BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

CAO ĐỨC TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH
PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN BIỂN
THUỘC CHI STREPTOMYCES
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

Hà Nội – 2020


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Đoàn Thị Mai Hương
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Lê Thị Hồng Minh

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng
… năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Các sản phẩm tự nhiên đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, chất gây
nghiện hay chất độc từ trước đây rất lâu (Marderosian, 1969). Đến nay, các
hợp chất tự nhiên, hầu hết có nguồn gốc từ lục địa, là nguồn đóng góp nhiều
nhất cho công nghiệp dược phẩm (Harvey, 2000). Mặc dù các đại dương
chiếm khoảng 70% diện tích bề mặt trái đất, được đánh giá có độ đa dạng
sinh học cao, song các nghiên cứu về hợp chất tự nhiên từ biển chỉ phát triển
mạnh trong thời gian gần đây (Fattorusso, 2012). Đã có hơn 30.000 hợp chất
tự nhiên từ đại dương đã được xác định với cấu trúc hóa học và hoạt tính
sinh học rất đa dạng (Hu, 2011). Trong số đó, một số hợp chất có cấu trúc
tương đồng với các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ vi sinh vật. Điều này
gợi ý có thể vi sinh vật đã tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoặc chính
các vi sinh vật là nguồn sản xuất ra các hợp chất này (Molinski, 2009). Hơn
nữa, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển có ưu điểm là chỉ
yêu cầu thu một lượng mẫu tự nhiên nhỏ, từ đó tiến hành phân lập vi sinh vật
và sinh khối lượng lớn trong phòng thí nghiệm, giúp tạo ra được lượng mẫu
đủ lớn để thực hiện nghiên cứu về đặc điểm hoá học và hoạt tính sinh học.

Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương với hệ sinh vật biển đa
dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển. Chính phủ Việt
Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên
nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển (Nguyễn Phú Trọng,
2018). Bên cạnh đó, Việt Nam hiện là một trong những nước có tỷ lệ kháng
kháng sinh cao trên thế giới, đặc biệt, một số vi khuẩn gây ra những bệnh
truyền nhiễm có khả năng lây lan cao trong cộng đồng để lại những hệ quả
nặng nề về sức khoẻ và kinh tế (WHO, 2014). Vì vậy, việc tìm kiếm các
thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, có nguồn gốc từ biển với hiệu quả cao hơn,
giá thành rẻ hơn và quan trọng nhất là có thể chủ động, tự sản xuất trong
nước là một yêu cầu rất cấp thiết.
Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu phát hiện các hợp chất thứ
cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ một số chủng xạ
khuẩn biển thuộc chi Streptomyces” đã được lựa chọn, thực hiện.


2

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Phát hiện các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
(VSVKĐ) từ một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ vùng biển Việt Nam,
cụ thể là:
- Phân lập, sàng lọc và xác định một số chủng xạ khuẩn có hoat tính
kháng VSVKĐ có nguồn gốc từ biển Việt Nam.
- Phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy 2
chủng xạ khuẩn tiềm năng và khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ của các hợp
chất thứ cấp phân lập được, làm cơ sở khoa học cho việc định hướng nghiên
cứu ứng dụng các hợp chất có hoạt tính tốt cũng như 2 chủng xạ khuẩn nghiên
cứu một cách hiệu quả.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1. Phân lập và nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn biển Việt Nam từ trầm tích,
hải miên và một số sinh vật biển khác;
2. Thử hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết của các chủng xạ khuẩn biển phân
lập được và lựa chọn 2 chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính tốt để định danh,
lên men sinh khối lượng lớn;
3. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ 2 chủng xạ khuẩn biển đã lên men sinh
khối lượng lớn;
4. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thứ cấp phân lập được bằng
các phương pháp vật lý, hóa học;
5. Đánh giá hoạt tính sinh học kháng VSVKĐ của các hợp chất thứ cấp phân
lập được từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tài nguyên sinh vật biển
1.2. Xạ khuẩn (Actinomycetes)
1.2.1. Phân loại xạ khuẩn
1.2.2. Chi xạ khuẩn Streptomyces
1.2.3. Thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ chi Streptomyces
1.3. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật từ chi
Streptomyces biển
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới


3

1.3.1.1. Streptomyces phân lập từ trầm tích biển
1.3.1.2. Streptomyces biển có nguồn gốc từ động vật thân mềm
1.3.1.3. Streptomyces biển có nguồn gốc khác
1.3.1.4. Một số hợp chất kháng vi sinh vật phát triển bằng phương pháp khai
thác bộ gene xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (Genome mining)
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn biển từ các mẫu sinh vật và trầm
tích biển (Williams, 1965; Williams, 1971; Vũ Thị Minh Đức, 2001)
2.2.3. Phương pháp làm sạch xạ khuẩn và lưu giữ giống sau phân lập (
Vũ Thị Minh Đức, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003)
2.2.4. Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy xạ khuẩn (Vũ Thị Minh Đức,
2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003)
2.2.5. Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn (Carlson,
2014; Tanouye, 2015)
2.2.6. Phương pháp định danh xạ khuẩn (Holt, 1989; Sambrook, 1989;
Weisburg, 1991; Li, 2007)
2.2.7. Phương pháp lên men xạ khuẩn (quy mô 50 L) (Basilio, 2003;
Nguyễn Văn Cách, 2004)
2.2.8. Phương pháp phân lập các hợp chất thứ cấp
2.2.9. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập
được
2.2.10. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Hadacek,
2000)
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Kết quả thu mẫu
Từ các thiết bị và phương pháp thu thập mẫu đã nêu, chúng tôi đã thu
được 23 mẫu biển bao gồm:


