Sàng lọc vi sinh vật phân rã
rơm lúa và hoạt động enzyme
cellulase của chúng
GVHD: Phan Thị
Huyền

Võ Thị Tú Như

1512369

Trần Thị Loan Anh

1510110

Lương Đình Hoàn

1511101

Huỳnh Hải Danh

1510396

Nguyễn Thị Phương Thủy

1513368


RƠM LÚA
Cấu tạo

Chứa khoảng 39% cellulose,

27% hemicellulose và 12%
lignin. Cellulose và
hemicellulose
Khi thủy phân bằng chất hóa
học hay bằng enzym, biến đổi
thành glucose và đường có
thể lên men đc để sản xuất
etanol.

22%

2


CELLULOSE
Cấu tạo
Thành phần chính của tế bào
bền chắc, bao bọc các tế bào
thực vật.
Trên quy mô toàn cầu, thực vật
tạo ra khoảng 100 tỷ tấn
cellulose mỗi năm.
Cellulose là polymer của -Dglucose
Phân tử Cellulose không bao giờ
phân nhánh
Các phân tử cellulose nằm song
song liên kết với nhau giữa các
nhóm hydroxyl

22%


3


CELLULASE
Cấu tạo

Cơ chế tổng quát được đề xuất trong phản ứng thủy
phân cellulose bằng phức hệ enzyme C1: Exocellulase;
Cx: Endocellulase

22%

Cellulase là enzym đa cấu tử
gồm: exoglucanase hay C1 (EC
3.2.1.91), endoglucanase hay Cx
(EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC
3.2.1.21) hoạt động phối hợp để
thủy phân cellulose thành
glucose.
Cellulase được ứng dụng để cải
thiện gía trị dinh dưỡng của thức
ăn gia súc, gia cầm; chế biến
thực phẩm; trích ly các chất từ
thực vật, từ cây thuốc; đường hóa
các phế liệu giàu cellulose để sản
xuất ethanol.

4



Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa
Vi khuẩn
Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes,
Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium,
Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,
Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia
riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter
freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh
vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ
làm nguồn thức ăn.

22%

5


Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa
Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm. Chúng là vi sinh
vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm
57-75 % [22]. Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô [23]. Xạ khuẩn còn được biết
đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như
streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò
quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh
cellulase được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống này như
Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans.
Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium
trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân hủy cellulose.


22%

6


Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa
Nấm
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản
phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân
hủy cellulose [30]. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không
có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn.
Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride,
penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces
emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus
terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose
ở nhiều môi trường khác nhau [7, 30].

22%

7


Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa

Bacillus
sp

Bacillus
sp


22%

PA1: Serratia sp
PA2: Pseudomonas
sp

8


PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

 Chọn 3 mẫu để bắt đầu sàng lọc
10g
Mỗi mẫu pha loãng lấy 0,1ml truyền trên NA 0,1%
mẫu
cellulose agar hay 2% rơm agar.
nước

Ủ 3-5 ngày ở 37°C
thải
và
 Thu
thập khuẩn lạc và nấm
đất
 Vi khuẩn nằm rải rác và ổn định trên môi trường
thạch

Sàng lọc vi khuẩn phân hủy
cellulose


90ml
NaCl
Vortex
5
0.85%
phút

22%

9


PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
 Chuẩn bị enzyme thô
 Một vòng lặp của mỗi vi khuẩn được phân lập là cấy
trong 25 ml môi trường 0,1% cellulose, ủ 24 giờ ở 37 o C,
150 vòng / phút.
 Dịch tế bào được đo bằng OD 600 và điều chỉnh tới OD
600 = 0,1, sau đó 5 ml dung dịch tế bào đã được điều
chỉnh được tiêm vào 45 ml môi trường 0,1% cellulose và
ủ trong 24 giờ ở 37 oC, 150 vòng / phút.
 10 ml dung dịch tế bào được ly tâm trong 10 phút ở 4°C
với 5.000 vòng / phút.
 Dịch ở trên chứa enzym thô được sử dụng để khảo sát
các hoạt động cụ thể của enzyme

22%

Phân tích các hoạt động cụ

thể của cellulase

10


PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
 Tổng lượng protein của enzym thô được xác định bằng
phương pháp Lowry và nồng độ protein (mg / ml) sau đó
được sử dụng để tính toán hoạt độ cụ thể (UI / mg
protein).
 Các enzyme thô sau đó được kiểm tra khả năng thủy
phân các chất nền sau: Giấy lọc 1x1cm (Whatman No.1),
1% carboxymethyl cellulose (1% CMC) và 0,1%
cellobiose.

22%

Khảo nghiệm hoạt động cụ
thể của cellulase

11


PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
 Tất cả các chất nền này được phân tán trong dung dịch
đệm natri acetate 0,2 M pH 5. Mỗi phản ứng được chuẩn
bị trong 2 bộ ủ ở 30°C và 50°C bằng cách trộn 1 ml
enzym thô với 1 ml đệm, ủ trong 1 giờ khi sử dụng giấy
lọc như chất nền và trong 10 phút khi CMC hoặc
cellobiose được sử dụng làm chất nền.

 Giảm đường được đo bằng phương pháp Somogyi-Nelson
(Nelson, 1944) (cho giấy lọc và CMC) hoặc phương pháp
DNS (Miller, 1959) (cho cellobiose).
 Các hoạt động enzyme được báo cáo bằng đơn vị UI/ ml
của enzym thô.

