BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

ĐẶNG THỊ HẢI YẾN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC DẪN CHẤT SUCCINAT
CỦA CURCUMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

ĐẶNG THỊ HẢI YẾN
MÃ SINH VIÊN: 1401697

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC DẪN CHẤT SUCCINAT
CỦA CURCUMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hải
2. NCS. Phạm Thị Hiền
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Hải
và NCS. Phạm Thị Hiền, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền
đạt, chỉ bảo cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm u

u

tạ

i điều iện gi p

đ tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cả

ơn PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn

Văn Giang, TS. Đào Nguyệt Sương Huyền và NCS. Nguyễn Thị Ngọc đã nhiệt t nh
gi p đ , động viên khích lệ

tạ điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt

nghiệp n .
Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự gi p đ của các cán
bộ thuộc Phòng Hóa ô cơ, khoa Hóa và các cán bộ Phòng NMR trường Đại h c
Khoa h c tự nhiên – Đại h c quốc gia Hà Nội và các cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh
h c, Viện Công nghệ sinh h c, Viện Hàn lâm Khoa h c và Công nghệ Việt Nam, tôi

xin chân thành cả ơn.
Tôi xin cả
những nă

ơn c c ạn bè của tôi đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt

th ng h c tập tại trường.Xin cả

ơn các anh chị, các bạn đặc biệt là bạn

Trần Thị Hường và các em cùng thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm Tổng hợp
hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn gắn ó, động iên, gi p đ , sẻ chia
cùng nhau suốt quãng thời gian thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ, hai em gái và tất cả
những người thân tr ng gia đ nh tôi, những người đã luôn êu thương, ủng hộ để tôi
có được ngày hôm nay.
Do thời gian làm thực nghiệ cũng như iến thức của bản thân còn hạn chế, nên
khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của
các thầy cô, bạn è để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cả ơn!

Hà Nội, ng

18 th ng 05 nă 2019
Sinh viên
Đặng Thị Hải Yến


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về curcumin ................................................................................ 2
1.1.1. Cấu trúc hóa h c ...................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất lý hóa ........................................................................................ 2
1.1.3. Độ ổn định ................................................................................................ 4
1.1.4. Tác dụng sinh h c của curcumin .............................................................. 5
1.2. Tiền thuốc succinat và ứng dụng trong biến đổi cấu trúc curcumin ........ 8
1.2.1. Tiền thuốc succinat ................................................................................... 8
1.2.2. Các dẫn chất succinat của curcumin ....................................................... 9
1.3. Lựa chọn hướng nghiên cứu ....................................................................... 11
1.3.1. Lựa ch n hướng tổng hợp ...................................................................... 11
1.3.2. Lựa ch n phép thử hoạt tính sinh h c .................................................... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13
2.1. Nguyên liệu, hóa chất .................................................................................. 13
2.2. Dụng cụ – Thiết bị ....................................................................................... 14
2.3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 15
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 15
2.4.1. Tổng hợp hóa h c ................................................................................... 15
2.4.2. Kiể tra độ tinh khiết ............................................................................. 16
2.4.3. X c định cấu trúc hóa h c ...................................................................... 16
2.4.4. Thử hoạt tính sinh h c ............................................................................ 16


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 23
3.1. Cải tiến quy trình tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) 23
3.1.1. Tổng hợp S-1 theo tài liệu tham khảo .................................................... 23

3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng........................ 24
3.1.3. Quy trình tổng hợp S-1 ........................................................................... 26
3.1.4. X c định cấu trúc S-1 ............................................................................. 29
3.2. Tổng hợp dẫn chất succinat của curcumin. .............................................. 32
3.2.1. Xây dựng quy trình tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2)
.......................................................................................................................... 32
3.2.2. X c định cấu trúc sản phẩm S-2 ............................................................. 37
3.2.3. Thử hoạt tính sinh h c ............................................................................ 40
3.3. Bàn luận ........................................................................................................ 41
3.3.1. Về tổng hợp hóa h c ............................................................................... 41
3.3.2. Về x c định cấu trúc sản phẩm .............................................................. 45
3.3.3. Về thử hoạt tính sinh h c ........................................................................ 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic
resonance)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic

Resonance spectroscopy)

AR

Tinh khiết phân tích (Analytical reagent)

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

S-1

mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin

S-2

2-(Curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat

DCM

Dicloromethan

DMEM

Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium)


DMF

Dimethyl formamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DPPH

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

đvC

Đơn vị carbon

FBS

Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

G

Gam

H

Giờ

Hela


Human cervix carcinoma (Ung thư tử cung ở người)

HepG2

Human hepatocellular carcinoma (Ung thư gan ở người)

HPLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IC50

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at
50%)

IR

Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

K562

Human leukemia (Ung thư bạch cầu cấp ở người)

L-NMMA

NG-methyl-L-arginin acetat

logP


Hệ số phân bố dầu nước

LPS

Lipopolysaccharid

MCF7

Human breast carcinoma (Ung thư vú ở người)

MS

Phổ khối lượng (Mass spectrometry)


MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium

OD

Mật độ quang học (Optical Density)

PEG

Polyethylen glycol

Rf

Hệ số lưu giữ (Retention factor)


SA

Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do

SC50

Nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do (Scavenging concentration
at 50%)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SRB

Sulforhodamin B

δ

Độ chuyển dịch hóa học

RAW 264.7

Dòng đại thực bào chuột 264.7

t°nc

Nhiệt độ nóng chảy


SOD

Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền (superoxid dismutase)

