắc ký cột nhanh (FC – Flash
Chromatography)
Giới thiệu
Vào giai đoạn đầu của kỹ thuật sắc ký, những
cột đơn giản bằng thủy tinh được sử dụng,
hoạt động nhờ vào áp lực thủy tĩnh của dung
môi. Trong một ấn phẩm năm 1978 Clark
W.Still khám phá ra khả năng tăng tốc quá
trình phân lập trên cột thủy tinh, từ đó gia tăng

hiệu lực của phương pháp sắc ký. Kết quả hết
sức thuyết phục và trở nên một phương pháp
tinh chế không ngờ trong hóa học chế hóa.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
15

Trang


Ngày nay sắc ký cột nhanh càng được phát triển với nhiều thiết bị hỗ trợ và sự tiện dụng.
Sắc ký cột nhanh trở nên phổ biến vì chúng đơn giản dễ sử dụng, tiện lợi và có thể trang bị ở
mọi phòng thí nghiệm.
9.1.

Nguyên tắc:

Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân lập, một tác
nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha động).
Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách ra bởi pha
động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần và pha
tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm trong sự rửa giải cột. Sự
phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể thực hiện khi mỗi thành phần
này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.

9.2.

Lựa chọn pha tĩnh phù hợp

Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ tùy thuộc vào

mỗi nhà sản xuất.
Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không phân cực.
Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của nó với chất hấp
phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các
chất phân cực mạnh hơn.
Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải
được thực hiện bởi dung môi phân cực. Những pha tĩnh này được
thiết kế bằng cách thay đổi silica gel với nhóm không phân cực
nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo mắc hơn
nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh
chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.
9.3.

Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng:

Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica
gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sát
trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian và
vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cột
sắc ký nhanh.
Xác định pha tĩnh
Tìm pha động với sự chọn lọc nhất
Xác định độ mạnh dung môi

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
16

Trang



Một cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau để khả năng áp dụng từ TLC
cho FC là cao nhất.
Khảo sát pha tĩnh
Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn. Nếu TLC với silica gel thường
được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng có thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới
nghĩ đến khả năng sử dụng pha đảo.
Khảo sát dung môi
Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp dung môi
phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.
Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng giống nhau
trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh
các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung môi có chung tác dụng thành
các nhóm chọn lọc.
Nhóm chọn lọc cho
phép công việc tìm
kiếm được tập trung,
sẽ có ít điểm so sánh
khi mà dung môi
chung nhóm. Công
việc sẽ được tiến hành
theo hướng so sánh
giữa các nhóm đặc
tính.
Những dung môi quan
trọng cho sắc ký được
trình bày theo bảng
sau chỉ bao gồm các
dung môi có thể dùng
trong phân lập sử
dụng bộ phận phát

hiện UV (không gây
tín hiệu)
Dựa trên độ phân cực
của các thành phần
cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân
tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ
mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
17

Trang


Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1)
Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc
(khả năng phân giải)

Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp. Bản VI có sự
phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ở
bản V sẽ được chọn.
Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.
9.4.

Từ TLC đến FC

Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ
TLC đến FC
Thể tích cột CV = 1/Rf
Rf nằm trong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6


Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
18

Trang


9.5.

Nạp mẫu lên cột

Việc nạp mẫu đối với sắc ký cột bình thường là một công việc đơn giản trong phân tích sắc ký,
tuy nhiên trong sắc ký điều chế, cột thường được triển khai quá tải và việc nạp mẫu là rất quan
trọng.
Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo
loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (R f 0.04 – 0.4, CV > 1),
nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều. Khi đó
thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.
9.6.

Rửa giải theo gradient

Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các pic theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.
Ví dụ các kết quả:

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
19


Trang


10. SẮC KÝ CỘT KHÔ
Sắc ký cột khô ( DDC) là một kỹ thuật sắc ký hiện đại cho phép chuyển đổi nhanh chóng và dễ
dàng các thông số hoạt động của cắc ký lớp mỏng phân tích ( TLC) sang sắc ký cột chế hóa
( CC). Sắc ký cột khô khắc phục được nhược điểm của 2 phương pháp sắc ký lớp mỏng phân
tích và sắc ký cột chế hóa.
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật quan trọng sử dụng trong phòng thí nghiệm,vì nó cho phép xác
định nhanh thành phần của các hợp chất phức tạp. TLC có thể phân lập các chất ở một lượng rất
nhỏ. Tuy nhiên, những chất từ vài mg đến vài g cũng có thể áp dụng sắc ký cột, vì khi đó dùng
sắc ký lớp mỏng tốn nhiều thời gian và giá thành cao. Trong một số trường hợp, thậm chí những
phương pháp gọi là lớp dày hay lớp chế hóa cũng là lựa chọn cuối cùng vì các yếu tố thời gian,
giá thành, và thiếu hụt sự chuyển đổi các thông số của kỹ thuật phân tích. Bên cạnh đó, sự
chuyển đổi từ sắc ký lớp mỏng sang sắc ký cột thì khó khăn hơn vì chất hấp phụ của sắc ký lớp
mỏng không giống sắc ký cột.
Trong sắc ký lớp mỏng lớp silic và nhôm thì khô trước khi sử dụng và chỉ tiếp xúc với dung môi
sau khi được đặt vào bình khai triển. Đó là lý do tại sao trong sắc ký cột khô thì mẫu được nạp
vào cột khô . Trái ngược với sắc ký cột thông thường, sắc ký cột khô là kỹ thuật không rửa giải
được. Vì thế chỉ một lượng giới hạn chất rửa giải được dùng đơn thuần để lấp những kẽ của các
phân tử hấp phụ.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
20

Trang


Chất hấp phụ sắc ký cột khô có sẵn trên thị trường được điều chỉnh phù hợp với đặc tính lý hóa
của sắc ký lớp mỏng, trong suốt chu trình sản xuất. Với những đặc tính lý hóa tương tự, các giá

trị Rf của các chất phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thì hầu như đúng với các giá trị thu được từ
sắc ký cột khô. Việc sử dụng những chất hấp phụ được điều chỉnh một cách đặc biệt này, có thể
sử dụng cùng một chất hấp thụ, cùng một dung môi cho việc tiến hành trên cột và có thể chuyển
đổi những kết quả của sắc ký lớp mỏng sang sắc ký cột rửa giải một cách nhanh chóng, tiết kiệm
thời gian và tiền bạc. Những chất liệu cho sắc ký cột hấp phụ tương ứng với những chất liệu của
lớp mỏng thông dụng nhất, như chì DDC, nhôm DDC. Những chất hấp thụ sắc ký cột khô này
được sử dụng rộng rãi khi cần phải tăng lên một cách tương xứng với sắc ký lớp mỏng, để chuẩn
bị đủ số lượng các hợp chất cho các phản ứng hóa học và/ hoặc các quy trình phân tích tiếp theo.
DDC thực tế được sử dụng cho các phân lập từ sắc ký lớp mỏng.
10.1.

Quy trình đơn giản hóa:

Chuẩn bị
Sử dụng cùng 1 hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng
Cắt 1 ống nylon theo chiều dài yêu cầu. Để phân lập 1 g chất liệu, cần khoảng 300 g chất hấp
thụ trong một ống 1-m*740 mm( hình 2)
Đóng ống bằng cách kéo một đầu và giữ chặt một đầu bằng cái ấn, ghim hay đinh kẹp
Chèn một tấm giấy nhỏ hay lót bông thủy tinh ở đáy cột, dùng một cây kim đâm xuyên qua lỗ ở
đáy cột.
Đổ đầy cột đến ba phần tư chiều dài.
Mẫu được dùng để phân lập nên kết hợp với một lượng chất hấp thụ tương tự bằng ít nhất 10 lần
khối lượng của nó trong một ống kiểm tra hình nón.
Thêm từng centimet chất hấp thụ vào phía trên mẫu, sau đó cho một miếng bông thủy tinh nhỏ
Cột chặt ống bằng một kẹp trên giá.
Mở khóa vòi của bình đựng dung môi, thêm dung môi cho đến khi dung môi chảy đến đáy cột.
Ngưng lại, chờ khoảng 30 phút.( Hình 5)
Tìm vị trí của dải phân lập bằng mắt thường, tia UV hay tắt quang. Phun thuốc thử thích hợp vào
vùng tiếp xúc và so sánh với phần cột không được xử lý để đánh dấu dải đã được phân lập.
Đánh giá vị trí của dải trên ống nilon

Lấy cột ra khỏi giá
Cắt cột thành những phần theo yêu cầu. ( Hình 6)
Rửa giải những hợp chất tinh khiết từ những phần đã cắt bằng các dung môi phân cực
10.2.

