BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
---------------------------

NGUYỄN KIM ĐỒNG

KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF
VÀ CÁC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2011 – 2015


HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
---------------------------

NGUYỄN KIM ĐỒNG

KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF
VÀ CÁC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2011 – 2015

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
ThS.BS. TRẦN NGỌC MINH
CN. NGUYỄN NGỌC QUÂN


HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực
của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên và chỉ bảo tận
tình của các thầy, các cô, gia đình cũng như bạn bè.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo
Đại học, Bộ môn Giải phẫu bệnh trường Đại học Y Hà Nội, phòng Giải phẫu
bệnh – khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã cho phép và tạo mọi
điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn sâu sắc tới ThS.BS. Trần
Ngọc Minh và CN. Nguyễn Ngọc Quân – cán bộ bộ môn Giải phẫu bệnh
trường Đại học Y Hà Nội. Thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, động viên em
không chỉ trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Thầy đã dành cho em sự
giúp đỡ quý báu trong học tập và còn trong cả cuộc sống.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy, các cô, các anh
chị trong bộ môn Giải phẫu bệnh – Trường Đại học Y hà Nội đã tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ tận tình trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, anh chị
trong phòng Giải phẫu bệnh – khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong

suốt quá trình em thực hiện khóa luận.
Kết quả này con xin dành tặng ông bà, bố mẹ đã luôn ở bên con, chia sẻ
và động viên con suốt cuộc đời.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn tới tất cả những người bạn đã
giúp đỡ, động viên em suốt 4 năm học vừa qua.
Hà Nội, tháng 6 năm 2015


Nguyễn Kim Đồng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PAS

Periodic Acid Schiff

HE

Hematoxylin – Eosin

GMS

Grocott’s Methenamine Silver


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................3
1.1. Giới thiệu về phương pháp nhuộm PAS.....................................................3
1.2. Tổng quan về carbohydrate........................................................................4

1.2.1. Phân loại carbohydrate........................................................................4
1.2.2. Monosaccharide – cấu trúc cơ bản của carbohydrate..........................5
1.2.3. Polysaccharide.....................................................................................6
1.3. Glycogen....................................................................................................6
1.4. Chất nhầy – Mucins....................................................................................7
1.4.1. Chất nhầy trung tính............................................................................8
1.4.2. Chất nhầy acid.....................................................................................9
1.5. Nấm..........................................................................................................10
CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF................12
2.1. Nguyên lý của phương pháp nhuộm PAS................................................12
2.2. Cơ chế phản ứng của kỹ thuật PAS..........................................................12
2.2.1. Phản ứng oxy hóa của acid periodic..................................................13
2.2.2. Phản ứng hiện màu của thuốc thử Schiff...........................................15
2.2.3. Nhuộm nhân......................................................................................18
2.3. Chuẩn bị mảnh cắt và hóa chất nhuộm....................................................20
2.3.1. Chuẩn bị mảnh cắt.............................................................................22
2.3.2. Chuẩn bị hóa chất..............................................................................24
2.4. Quy trình nhuộm......................................................................................29
2.4.1. Quy trình nhuộm PAS theo hướng dẫn của tài liệu “Giải phẫu bệnh vi
thể lâm sàng”...............................................................................................29


2.4.2. Quy trình nhuộm PAS tại phòng Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Đại học
Y Hà Nội......................................................................................................29
2.5. Kết quả.....................................................................................................30
2.6. Tiêu chuẩn của một tiêu bản nhuộm PAS đạt yêu cầu.............................31
2.7. Các kỹ thuật PAS cải tiến.........................................................................33
2.7.1. Kỹ thuật PAS phát hiện glycogen......................................................33
2.7.2. Kỹ thuật nhuộm phối hợp Alcian blue - PAS....................................34
CHƯƠNG 3: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHẤT LƯỢNG NHUỘM

PERIODIC ACID SCHIFF VÀ CÁCH KHẮC PHỤC.................................37
3.1. Cố định.....................................................................................................37
3.2. Cắt và dán mảnh.......................................................................................38
3.3. Tẩy paraffin..............................................................................................39
3.4. Quá trình oxy hóa trong acid periodic......................................................39
3.5. Thời gian phản ứng với thuốc thử Schiff.................................................40
3.6. Nhuộm nhân.............................................................................................41
3.7. Chất lượng hóa chất..................................................................................41
3.8. pH nước rửa.............................................................................................42
3.9. Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới chất lượng tiêu bản nhuộm PAS........42
3.10. Một số kiến nghị nhằm đảm bảo chất lượng tiêu bản nhuộm PAS........43
KẾT LUẬN.....................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số phương pháp pha thuốc thử Schiff.....................................25
Bảng 2.2. Một số cách pha Hematoxyline theo Gill...........................................28

