Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Mở đầu
Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 29 tỷ lít rượu vang. Trong đó
các nước sản xuất nhiều nhất là: Pháp, I-tali-a, Angie-ri [12]. Tuyệt đại đa
số các loại rượu vang sản xuất từ quả nho nên danh từ Vang nho đồng nghĩa
với danh từ Vang. ở các nước nhiệt đới nóng ẩm như nước ta, diện tích đất
trồng nho còn hạn hẹp và chất lượng nho còn thấp. Ngược lại, chúng ta có thể
sản xuất rượu vang từ các loại quả khác như: vải, táo, dâu có chất lượng và
hương vị đặc trưng cho từng loại quả [4].
ở Việt Nam, việc sản xuất vang nho bắt đầu xuất phát từ một số cơ sở
nhỏ, lẻ, sau đó phát triển thành các nhà máy như nhà máy vang Thăng Long,
Gia Lâm, Thanh Ba, Đà Lạt Trong sản xuất rượu vang tuỳ phương thức sản
xuất và loại quả chế biến mà cho ra các loại vang khác nhau. Nước ta do khí
hậu nhiệt đới nên các loại cây hoa quả phong phú, trong đó nhiều loại quả có
thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang. Miền núi phía Bắc nước
ta có cây táo mèo cho quả có vị và hương thơm rất đặc trưng.
Hiện nay, quả táo mèo vẫn chủ yếu là ăn tươi, ngâm rượu, ngâm dịch si
rô. Tổng diện tích trồng táo mèo khoảng 40.000 ha [14,15]. Nơi có diện tích
cây táo mèo nhiều là các tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Sơn La, Điện Biên, Lai
Châu. Nhưng hiện nay có một số vấn đề tồn tại là sản lượng quả hàng năm rất
lớn mà số lượng mang đi tiêu thụ là không đáng kể (khoảng 35%). Số còn lại
thường bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ, vận chuyển khó khăn
hoặc giá thành quá rẻ. Trong khi đó, đời sống bà con các dân tộc ở những
vùng này còn gặp rất nhiều khó khăn.
Ngành sản xuất rượu vang ở Việt Nam đang phát triển và có nhiều sản
phẩm bán trên thị trường. Tuy nhiên, đây là ngành sản xuất khá mới, đang trên
đường tìm kiếm nguồn nguyên liệu phù hợp. Trong khi đó, nước ta lại có

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

nguồn táo mèo lớn nên nếu tận dụng được loại quả này sẽ đem lại nguồn
nguyên liệu lớn. Hơn nữa nó sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho người dân
các dân tộc vùng cao.
Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang
theo chúng tôi là có triển vọng phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Chúng tôi đã
chọn và tiến hành công trình nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt
độ, hàm lượng men giống, nồng độ (NH4)2SO4 tới quá trình lên men vang
táo mèo.
* Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo
mèo.
- Nghiên cứu một số nhân tố nhiệt độ, hàm lượng men giống, nồng độ
(NH4)2SO4 được dùng cho lên men vang táo mèo, lên men vang táo mèo với
quy mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu vang từ quả táo mèo.
* Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae).
- Chủng nấm nem Saccharomyces cerevisiae thuần chủng phân lập
được từ quả táo mèo. Chúng tôi đã tiến hành phân lập được 38 mẫu và chọn ra

được một chủng Saccharomyces cerevisiae D2.
* ý nghĩa khoa học của đề tài
Công trình nghiên cứu của chúng tôi nhằm đáp ứng yêu cầu khoa học
về ý nghĩa lý luận và thực tiễn như sau:

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá
của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D2 có khả năng lên men vang
táo mèo.
Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn nhằm sản xuất một loại rượu vang
phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị trường vang
trong nước.
Công trình của chúng tôi còn mang ý nghĩa thực tế đó là tạo nguồn tiêu
thụ quả táo mèo nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