ỨNG DỤNG SẮC KÝ CỘT KHÔ

Tinh dầu
Mặc dù có thể dùng máy sắc ký khí mao dẫn để phân tích, các hợp chất phức tạp như tinh dầu có
thể được phân tích bằng phương pháp khác. Bước phân tích rất cần thiết để tách các
hydrocarbon từ các terpenoid bị oxy hóa và sắc ký cột có thể thực hiện chức năng này. Mặt hạn
chế của phương pháp này là tiêu thụ nhiều dung môi, làm loãng các chất đặc biệt, khả năng tái
chế kém, hình thành tạp chất và tốn nhiều thời gian.
Sắc ký cột khô là phương pháp nhanh được sử dụng bởi Kubeczka để phân lập tinh dầu thành
các giai đoạn thích hợp cho phân tích sắc ký khí.Các thành phần không phân cực sẽ được phân
lập trên silica gel Woelm ( cần phải tái hoạt hóa với 7% nước để tránh sự tái sắp xếp lại của các
hydrocarbon terpen) bằng cách rửa giải đầu tiên với n-pentan( cho phân đoạn 1), tiếp theo là
benzen hay propyl chloride ( cho phân đoạn 2). Sau cùng benzen sẽ được chạy qua cột, cột sẽ
được cắt thành 3 dãy chứa những thành phần phân cực hơn. Mỗi dãy sẽ được chiết xuất với
diethylether-methanol 8:2, sau đó sẽ cho phân đoạn 3-5. Tất cả các phân đoạn 1-5 sẽ được tiêm
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
21

Trang


lần lượt vào cột sắc ký khí, sắc ký đồ dễ dàng được nhận diện. Hơn nữa, thông tin về độ phân
cực liên quan của các giai đoạn do rửa giải trên silicagel thì rất hữu ích trong việc nhận dạng các
pic.
Sesquiterpene.

Việc phân lập các sesquiterpene từ dược liệu thì thường được thực hiện bởi các bước sắc ký cột
của phương pháp chiết xuất không phân cực ở áp suất thấp hay trung bình, hay phân lập bằng
sắc ký lớp mỏng chế hóa và kết tinh lại với số lượng lớn.Thường sử dụng cột RP-8 hay RP-18
với dung môi rửa giải là hỗn hợp methanol-nước. Những giai đoạn này chắc chắn dẫn đến sự
hấp thu không thuận nghịch của các hợp chất mong muốn.
Diterpene
Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của paclitaxel từ loài T. yunnanensis của Trung Quốc. Phân
tích đầu tiên với sắc ký cột khô ( silicagel 80-200 mesh; CH 2Cl2- MeOH 40:1) và sau đó là trên
các cột mở thông thường cho ra taxin B và 2-deacetyltaxin B.
Hỗn hợp silicagel ( 63-200 µg) và AgNO3 ( 5:1) để phân lập labdane diterpene methyl ester
Cucurbitacins
Sắc ký cột khô silicagel được sử dụng trong suốt quá trình phân lập chất độc 11deoxycucurbitacin từ Desfontainia spinosa, triển khai với ethyl acetate- nước 9:1 và hexanedichloromethane 7:3. Giai đoạn tinh chế cuối cùng được thực hiện với sắc ký lớp mỏng chế hóa
và ly tâm.
Lignans
Cả lignans và neolignans đều thu được bằng cách kết hợp sắc ký cột khô và sắc ký lớp mỏng chế
hóa.
Depside
Ví dụ như acid salvianolic B, sử dụng trong thuốc cổ truyền Trung Quốc. Được phân lập với sắc
ký cột khô trên 2.3 kg silicagel ( CHCl 3-MeOH-HCOOH 85:15:1). Cột được cắt thành 16 phần
và rửa giải bằng ethanol ấm. Phần 13-14 được tinh khiết hóa bằng sephadex LH-20 ( MeOH) để
thu được 20.6 g acid salvianolic B. ( Ai và Li 1988).
11. SẮC KÝ LỎNG CHÂN KHÔNG
Sắc ký lỏng chân không ( VLC) có nguồn gốc từ Úc. Vào năm 1977, một mô tả ngắn về phương
pháp phân lập cembrenoid terpene từ san hô mềm của Úc đã được xuất bản.
11.1.

