Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Đại học Bách Khoa
Khoa Kỹ thuật Hóa học

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
MÔN: VI SINH VẬT
ĐỀ TÀI: HỢP CHẤT KHÁNG NẤM TỪ STREPTOMYCES SP.3265 - KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CHO THỰC VẬT
GVHD: Cô Phan Thị Huyền
Nhóm 8: Võ Phi Long
1511828
Nguyễn Thị Lẹ
1511712
Nguyễn Thị Hương Huệ
1511202
Ngô An Mai Phương


Nội dung báo cáo
1.

Đặt vấn đề

2.

Các phương pháp sử dụng

3.

Nuôi cấy

4.

Thu nhận các hợp chất chống nấm

5.

Xác định cấu trúc các hợp chất chống nấm

6.

Hoạt tính kháng nấm

7.

Kết luận


1. Đặt vấn đề

Nhân Sâm


1. Đặt vấn đề

 Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác.
 Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều
chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác
Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp
chất dễ bay hơi.
Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông



1. Đặt vấn đề
Sản lượng nhân sâm bị hạn chế bởi nhiều yếu tố, trong đó có bệnh thối rễ và bệnh úng nước trong quá trình trồng cũng như tích trữ trước khi tiêu
thụ.
Một số tác nhân gây bệnh là: Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides
Rhizoctonia solani: Gây bệnh úng nước Điều hòa bằng những hợp chất kháng nấm như iprodione, benomyl, fentin hydroxide, benodianil,
difenoconazole và pencycuron.
Botrytis cinerea: Gây ra bệnh thối rễ
nguyên nhân của đa số tổn thất sau thu hoạch ở nhân sâm. Việc kiểm soát B. cinerea thường được
thực hiện bằng cách sử dụng thuốc trừ nấm. Tuy nhiên sử dụng thuốc kháng nấm dấy lên lo ngại ở người tiêu dùng, cũng như sự xuất hiện hiện
tượng kháng thuốc đòi hỏi cần có các phương pháp để kiểm soát các bệnh này.

◦
◦

Khống chế sinh học là cách hiệu quả và thân thiện với môi trường để tránh tình trạng bệnh thối rễ và úng nước ở cây nhân sâm.


1. Đặt vấn đề
Xác định được Streptomyces sp.A3265 thể hiện hoạt tính kháng nấm mạnh đối với nhiều loại nấm gây bệnh thực vật

Hai hợp chất chống
nấm

Các hợp chất này biểu hiện hoạt tính kháng nấm

Phân lập

mạnh đối với nhiều loại nấm gây bệnh thực vật
cũng như chống lại vi khuẩn.


Guanidylfungin A

Methyl Guanidylfungin A


2. Các phương pháp sử dụng
 Sắc ký cột Diaion HP-20 và Sephadex LH-20
 Sắc ký lỏng trung áp (MPLC) và sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
 Phương pháp phân tích quang phổ

◦ Phương pháp khổi phổ (Mass spectrometry – MS)
◦ Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic
resonance – NMR)


 Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng
phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử
hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định.

 Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối
với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta
dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.

 Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên
nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá
bằng các phương pháp thích hợp.



3. Cultivation

 Streptomyces sp. A3265 được nuôi trên một đĩa môi trường thạch Bennett’s biến đổi trong vòng 5 ngày.
 Nhân giống cấp 1: Lấy chủng trên môi trường thạch cấy vào hai bình erlen 1 L chứa 200 mL môi trường nhân giống

Thành phần môi trường: 20g glucose, 10g tinh bột hòa tan, 1g dịch chiết thịt bò, 4g dịch chiết nấm men, 2g NaCl, 0.05g KH2PO4 và 25g bột đậu
nành trong 1L nước cất (pH=7.0)

Nuôi ở 27°C trong 2 ngày trên máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min
 Nhân giống cấp 2: Chuẩn bị 15 bình erlen chứa 200mL môi trường nhân giống, hút vào mỗi bình 2mL môi trường nhân giống cấp 1
°
trên. Lên men ở 27 C trong 5 ngày trên máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min


4. Tách hợp chất chống nấm
Dịch nuôi cấy của Streptomyces sp.A3265

Ly tâm 6000 vòng trong 20 phút

phần tủa

phần dịch

Chiết với acetone

Sắc ký cột Diaion HP-20

Cô đặc chân không


Sắc kí cột sephadex LH-20
rửa giải với methanol 70%

phần tủa

Sắc kí lỏng trung áp (MPLC)
Rửa giải với methanol 40-100%

Đem tủa thu trong acetonitrile 30%
phần dịch


4. Tách hợp chất chống nấm

Phần
Phần dịch
dịch

Sắc
Sắc ký
ký điều
điều chế
chế lỏng
lỏng hiệu
hiệu năng
năng
cao
cao với
với cột
cột C18

C18

Rửa giải với acetonitrile 33%

Sắc
Sắc ký
ký điều
điều chế
chế lỏng
lỏng hiệu
hiệu năng
năng

Rửa giải với 58%

cao
cao với
với cột
cột C18
C18

methanol+0,04%TFA

Hợp
Hợp chất
chất A3265-2
A3265-2


5. Xác định cấu trúc của chất chống nấm




Phân tích khối phổ (ESI-MS) quét điện tích dương
để xác định trọng lượng phân tử: thu được các
peak m / z là 1130.4[M + H]

+

và 1152.3

+
[M + Na] đối với hợp chất A3265-1.