3

K29B - Sinh



Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Khái quát chung về rượu vang
1.1.1. Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:
Cồn (etanol): do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn
aldehit, este. Độ cồn của rượu vang từ 10 -> 12 độ nên nhiều người uống được.
Chất bổ dưỡng: đường trong vang có từ 62 132g/l, chủ yếu là fructoza,
glucoza, và một ít galactoza.
Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit xitric, axit oxalic
hàm lượng axit tổng số từ 4 7g/l (quy ra axit tartaric).
Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình
lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần.
1.1.2. Phân loại vang
Có nhiều cách phân loại khác nhau có thể căn cứ vào màu sắc của sản
phẩm mà phân thành các loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng và tương ứng
các loại vang này đều có các chỉ tiêu giới hạn về màu sắc nhất định. Chẳng
hạn vang đỏ là vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm; vang trắng là vang có màu
vàng rơm đến vàng ánh; vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi.
Căn cứ vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit có trong vang
mà phần thành các loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt
Xu hướng chung thì vang phân thành hai nhóm chính là vang không có
gas (trong vang thành phẩm không có CO2) và vang có gas (trong vang thành
phẩm có CO2).


Trường ĐHSP Hà Nội 2

4

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nguyên liệu để sản xuất là dịch trái cây từ các loại quả: Mơ, táo mèo,
vài, dứa, lê, nho (Bảng 1.1.3).
Bảng 1.1.3. Thành phần hoá học của các loại quả

Tên quả

Thành phần hoá học
Nước

Đường

Axit tổng số

Pectin

Tanin

Nho ngọt


73,1

9,88

0,56

0,092

0,07

Vải

84,28

16,1

5,16

0,249

0,83

Dứa

54,3

3,9

0,6


-

-

Mơ

73,8

9,0

1,1

-

-

Dâu

84,74

9,19

0,49

0,31

0,035

1.1.4. Thành phần hoá học cơ bản của dịch táo mèo

Theo kết quả phân tích thành phần cơ bản của quả táo mèo được tiến
hành tại Viện công nghiệp thực phẩm thì quả táo mèo bao gồm các thành phần
cơ bản sau:
Bảng 1.1.4. Thành phần cơ bản của quả táo mèo
STT

Thành phần hoá học

Đơn vị

1

Đường tổng số

2

Nơi thu mẫu

Trung bình

Yên Bái

Sơn La

%

4,8

4,82


4,81

Axit tổng số

%

1,45

1,48

1,47

3

VitaminC

mg/l

11,0

11,4

11,22

4

Nước

%


84,0

85,1

84,6

5

Protein toàn phần

0,92

0,92

0,92

6

pH

2,8

3,0

2,9

Trường ĐHSP Hà Nội 2

5


K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy các chỉ tiêu cơ bản như hàm lượng
đường: 24,81%; pH = 2,9; axit tổng số:1,47% của quả táo mèo phù hợp với
yêu cầu lựa chọn làm nguyên liệu để lên men rượu vang.
1.1.5.Tng trữ rượu vang
Vang được tng trữ từ 1 đến 5 năm hoặc có thể tng trữ hàng trăm năm.

Trong thời gian này xảy ra quá trình oxy hoá - khử màu tím sang màu đỏ tía,
vang trắng chuyển sang vang vàng thậm chí đỏ nâu. Thành phần axit tăng, độ
cồn giảm, este và hương vị tăng lên [4,8].
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men
1.2.1. Sơ lược về nấm men Saccharomyces
Nấm men (Yearst) là tên chung chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn
bào, sinh sản bằng lối nảy chồi. Từ năm 1857, Pasteur đã nghiên cứu khá tỷ
mỉ về rượu vang.
Nấm men phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nước, không
khí, thực phẩm, hoa quả), nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu. Vì
vậy, từ lâu con người đã sử dụng nấm men để sản xuất rượu, bia. Nấm men
sinh sản nảy chồi nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu protein, vitamin. Vì
vậy, chúng còn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm.
Nấm men cũng được sử dụng làm nở bột mì, gây hương nước chấm, sản xuất
một số dược phẩm, gần đây còn được sử dụng để sản xuất lipit [4].
Tuy nhiên, bên cạnh những nấm men có ích cũng có một số loại gây
bệnh cho người, gia súc hoặc làm hỏng thực phẩm.