4

- 09 mẫu thu nhận ở vùng biển Quảng Bình (2 mẫu trầm tích, 3 mẫu

rong, 3 mẫu san hô mềm và 1 mẫu hải miên).
- 14 mẫu thu nhận ở vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam (5 mẫu trầm
tích, 2 mẫu san hô mềm, 1 mẫu hải miên, 2 mẫu da gai, 2 mẫu thỏ biển, 1 mẫu
đuôi rắn và 1 mẫu thân mềm).
3.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn
Từ 23 mẫu biển đã thu nhận ở 2 vùng biển Quảng Bình và Cù Lao
Chàm, Quảng Nam, 35 chủng xạ khuẩn có hình thái và màu sắc khuẩn lạc
khác nhau đã được phân lập.
3.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các
chủng xạ khuẩn đã phân lập
35 chủng xạ khuẩn đã phân lập được nuôi cấy lượng nhỏ (500 mL), tạo
cặn chiết và thử hoạt tính kháng VSVKĐ. Kết quả (Bảng 4.1) cho thấy 24/35
chủng đã phân lập có tính kháng VSVKĐ, trong đó có 4/35 chủng có hoạt
tính kháng từ 4 chủng VSVKĐ trở lên. Hai chủng G212 và G278 (kháng 5
chủng VSVKĐ), đại diện hai vùng biển nghiên cứu, được lựa chọn để thực
hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Kết quả định danh chủng xạ khuẩn G212 và G278
3.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu
3.4.2. Định danh các chủng nghiên cứu bằng trình tự gene 16S rRNA
3.4.2.1. Tách DNA tổng số các chủng nghiên cứu
3.4.2.2. Nhân gene 16S rRNA
3.4.2.3. Kết quả giải trình tự gene 16S rRNA
Từ trình tự gene 16S rRNA của hai chủng G212 và G278, thực hiện so
sánh với dữ liệu đã được công bố trên ngân hàng gene, kết hợp với cây phát
sinh chủng loại, cho thấy hai chủng G212 và G278 có mối quan hệ gần gũi
với các chủng thuộc chi Streptomyces. Trình tự gene 16S rRNA của 2 chủng
G212 và G278 đã được đăng ký trên ngân hàng gene quốc tế với mã số tương
ứng là MF187963 và MF960781.
3.5. Kết quả sinh khối lượng lớn hai chủng xạ khuẩn G212 và G278
Thực hiện lên men lượng lớn quy mô 50L đã thu nhận được 50L dịch

nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn G212 và G278.


5

3.6. Kết quả phân lập các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G212
3.6.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết
Đã tạo được hai cặn chiết EtOAc (EG212) và n-BuOH (BG212), từ
dịch nuôi cấy (50L) của chủng Streptomyces sp. G212, với khối lượng tương
ứng là 2,2 g và 21,4 g.
3.6.2. Phân lập hợp chất thứ cấp từ các cặn chiết chủng Streptomyces sp.
G212
3.6.2.1. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG212)
Từ cặn chiết EG212 (2,2 g), đã phân lập được 10 hợp chất là G212-1
(5 mg), G212-2 (6 mg), G212-3 (5 mg), G212-4 (7 mg), G212-5 (12 mg),
G212-6 (7 mg), G212-7 (6 mg), G212-8 (8 mg), G212-9 (8 mg) và G21210 (6 mg).
3.6.2.2. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG212)
Từ cặn chiết BG212 (21,4 g), đã phân lập được 6 hợp chất là G212-11
(7 mg), G212-12 (13 mg), G212-13 (5 mg), G212-14 (6 mg), G212-15 (10
mg) và G212-16 (5 mg).
3.6.3. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất thứ cấp phân lập
được từ chủng Streptomyces sp. G212
3.6.4. Tổng hợp hợp chất G212-2 và G212-3
Để khẳng định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới 2,4-dichlorophenyl
2,4-dichlorobenzoate (G212-2) và 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide
(G212-3), chúng tôi đã tổng hợp toàn phần 2 hợp chất này từ hai hợp chất
thương mại tương ứng là 2,4-dichlorobenzoyl chloride và 2,3dimethoxybenzoic acid.
3.6.4.1. Tổng hợp hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G2122 TH)
3.6.4.2. Tổng hợp hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) và

đồng phân G212-6’
3.7. Kết quả phân lập các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G278
3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết


6

Đã tạo được hai cặn chiết EtOAc (EG278) và n-BuOH (BG278), từ
dịch nuôi cấy (50L) của chủng Streptomyces sp. G278, với khối lượng tương
ứng là 3,26 g và 22,4 g.
3.7.2. Phân lập hợp chất thứ cấp từ các cặn chiết chủng Streptomyces sp.
G278
3.7.2.1. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG278)
Từ cặn chiết EG278 (3,26 g), đã phân lập được 6 hợp chất (Hình 3.13)
là G278-1 (6 mg), G278-2 (7 mg), G278-3 (5 mg), G278-4 (10 mg), G2785 (6 mg), G278-6 (6 mg).
3.7.2.2. Phân lập các chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG278)
Từ cặn chiết BG278 (22,4 g), đã phân lập được 10 hợp chất (Hình 3.14)
là G278-7 (7 mg), G278-8 (6 mg), G278-9 (5 mg), G278-10 (8 mg), G27811 (6 mg), G278-12 (20 mg), G278-13 (6 mg), G278-14 (10 mg), G278-15
(8,5 mg), G278-16 (5 mg).
3.7.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ chủng
Streptomyces sp. G278
3.8. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được (Xem Bảng 4.33
và Bảng 4.34)
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Kết quả thu mẫu
Tổng số 23 mẫu đã thu thập được bao gồm: 9 mẫu thu nhận ở Quảng
Bình và 14 mẫu thu nhận ở Cù Lao Chàm, Quảng Nam. Số lượng mẫu ở các
vùng khác nhau là khác nhau, tương ứng với sự đa dạng các loại sinh vật
biển khác nhau trong các đợt thu mẫu để thực hiện luận án này.