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của β-D-glucose..................................................................5
Hình 1.2. Hai đơn vị glucose liên kết với nhau bởi liên kết α1-4 glycosidic.....6
Hình 2.1. Chuỗi phản ứng trong kỹ thuật PAS..............................................13
Hình 2.2. Acid periodic....................................................................................13
Hình 2.3. Quá trình oxy hóa của acid periodic...............................................14
Hình 2.4. Phản ứng tạo thành thuốc thử Schiff..............................................17
Hình 2.5. Cơ chế nhộm màu của thuốc thử Schiff trong kỹ thuật PAS.........18
Hình 2.6. Hematoxylin bị oxy hóa thành Hematin.........................................19
Hình 2.7. Quá trình gắn hematin vào nhân qua chất gắn màu.............................20



DANH MỤC ẢNH
Ảnh 2.1. Ung thư biểu mô tế bào nhẫn. PAS x 100 và 400.............................31
Ảnh 2.2. Ung thư biểu mô tế bào nhẫn di căn tới tủy xương PAS x 100 và 400.
.........................................................................................................31
Ảnh 2.3. Tế bào gan chứa glycogen. PAS x 100..............................................32
Ảnh 2.4. Nấm Candida bắt màu hồng đậm. PAS x 400..................................32
Ảnh 2.5. Glycogen dương tính với mảnh S, âm tính với mảnh C. PAS x 100.
.........................................................................................................34
Ảnh 2.6. Mô dạ dày có dị sản ruột (Xanh Alcian/PAS). pH =1,5...................36
Ảnh 2.7. Tiêu bản nhuộm nhạt màu do thời gian phản ứng với thuốc thử
SChiff chưa đủ. PAS x 100..............................................................40
Ảnh 2.8. Bắt màu quá mức do thời gian phản ứng với thuốc thử Schiff quá lâu.
PAS x 100.........................................................................................40


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chẩn đoán bệnh, nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau được
sử dụng phối hợp, hỗ trợ nhằm chẩn đoán bệnh một cách chính xác. Thế kỉ 21
là thế kỉ của y học bằng cớ, cho nên chẩn đoán giải phẫu bệnh là một trong
những phương pháp chẩn đoán có vai trò to lớn và vô cùng quan trọng, giúp
quan sát đánh giá tận bản chất của các tổn thương. Vì vậy, trong chẩn đoán
bệnh học hiện đại người ta cho rằng, tiêu chuẩn của chẩn đoán giải phẫu bệnh
gần như được coi là tiêu chuẩn vàng. Để có thể chẩn đoán mô bệnh học, các
mảnh sinh thiết hay tử thiết từ các mô cần phải được nhuộm màu. Các thành
phần khác nhau trong tế bào khi được nhuộm màu sẽ bắt màu riêng biệt, giúp
các nhà mô bệnh học có thể phân biệt rõ ràng các thành phần cấu thành tế bào
và mô, là cơ sở cho chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Có thể sử dụng một loại

phẩm nhuộm hay cùng lúc nhiều loại phẩm nhuộm khác nhau để nhuộm nhiều
thành phần khác nhau của tế bào và mô nhưng phải tuân thủ hai nguyên tắc cơ
bản: một là các phẩm nhuộm phải bắt màu chọn lọc trên từng thành phần mà
không cản trở sự bắt màu của phẩm nhuộm kế tiếp hoặc sau đó; hai là phải đạt
được sự tương phản giữa các thành phần hoặc cấu trúc cần phân tích để có thể
nhận định rõ ràng. Kỹ thuật nhộm Hematoxylin - Eosin (HE) với nhiều ưu
điểm, cho phép phân biệt rõ ràng thành phần nhân và bào tương, cho phép
nhận định khá rõ các thành phần cũng như cấu trúc của tế bào và mô, cung
cấp những thông tin rất có giá trị đã trở thành kỹ thuật thường quy ngay từ
thời kì sơ khai.
Tuy nhiên, với sự đa dạng của các tổn thương, đòi hỏi nhận định các
thành phần cụ thể hơn, cung cấp thông tin đặc hiệu hơn cho các tình trạng
bệnh lí khác nhau thì kỹ thuật nhuộm HE là chưa đủ. Vì vậy, cần có sự ra đời
của các kỹ thuật nhuộm khác nhau phục vụ cho những mục đích khác nhau