1.2.2. Hình thái và kích thước của tế bào nấm men Saccharomyces
Tế bào nấm men có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van. Kích
thước của tế bào khoảng 3 10 mm x 5 12 mm. Hình dạng kích thước tế bào
điển hình chỉ được tạo ra trong điều kiện môi trường phù hợp. Khi điều kiện

Trường ĐHSP Hà Nội 2

6

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

bất lợi thì hình dạng, kích thước tế bào sẽ bị biến dạng (khi môi trường nghèo
dinh dưỡng nấm men có hình đế giày).
Nấm men có cấu tạo đơn bào nhưng phức tạp hơn vi khuẩn. Về mặt hoá
học có sự phân bố rõ ràng. Tế bào Saccharomyces được bao bọc bởi lớp thành
tế bào, thành tế bào là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế
bào có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghệ sản xuất bia. Bên
trong là màng nguyên sinh ăn sâu vào màng lưới nội chất.
Cấu tạo chủ yếu của tế bào là hemixenluloza chiếm 70% trọng lượng
khô (trong đó 31% manman, 29% glucan) ngoài ra chứa 1- 3% kitin, 6 10%
protein, 8,5% lipit, 7% chất khoáng.
Không giống với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có ty thể. Ty thể
của nấm men có dạng hạt, có thể thay đổi tùy điều kiện nuôi cấy cũng như
trạng thái sinh lý của tế bào, kích thước ty thể khoảng 0,2 0,6 mm, có màng
bọc trong suốt, mỏng 60 80, có tính thấm cao. Màng có cấu tạo hai lớp, lớp

trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược. Lớp ngoài có cấu trúc
bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể có cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất protein,
lipit trong đó chiếm một lượng lớn nucleoprotein, photpho lipit. Số lượng ty
thể trong tế bào nấm men khoảng từ 10 20, chúng tham gia vào quá trình
sinh trưởng tế bào, sự hình thành và nảy chồi của bào tử.
Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào được
hình thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao
và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa một hệ
thống keo trong đó bao gồm cả điện tử, enzym, protein, hydrocacbon, các
muối canxi, kali, phenolflavin, riboflavin, axit nucleic. Hình dạng của không
bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào
thường xảy ra phản ứng oxy hoá - khử nhờ hệ thống xitocrom oxidaza trong

Trường ĐHSP Hà Nội 2

7

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

không bào. Trong môi trường giàu hydrocacbon tế bào dự trữ glicogen,
glicogen của tế bào nấm men được tích luỹ nhiều.
Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật. Nhân có hình ô
van, hình tròn gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4 mm. Nhân
tế bào được bao bọc bởi hai lớp màng, mỗi màng có cấu trúc gần như màng cơ
sở gồm 3 lớp phân tử. Những lớp này có liên hệ ở gần lỗ màng nhân. Lỗ màng

nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất ở tế bào.
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces
Trong điều kiện bình thường, tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảy
chồi. Trong điều kiện không thuận lợi, một số có thể chuyển sang sinh sản
bằng bào tử.
Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến mức độ nhất định thì trên cơ thể nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là
mầm (chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế
bào mẹ. Cùng một lúc, tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi ở nhiều phía khác
nhau, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế
bào mẹ.
Sau khi nảy mầm, tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập,
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi, tế bào con hoàn chỉnh và tách khỏi
tế bào mẹ là 20 30 phút.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi
được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi nang chứa 1 8 bào
tử. Nấm men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử
túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào
nấm men. Tiếp theo, bào tử này lại sinh sản theo lối nảy chồi.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