4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn
Từ 9 mẫu thu nhận ở khu vực biển Quảng Bình và 14 mẫu thu nhận ở
vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam có tương ứng 15 và 20 chủng xạ
khuẩn đã được phân lập.
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu được
Kết quả thử hoạt tính kháng VSVKĐ của cặn chiết thô dịch nuôi cấy 35
chủng XK (Bảng 4.1) cho thấy 24/35 (68,6 %) chủng có hoạt tính kháng
VSVKĐ, trong đó có 4/35 (11,4 %) chủng có hoạt tính kháng từ 4 chủng


7

VSVKĐ trở lên; 11/35 (31,4 %) chủng phân lập kháng nấm kiểm định khá
mạnh (MIC 2 – 64 µg/mL). Ngoài ra, có 15/35 (42,8%) chủng thể hiện hoạt
tính kháng VSVKĐ Gram dương trong khi chỉ có 6/35 (17,1%) chủng thể
hiện hoạt tính kháng VSVKĐ Gram âm.
Bảng 4.1. Giá trị MIC (µg/mL) các chủng xạ khuẩn biển phân lập được.
(* Chỉ thể hiện kết quả đối với các chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ)
TT

1
2
3
4
5
6
7
8
9
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Chủng
(*)

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL)
Gram dương
Gram âm

Nấm

E. faecalis
S. aureus
B. cereus
E. coli
P. aeruginosa S. enterica
C.albicans

ATCC29212 ATCC25923 ATCC14579 ATCC25922 ATCC27853 ATCC13076 ATCC10231

15 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Quảng Bình
G183
128
G193
64
G196
64
G197
128
G202
128
G207
128
G212
128
128
64
256
256
G214
128
G216
256
20 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Cù Lao Chàm – Quảng Nam
G274
256
G275
G276

256
8
G277
256
G278
256
32
16
16
2
G280
256
256
16
32
32
G283
128
G284
256
256
G285
32
G288
32
G289
32
G290
32
16

8
16
G291
128
G292
32
G293
256
S
256
256
128
32
256
128
C
32
(S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL)


8

4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G212, G278
Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng G212 có độ tương đồng
(99,57%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-5 (mã số EU124773) và
(99,64%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-4 (mã số EU124772).
Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng G278 có độ tương đồng (99,86%)
so với chủng Streptomyces sp. R1 (mã số MK757961)
4.5. Kết quả sinh khối lượng lớn chủng xạ khuẩn G212 và G278
Đã lên men thành công lượng lớn (50 L) cho các chủng G212 và G278

để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.
4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp phân lập từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G212
Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G212, đã phân
lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất (Hình 4.31) trong đó có 2 chất mới
(G212-2 và G212-3) và 1 chất lần đầu phân lập từ tự nhiên (G212-1): 1 hợp
chất polyethylene terephthalate là ethylene terephthalate cyclic trimer
(G212-1), 1 dẫn xuất dichlorophenyl là 2,4-dichlorophenyl 2,4dichlorobenzoate (G212-2), 1 dẫn xuất phthalite là 4,5-dihydroxy-7-methyl
phthalide (G212-3), 2 hợp chất kháng sinh germicidine A (G212-4),
germicidine B (G212-5), 1 dẫn xuất benzopyridine là 3,4-dihydroxy-6,7dimethyl-quinolin-2-carboxylic (G212-9), 3 hợp chất cyclopeptide là cyclo(Pro-Val) (G212-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G212-11), cyclo-(Leu-trans-4hydroxy-Pro) (G212-12), 2 dẫn xuất của nucleic acid là 2’-deoxythymidine
(G212-7), 2’-deoxyuridine (G212-8), 2 hợp chất indol là N-[2-(1H-indol-3yl)-2-oxo-ethyl] acetamide (G212-13), indole-3-carboxylic acid (G212-14)
và
các
hợp
chất
5-hydroxymethyl-4-hydroxy-2,4-dimethyl-2cyclopentenone (G212-6), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G212-15), 2phenylacetic acid (G212-16). Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới (G212-2
và G212-3) được khẳng định bằng phương pháp tổng hợp toàn phần. Dưới
đây trình bày tóm tắt phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất G212-1,
G212-2 và G212-3.


9

Hình 4.31. Các hợp chất phân lập được từ chủng G212
4.6.1. Hợp chất Ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1)
Hợp chất G212-1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, phổ
khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 577,1349
[M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C30H25O12, m/z: 577,1346). Kết hợp
với dữ liệu phổ NMR cho phép xác định CTPT của hợp chất G212-1 là
C30H24O12. Phổ IR của G212-1 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm

carbonyl (νmax 1729 cm-1) và vòng thơm (νmax 1578 và 1457 cm-1). Trên phổ
1H-NMR của G212-1 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet ở  8,10 và 4,69. Trên
H
phổ 13C-NMR và DEPT của G212-1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của
1 nhóm carbonyl ở C 165,3; 1 nhóm methylene ở C 62,7; 1 nhóm methine
vòng thơm ở C 129,7 và 1 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở C
133,8. Độ chuyển dịch hóa học của nhóm methylene (H 4,69; C 62,7) gợi ý
liên kết của nhóm gắn trực tiếp với nguyên tử oxy.