Nguyên tắc:

Kỹ thuật này có thể được xem như sắc ký lỏng chế hóa, hoạt động như một cột, dùng chân
không để tăng tốc độ chảy của chất rửa giải. Kỹ thuật này khác với sắc ký cột nhanh là cột được

chạy khô sau khi thu mỗi phân đoạn. Điều này giống sắc ký lớp mỏng chế hóa vì các đĩa được
làm khô sau khi chạy và sau đó được rửa giải lại.
11.2.

Quy trình:

Một cột nhỏ hoặc một phễu lọc Buchner vừa với thủy tinh ( 10-20 µm, độ xốp D hay 2) được
gắn khô với chất hấp thụ ( 10-40 µm của loại sắc ký lớp mỏng, ví dụ như silicagel Merck 60 H
hay 60 G).
Chất hấp thụ được cho vào bằng cách gõ nhẹ dưới trọng lực. Sau đó đưa chân không vào thông
qua vòi 3 ngã, chất hấp thụ được nén xuống thành một lớp mỏng cứng bằng cách đè một nút
chặn cao su và gõ nhẹ.
Tắt chân không, rót dung môi kém phân cực nhanh lên trên bề mặt chất hấp phụ, sau đó mở chân
không. Khi mà chất rửa giải đi qua, cột được hút khô và sẵn sàng để tải.
Mẫu trong dung môi thích hợp được cho trực tiếp phía trên đầu cột và được kéo nhẹ nhàng vào
vật hứng bằng chân không. Mẫu được tái hất thu trên silicagel, nhôm oxide.
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
22

Trang


Cột được triển khai với hỗn hợp dung môi thích hợp, bắt đầu với dung môi kém phân cực, tăng
dần độ phân cực, rút cho cột khô giữa mỗi phân đoạn thu được ( điều này tránh tạo rãnh).
Ngược với phương pháp sử dụng áp suất phía trên đầu cột, sự lôi kéo trên cột VLC thì dễ dàng
vì phía trên đầu cột bằng với áp suất khí quyển.
Nhìn chung, chiều cao cột hấp thụ không nên quá 5 cm. Với lớp nhỏ ( < 100 mg), thích hợp với
cột .5-1 cm i.d. và cao 4 cm, đối với 0.5-1g, thích hợp kích thước 2.5*4 cm, từ 1-10 g, 5*5 cm,
với lượng lớn hơn thì được phân lập tốt nhất với phễu lọc thủy tinh nung với chiều cao 5 cm.
Hỗn hợp để phân lập được thêm vào cột silic ở bất cứ vị trí nào có thể với một ít dầu hỏa ( nếu

không thể làm như trên thì thêm vào một chất rắn). Tăng lượng dung môi phân cực hơn cho mỗi
phân đoạn dung môi liên tiếp. Tăng độ phân cực một lượng nhỏ (1%,2%, 3%), sau đó lượng
tăng có thể tới 5%, 10%, 20%.
11.3.

Các ứng dụng:

Sắc ký lỏng chân không được dùng để phân lập từng phần dịch chiết dược liệu trước khi dùng
HPLC và các bước phân lập phức tạp khác. Trong những năm trước VLC được sử dụng rộng
rãi trong lĩnh vực sản phẩm tự nhiên vì cơ chế hoạt động đơn giản. Những chất hỗ trợ sắc ký
khác được sử dụng trong VLC: silicagel ( cả loại thường và loại pha đảo), Al 2O3, CN, diol và
polyamide. Chất rửa giải phổ biến nhất là ether dầu hỏa, tăng thành phần ethyl acetate.
Alkaloid
Diterpene alkaloids được phân lập nhanh chóng và dễ dàng bằng VLC.
Việc tinh khiết hóa aconitine thương mại bằng VLC thì nhanh hơn, rẻ hơn và thuận tiện hơn
bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa, yếu tố quan trọng nhất, rõ nhất là việc rữa giải mẫu bởi VLC mà
không cần phải cạo đĩa.
Những phân lập về diterpene alkaloids dùng VLC trên Al 2O3 đã được báo cáo ( Pelletier and
Badawi 1987; Joshi et al. 1990: Liang et al. 1991). Trong những ví dụ này thì có sự kết hợp VLC
và CTLC.
Một alkaloid guanidine độc mới được phân lập từ bọt biển lục địa Anchinoe paupertas bởi một
quy trình bao gồm VLC trên diol, với dichloromethane-methanol ( 10:05:5) ( Bouaicha et al.
1994)
Diterpene
Dầu hạt của Croton tiglium chứa phorbol-12,13-diester được biết như là chất dị ứng và gây ung
thư. Những diesters này được tinh khiết hóa trên silicagel 60( 15-40 µm, Merck) với máy VLC
được sữa đổi dùng dòng dung môi không đổi và chân không.
Isobenzofuranones
Dịch chiết từ rễ Polygonum multiflorum được sử dụng trong thuốc cổ truyền Trung Quốc trị
bệnh tim mạch. Dịch chiết methanol của rễ được chia ra giữa nước và ethyl acetate. Phần ethyl