8

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp


Bùi Thị Tuyết

1.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá, vi sinh khi lên men rượu vang
Quá trình sản xuất rượu vang được bắt đầu bằng công đoạn ép nước
quả. Trong quá trình lên men rượu vang, giai đoạn đầu nấm men bắt đầu sinh
sản. Môi trường dịch quả ban đầu vẫn còn oxy, kích thích sự phát triển của
nấm men. Sau đó tạo điều kiện cho lên men etylic yếm khí nhanh chóng được
thiết lập, cacbonic tạo ra chiếm chỗ toàn bộ khoảng không.
Quá trình lên men rượu etylic và CO2 được hình thành mạnh mẽ thường
được hình thành sau vài ngày.
Sự lên men rượu etylic được biểu diễn theo phương trình hoá học:
C6H12O6 đ 2C2H5OH + 2CO2 + 33 kcal
Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men
hoặc tổn thất dưới dạng nhiệt khi lên men rượu.
Sự lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Là giai đoạn hoạt hoá phân tử hecxoza.
Biến đổi glucoza thành fructoza 1.6 diphotphat dưới xúc tác của enzim
hecxokinase và izomerase.
*Giai đoạn 2: Quá trình biến đổi fructoza 1.6 diphotphat tạo thành 3
photphoglixeraldehit và photphodioxiaxetol nhờ xúc tác của enzym aldolase.
*Giai đoạn 3: Trước hết là 3 photpho glixeraldehit biến đổi thành
glyxeraldehit nhờ xúc tác của enzym photpho glyxeromutase. Giai đoạn cuối
của quá trình này là sự biến đổi 2 photpho glyxerat thành axit pyruvic nhờ
xúc tác của enzym aldolase và photphopherase.
*Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetaldehit có xúc tác của enzym
alcoldehidrogenaza.

Trường ĐHSP Hà Nội 2


9

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường còn lại ít trong môi
trường nên nấm men sẽ sử dụng các glycogen đã được tích luỹ trong đó. Do
đó hàm lượng glycogen trong tế bào giảm dần. Với mỗi loại đường khác nhau
thì tốc độ lên men của chủng Saccharomyces khác nhau. Tốc độ lên men
đường glucoza và fructoza nhanh hơn đường saccaroza.
Tốc độ lên men được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ một thể tích
môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian.
Kết quả của quá trình lên men rượu có thành phần rất phức tạp, những
vật chất của dịch quả đã chịu sự biến đổi lớn, đạm cùng chịu nhiều biến đổi
hoá học. Từ các axit amin tương ứng tạo ra các rượu bậc cao như amylic,
propylic, izobutylic. Những rượu bậc cao có trong vang với số lượng không
lớn nhưng đóng vai trò quyết định trong quá trình tạo hương rượu vang. Sự cân
bằng của những sản phẩm lên men được Pasteur nghiên cứu và cho kết quả:
100g glucoza tạo ra 40g etylic; 46,5g CO2; 3,3g glixeryl; 0,6g axit xucxinic;
1,2g axit lactic và axit axetic.
Thực tế, rượu etylic tạo ra luôn thấp hơn lý thuyết khoảng 5%. Đường
tiêu thụ để tạo sản phẩm phụ và 1% nuôi nấm men.
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
Nấm men phổ biến được dùng rộng rãi nhất trong sản xuất là loài
Saccharomyces cerevisiae. Nấm men chứa trung bình 75% nước, 25% chất

khô.
Theo quan điểm kinh tế, người ta chia nấm men thành các chủng:
- Chủng lên men với hiệu suất cao, ở thời gian tối ưu sản xuất tới 20%
V cồn.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

10

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

- Chủng chịu thời gian thấp sản sinh 8 -12% V cồn, thậm chí ở nhiệt độ
thấp 4 100C không bị kìm hãm.
- Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men được trong rượu vang dưới 30%
đường với sản lượng cồn 10 13%V.
1.4.2. Vi khuẩn
Trong nước hoa quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn
có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ.
Chúng có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong
rượu vang về vị chua, mùi, có loài còn gây đục vang.
Đó thường là các loại vi khuẩn Acetobacter xyllium, Acetobacter aceti,
lactic, axetic Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang trong các vi sinh vật khi
rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [4,14].
Do vậy, để bảo quản rượu vang, người ta dùng phương pháp thanh trùng
Pasteur nhưng nó lại làm giảm chất lượng rượu vang. Ngoài ra, người ta còn

dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO2
(75 120mg/l).
1.4.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc do bụi không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [6,9,14].
1.4.4. Bệnh vang
Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất rượu
vang. Vấn đề bệnh vang được khám phá đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm
cho rượu bị chua, mùi vị khó chịu và phẩm chất rượu giảm rất nhanh [4,7].