2

trong chẩn đoán, giúp cung cấp những thông tin mà kỹ thuật nhuộm HE
không đáp ứng được. Kỹ thuật Periodic Acid Schiff (PAS) được ra đời để đáp
ứng một trong số yêu cầu trên, cung cấp những thông tin hữu ích cho chẩn
đoán mô bệnh học.
Kỹ thuật nhuộm PAS với bản chất hoạt động dựa trên các phản ứng hóa
học kế tiếp nhau, giúp các chất cần phát hiện tạo thành phức hợp với nhóm
mang màu, kết quả là sự nhuộm màu đặc trưng cho một số thành phần ngoài
nhân trong tế bào và mô. Kỹ thuật nhuộm PAS được sử dụng chủ yếu nhằm
phát hiện sự có mặt của glycogen, chất nhầy, nấm và một số thành phần khác
dựa trên cấu trúc hóa học của các thành phần này. Sự có mặt của liên kết giữa
hai nguyên tử carbon trong vòng hexose của các phân tử carbohydrate, có
trong một số nhóm hóa học (các nhóm glycol 1-2, hydro-1, amino-2,

hydroxy-1, alkylamino-2, hydroxyl-1, ceto-2…) ở các thành phần trên là cơ
sở của kỹ thuật nhuộm PAS.
Với những giá trị của mình, kỹ thuật nhuộm PAS ngày càng đóng vai
trò quan trọng trong chẩn đoán mô bệnh học, được phổ biến rộng rãi, song
hành cùng với kỹ thuật HE thường quy. Trong phạm vi bài khóa luận tốt
nghiệp Cử nhân Kỹ thuật y học, em lựa chọn đề tài: “Kỹ thuật nhuộm
Periodic Acid Schiff và các ứng dụng” với mục tiêu như sau:
1. Trình bày tổng quan kỹ thuật nhuộm Periodic Acid Schiff trong chẩn
đoán mô bệnh học.
2.

Nhận xét về một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp nhuộm PAS.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về phương pháp nhuộm PAS
Kỹ thuật PAS được sử dụng lần đầu tiên bởi McManus vào năm 1946
để phát hiện sự có mặt của chất nhầy. Tuy nhiên sau đó nhiều công trình
nghiên cứu khác đã cho thấy của kỹ thuật PAS còn rất hữu ích trong sự phát
hiện các phân tử có chứa carbohydrate khác như là glycogen và đặc biệt là các
glycoprotein. Phản ứng PAS dương tính với nhiều loại mô và tế bào khác
nhau trong cơ thể, với các thành phần như: glycolgen, tinh bột, chất nhầy
(chất nhầy trung tính, sialomucin), màng đáy, nấm…
Kỹ thuật PAS có thể hỗ trợ trong việc chẩn đoán phân biệt các khối u
thông qua việc phát hiện các chất nhầy hoặc glycogen. Phản ứng của thuốc
thử Schiff với glycoprotein có trong màng đáy cho kỹ thuật PAS một phương
tiện có giá trị để đánh giá độ dày màng đáy. Tăng độ dày màng đáy, đặc biệt là

trong các mao mạch cầu thận của thận, là dấu hiệu của một số bệnh lý. Kỹ thuật
PAS cũng là một phương pháp có độ nhạy cao và tương đối đặc hiệu để phát
hiện nấm trong mô dựa trên sự xuất hiện của các polysaccharide phản ứng với
acid periodic trong bao nang hoặc lớp vách của nhiều loài nấm. Một số loài nấm
thông thường dương tính với kỹ thuật PAS bao gồm Candida albicans,
Histoplasma capsulatum, Cryptococcus, và Blastomyces.
Kỹ thuật PAS sử dụng acid periodic làm tác nhân oxy hóa để bẻ gãy
liên kết giữa hai nguyên tử carbon liền kề trong vòng hexose của carbohydrate
có trong mô và làm xuất hiện nhóm chức aldehyde sẽ được phát hiện nhờ
thuốc thử Schiff. Các chất có cấu tạo với hàm lượng lớn carbohydrate sẽ được
phát hiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS dựa trên cấu trúc hóa học của chúng (chất
nhầy, glycogen, màng đáy, nấm).


4

Phương pháp nhuộm PAS thường được sử dụng để chẩn đoán và hỗ trợ
điều trị các bệnh sau:
- Bệnh dự trữ glycogen.
- Ung thư biểu mô tuyến nói chung thường tiết chất nhầy trung tính.
- Nhiễm nấm, thành tế bào của nấm có màu đỏ tươi.
- Bệnh lí cầu thận.
- Ung thư mô liên kết phần mềm dạng nang.
- Bệnh Paget của vú.
- Nhuộm các đại thực bào trong bệnh Whipple.
- Nó có thể được sử dụng để chẩn đoán thiếu hụt α-1-antitrypsin nếu
xung quanh tĩnh mạch cửa của gan dương tính với phương pháp nhuộm này.
- Erythroleukemia, bệnh bạch cầu non trong máu ngoại vi. Những tế
bào này khi nhuộm bắt màu sáng.
- Phế nang phổi có protein (tích tụ protein thừa).