Trọng lượng phân tử A3265-1 là 1129



Tương tự, thu được phổ khối lượng của hợp chất A3265+
2 trong hình 2.2 với các peak m/z là 1144.4[M + H] và
1166.3 [M + Na]

+

Trọng lượng phân tử A3265-2 là 1143
Hình 2.2: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-2 in positive mode.
Hình 2.1: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-1 in positive mode.


5. Xác định cấu trúc các hợp chất


•

Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân

•

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR) của
hợp chất A3265-1 thể hiện tín hiệu cho các nhóm
chức sau :

4

nhóm

olefinic

methine

ở δ 5,55, 5,44, 5,33 và 5,32.

 Nhiều nhóm oxygenated methine ở δ 3.5-4.2.
 Một nhóm N-methyl ở δ 2.82
 Chín nhóm methyl ở δ 0.5-1,5
Trong đó: δ là độ chuyển dịch hóa học

Hình 3: H-NMR spectra of compounds A3265-1. 1



•

Phổ carbon 13-NMR cung cấp thông tin trực tiếp về bộ sườn carbon
của phân tử

•

Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon (

13

C-NMR) của A3265-1

có tổng cộng 58 carbon, bao gồm :









ba carbonyl carbon ở δ 177,0, 170,5, và 169,1;
một carbon guanidyltại δ 158,3
sáu olefinic carbon ở δ 120-140
một hemiketal carbon ở δ 102,9
carbon oxy hoá ở 60-85;
methylene và methine carbons at δ 20-60
chín methyl carbon ở δ 10-18


Hình 4:13C-NMR spectra of compounds A3265-1 and A3265-2 in CD3OD

Những
Những dữ
dữ liệu
liệu quang
quang phổ
phổ này
này tương
tương đồng
đồng với
với dữ
dữ liệu
liệu của
của guanidylfungin
guanidylfungin A
A
guanidylfungin
guanidylfungin A
A

hợp
hợp chất
chất A3265-1
A3265-1 là
là


1


2

•
•

•
•
•

•
3

Phổ 1H-NMR của hợp chất A3265-2 tương tự như hợp chất A3265-1,
Ngoại trừ sự có mặt của một nhóm methoxyl ở δ 3,98 có thể dễ dàng trao đổi bằng dung môi -OCD 3

Trong phổ 13C-NMR của hợp chất A3265-2, 59 cacbon đã được quan sát.
Phổ 13C-NMR của A3265-2 rất giống với hợp chất A3265-1
Ngoại trừ, sự có mặt của một methoxyl carbon tại δ 54,9 dễ dàng trao đổi bằng dung môi -OCD 3

hợp chất A3265-2 là methyl guanidylfungin A




Cấu trúc hóa học của cả hai hợp chất trên đềiu được xác định nhờ 2D NMR


6. Hoạt động kháng nấm




Hợp chất A3265-1 thể hiện hoạt động kháng nấm mạnh với: F. oxysporum và
R. solani, với nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) là 5,0 -10 μg.



Hợp chất A3265-2 cho thấy hoạt động kháng nấm đáng kể đối với: F.
oxysporum và A. panax, với giá trị MICs là 2,5 μg.



Các hợp chất này cũng có hoạt tính khánh vi khuẩn Gram dương: Bacillus
subtilis, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus. với MICs trong
khoảng 5 ~ 20 μg.




Chủng
Chủng Streptomyces
Streptomyces A3265
A3265 sản
sản xuất
xuất hai
hai kháng
kháng sinh
sinh phổ
phổ rộng
rộng vừa

vừa kháng
kháng nấm
nấm và
và kháng
kháng khuẩn.
khuẩn.
Hợp
Hợp chất
chất A3265-2
A3265-2 có
có tính
tính kháng
kháng nấm
nấm cao
cao hoạt
hoạt động
động hơn
hơn so
so với
với hợp
hợp chất
chất A3265-1.
A3265-1.


7. Kết luận
◦ Chủng
Chủng vi
vi khuẩn
khuẩn Streptomyces

Streptomyces sp.A3265
sp.A3265 được
được phát
phát hiện
hiện là
là có
có hoạt
hoạt tính
tính kháng
kháng nấm
nấm chống
chống lại
lại nhiều
nhiều loại
loại nấm
nấm gây
gây bệnh
bệnh cho
cho thực
thực vật
vật như
như
Rhizoctonia
Rhizoctonia solani,
solani, Botrytis
Botrytis cinerea
cinerea và
và Colletotrichum
Colletotrichum gloeosporioides
gloeosporioides



 Nghiên
Nghiên cứu
cứu tiến
tiến hành
hành nuôi
nuôi giống
giống Streptomyces
Streptomyces sp.A3265
sp.A3265 và
và thu
thu nhận
nhận những
những hợp
hợp chất
chất kháng
kháng nấm
nấm bằng
bằng các
các phương
phương pháp
pháp sắc
sắc ký
ký
khác
khác nhau.
nhau.



 Những
Những hợp
hợp chất
chất này
này sau
sau khi
khi được
được phân
phân tích
tích cấu
cấu trúc
trúc bằng
bằng các
các phương
phương pháp
pháp quang
quang phổ
phổ (MS
(MS và
và NMR)
NMR) thì
thì được
được xác
xác định
định là
là
guanidylfungin
guanidylfungin A
A và
và methyl

methyl guanidylfungin
guanidylfungin A.
A. Chúng
Chúng vừa
vừa thể
thể hiện
hiện hoạt
hoạt tính
tính kháng
kháng nấm
nấm vừa
vừa có
có hoạt
hoạt tính
tính kháng
kháng khuẩn
khuẩn cao.
cao.