acetate được sắc ký bởi VLC trên một giá sâu 2.5 cm theo loại silicagel 60H của sắc ký lớp
mỏng pha đảo, Merck ( số 7716) ( trong một phễu Buchner đường kính 13.7 cm, thủy tinh xốp
loại 3).
Triterpen Glcosides
Oleanolic acid saponin của cây Dialium guineense được phân lập từ quả bởi quy trình đầu tiên là
sắc ký cột nhanh trên silicagel và sau đó là VLC trên lichoprep RP-18 với methanol 7:4.
( Odukova et al. 1996)
Limonoids
Azadirone được phân lập từ nhân hạt chưa chín của Trichilia havanensis. Dịch chiết hexane của
nhân được chia ra giữa hexane và methanol-nước 19:1. Dung dịch methanol nước được chiết với
ethyl acetate và VLC của dịch chiết sau trên silicagel tái hoạt hóa với 5% nước ( rửa giải với dầu
hỏa-ethyl acetate 19:1) thu được trực tiếp limonoid( Arenas and Rogriquez-Hahn 1990)
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
23

Trang


Xanthones
5 xanthones được phân lập từ Garcinia cowa bởi quy trình gồm các bước phân lập chủ yếu của
VLC. Dịch chiết methanol của vỏ được phân lập thành 8 phân đoạn bởi VLC trên silicagel
( 80g), rửa giải thường xuyên với hexane, hỗn hợp hexane-benzene và dichloromethane. Các
xanthones có thể thu được bằng cách kết tinh trực tiếp từ các phân đoạn hay từ sắc ký lớp mỏng
ly tâm liên tục. Cowanol cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trung bình với Staphylococcus areus
( Na Pattalung et al. 1994)
Iridoids
Việc áp dụng VLC để phân lập các iridoid khác nhau đã được báo cáo bởi Handjieva et al.( 1991
a,b). Với mục đích này, cả nhôm trung tính 60G ( 5-40 µm, Merck 1090), Silicagel sắc ký lớp
mỏng 60H ( 15 µm, Merck 11695), hoặc Florisil ( 10-63 µm, Merck 12519 ) và phễu lọc
Buchner với đường kính khác nhau ( tùy theo kích thước mẫu) đã được sử dụng. Một số biến đổi