- Còn được sử dụng để xác định glycogen trong mẫu sinh thiết phổi của
trẻ sơ sinh trong bệnh glycogenosis phổi kẽ.
1.2. Tổng quan về carbohydrate
1.2.1. Phân loại carbohydrate
Carbohydrate được chia thành hai loại lớn: carbohydrate đơn giản hoặc
những phân tử gồm hoàn toàn của carbohydrate, và glycoconjugate -những phân
tử gồm carbohydrate và các phân tử khác như protein hoặc lipid. Các
carbohydrate đơn giản được tiếp tục phân loại như monosaccharide (glucose,
mannose, galactose), oligosaccharide (sucrose, maltose), hoặc polysaccharide
(glycogen, tinh bột). Glycoconjugate tiếp tục được chia thành các proteoglycan,
chất nhầy - mucin, glycolipid và glycoprotein 'khác' [1].


5

1.2.2. Monosaccharide – cấu trúc cơ bản của carbohydrate
Monosaccharide là dạng cơ bản nhất và đơn giản nhất của carbohydrate,
có công thức phân tử là (CH2O)n với n nằm trong khoảng từ 3-9. Các
monosaccharide chính là đơn vị cấu trúc nên các oligosaccharide và
polysaccharide. Monosaccharide cơ bản là một carbohydrate đơn giản 6 carbon
như glucose (hình 1). Glucose không tích điện hay bị ion hóa nên được gọi là
một đường trung tính. Ngoài ra còn có các đường trung tính khác như: mannose,
galactose và fructose, chúng là các monosaccgaride có trong tự nhiên ở dạng tự
do và đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sống.
Monosaccharide có hai dạng đồng phân quang học là dạng D và L do vị
trí của các nguyên tử carbon không đối xứng trong phân tử, tuy nhiên
monosaccharide cấu hình D lại chiếm đại đa số trong tự nhiên.

Hình 1.1. Cấu trúc của β-D-glucose.
Sự có mặt số lượng lớn các nhóm hydroxyl (-OH) trong cấu trúc của

các monosaccharide làm cho chúng hầu hết có khả năng hòa tan vô cùng tốt
trong nước. Các monosaccharide có trong mô bệnh phẩm sẽ bị mất đi trong
quá trình cố định do kích thước nhỏ và khả năng hòa tan tốt trong nước của
chúng. Vì vậy, các monosaccharide khó được phát hiện bởi hầu hết các kỹ
thuật hóa mô. Tuy nhiên, monosaccharide là cấu trúc cơ bản của các
carbohydrate phức tạp hơn, chính vì vậy mà các tính chất hóa học, vật lý và
đặc đính của các polysaccharide và glycoconjugate được xác định bởi các
monosaccharide cấu thành cũng như các nhóm phản ứng trong phân tử


6

monosaccharide [1].
1.2.3. Polysaccharide
Là một trong các chất phổ biến nhất trong cuộc sống. Đối với cơ thể
sống polysaccharid có chức năng tạo năng lượng và làm cấu trúc nền tảng cho
thành phần của nhiều tế bào. Trong thành phần của polysaccharide có rất
nhiều các monosaccharide, các monosaccharide này được liên kết với nhau
bởi các liên kết đồng hóa trị được gọi là liên kết glycosidic (hình 2).

Hình 1.2. Hai đơn vị glucose liên kết với nhau bởi liên kết α1-4 glycosidic.
Liên kết α1-4 glycosidic giữa các đơn vị glucose là mối liên kết chủ yếu
trong tinh bột và glycogen. Ngoài ra, một số các đơn vị glucose của các
polysaccharide có thể tham gia nhiều hơn một mối liên kết glycosidic, do đó
tạo thành cấu trúc phân nhánh. Cả glycogen và tinh bột đều bao gồm các đơn
vị glucose với liên kết α1-4 và α1-6 glycosidic, chỉ khác nhau về kích thước
và cấu trúc phân nhánh.
1.3. Glycogen
Glycogen là một polysaccharide đơn giản bao gồm các chuỗi phân
nhánh hoặc chuỗi thẳng mà các đơn vị cấu tạo là D-glucose liên kết với nhau

bởi liên kết α1-4 và α1-6 glycosidic. Glycogen chỉ có ở các loài động vật cũng
như con người mà không có ở thực vật. Glycogen là dạng dự trữ năng lượng
chính của cơ thể người. Carbohydrate được hấp thụ sau bữa ăn được chuyển
đổi thành glycogen bởi các tế bào gan của gan. Khi đói hay khi lượng glucose
trong máu giảm nhanh do hoạt động quá mức, glycogen được chuyển hóa
thành các đơn vị glucose có thể được sử dụng như một nguồn năng lượng