Trường ĐHSP Hà Nội 2

11

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm
men
1.5.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng
enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, những hợp chất
cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của vi sinh vật. Nguồn thức ăn chủ
yếu của nấm men là hidrat cacbon. Nó đáp ứng 3 nhu cầu sau của nấm men:
- Sản sinh năng lượng.

- Tạo thành những tiền chất.
- Thực hiện quá trình oxi hoá - khử.
1.5.2. Nguồn nitơ vô cơ và nguyên tố khoáng
Trong quá trình sống, nấm men cần nitơ để kiến tạo tế bào. Do đó môi
trường cung cấp nấm men phải cung cấp đầy đủ nitơ mà nấm men có thể đồng
hoá.
Các nguyên tố khoáng như S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi
chất của tế bào nấm men. Ion Fe+3, Mg+2 nằm trong thành phần của enzym
hoạt động [4].
1.5.3. ảnh hưởng của oxi đến gây giống và lên men
Trong lên men, giai đoạn đầu cần oxi để tăng sinh khối tế bào nấm
men. Sau đó, quá trình lên men rượu diễn ra ở điều kiện yếm khí để tăng hiệu
quả cồn.
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang
1.6.1. ảnh hưởng của nhiệt độ

Trường ĐHSP Hà Nội 2

12

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm
men và chất lượng của vang.
- Nhiệt độ < 200C: Sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp.

- Nhiệt độ < 100C: Không diễn ra quá trình lên men.
- Nhiệt độ ở 350C: Nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không
chết nhưng mất tác dụng.
- Nhiệt độ > 350C: Quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi
khuẩn hoạt động, đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic
gây chua, giảm chất lượng vang.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26 280C [8].
1.6.2. ảnh hưởng của nồng độ cồn
Khả năng chịu cồn cao và lên men được trong môi trường có nồng độ
cồn hợp lý là một trong những yêu cầu của chủng lên men rượu vang vì trong
quá trình lên men luôn sinh ra cồn. Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt hoạt
động sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hoá hydrat
cacbon và nitơ.
Nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt là 9 14% V.
1.6.3. ảnh hưởng của pH
pH ở các độ khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác
nhau, pH: 2 3 thì quá trình lên men yếu, pH: 6,4 7,5 thì quá trình lên men
dừng lại.
pH thích hợp cho sự lên men là 4 5.
1.6.4. ảnh hưởng của hàm lượng giống

Trường ĐHSP Hà Nội 2

13

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp


Bùi Thị Tuyết

Hàm lượng giống tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp, thì
thời gian nhân giống và lên men kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại
hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ
ngắn hơn và hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn cho sự áp đảo thay đổi
thành của nấm men. Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi
thành phần môi trường lên men, sẽ không có lợi cho quá trình lên men và chất
lượng rượu vang.
Nhìn chung, hàm lượng nấm men giống thích hợp nhất trong dịch lên
men từ 4 10 triệu tế bào /1 ml dịch lên men.
1.6.5. ảnh hưởng của hàm lượng đường
Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men vang là 12 25%.
Hàm lượng đường 30% V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy, khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm
lượng axit trong vang cũng cao. Mặt khác, tỉ lệ các loại đường có trong dịch
lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men. Kết quả
nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho
sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men cũng như quá trình tạo rượu,
tiếp đó là đường fructoza và đường sacaroza. Vì vậy, quả có chứa hàm lượng
đường khử cao càng có lợi cho quá trình lên men và chất lượng của vang thành
phẩm [ 4,6,8,14].