10

Bảng 4.2. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-1 và hợp chất tham khảo.
Poly(ethylene
G212-1
terephthalate)
C
δHa,c độ bội (J, Hz)
δCa,d
δC a,e,#
1
165,3
168

a

2

-


133,8

134

3
4

8,10 s
4,69 s

129,7
62,7

130
64

trong CDCl3, b trong DMSO-d6, c 500 MHZ, d 125 MHz; e 75 MHz, # C của
Poly(ethylene terephthalate) (Kint, 2003).

Các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, NMR đặc trưng cho hợp chất có cấu trúc
đối xứng tương tự như các hợp chất polyethylene terephthalate (Štokr, 1982;
Backson, 1995). Điều này cũng được khẳng định trên phổ HMBC giữa
tương tác xa của proton vòng thơm và proton của nhóm methylene với nhóm
carbonyl và với carbon của chính nhóm này.
Căn cứ vào độ bội của G212-1 và CTPT C30H24O12, kết hợp với dữ liệu
phân tích từ phổ X-ray, hợp chất G212-1 này được xác định là ethylene
terephthalate cyclic trimer. Đây là một hợp chất lần đầu tiên phân lập từ tự
nhiên, hợp chất này đã được báo cáo trước đó dưới dạng dẫn xuất tổng hợp
(Kint, 2003).


Hình 4.4. Tương tác HMBC và cấu trúc tinh thể X-ray của G212-1
4.6.2. Hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2)
Hợp chất G212-2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối
phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất G212-2 cho pic ion giả phân tử ở
m/z 334,9194 [M+H]+ (cùng với các mảnh đồng vị của nguyên tử clo ở m/z
334,9194; 336,9167 và 338,9141). Từ dữ liệu phổ HR-ESI-MS kết hợp với
phổ 13C-NMR cho phép xác định CTPT của chất G212-2 là C13H6Cl4O2. Phổ
1H-NMR và phổ COSY của hợp chất G212-2 cho tín hiệu của 2 hệ vòng
thơm ABX [vòng A: H 7,40 (dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-5); 7,57 (d, J = 2,5, H-


11

3); 8,11 (dd, J = 8,5 Hz, H-6), và vòng B: H 7,23 (d, J = 8,5 Hz, H-6'); 7,32
(dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-5'); 7,50 (d, J = 2,5 Hz, H-3')]. Phân tích phổ 13CNMR cùng với sự trợ giúp của phổ HSQC của hợp chất G212-2 đã chỉ ra sự
có mặt của 13 nguyên tử carbon, bao gồm một nhóm carbonyl ở C 161,7;
sáu nhóm methine sp2 ở C 124,6 (C-5'), 127,3 (C-6), 128,1 (C-6'), 130,3 (C3'), 131,5 (C-3), 133,3 (C-5) và 6 carbon không liên kết trực tiếp với hydro
ở C 126,4 (C-1), 127,9 (C-2'), 132,4 (C-4'), 136,2 (C-4), 139,7 (C-2), 145,5
(C-1').
Bảng 4.3. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-2 và hợp chất tổng hợp
G212-2
G212-2 TH
C
a,b
a,c
a,b,#
δH độ bội (J, Hz)
δC
δH
độ bội (J, Hz)

1
126,4
2
139,7
3
7,57 d (2,5)
131,5
7,56 d (2.0)
4
136,2
5
7,40 dd (2,0; 8,5)
133,3
7,39 dd (2,0; 8,5)
6
8,11 d (8,5)
127,3
8,11 d (8,5)
7
161,7
1'
145,5
2'
127,9
3'
7,50 d (2,5)
130,3
7,50 d (2.5)
4'
132,4

124,6
5'
7,32 dd (2,5; 8,5)
7,31 dd (2,5; 8,5)
6'
7,23 d (8,5)
128,1
7,23 d (8,5)
a

trong CDCl3, b 500 MHZ, c 125 MHz, #H của G212-2 TH

Phổ COSY của G212-2 cho phép xác định 2 hệ tương tác spin-spin: H5/H-6 và H-5'/H-6' (Hình 4.10). Các mảnh cấu trúc sau đó được kết nối nhờ
phân tích phổ HMBC. Trên phổ HMBC của hợp chất G212-2 cho thấy tương
tác giữa H-5 (H 7,40) với C-3 (C 131,5), C-1 (C 126,4); tương tác giữa H3 (H 7,57) với C-1 (C 126,4), C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2); giữa H-6 (H
8,11) với C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2) xác nhận cấu trúc của vòng A bị thế
ở 3 vị trí. Tương tác HMBC giữa H-3' (H 7,50) với C-1' (C 145,5), C-2' (C
127,9), C-4' (C 132,4); giữa H-5' với C-1' (C 145,5), C-3' (C 130,3), C-4'
(C 132,4); giữa H-6' với C-1' (C 145,5), C-2' (C 127,9), C-4' (C 132,4) xác
nhận cấu trúc của vòng B. Trên phổ HMBC (Hình 4.10) xuất hiện tương tác


12

xa của proton H-6 (H 8,11) với carbon carbonyl (C 161,7) khẳng định sự
liên kết của nhóm carbonyl với vòng A. Độ chuyển dịch hóa học của C-1'
(C 145,5) gợi ý sự liên kết của carbon này với nguyên tử oxy. Dựa vào CTPT
của C13H6Cl4O2 và các dữ liệu phổ 2D-NMR, cấu trúc của G212-2 được xác
định là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate. Tuy nhiên, liên kết este
giữa vòng A và vòng B chưa được khẳng định rõ ràng trên phổ HMBC nên

cấu trúc của hợp chất G212-2 được khẳng định lại bằng phản ứng tổng hợp
giữa 2,4-dichloro-benzoyl chloride và 2,4-dichlorophenol (Hình 4.11). Phản
ứng được thực hiện ở 0 oC đến nhiệt độ phòng với sự có mặt của Et3N. Phổ
1
H NMR của sản phẩm tổng hợp được (G212-2 TH) giống hệt với hợp chất
tách từ tự nhiên G212-2 (Bảng 4.3). Như vậy hợp chất G212-2 được xác
định là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate và đây là một hợp chất mới.