7

ngay lập tức cung cấp cho cơ thể.
Glycogen được phân bố rộng khắp cơ thể, được tìm thấy với số lượng
lớn nhất trong: gan, cơ tim và cơ xương, nang lông, tuyến nội mạc tử cung,
âm đạo và biểu mô vảy cổ tử cung [3]. Glycogen có thể có ý nghĩa chẩn đoán
trong một số loại khối u bao gồm ung thư biểu mô, u trung biểu mô và ung
thư mô liên kết cơ vân. Sự phân phối bình thường glycogen có thể bị gián
đoạn trong các bệnh gây ra bởi sự thiếu hụt enzyme chuyển hóa carbohydrate
như bệnh von Gierke và bệnh Pompe hay sự tích lũy bất thường glycogen
trong mô của bệnh nhân mắc bệnh tích lũy glycogen cũng rất có giá trị.
Glycogen có thể được nhìn thấy bằng kính hiển vi điện tử dưới hai hình
thức chủ yếu:
- Alpha: nhìn thấy như hình hoa thị hoặc cụm hạt beta đường kính
khoảng 60-250nm.
- Beta: nhìn thấy những hạt tự do hoặc là một phần của một hình hoa
thị và có đường kính 20-40nm.
Ngoài ra còn có loại thứ ba, hay gamma, hình thức đã được mô tả trong
gan chuột và là một glycogen không hạt được tìm thấy giữa hạt beta trong hoa
hồng alpha. Glycogen gamma chỉ nhìn thấy khi kali ferixianua được kết hợp vào
một tetroxide cố định osmium, người ta cho rằng một hợp chất được hình thành
là giảm phản ứng với các nhóm hydroxyl của glycogen [2].

1.4. Chất nhầy
Chất nhầy là thành phần chủ yếu của carbohydrate có trong mô, còn
được gọi là mucopolysaccharide, glycosaminoglycan và mucosubtance. Gần
đây, tên glycocojugate được đề nghị là tên chung thay thế cho những tên gọi
trước đó.
Chất nhầy giống như các proteoglycan, bao gồm chuỗi polysaccharide
đồng hóa trị liên kết với một lõi protein thông qua một liên kết O-glycosidic.


8

Trong cấu trúc của chất nhầy còn có sự góp mặt của các acid hexuronic xen kẽ
với hexsoamin, acid sialic hoặc các gốc sulfate, carboxyl. Các nhóm hexose tự
do thường có sẵn cùng với các tính chất nửa acid, sự biểu hiện của các loại
này sẽ ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng hóa mô. Carbohydrate có thể chiếm tới
90% trọng lượng phân tử của chất nhầy.
Chức năng của chất nhầy còn chưa được tìm hiểu hết, phụ thuộc vào
các vị trí mô của tế bào chế nhầy cũng như các loại . Được tiết ra bởi nhiều
loại tế bào biểu mô và mô liên kết, chúng có chức năng như một chất bôi trơn,
hỗ trợ kết dính tế bào hoặc bảo vệ và hình thành một môi trường thích hợp
cho sự khuếch tán các phân tử và ion.
Trong chẩn đoán, phát hiện sự có mặt của chất nhầy có giá trị trong
việc xác định các khối u ác tính. Ngoài ra, việc xác định loại chất nhầy (trung
tính hay acid) có thể hữu ích trong việc đánh giá những thay đổi trong một mô
ung thư. Các phát hiện của acid hoặc sulfomucin trong niêm mạc dạ dày có
thể hỗ trợ trong việc phát hiện và mô tả đặc điểm của dị sản ruột, tổn thương
liên quan đến ung thư dạ dày. Chất nhầy được sản xuất bởi nhiều khối u bao
gồm ung thư biểu mô, liposarcoma và u trung biểu mô. Sự bất thường của hệ
thống sản xuất chất nhầy cũng được tìm thấy trong các bệnh gây ra bởi sự
thiếu hụt enzyme (bệnh Hurler, bệnh Schele, bệnh Hunter) [3].

Phân loại chất nhầy
Chất nhầy được phân thành hai loại lớn bao gồm chất nhầy trung tính
và chất nhầy acid. Có rất nhiều kiểu phụ của chất nhầy acid dựa trên nguồn
gốc (biểu mô, mô liên kết) và cấu trúc phân tử (nhóm sulfate, carboxyl).
1.4.1. Chất nhầy trung tính
Chất nhầy trung tính bao gồm các nhóm hexosamine liên kết với các
nhóm hexose tự do. Các mucin trung tính có chứa một hàm lượng cao của


9

monosacaride nguyên hiện như mannose, galactose, và galactosamine. Có
trong biểu mô và phong phú nhất trong tuyến Brunner của tá tràng và biểu mô
niêm mạc dạ dày. Chất nhầy trung tính thường được tìm thấy với nhiều mức
độ khác nhau trong phần lớn các tế bào hình đài tế bào tiết hình trụ trong biểu
mô đường hô hấp và tiêu hóa và tuyến tiền liệt [2]. Với sự có mặt của số
lượng lớn các monosacaride nguyên liệu, chất nhầy trung tính dễ dàng được
phát hiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS.
1.4.2. Chất nhầy acid
a.