Trường ĐHSP Hà Nội 2

14

K29B - Sinh



Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Chương 2. Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo (Docynia indica) được thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái
(Trạm Tấu) và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có
vị trí phân loại theo Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty
(1997) sau đây:
Lớp: Hemiascomycetes
Bộ: Endomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Cerevisiae
2.1.2. Hoá chất
Các loại đường chuẩn ( hãng BDH Anh) saccaroza, fructoza, glucoza.
Một số chất vô cơ, hữu cơ MgSO4.7H2O, KH2PO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4,
NaOH, HCl, axit xitric. Rượu etylic, pepton, agar, phenolphtalein.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

15


K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

- Thiết bị: Bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng cấy vô trùng, tủ sấy,
cân phân tích, máy lắc, đường kế, kính hiển vi quang học có độ phóng đại
1000 lần.
2.1.4. Môi trường
Dựa vào kết quả phân tích tính chất của nấm men Saccharomyces
cerevisiae chúng tôi chọn môi trương vô cơ theo tỷ lệ sau:
2.1.4.1. Môi trường Hansen (MT1) g/l
1. Đường glucoza: 50g
2. Pepton: 5g
3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1g
5. (NH4)2SO4: 1g
6. Thạch aga: 20g
7. Nước: 1000ml
2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2) g/l
1. Đường glucoza: 50g
2. Pepton: 5g
3. MgSO4.7H2O: 0,5g
4. KH2PO4: 1g
5. (NH4)2SO4: 1g
6. Nước: 1000ml
2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3) g/l
1. Dịch sirô hoa quả: 200ml


Trường ĐHSP Hà Nội 2

16

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

2. MgSO4.7H2O: 0,5g
3. KH2PO4: 1g
4. (NH4)2SO4: 1g
5. Nước: 1000ml
2.1.4.4. Môi trường nitơrat (MT4)g/l
1. Glucoza: 20g
2. MgSO4. 7H2O: 0,5g
3. Thạch: 20g
4. KH2PO4: 1g
5. Nước cất: 1000ml
6. KNO3: 0,78g
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Trong công trình này chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên
cứu sau đây:
2.2.1. Phương pháp vi sinh
Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men dựa trên việc nghiên cứu hình
thái tế bào nấm men, xác định số lượng tế bào nấm men, hoạt lực lên men.
2.2.2.Phương pháp hoá lý

Xác định hàm lượng đường tổng số bằng khúc xạ kế, hàm lượng đường
sót bằng phương pháp DNS, hàm lượng cồn bằng phương pháp bicromatkali,
hàm lượng axit tổng số theo axit tartaric, dựa vào nguyên tắc trung hoà axit
bằng dung dịch NaOH 0,1N, xác định pH bằng máy đo pH.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

17

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

2.2.3. Phương pháp phân tích cảm quan
2.2.4. Phương pháp xử lý các kết quả thu được bằng thống kê toán
học
- Giá trị trung bình số học:
n

X=

ồ

Xi

i= 1


n

- Độ lệch chuẩn:

ồ

S=

ồ

S=

(X i - X)2
n- 1
(X i - X)2
n

( nếu n < 30)
( nếu n 30)

- Sai số trung bình học:
m=

S
n

- Hệ số biến thiên:
C% =

S

. 100%
X

Trong đó:
n: Số lần nhắc lại.
Xi: Giá trị của lần thứ i.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae tuyển chọn trên đối tượng là
quả táo mèo thu được từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

18

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Chương 3. Kết quả nghiên cứu
và thảo luận
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men lên
men vang táo mèo
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là quả táo mèo. Quả sau
khi thu hoạch về thì lựa chọn quả đã chín, loại bỏ quả non, dập nát, thối rữa

sau đó rửa sạch để ráo nước, khía các đường nhỏ quanh quả rồi cho vào các
ang thùng ngâm đường theo tỷ lệ 1:1 sau 2 ngày khuấy trộn một lần. Sau một
tháng, ta thu được một lượng sirô có nồng độ đường từ 60 80% và nhiều
dưỡng chất khác được chiết ra từ dịch quả.
Từ dịch quả tự nhiên, chúng tôi tiến hành phân lập trên hộp pêtri được
38 mẫu nấm men. Từ 38 mẫu này, chúng tôi tiến hành tuyển chọn được ba
khuẩn lạc có đường kính lớn, trơn, nhẵn, bóng, lồi, bờ không có răng cưa làm
đối tượng nghiên cứu tiếp theo. Các chủng này được kí hiệu là D1, D2, D3.
Sau đây là ảnh chụp khuẩn lạc và tế bào nấm men S. cerevisiae