22%

Khảo nghiệm hoạt động cụ
thể của cellulase

12


Tuyển chọn các loại vi sinh vật sinh tổng
hợp từ cellulose.
Từ tám mẫu thử ( chất bẩn và nước thải ):
+ 11 chủng vi khuẩn ( BC1-11) và 9 chủng vi
nấm ( FC1-9) đã được tìm thấy trong 0.1%
cellulose agar ( nguồn carbon lấy từ
cellulose )
+ 19 chủng vi khuẩn (BR1-19) và 20 chủng vi
nấm ( FR1-20) có thể phát trển trên 2% RƠM
agar ( rơm đã qua tiền xử lý )
Do đó, tổng số chủng là 59, trong đó 30 là chủng
vi khuẩn và 20 là chủng vi nấm. Những chủng này
sẽ được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về hoạt
tính phân hủy cellulase của chúng

22%


13


Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với
nhiều cơ chất khác nhau.
Summary of bacteria (B) or fungi (F) isolates with
high specific activity of filter paper cellulase
0.04
(FPase)
0.03
0.03
0.03
0.02

0.02

0.02
0.02

0.02

0.02

FR9

BR4

0.01
0.01

0

FR14

BR15

BR11

22%

Hoạt tính trên giấy lọc ( Hoạt tính
FPase )
Chúng ta đo hoạt tính của những enzyme đã
thủy phân giấy lọc. Đối tượng enzyme chính là
exoglucanase.
Vàiđều
chủng
vi khảo
sinh vật
Tất cả các chủng
được
sát cho
hoạtthấy
tính
hoạt
tính FPaseendoglucanase
cao ở 30 độ C và
exoglucanase,
và một
beta-vài cái

cho
thấy hoạtCác
tínhchất
caonền
ở 50được
độ C.
glucosidase.
sử dụng là :
 giấy lọc ( whatman No.1 ), Carboxymethy
Tuy
nhiên,vànhìn
chung thì hoạt tính của các
cellulose
Cellobiose.
chủng trên giấy lọc tương đối thấp, hoạt tính
trung bình đối với vi khuẩn là 0,0049 unit/mg
protein và với nấm là 0,0041 unit/mg protein.

14


Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với
nhiều cơ chất khác nhau.
Hoạt tính trên CMCase và Cellobios
Việc tuyển chọn được thực hiện trên 0,1%
cellulose agar (C) và 2% rơm agar (R) ở 30 độ C
và 50 độ C. Chủng FR14 và BR14 có hoạt tính cao
ở 30 độ C, trong khi đó BR15, BR11 và FR9 có
hoạt tính cao ở 50 độ C. Các cơ chất
''carboxylmethyl cellulase'' ( CMCase) và

''cellobiase'' sẽ cho ta thấy hoạt tính
endoglucanase và beta-glucosidase theo thứ tự
lần lượt. Một vài chủng VSV có hoạt tính thủy
phân cellulose ở nhiệt độ thấp ( 30C) và vài chủng
cho hoạt tính cao ơn ở nhiệt độ cao ( 50C).
 

Chủng có hoạt
tính

22%

15


Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với
nhiều cơ chất khác nhau.
Hoạt tính trên CMCase và Cellobios
Chủng vi khuẩn hướng tới việc tổng hợp ra nhiều
enzyme thủy phân cellulose hơn enzyme thủy
phân carboxymethyl cellulose hydrolyzing
enzymes (CMC), trong khi đó chủng nấm lại có
khả năng tổng hợp số lượng lớn enzymes như
chủng vi khuẩn. Một vài nấm có khả năng tổng
hợp CMCase hoặc cellobiase, trong khi đó một vài
nấm khác có tể tổng hợp cả hai loại enzymes này
ở cùng một mức độ giống nhau. Hoạt tính CMCase
và cellobiase trung bình của chủng vi khuẩn là
0.06 và của chủng nấm là 0,062 unit/mg protein.


Chủng có hoạt
tính

22%

16


Kết luận
Áp dụng các enzyme cellulolytic trong phân hủy các vật liệu lignocellulosic cần điều phối các
hoạt động của các loại xenlulaza khác nhau. Như vậy, có 2 cách thực hiện được từ việc sử dụng
các enzym được phân lập trong nghiên cứu này.
- Cách thứ nhất là chọn các chất phân lập với phạm vi hoạt động riêng cao của cá nhân enzyme
và sử dụng chúng như là sự kết hợp giống.
- Cách khác là chỉ sử dụng một chất phân lập có thể sản xuất ra nhiều loại enzyme khác nhau,
trong đó vấn đề điều kiện tăng trưởng tối ưu của từng chất phân lập bằng cách tránh đồng lên
men. Các hoạt động cụ thể của xenlulaza được khảo sát trong nghiên cứu vẫn còn rất thấp so
với các nghiên cứu khác đã được báo cáo. Tuy nhiên, sản xuất cellulase từ những phân lập này
phải được tối ưu hoá dưới các điều kiện khác nhau để tăng cường xenluloza suy thoái và do đó
làm cho chúng hữu ích cho các ứng dụng khác.

22%

17


Kết luận
 Sàng lọc vi sinh vật cellulolytic từ rơm rạ đã được nghiên cứu. Có 29 vi khuẩn phân lập và 30
loài nấm phân lập được nghiên cứu trên các hoạt động xenlulit. Phân lập FR14 cho thấy hoạt
động đặc biệt với cellulase lọc giấy cao nhất (FPase) với 0,032 đơn vị protein / mg protein,

trong khi FR4 cao nhất,
 Hoạt tính CMCase đặc hiệu với 0,5 đơn vị protein / mg.
 Tốc độ tăng trưởng FC1 với 0.6 đơn vị protein / mg.
 Sản xuất Cellulase từ những phân lập này phải được tối ưu hoá dưới điều kiện khác nhau.

22%

18