Chất nhầy sulfate mạnh

- Chất nhầy mô liên kết sulfate mạnh:
Chất nhầy này phản ứng tại giá trị pH thấp với các thuốc nhuộm cation
thích hợp và âm tính với PAS thông thường. Có nhiều tế bào sản xuất ra
những chất nhầy sulfate này, là các nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bào
xương, tế bào sụn và các dưỡng bào, tế bào hình chén của đường ruột.
- Chất nhầy biểu mô sulfate mạnh:
Loại này được phân biệt bởi nguồn gốc biểu mô. Chất nhầy biểu mô

sulfate mạnh được tìm thấy trong những tuyến thanh dịch của phế quản và có
thể có một phần nhỏ trong tế bào hình chén của đường ruột. Về mặt hóa mô,
nó phản ứng ở nồng độ pH thấp với những thuốc nhuộm cation tương tự như
những chất nhầy sulfat của mô liên kết.
b.

Chất nhầy sulfate yếu
Chất nhầy này thuộc loại biểu mô, gồm các este sulfate polysaccharide,

trong đó các gốc sulfate tự do được liên kết với những hexosamine khác nhau
như glucosamine. Các nhóm sulfate không điển hình về hóa mô. Chúng được
phân bố rộng trong mô, thường xuất hiện trong những tế bào hình chén của
đại tràng. Các chất nhầy sulfate yếu khác loại sulfate mạnh ở phản ứng tại độ
pH cao hơn với thuốc nhuộm cation.
c.

Carboxylate Sialomucin


10

Enzyme-labile: đây là một chất nhầy có nguồn gốc biểu mô, cấu trúc
bao gồm nhóm N-acetyl. Tên gọi ‘Enzyme-labile’ bởi thực tế N-acetyl
sialomucins bị phân cắt bởi enzyme sialidase (không bền). Được phân bố
rộng trong cơ thể (tuyến dưới niêm mạc phế quản, tuyến nước bọt dưới hàm,
các tế bào hình chén của ruột non) ở dạng đơn hoặc ở dạng hỗn hợp với các
dạng chất nhầy khác (bao gồm cả chất nhầy acid và trung tính). Được phát
hiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS.
Emzym-resistant: enzyme này không bị phân cắt bởi enzyme sialidase
(bền) và âm tính với PAS. Chúng được tìm thấy trong niêm mạc của ruột già,

dạ dày và phế quản.
d.

Sulfate sialomucin
Đây là chất nhầy gặp nhiều trong mô liên kết, có cấu trúc bao gồm các

nhóm carboxylate, acid uronic không sulfate hóa.
Kỹ thuật PAS có khả năng phát hiện được chất nhầy trung tính và Nacetyl sialomucin dựa trên khả năng phản ứng của nhóm hexose trong phân tử
carbohydrate. Các chất nhầy còn lại không được phát hiện bởi kỹ thuật PAS là
do sự có mặt của các nhóm chức khác (sulfate, carboxyl, O-acetyl…). Sự có
mặt của nhóm sulfate khiến chất nhầy phản ứng ở giá trị pH thấp, âm tính với
kỹ thuật PAS thường sử dụng. Nhóm O-acetyl khóa các nhóm hydroxyl lân
cận, bất hoạt các nhóm hydroxyl nên không được oxy hóa bởi acid periodic,
âm tính với PAS [2].
1.5. Nấm
Vi nấm kí sinh là sinh vật có cấu tạo đơn bào hoặc đa bào có nhân thực,
có khả năng xâm nhập vào mọi tổ chức trong cơ thể để gây bệnh. Có bao
nang, lớp vách dày cấu tạo bởi polysaccharide.
Trên tiêu bản mô bệnh học, có thể quan sát được hình thái và kích thước
của nấm. Đánh giá mô học là một cách nhanh chóng và dễ dàng để xác định
và chẩn đoán bệnh do nấm gây ra. Sự có mặt của nấm trong mô là một bằng
chứng rõ ràng của nhiễm trùng xâm lấn.