Trường ĐHSP Hà Nội 2

19

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

ảnh 3.1.1.a. ảnh chup của khuẩn lạc nấm men S. cerevisiae
trên môi trường thạch đĩa.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

20

K29B - Sinh



Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

ảnh 3.1.1.b. ảnh chụp tế bào nấm men S. cerevisiae trên
kính hiển vi quang học x 1000
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và
chất lượng của vang. Vì vậy, khi tuyển chọn phải lấy được chủng tốt nhất. Từ
đó, chúng tôi lựa chọn chủng nấm men dựa vào các chỉ tiêu sau:
- Chịu được độ đường và độ axit cao.
- Có hiệu suất lên men cao.
- Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
- Tạo được hương thơm đặc trưng, không có vị lạ, không sinh độc tố, ổn
định lâu dài trong sản xuất.
3.1.2.1. Nghiên cứu hoạt lực lên men của ba chủng nấm men đã tuyển
chọn
Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men được đánh giá bằng lượng
CO2 thoát ra. Lượng CO2 thoát ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng
lớn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên môi trường là dịch sirô táo mèo có bổ
sung cao men và được pha loãng để đạt nồng độ đường là 20%. Tiến hành lên
men trong các bình tam giác ở quy mô 150ml với thời gian là 36h. Chúng tôi
thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.2.2.1.
Bảng 3.2.2.1. Thử hoạt lực lên men của ba chủng nấm men
STT
1

Chủng
D1


độ pH
3

3,5

4

4,5

5

+

+

+ +

+ +

+

2

D2

+ +

+ + +


+ + + +

+ + + +

+ + +

3

D3

+ +

+ +

+ + +

+ + + +

+ +

Trường ĐHSP Hà Nội 2

21

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết


Trong đó : + + + +: Hàm lượng CO2 tạo ra > 30g/l dịch lên men.
+ + +: Hàm lượng CO2 từ 15 25g/l dịch lên men.
+ + : Hàm lượng CO2 từ 10 15g/l dịch lên men.
+: Hàm lượng CO2 < 10 g/l dịch lên men.
Từ kết quả cho thấy:
Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở pH: 4 4,5.
Chủng có hoạt lực lên men mạnh nhất D2.
3.1.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men đường
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên môi trường dịch sirô táo mèo có
hàm lượng đường 240g/l, pH: 4, nhiệt độ lên men là 28 320C, số lượng giống
ban đầu (3,8 0,2)x 106 tb/ml. Sau khi kết thúc qúa trình lên men rượu (15
17 ngày), chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả
năng lên men của các chủng nấm men và kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở
bảng 3.1.2.2.
Bảng 3.1.2.2. Khả năng lên men của ba chủng nấm men
Chỉ tiêu đánh giá

Đơn vị

Đường tổng số

Chủng nấm men
D1

D2

D3

g/l


75

50

70

Đường khử

g/l

0,75

0,45

0,7

Độ cồn

%V

9,76

11,17

9,84

Hiệu suất lên men

%


76,2

87,1

76,6

Từ kết quả trên, ta thấy rằng chủng D2 có hiệu suất lên men và độ cồn
cao nhất, lượng đường khử thấp nhất.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng kết lắng, khả năng tạo hương
thơm và độ trong của sản phẩm.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

22

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

3.1.2.3. Khả năng tạo hương thơm
Sau khi kết thúc lên men (90 ngày), chúng tôi xác định khả năng tạo
hương thơm bằng phương pháp cảm quan bằng cách mở nút từng bình lên men
sau đó đưa gần lên mũi so sánh độ thơm của các bình. Chúng tôi thu được kết
quả dẫn ra ở bảng 3.1.2.3.
Bảng 3.1.2.3. Khả năng tạo hương thơm của ba chủng nấm men
STT