Hình 4.10. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của G212-2

Hình 4.11. Phản ứng tổng hợp tạo thành G212-2 TH
4.6.3. Hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3)
Hợp chất G212-3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối
phân giải cao của G212-3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 181,0496
[M+H]+, tính toán lý thuyết cho CTPT C9H9O4, 181,0501. Kết hợp với dữ
liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định CTPT của G212-3 là C9H8O4. Phổ
hồng ngoại của G212-3 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxy
(νmax 3475 cm-1) và nhóm chức carbonyl (νmax 1717 cm-1).
Trên phổ một chiều (1H-NMR và 13C-NMR) của G212-3 xuất hiện tín
hiệu của 1 nhóm methyl (H 2,38, C 16,0), 1 nhóm methylene (H 5,13, C
66,7), 1 nhóm methin sp2 (H 6,72, C 118,4), 5 carbon vòng thơm không


13

liên kết trực tiếp với hydro (C 113,5, 130,1, 134,7, 137,1 và 150,6) và 1
nhóm carbonyl (C 170,9). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon C-3 (C
66,7), C-4 (C 137,1) và C-5 (C 150,6) cho phép dự kiến các carbon này gắn
trực tiếp với nguyên tử oxy.
Trên phổ HMBC của G212-3 (Hình 4.16) cho thấy tương tác xa giữa

H-6 (H 6,72) với C-4 (C 137,1), C-5 (C 150,6), C-7 (C 130,1), C-7a (C
113,5) và C-8 (C 16,0). Tương tác giữa proton của nhóm methyl CH3-8 (H
2,38) với C-6 (C 118,4), C-7 (C 130,1), C-7a (C 113,5) cho phép xác định
vòng A của hợp chất G212-3 và nhóm methyl CH3-8 gắn với vòng A ở vị trí
C-7. Tương tác giữa proton của nhóm methylene CH2-3 (H 5,13) với carbon
C=O (C 170,9), C-4 (C 137,1), C-3a (C 134,7), C-7a(C 113,5), C-7 (C
130,1) cho phép xác định vòng lactone B. Từ các dữ liệu phổ HMBC trên
cho phép xác định đây là 1 dẫn xuất phthalite. Tuy nhiên, như đã trình bày ở
trên, phổ HMBC của hợp chất G212-3 cho thấy proton của nhóm CH2-3 (H
5,13) tương tác với cả 2 carbon C-4 (C 137,1) và C-7 (C 130,1) nên có 2
khả năng về cấu trúc của hợp chất này ở vòng lactone B (Hình 4.12).

Hình 4.12. Hai khả năng về cấu trúc của G212-3

Hình 4.16. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G212-3
Bảng 4.4. Dữ liệu NMR của G212-3 và hợp chất tổng hợp (G212-3 TH)
G212-3
G212-3 TH
C
a,b
a,c
a,b,#
δH độ bội (J, Hz)
δC
δH
độ bội (J, Hz)
1
170,9
3
5,13 s

66,7
5,13 s
3a 134,7


14

C
4
5
6
7
7a
8
a

δHa,b

G212-3
độ bội (J, Hz)

6,72 s
2,38 s

trong DMSO-d6,

b 500

MHZ,


δC
137,1
150,6
118,4
130,1
113,5
16,0

δH

a,c

c 125

MHz,

G212-3 TH
bội (J, Hz)

a,b,# độ

6,72 s

2,38 s
#
H

của hợp chất G212-3 TH

Để khẳng định cấu trúc của hợp chất phân lập được cũng như để có thể

có thêm chất phục vụ cho việc thử hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành
tổng hợp toàn phần hợp chất G212-3 và đồng phân G212-6′. Quy trình tổng
hợp được trình bày trong Hình 4.17. đi từ hợp chất thương mại 2,3dimethoxy benzoic acid qua 5 bước chính. Ngoài ra để phân biệt chính xác
cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′, hợp chất G212-4′ được tổng
hợp qua 1 bước từ hợp chất halogen hóa G212-1′.

(a) HCHO, HCl đặc, 60-70 oC, 80%; (b) LiAlH4, THF, 72%; (c) i, KMnO4,
NaOH, H2O; ii, Ac2O, 55% 2 bước; (d) LiAlH4, THF, 77%; (e) H2, Pd/C, THF,
97%; (f) BBr3, CH2Cl2, 0 oC - RT, 89%; (g) BBr3, CH2Cl2, 0oC-RT, 87%.