nhỏ về phương pháp của Coll và Bowden ( 1986) đã được thực hiện, đun nóng chất hấp thụ và
sử dụng một lớp nổi bằng nhựa bên trên phần hỗ trợ.
Ví dụ:
-Mẫu là dịch chiết dichloromethane từ rễ khô của Centrathus ruber.
-So sánh giữa VLC và sắc ký lớp mỏng chế hóa cho việc phân lập valepotriates từ Valeriana
oficinalis cho thấy những thuận lợi của VLC: thời gian phân tích ngắn hơn 6 lần, ít hơn 6 lần
dung môi, chất hấp thụ có thể tái sử dụng 6-7 lần, hơn nữa VLC thu được valepotriate ít bị biến
chất hơn so với sắc ký cột mở.
-Secoiridoid glucosides gentiopicroside và swertiamarin thu được ở dạng tinh khiết từ rễ tươi
của Gentiana punctata sau khi dùng VLC.
Ngoài ra việc phân lập iridoid glycosides bằng VLC bao gồm các báo cáo bởi Boros at al.
( 1990,1991), Akunyili et al. ( 1991) và Justice et al. ( 1992). Trong một ứng dụng được báo cáo
bởi Boros et al.( 1990), “ mini-VLC” trên pipet Pasteur có sẵn được dùng để phân lập số lượng
nhỏ nguyên liệu
Flavonoid glycosides
Trong việc phân lập một flavonol glycoside mới ( kaempferol-3-(2,3-diacetoxy-4-p-coumaroyl)
rhamnoside) từ lá của Myrica gale, bước tinh khiết hóa ban đầu là VLC trên polyamide-TLC 6
AC ( Macherey-Nagel), rửa giải với 50 ml, ước số của methanol-nước với độ phân cực tăng dần
( methanol-nước 1:1Methanol 100%) ( Carton et al. 1990)
Acetylenic Alcohols
VLC trên pha khung cyano ( 40 µm) được sử dụng để phân lập acetylenic alcohols gây độc tế
bào từ bọt biển Cribrochalina vasculum ( Hallock et al.1995). Chiết xuất bọt biển thô được rửa
giải trong VLC với gradient của t-butyl methyl ether-hexanes: HPLC pha đảo thì cần thiết cho
giai đoạn phân lập cuối của các alcohols chuỗi dài.
Polyacetylenes
Một polyacetyllene độc tế bào, (-)-17-hydroxy-9,11,13,15-octadecatetraynoic aicd được phân
lập từ Minquartia guianensis, một cây từ Ecuador. Vỏ thân cây được chiết xuất với các dung
môi có độ phân cực tăng dần và dịch chiết chloroform được cho là có hoạt tính chống lại tế báo
ung thư máu lympho P-388 ở chuột. Dịch chiết này trước tiên được sắc ký với sắc ký cột mở và
phân đoạn hoạt tính là mẫu cho VLC trên mộtt cột 8*40 cm của silicagel 70-230 mesh. Sau khi

rửa giải với chloroform- ethylacetate- methanol ( 18:1:1) và cuối cùng kết tinh thu được
polyacetylene có hoạt tính.
Kawalactones
Dịch chiết của lá Cryptocarya kurzii ( Lauraceae) với ethanol thu được cặn, cặn này độc với tế
bào KB. Hỗn hợp có hoạt tính này, một lacton loại kawa mới, kurzilactone, thu được bằng cách
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
24

Trang


kết hợp VLC, sắc ký lớp mỏng chế hóa, HPLC pha đảo. Silicagel 60H ( 70-230 mesh) được sử
dụng cho VLC, với dichloromethane-methanol ( 100:0, 99:1, 99:2, 19:1, 9:1) như là chất rửa
giải. ( Fu et al. 1993)

III. HPLC ĐIỀU CHẾ
1.
Nguyên tắc, yêu cầu:
Sự tách các chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần, một
chất hấp phụ trong cột (=pha tĩnh) và một dung môi chảy qua nó (pha động).Khi một thành phần
liên kết với pha tĩnh, hiện tượng này được định nghĩa là sự hấp phụ, khi thành phần này bị tách
ra nhờ pha động, hiện tượng này được định nghĩa là phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa
các thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa là sự lưu giữ các thành phần này trên cột cao và
do đó thành phần đó sẽ được rửa giải ra khỏi cột trễ hơn thành phần khác. Việc tách riêng các
chất từ một hỗn hợp thành chỉ có thể tiến hành mỗi chất có khả năng hấp phụ và phản hấp phụ
khác nhau đối với pha tĩnh và pha động.
Bình chứa dung môi

Bơm dung môi


Bình chứa mẫu

Bơm mẫu

Valve
mẫu

bơm

Cột sắc ký chế hóa

Detector

Bộ xử lý
dữ liệu

Valve
bơm
phân đoạn

Bình hứng các
phân đoạn

Sơ đồ mô hình sắc ký lỏng chế hóa

HPLC điều chế là một phương pháp hiệu quả và đang được sử dụng rất phổ biến để tách các
chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hỗn hợp hoặc để tinh chế các chất.
Các yếu tố sau đây phải được chú ý đặc biệt:
- Linh hoạt trong việc chọn cột. Số lượng chất và các yêu cầu tách ảnh hưởng khác nhau đến các
vấn đề cần giải quyết. Đơn giản và phù hợp với kinh tế của một vấn đề phân tích cụ thể do đó có

thể giải quyết được.
- Hiệu suất bơm cao hơn. Dung tích cột lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn, do đó tốc độ dòng
cũng cần phải lớn hơn.
- Áp suất lớn hơn. Khuynh hướng của sắc ký điều chế rõ ràng là hướng về chất hấp phụ dạng hạt
mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý
Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3
25

Trang