TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NÔNG HỌC

BÁO CÁO MÔN
DI TRUYỀN THỰC VẬT
Chủ đề 9: KỸ THUẬT DI TRUYỀN – NGUYÊN LÝ
VÀ ỨNG DỤNG
GVHD: ThS. Hồ Tấn Quốc

5/23/20


DANH SÁCH NHÓM
1. Đào Thị Thanh Ngân
2. Nguyễn Lê Hoài Thương
3. Đỗ Hữu Tính

5/23/20

18113094
18113164
18113172

2


NỘI DUNG CHÍNH
MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
• Enzyme giới hạn
• Kỹ thuật RFLP
• PCR

CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
•
•
•
•
•
•

Mục đích tạo cây chuyển gen
Những bước trong quá trình thực hiện cây chuyển gen
Thu nhận gen
Tạo vector chuyển gene
Phương pháp chuyển nạp gene ở thực vật
Ứng dụng và chiến lược phát triển

•

5/23/20

3


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ
DI TRUYỀN
1.1. KHÁI NIỆM KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Kỹ thuật di truyền là kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA
technology) là một hệ thống kỹ thuật nhằm kết hợp một hay vài gen của
loài này vào gen của loài khác và chuyển DNA tái tổ hợp đến một nơi nó
sẽ được tái bản và biểu hiện.


5/23/20

4


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.2. ENZYME GIỚI HẠN

Khái niệm: những enzym
đặc biệt nằm bên trong tế
bào vi khuẩn có khả năng
nhận biết DNA “lạ” của
phage (thể thực khuẩn) thâm
nhập vào và làm phân hủy
chúng làm hạn chế sự sinh
sản của các phage.
Hình 1.1: Một phản ứng có sự tham gia của RE
5/23/20

5


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.2. ENZYME GIỚI HẠN
Lịch sử:
Enzyme giới hạn được Werner Arber
tìm thấy ở vi khuẩn vào năm 1962.

Ông cho rằng các RE có khả năng rất
đặc biệt đó là khả năng nhận biết DNA
chủ và DNA lạ.

5/23/20

Hình 1.2: Werner, Daniel Nathans và
Hamilton O. Smith

6


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.2. ENZYME GIỚI HẠN
Tính chất:
• Chỉ cắt DNA lạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mà không cắt DNA của
mình.
• Các enzyme nhận biết một nucleotit đặc hiệu trên phân tử DNA và cắt
tại vị trí đó.

5/23/20

7


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.3. RFLP
Khái niệm: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là kỹ

thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên
điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE).
Nguyên tắc chung: dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn
(đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen). Sự khác biệt vị trí
cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

5/23/20

8


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.3. RFLP

Hình 1.2: Phân tích RFLP bằng cách lấy mẫu DNA từ vết máu
5/23/20

9


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.3. RFLP

Ưu điểm

Khuyết điểm

 RFLP có ưu điểm là marker đồng trội  Qui trình thực hiện phức tạp, nguy

cho phép phân biệt được cá thể đồng
hiểm đối với sức khoẻ người nghiên
hợp và dị hợp.
cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu).
 Do kích thước DNA khảo sát trong
 DNA yêu cầu có chất lượng cao đã
RFLP lớn vì vậy số lượng dấu phân
làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật
tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng
này.
 Hiện nay, ở nước ta chưa cho phép
nhu cầu nghiên cứu.
nhập chất phóng xạ.

5/23/20

10


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.3. RFLP
Định vị gen chịu
trách nhiệm cho rối
loạn di truyền

Lập sơ đồ di truyền
(bản đồ hệ gen)

Ứng dụng

Xác định nguy cơ
mang bệnh

5/23/20

Thử nghiệm quan hệ
huyết thống (xét
nghiệm phả hệ)

11


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.4. PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng
khuếch đại gen).
Khái niệm: Phản ứng chuỗi trùng hợp là quá trình nhân (khuếch đại) một đoạn
DNA đặc hiệu dưới sự xúc tác của enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt độ cao
(Taq polymerase), diễn ra theo chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục.
Giới thiệu chung: Được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát
minh năm 1985 tại công ty Cetus. Kỹ thuật này được thực hiện in vitro trong một
ống nghiệm plastic nhỏ, được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với
sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền.

5/23/20

12


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

Hình 1.3: Máy real – time PCR

5/23/20

13


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.4. PCR: Taq Polymerase và các thành phần khác của phản ứng
chuỗi trùng hợp
Taq Polymearase: là một DNA – polymerase bền nhiệt được sử dụng
trong PCR, ban đầu được phân lập từ Thermus aquaticus, một loài vi
khuẩn ưa nhiệt được thấy trong suối và miệng giếng nước nóng.
Các thành phần khác:
◦ Khuôn mẫu (Template)
◦ Các Oligonucleotide primer (mồi), còn gọi là Amplifer
◦ Các loại nucleotide triphosphate (dNTP)
◦ Dung dịch đệm (buffer) thích hợp và MgCl2

5/23/20

14


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.4. PCR:


Sợi DNA kép ban đầu tách ra
thành hai mạch đơn (94 –
96oC, 5 phút)
Các đoạn mồi tới bám vào
Đoạn DNA kép phân tách
đầu của đoạn nhân
thành hai mạch đơn
(50oC – 65oC, 30 giây)
(96oC, 30 giây)
Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
xúc tác tổng hợp hai sợi DNA mới
(65oC – 72oC, 2 – 5 phút)

Nguyên lý hoạt động
• Số lượng DNA nhân lên được tính theo công thức: 2n-2 (n là số chu kỳ nhân)
5/23/20

15


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.4. PCR
Đặc điểm:
◦ Một phản ứng PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai
đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.
◦ Việc chọn thiết kế đoạn mồi có vai trò quan trọng trong việc nhân đoạn đích.
◦ Taq polymerase không có khả năng sửa chữa kết cặp sai trong quá trình kéo dài
chuỗi.

◦ Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng
biệt. Là phương pháp hiện đại, thuận tiện, độ chính xác cao.
◦ Thời gian thực hiện cực nhanh, mất 3 giờ.
◦ Đơn giản và ít tốn kém.
◦ Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.

5/23/20

16


I. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
1.4. PCR
Ứng dụng:
TRONG ĐỜI SỐNG SẢN XUẤT

Xác định các đoạn trình tự cần nghiên
cứu.
Phát hiện đột biến.
Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử.
Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu
năm.
Chọn giống vật nuôi, cây trồng…
5/23/20

TRONG Y HỌC – KHOA HỌC HÌNH SỰ

Chuẩn đoán chính xác các bệnh
nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus.

Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do
ung thư, các bệnh di truyền.
Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết
tội phạm.
Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác
như: RAPD, SSR…
17


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.1. Khái niệm cây trồng chuyển
gen: cây có DNA được sửa đổi bằng
cách sử dụng kỹ thuật di truyền.
2.2. Mục đích tạo cây chuyển gen:
để chuyển tải đến một đặc điểm mới
cho thực vật mà trong tự nhiên không
thể xảy ra.

Hình 2.1: Một số sản phẩm biến đổi gen
5/23/20

18


II. CHUYỂN
NẠP GEN Ở
THỰC VẬT
2.3. Những bước
trong quá trình thực
hiện cây chuyển gen


5/23/20

Hình 2.2: Những bước chuyển gen

19


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.4. Thu nhận gen

mARN

Mô tế bào
chiết xuất

DNA
genom

Sao chép ngược
(enzyme revertase)

Cắt bằng 1 hay nhiều
loại enzym giới hạn

c - DNA

Phân tích đoạn
DNA
Tạo các DNA có

khả năng gắn với
plasmid (vector)

5/23/20

Tách và nhân
dòng DNA

20


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.5. Tạo vector chuyển gen:
Khái niệm: vector chuyển gen là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại
độc lập trong tế bào và mang được gen cần chuyển.
Mục đích tạo các vector chuyển gen: để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho)
sang tế bào B (tế bào nhận) chỉ có thể thực hiện bằng cách đính các gen cần
chuyển vào một yếu tố trung gian được gọi là đoạn dẫn. Những đoạn dẫn này
có khả năng hướng dẫn, vận chuyển các đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào
nhận. Đoạn dẫn này chính là các vector chuyển gen.

5/23/20

21


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.5. Tạo vector chuyển gen
Một số yêu cầu tối thiểu của vector chuyển gen:
◦ Có các trình tự khởi sự sao chép (ori).

◦ Có các trình tự nhận biết (palindrom).
◦ Các trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi cho phiên mã gen lạ.
◦ Đảm bảo sự di truyền bền vững của một DNA tái tổ hợp.
◦ Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện ra chúng hoặc các gen lạ gắn vào.
◦ Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn trong
tế bào chủ.
◦ Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng DNA tối đa và dễ
biến nạp vào tế bào chủ…

5/23/20

22


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.5. Tạo vector chuyển gen:
5 ứng dụng quan trọng chủ yếu của vector chuyển gen:
• Tạo dòng và khuếch đại trình tự của DNA (nhiều bản sao giống nhau).
• Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự của DNA.
• Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men) hay các động
thực vật (transfection – cho nhiễm gen).
• Sản xuất RNA.
• Sản xuất protein từ gen được tạo dòng.

5/23/20

23


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT

2.5. Tạo vector chuyển gen:

Một số loại vector chuyển gen:
• Các vector chuyển gen là plasmid.
• Các vector chuyển gen là thể thực
khuẩn (Bacteriophage).
• Các vector chuyển gen loại khác ở
Prokaryotes.

5/23/20

24


II. CHUYỂN NẠP GEN Ở THỰC VẬT
2.5. Tạo vector chuyển gen:
2.5.1. Vector chuyển gen là plasmid:
•Thế hệ đầu tiên: là các plasmid tự nhiên, hầu như không còn sử dụng nữa.
•Thế hệ thứ hai: được cấu tạo phức tạp hơn và có thêm nhiều đoạn gen quý,
một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất là pBR322.
•Thế hệ thứ ba: là các plasmid mạnh và đa năng. Một số plasmid thông dụng
như họ pUC, họ Gemini…

5/23/20

25