Chỉ tiêu đánh giá

1

Độ thơm

Tên chủng nấm men
D1
ít thơm

D2

D3

Thơm

Thơm

Kết quả phân tích cho thấy, chủng D2 , D3 đạt hương thơm tốt hơn
chủng D1.
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu của ba chủng nấm men, chúng tôi thu
được kết quả sau:
Bảng 3.1.2. Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men
STT

Chỉ tiêu đánh giá

1


Chủng
D1

D2

D3

Khả năng lên men ở pH thấp

1

3

2

2

Hiệu suất lên men

1

3

2

3

Hương thơm của sản phẩm

1


2

3

4

Đánh giá chung

2

3

1

5

Tổng điểm

5

11

8

Như vậy, chủng mang nhiều đặc điểm tốt nhất đạt số là D2. Vì vậy,
chúng tôi quyết định chọn chủng D2 cho các nghiên cứu tiếp theo.

Trường ĐHSP Hà Nội 2


23

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

3.1.3. Xác định tên khoa học của chủng D2
Chúng tôi tiến hành xác định tên khoa học của chủng D2 dựa vào các
đặc tính sinh học của chủng nấm men như:
- Khả năng lên men đường.
- Khả năng đồng hóa muối nitrat.
- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi.
3.1.3.1. Khả năng lên men các loại đường
Để xác định khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men S.
cerevisiae D2 chúng tôi sử dụng phương pháp lên men trong các bình tam giác
250ml bằng cách cấy chủng D2 vào 6 môi trường khác nhau (mỗi môi trường
ứng với một loại đường) với số lượng tế bào nấm men ban đầu như nhau là 4,8
x106 tb/ml. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.3.1
Bảng 3.1.3.1. Khả năng lên men các loại đường của chủng D2
Loại đường

Khả năng lên men

Loại đường

Khả năng lên men


D-glucoza

++

Sacaroza

+

D-galactoza

+

Lactoza

+

Mantoza

+

Dextrin

-

Trong đó: ++: lên men mạnh
+: Có khả năng lên men nhưng không mạnh
-: Không có khả năng lên men

Trường ĐHSP Hà Nội 2


24

K29B - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Bùi Thị Tuyết

Như vậy, chủng nấm men D2 không có khả năng lên men ở môi trường
có đường Dextrin nhưng có khả năng lên men ở môi trường có đường
Sacaroza, Lactoza, Mantoza, D-galactoza và lên men tốt nhất ở môi trường có
đường D-glucoza.
3.1.3.2. Khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ duy nhất.
Để xác định khả năng sử dụng nitrat của chủng nấm men D2 chúng tôi
tiến hành làm thí nghiệm trên môi trường nitơrat (MT4) bằng cách đổ môi
trường vào các ống nghiệm sau đó hấp thanh trùng (không để nghiêng sau khi
khử trùng) và bố trí các thí nghiệm theo 2 lô khác nhau.
+ Lô thứ nhất: Mẫu đối chứng
+ Lô thứ hai: Bổ sung nitơ (pepton = 1g/l) lên bề mặt. Dùng que cất có
đầu nhọn để cấy chủng D2 chích sâu vào bề mặt thạch và tiến hành nuôi cấy ở
nhiệt độ 28 300C trong thời gian 2 3 ngày.
Kết quả: Lô thứ nhất: Không có sự phát triển của chủng D2.
Lô thứ hai: Chủng D2 đều phát triển rất tốt trong các ống
nghiệm tạo khuẩn lạc rất đặc trưng.
Tóm lại, chủng nấm men D2 không có khả năng sử dụng nitrat làm
nguồn nitơ duy nhất.
Dựa vào khoá phân loại của Lodder năm (1971) và kết quả nghiên cứu
đối với chủng D2 có đặc tính:
- Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía.

- Không đồng hoá nitrat.
- Tế bào hình trứng, hình ô van, hình cầu.
- Lên men glucoza mạnh.
- Lên men saccaroza, galactoza, mantoza.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

25

K29B - Sinh