Hình 4.17. Sơ đồ tổng hợp G212-3 TH và đồng phân G212-6′


15

Tổng hợp
(G212-1′)

4-(chloromethyl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one

Hợp chất thương mại 2,3-dimethoxy benzoic acid được biến đổi thành
dẫn xuất phthalide G212-1′ với việc sử dụng HCl đặc và paraformaldehhyde
ở nhiệt độ 60-70 oC trong 3 giờ với hiệu suất thu được là 80% (Bhattacharjee,
1980). Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-1′ cho tín hiệu của 1 nhóm
carbonyl ở C 168,1, 1 nhóm methine (C 119,8, H 7,20), 2 nhóm methoxy
(C 57,1; 62,5, H 3,93; 4,11), 2 nhóm methylene và 5 carbon không liên kết
trực tiếp với hydro. Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất thu
được là dẫn xuất phthalide G212-1′.
Tổng hợp 3,4-dimethoxy-6-methyl-1,2-phenylene dimethanol (G212-2′):


Hợp chất G212-1′ sau đó được khử thành ancol G212-2′ sử dụng
LiAlH4 trong dung môi THF cho hiệu suất 72% (Ying, 2011). So với hợp
chất G212-1′, phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-2′ thấy mất đi tín hiệu
của nhóm carbonyl và xuất hiện thêm tín hiệu của 1 nhóm methyl ở C 19,6,
H 2,39. Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất G212-2′ đã được
mở vòng lactone tạo alcol.
Tổng hợp 4,5-dimethoxy-7-methylisobenzofuran-1,3-dione (G212-3′)

Quá trình oxy hóa đóng vòng hợp chất G212-2′ qua 2 bước, đầu tiên
cho G212-2′ tác dụng với bằng KMnO4 cho sản phẩm acid, sau đó sản phẩm
acid thô được đun hồi lưu với 5 mL Ac2O trong vòng 30 phút cho hợp chất
phthalic anhydride G212-3′ với hiệu suất đạt 55%. So với hợp chất G212-


16

2′, phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-3′ thấy mất đi tín hiệu của 2 nhóm
methylene, thay vào đó là tín hiệu của 2 nhóm carbonyl ở C 162,6 và 160,9.
Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định cấu trúc của hợp chất G212-3′.
Tổng hợp hợp chất G212-4′ và G212-5′

Hợp chất G212-3′ được khử hóa với LiAlH4 cho hỗn hợp 2 đồng phân
G212-4′ và G212-5′ với tỉ lệ là 1:2. Hai đồng phân này được phân tách dễ
dàng trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/ EtOAc gradient. Trên phổ
NMR của 2 hợp chất G212-4′ và G212-5′ đều cho tín hiệu của 1 nhóm
methyl, 1 nhóm carbonyl, 1 nhóm methin, 2 nhóm methoxy và 5 carbon
không liên kết trực tiếp với hydro. Phổ HMBC của chất G212-5′ (Hình 4.19)
cho tương tác giữa proton của nhóm methyl 10 với carbon C-7a, là carbon
gắn trực tiếp với nhóm carbonyl ở C 116.1, cho phép dự đoán cấu trúc của
chất G212-5′, tuy nhiên cũng nhìn thấy tương tác của nó với C-3a và C-4.

Do đó, để phân biệt chính xác cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G2125′, hợp chất G212-4′ đã được tổng hợp qua 1 bước từ hợp chất halogen hóa
G212-1′ thông qua quá trình hydro hóa có sử dụng xúc tác Pd/C. Sau khi so
sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất G212-4′ được tổng hợp từ hợp chất
halogen hóa G212-1′ với dữ liệu phổ của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′
được tổng hợp từ hợp chất G212-3′ (Bảng 4.5), chúng tôi xác định được
chính xác cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′.

Hình 4.19. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G212-5′


17

C

1
3
3a
4
5
6
7
7a
8
9
10

Bảng 4.5. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-4′ và G212-5′
G212-4′
G212-5′
G212-4′

tổng hợp từ
tổng hợp từ G212-3′
G212-1′
a,b
δHa,b
δ
δHa,b
H
δCa,c
δCa,c
độ bội (J, Hz)
độ bội (J, Hz) độ bội (J, Hz)
169,0
170,8
5,12 s
68,0
5,12 s
5,24
66,7
137,8
138,8
120,6
140,7
7,02 s
117,6
7,02 s
156,0
152,5
6,81 s
116,1

146,5
136,0
126,8
115,3
4,05 s
62,3
4,05 s
3,90 s
56,3
3,90 s
57,0
3,90 s
3,95 s
60,4
2,26 s
17,2
2,26 s
2,63
17,1
a

trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz.

Tổng hợp hợp chất G212-3 và G212-6′

Cuối cùng, cho từng hợp chất G212-4′ và G212-5′ phản ứng với
BBr3 thu được hợp chất G212-3 tổng hợp (G212-3 TH) và G212-6′ với hiệu
suất từ 87-89 %. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất tách từ tự nhiên G212-3
với hợp chất tổng hợp G212-3 TH thấy dữ liệu phổ trùng khớp, như vậy hợp
chất G212-3 chính là 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide. Hợp chất G212-3

và đồng phân tổng hợp được G212-6′ đều là các hợp chất mới.


18

Bảng 4.6. Dữ liệu NMR hợp chất G212-3 TH và G212-6′
G212-3 TH
G212-6′
C
a,b
a,c
a,b
δH độ bội (J, Hz)
δC
δH độ bội (J, Hz)
δCa,c
1
170,9
169,8
3
5,13 s
66,7
5,11 s
68,1
3a
134,7
136,4
4
137,1
123,1

5
150,6
6,92 s
121,8
6
6,72 s
113,5
142,7
7
118,4
145,3
7a
111,5
111,5
8
2,38
16,0
2,08 s
16,4
OH-6
9,32 s
OH-7
9,67 s
a

trong DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz

4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp phân lập từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G278