11

Kỹ thuật nhuộm HE là một kỹ thuật nhuộm linh hoạt cho phép quan sát
và đánh giá nhiều yếu tố trong tế bào và mô. Giúp phát hiện sự có mặt của
nấm hay nhân của các tế bào giống nấm men. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng kỹ
thuật nhuộm HE để chẩn đoán nấm thì còn nhiều hạn chế, khó phân biệt các

nấm bắt màu nhẹ với các thành phần trong mô, kể cả ở độ phóng đại cao hơn.
Khi mật độ nấm có mặt trong mô thấp, nấm có thể bị bỏ qua trong tiêu bản
nhuộm HE do sự tương phản thấp giữa nấm và các thành phần trong mô. Các
đặc điểm hình thái không thực sự rõ ràng, đôi khi có thể gây hiểu lầm. Vì vậy,
cần có các kỹ thuật nhuộm đặc biệt cho nấm. Hầu hết các loại nấm đều có thể
phát hiện bởi các kỹ thuật như Grocott’s Methenamine Silver (GMS) hay
Periodic Acid Schiff (PAS).
Kỹ thuật GMS được ưu tiên trong sàng lọc nhờ sự bắt màu cho độ
tương phản tốt giữa nấm và các thành phần khác trong mô, nhuộm cả phần
nấm thoái hóa và không quan sát được ở hai kỹ thuật PAS và nhuộm nấm
của Gridley. Tuy nhiên, kỹ thuật GMS không cho phép quan sắc tố tự nhiên
của nấm, vì vậy không thể kết luận đó là một loại nấm có sắc tố hay không
có sắc tố. GMS là một kỹ thuật tương đối phức tạp, cho kết quả không ổn
định, thách thức ngay cả những kỹ huật viên giàu kinh nghiệm [4].
Kỹ thuật nhuộm PAS có thể phát hiện được nấm và nha bào nấm, trong
khi đó trên tiêu bản nhuộm HE khó quan sát được, đồng thời cũng không che
giấu màu tự nhiên của nấm, cho thấy đáp ứng viêm khi nhiễm nấm – kỹ thuật
GMS không đáp ứng được. Hơn nữa, kỹ thuật PAS còn thể hiện hình thái nấm
tốt hơn, và cũng không quá phức tạp để nhuộm, cũng cho kết quả nhanh
chóng và ổn định hơn kỹ thuât GMS. Với những ưu điểm của mình, kỹ thuật
PAS được sử dụng trong sàng lọc nấm. Một số loài nấm thông thường dương
tính với kỹ thuật nhuộm PAS bao gồm Candida albicans, Histoplasma
capsulatum, Cryptococcus, và Blastomyces [5].


12

CHƯƠNG 2
KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF
Kỹ thuật nhuộm PAS được sử dụng lần đầu tiên bởi McManus năm

1946 để phát hiện sự có mặt của chất nhầy. Tuy nhiên, nhiều công trình
nghiên cứu sau đó đã cho thấy của kỹ thuật PAS còn rất hữu ích trong sự phát
hiện các phân tử có chứa carbohydrate khác như là glycogen và đặc biệt là các
glycoprotein. Phản ứng PAS dương tính với nhiều loại mô và tế bào khác
nhau trong cơ thể, như: glycolgen, tinh bột, chất nhầy (chất nhầy trung tính,
sialomucin), màng đáy, nấm… Kỹ thuật nhuộm PAS được nghiên cứu và
hoàn thiện hơn theo thời gian, song hành cùng kỹ thuật nhuộm HE thường
quy cung cấp rất nhiều thông tin rất có giá trị trong chẩn đoán, giúp điều trị và
tiên lượng bệnh.
2.1. Nguyên lý của phương pháp nhuộm PAS
Sử dụng một tác nhân oxy hóa là acid periodic (HIO 4) để phá vỡ mối
liên kết của hai nguyên tử carbon trong một số nhóm hóa học: glycol 1-2,
hydroxy-1 amino-2, hydroxy-1 alkylamino-2, và hydroxyl-1 ceto-2… có
trong các phân tử carbohydrate làm xuất hiện các nhóm chức aldehyde
(-CHO) có khả năng hoạt động hóa học. Các nhóm aldehyde này được phát
hiện nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff (fuchsin basic không màu bởi acid
sulfurous) tạo thành hợp chất có màu hồng cánh sen [6].
2.2. Cơ chế phản ứng của kỹ thuật PAS
Là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong các labo giải phẫu
bệnh học, kỹ thuật PAS được xây dựng dựa trên cấu trúc của các đơn vị
monosaccharide tạo thành, đó là chuỗi phản ứng hóa học liên tiếp gồm hai
giai đoạn kế tiếp nhau, xảy ra dưới tác dụng của acid periodic và thuốc thử


13

Schiff để tạo thành một sản phẩm cuối cùng có màu hồng cánh sen quan sát
được trên kính hiển vi.
Polysaccharide