Hình 4.49. Các hợp chất phân lập được từ chủng G278


19

Từ dịch ngoại bào của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G278, đã
phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất (Hình 4.49), trong đó có 6 hợp
chất cyclodipeptide là cyclo-(Pro-Gly) (G278-1), cyclo-(Pro-Leu) (G278-2),
cyclo-(Pro-Phe) (G278-3), cyclo (Pro-Tyr) (G278-4), cyclo-(Leu-Tyr)
(G278-5), cyclo-(Pro-Trp) (G278-6), 1 hợp chất indol là 1H-indole-3ethanol (G278-7) 1 hợp chất coumarin là scopoletin (G278-8), 1 hợp chất
nucleoside là adenosine (G278-11), 1 hợp chất dioxan là 2-((-5-methyl-1,4dioxan-2-yl)methoxy)ethanol (G278-12) và các hợp chất phenolic khác như
benzyl salicylate (G278-9), N-phenylnaphthalen-2-amine (G278-10), N-(4hydroxyphenylethyl)acetamide (G278-13), 2,4-dichlorophenyl 2,4dichlorobenzoate (G278-14), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene
(G278-15), 3-hydroxyl-2-methylpyridine (G278-16). Trong đó có 2 hợp chất
lần đầu phân lập từ tự nhiên là G278-15 và G278-16. Dưới đây trình bày tóm
tắt phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất G278-15 và G278-16.
4.7.15. Hợp chất 2,5-Bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15)
Hợp chất G278-15 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối
phân giải cao của G278-15 thể hiện pic ion giả phân tử ở m/z 431,1785
[M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C26H27N2O2S, m/z: 431,1793), kết
hợp với dữ liệu phổ 13C-NMR cho CTPT là C26H26N2O2S, tương ứng với độ
bội là 15. Phổ hồng ngoại của hợp chất G278-15 chỉ ra các tín hiệu dao động
của các nhóm chức C=N (1635, 1581 cm-1) và C-O (1266, 1195 cm-1). Thêm
vào đó, sự có mặt của nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc của hợp chất G27815 được củng cố bằng tín hiệu dao động hấp thụ hồng ngoại của C-S ở νmax
715 cm-1.
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của một hệ ABX ở δH 7,54
(1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-5), 7,72 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-4), 7,81 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H-7), 1 proton thơm singlet ở 8,06 (1H, s, H-3′) và 3 nhóm methyl
ở δH 1,37 (9H, s, 3 x CH3). Phổ 13C-NMR and DEPT cho tín hiệu của 13
nguyên tử carbon tương ứng với 3 nhóm methyl, 4 nhóm methin sp2 và 6
carbon không liên kết trực tiếp với hydro.

Phân tích các tín hiệu tương tác từ phổ HMBC (Hình 4.38) cho phép
xác định liên kết của nhóm tert-butyl ở C-6 của vòng thơm ABX thông qua
tương tác của proton thuộc nhóm methyl ở δH 1,37 với C-6 (δC 148,3) và C-


20

8 (δC 34,8). Thêm vào đó, tương tác HMBC giữa proton H-3′ (δH 8,06) với
C-2 (δC 157,5) và C-2′ (δC 132,4), cho phép xác định liên kết của chuỗi carbon
C-3′/C-2′/C-2. Độ chuyển dịch hóa học của C-7a (δC 148,6) and C-3a (δC
141,3), C-2 (δC 157,5) gợi ý sự liên kết của các carbon này với các nguyên
tử oxy và nitơ. Các dữ liệu phổ MS, NMR gợi ý cấu trúc của G278-15 có
cấu trúc đối xứng với 2 đơn vị cấu trúc C13H13NO kết nối với nhau thông qua
các liên kết C-3–C-3′ và C-2′–S–C-2′′
Bảng 4.31. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G278-15
G278-15
C
a,b
δH độ bội (J, Hz)
δCa,c
2
157,5
3a
141,3
4
7,72 d (8,0)
110,3
5
7,54 dd (2,0; 8,0)
123,9

6
148,3
7
7,81 d (2,0)
116,3
7a
148,6
8
34,8
9
1,37 s
31,5
2′
132,4
3′
8,06 s
131,3
a

trong DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz

Hình 4.38. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G278-15
Kết hợp với các dữ liệu phân tích từ phổ, HR-ESI-MS, 2D-NMR khẳng
định hợp chất G278-15 là 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene.
Hợp chất này đã được tổng hợp trước đó và được sử dụng làm tác nhân phát
quang, tuy nhiên đây là báo cáo đầu tiên của hợp chất này được phân lập từ
tự nhiên (Li, 2008).
4.7.16. Hợp chất 3-hydroxy-2-methylpyridine (G278-16)



21

Hợp chất G278-16 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ
khối phân giải cao của G278-16 cho pic ion giả phân tử ở m/z 110,0609
[M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C6H8NO, m/z: 110.0606), kết hợp với
dữ liệu phổ 13C NMR cho CTPT là C6H7NO. Trên phổ 1H-NMR, xuất hiện
tín hiệu của 3 proton aromatic ở δH 7.01 (1H, dd, J = 5.0, 8.0 Hz, H-5), 7.09
(1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.86 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-6) và 1 nhóm methyl ở
δH 2.30 (3H, s, H-7). Phổ 13C-NMR and DEPT chỉ ra sự có mặt của 6 nguyên
tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 3 nhóm methin sp2, 2 carbon không
liên kết trực tiếp với hydro ở δC 147.7 (C-2) and 154.0 (C-3). Độ chuyển dịch
hóa học của C-2, C-6 và C-3 cho phép xác định chúng được gắn trực tiếp với
nguyên tử nitơ và oxy.
Trên phổ HMBC (Hình 4.48) cho thấy tương tác xa giữa H-6 với C-2,
C-4 và C-5 và tương tác gữa H-4 với C-2 và C-6 cho phép xác định sự có
mặt của vòng pyridine. Đồng thời tương tác giữa proton của nhóm CH3 với
C-2 và C-3; tương tác giữa H-5 với C-3 cho phép xác định nhóm OH gắn ở
vị trí C-3 và nhóm CH3 gắn với carbon C-2. Kết hợp các dữ liệu phổ 2DNMR, HR-MS cho phép xác định hợp chất G278-16 là 3-hydroxyl-2methylpyridine. Đây là một hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên, hợp chất
này đã được tổng hợp vào năm 2008 (Jida, 2008).
Bảng 4.32. Dữ liệu NMR của hợp chất G278-16 và hợp chất tham khảo
G278-16
3-hydroxy-2-methylpyridine
C
a,c
a,d
δH độ bội (J, Hz)
δC
δH b,e# độ bội (J, Hz)
δC b,f#
2 147,7

144,7
3 154,0
146,3
4 7,09 d (8,0)
122,6
7,15 dd (1,2; 8,4)
122,3
5 7,01 dd (5,0; 8,0)
123,2
7,06 dd (4,7; 8,4)
122,4
6 7,86 d (5,0)
139,3
8,05 dd (1,2; 4,7)
139,7
7 2,30 s
18,4
2,53 m
18,4
a

trong CD3OD, b trong CDCl3, c 500 MHZ, d 125 MHz, e 300 MHZ, f 63 MHz, #H của
hợp chất tham khảo (Jida and Ollivier, 2008).

Hình 4.48. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G278-16


22

4.8. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất

sạch đã phân lập
Các hợp chất phân lập và các hợp chất tổng hợp được thử nghiệm hoạt
tính kháng VSVKĐ. Kết quả cho thấy 20/30 hợp chất phân lập và 3 hợp chất
tổng hợp có hoạt tính kháng VSVKĐ (Bảng 4.33 và Bảng 4.34).
Bảng 4.33. và Bảng 4.34. Giá trị MIC (µg/mL) của các hợp chất tự
nhiên và tổng hợp (*Chỉ thể hiện các chất có hoạt tính kháng VSVKĐ)
T
T

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL)
Gram dương
Gram âm

Chất (*)

E. faecalis

S. aureus

B. cereus

E. coli

P. aeruginosa S. enterica

Nấm
C.albicans

ATCC29212 ATCC25923 ATCC14579 ATCC25922 ATCC27853 ATCC13076 ATCC10231


1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
17
18
19
20
1
2
3

G212-1
G212-2
G278-14
G212-3
G212-4
G212-5
G212-6

G212-7
G212-8
G212-9
G212-15
G212-16
G278-5
G278-6
G278-8
G278-9
G278-10
G278-12
G278-15
G278-16

Các hợp chất phân lập từ chủng G212 và G278
64
64
16
64
32
32
16
128
64
256
128
32
64
256


-

256

-

128
128
64
32
128
64
64
128
32
64
32
32
32
256
32
32
128
64
256
256
128
256
64
Các hợp chất tổng hợp

64
128
128
128
64
128
64
32
64
256
128
32

-

-

-

-

64

32
-

256
64
64
128

32
64
64
256

128
64
64
32
32
128
64
64

G212-4'
64
64
128
G212-5'
32
128
G212-6'
128
32
32
S
256
256
128
C

32
(S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL)


23

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Luận án đã thu được các kết quả chính như sau:
1. Từ 23 mẫu thu thập được ở hai vùng biển Quảng Bình và Cù Lao
Chàm – Quảng Nam đã phân lập, nuôi cấy và lưu giữ được 35 chủng xạ khuẩn
biển.
2. Đã đánh giá được hoạt tính kháng VSVKĐ của 35 chủng phân lập,
trong đó có 24/35 chủng (68,6 %) có hoạt tính kháng VSVKĐ, bao gồm
4/35 chủng (11,4 %) có hoạt tính kháng từ 4 chủng VSVKĐ trở lên.
3. Đã tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn G212 và G278 có hoạt tính
kháng VSVKĐ cao và phổ rộng, kháng 5/7 chủng VSV thử nghiệm. Định
danh 2 chủng này thuộc chi Streptomyces. Trình tự gene 16S rRNA của 2
chủng G212 và G278 đã được đăng ký trên cơ sở dữ liệu của GenBank với
mã số tương ứng là MF187963 và MF960781.
4. Đã tiến hành nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 32
hợp chất thứ cấp từ 2 chủng xạ khuẩn G212 và G278 (gồm 30 hợp chất khác
nhau). Trong đó có 2 hợp chất mới là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate
(G212-2), 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) và 3 hợp chất lần đầu
tiên được phân lập từ tự nhiên là ethylene terephthalate cyclic trimer (G2121), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) và 3-hydroxy2-methylpyridine (G278-16). Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới phân lập
từ chủng G212 là G212-2 và G212-3 được khẳng định bằng phương pháp
tổng hợp toàn phần. Trong quá trình tổng hợp, đã tổng hợp thêm được 3 hợp
chất mới là dẫn xuất của hợp chất G212-3. Cấu trúc hóa học của hợp chất
mới lần đầu được phân lập từ tự nhiên G212-1 được khẳng định bằng phương
pháp X-ray.

5. Các hợp chất phân lập được đã được khảo sát hoạt tính kháng
VSVKĐ trong đó có 19/30 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ.
6. Ba analog của hợp chất G212-3 tổng hợp đều thể hiện hoạt tính kháng
VSVKĐ thử nghiệm. Đồng phân tổng hợp G212-6’ thể hiện hoạt tính tốt
đối với chủng nấm C. albicans và chủng Gram âm P. aeruginosa với giá trị
MIC = 32 µg/ml, trong khi đồng phân phân lập từ tự nhiên G212-3 không
thể hiện hoạt tính đối với chủng nấm C. albicans.