Hình 2.1. Chuỗi phản ứng trong kỹ thuật PAS.
2.2.1. Phản ứng oxy hóa của acid periodic
Đây là bước đầu tiên trong kỹ thuật PAS, sử dụng acid periodic như
một tác nhân oxy hóa nhằm mục đích phá vỡ liên kết giữa hai nguyên tử
carbon liền kề của một số nhóm hóa học có trong phân tử carbohydrate (các
nhóm glycol 1-2, hydroxyl-1 amino-2, hydroxyl-1 alkylamino-2 và hydroxyl1 ceto-2). Kết quả đạt được là sự xuất hiện của các nhóm aldehyde tự do cũng
như phân cắt liên kết giữa hai nguyên tử carbon liền kề kể trên. Sự xuất hiện
của các nhóm aldehyde là cơ sở cho phản ứng tiếp theo với thuốc thử Schiff
để nhận biết sự có mặt của carbohydrate. Mặt khác, với các tiểu phần
monosacarit vắng mặt nhóm glycol 1-2 hoặc có chứa nhóm hydroxyl có liên
quan đến một ester hoặc liên kết glycosidic không dễ bị oxy hóa bởi acid
periodic và do đó không thể được phát hiện bằng các kỹ thuật PAS.

Hình 2.2. Acid periodic.


14

H

α-D-glucose

dialdehyde

H

NH2

hydroxy-1 amino-2


dialdehyde

Hình 2.3. Quá trình oxy hóa của acid periodic.
Trong quy trình kỹ thuật nhuộm PAS, acid periodic được sử dụng có
nồng độ từ 0,5-1% với thời gian oxy hóa là từ 5-10 phút cho kết quả tối ưu
nhất. Acid periodic là tác nhân oxy hóa rất tối ưu trong sự phát hiện các nhóm
1-2 glycol và nhiều cấu trúc mô học khác nhau. Sự tối ưu này do tính tính oxy
hóa của acid periodic, chỉ oxy hóa các nhóm 1-2 glycol thành các nhóm
aldehyde mà không có sự oxy hóa quá mức thành các nhóm carboxyl làm
giảm lượng aldehyde được tạo thành – oxy hóa một nấc. Nên không gây hiện
tượng âm tính giả do giảm số lượng nhóm aldehyde tạo thành.
Mặc dù được sử dụng nhiều nhất và cho kết quả tối ưu nhất nhưng acid
periodic không phải là tác nhân oxy hóa duy nhất có thể sử dụng trong phản
ứng này mà có thể sử dụng tác nhân oxy hóa khác như: acid cromic, kali
permanganate, acid performic, acid peracetic và chì tetracetate. Tuy nhiên, các


15

tác nhân oxy hóa này có tính oxy hóa quá mạnh nên ít được sử dụng. Như
acid cromic sau khi phản ứng để bộc lộ các nhóm aldehyde sẽ tiếp tục oxy
hóa chính các nhóm aldehyde vừa tạo ra thành các nhóm carboxylic – oxy hóa
hai nấc, nhóm carboxylic này không thể phát hiện được bằng phản ứng với
thuốc thử Schiff. Điều này sẽ dẫn tới trường hợp âm tính giả hay sự nhạt màu
giả tạo do sụt giảm số lượng các nhóm aldehyde tạo thành, không phản ánh
chính xác các thành phần của mô và gây khó khăn cho chẩn đoán [1].
Tuy nhiên, trong trường hợp phát hiện sự có mặt của nấm còn sử dụng
tác nhân oxy hóa khác. Nguyên nhân do sự bắt màu không đặc hiệu với nấm
mà bắt màu với nhiều thành phần trong mô, vì vậy làm giảm sự tương phản về
màu sắc giữa tế bào nấm và màu hồng của nền. Trong trường hợp này, acid

cromic sẽ được sử dụng để oxy hóa. Sự oxy hóa quá mức của acid cromic có
lợi trong sự phát hiện tế bào nấm. Acid cromic tiếp tục oxy hóa các nhóm
aldehyde được tạo thành thành các nhóm carboxylic, nhưng các tế bào nấm
với đặc điểm riêng với lớp vỏ rất dày cấu tạo bởi polysaccharide sẽ không bị
oxy hóa hoàn toàn thành acid carboxylic vì vậy vẫn phát hiện được. Điều này
cho phép giảm cường độ nền, các thành phần dễ bị oxy hóa sẽ không bắt màu,
giúp cho các loại nấm và các cấu trúc khác có thể xuất hiện nổi bật hơn do sự
tương phản rõ rệt giữa các thành phần khác nhau có trong mô [7].
2.2.2. Phản ứng hiện màu của thuốc thử Schiff
Sau khi các nhóm aldehyde được bộc lộ bởi quá trình oxy hóa của acid
periodic, cần có một quá trình tiếp theo là gắn màu cho các sản phẩm có
nhóm aldehyde được tạo thành từ mô để quan sát trên kính hiển vi. Chất được
sử dụng trong kỹ thuật nhuộm PAS là thuốc thử không màu Schiff. Thuốc thử
Schiff cũng có khả năng phản ứng với các nhóm ceton, nhưng được bỏ qua
trong thực tế.