TCA

Trichloracetic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc của mPEG2000–succinyl–curcumin và
curcumin trên hai dòng tế bào ung thư. .........................................................................10
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu - hóa chất .................................................................13
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ - thiết bị ...................................................................14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi phản ứng ...................................24
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi DMF .........................................25
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng .....................................25
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng .....................................26
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ khối lượng (CH3OH) của S-1 ...................................29
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của S-1 .........................................29
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) của S-1 ................30
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của S-1 ................31
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol anhydrid succinic : S-1 ..............33
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 ...............................................34
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 ...............................................35
Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ khối lượng (CH3OH) của S-2 .................................37
Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của S-2 .......................................37
Bảng 3.14. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của S-2 ...............38
Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của S-2 ..............39
Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa ..........................................................40

Bảng 3.17. Khả năng ức chế sản sinh NO lên dòng tế bào RAW 264.7 .......................40
Bảng 3.18. Tác động của mẫu nghiên cứu đến sự sống sót của tế bào RAW 264.7 .....40
Bảng 3.19. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hela và HepG2 ...................41
Bảng 3.20. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư K562 và MCF7 ...................41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin .....................................................................2
Hình 1.2. Dạng hỗ biến ceto-enol trong dung dịch .........................................................3
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin .............................. 3
Hình 1.4. Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng .................................4
Hình 1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm ...............................................5
Hình 1.6. Tác dụng sinh học tiềm năng của curcumin ....................................................6
Hình 1.7. Tiền thuốc của artemisinin ..............................................................................9
Hình 1.8. Tiền thuốc của α-tocopherol ............................................................................9
Hình 1.9. Công thức cấu tạo curcumin diethyl disuccinat ............................................10
Hình 1.10. Công thức cấu tạo của mPEG2000–succinyl–curcumin ................................ 10
Hình 1.11. Phản ứng tạo dẫn chất succinat của curcumin .............................................11
Hình 1.12. Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat ..................................................11
Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp S-2 ......................................................................................12
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) ..........15
Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-1 ........................................................................23
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 ở quy mô 2 g/mẻ ............................................28
Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp S-2 ........................................................................................32
Hình 3.4. Cơ chế phản ứng tổng hợp S-1 ......................................................................42
Hình 3.5. Các sản phẩm phụ của phản ứng tạo S-1 .......................................................42
Hình 3.6. Cơ chế phản ứng acyl hóa tạo S-2 .................................................................43
Hình 3.7. Dạng hỗ biến enol - ceton ..............................................................................45



ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xưa, con người đã biết đến và sử dụng nghệ trong đời sống hàng ngày.
Nghệ không chỉ dùng làm gia vị cho bữa ăn, làm phẩm màu mà còn được sử dụng làm
thuốc. Với vai trò làm thuốc, nghệ được sử dụng để làm mờ sẹo vết thương, hỗ trợ
trong điều trị đau dạ dày, chữa mụn nhọt,…Hiện nay, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng
curcuminoid là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ
nghệ. Hỗn

hợp curcuminoid

bao gồm

curcumin,

demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin trong đó curcumin là thành phần chính (77%) [22]. Curcumin
đã được nghiên cứu và chứng minh các tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxy
hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo… [1], [19].
Tuy có rất nhiều tác dụng sinh học như trên nhưng ứng dụng trên lâm sàng của
curcumin còn đang bị hạn chế do độ tan của curcumin trong nước ở pH acid và sinh lý
rất thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng khi sử dụng theo đường uống
dẫn đến sinh khả dụng của curcumin thấp [22]. Để tăng sinh khả dụng của curcumin,
người ta đã tiến hành đưa curcumin vào các hệ thống phân phối thuốc như liposome,
micel, polisacharid, tạo phức hợp phospholipid và các tiểu phân nano… Tuy nhiên, nó
vẫn chưa cải thiện được độ kém ổn định của curcumin trong môi trường kiềm và ánh
sáng [24]. Một hướng tiếp cận khác đang được sử dụng cho các chất có hoạt tính sinh học
tốt nhưng kém tan là tổng hợp tiền thuốc-một trong những chiến lược sửa đổi phân tử
nhằm mục đích tối ưu hóa tính chất hóa lý và dược lý của thuốc để cải thiện độ tan và
các tính năng dược động học cũng như giảm độc tính của thuốc. Các tiền thuốc hay

gặp thường là ester, amid, carbamat, carbonat, ether, imin,… [8]. Dạng ester succinat
là một trong số đích hướng đến của tổng hợp tiền thuốc. Một số ví dụ có thể kể đến
như dạng ester succinat của các chất cloramphenicol, prednisolon, methylprednisolon
làm tăng độ tan so với chất mẹ ban đầu [15]; dạng ester succinat của artemisinin là
artesunat vừa tăng độ tan, vừa tăng tác dụng chống sốt rét so với artemisinin [3].
Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng
chống ung thư dẫn chất succinat của curcumin” với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp được dẫn chất succinat của curcumin.
2. Thử tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm của dẫn chất tổng hợp
được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về curcumin
1.1.1. Cấu trúc hóa học
 Công thức cấu tạo của curcumin (Hình 1.1):

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin
 Tên khoa học: (1E, 6E)-1,7-bis(4-hydroxyl-3-methoxylphenyl)hepta-1,6dien-3,5-dion.
 Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I.
 Công thức phân tử: C21H20O6.
 Khối lượng phân tử: 368,38 đvC [16].
1.1.2. Tính chất lý hóa
1.1.2.1. Tính chất vật lý
 Dạng thù hình: curcumin tồn tại dưới dạng bột vô định hình hoặc tinh thể hình
kim màu vàng cam [16].
 Nhiệt độ nóng chảy: 183°C [16].
 Độ tan: curcumin hầu như không tan trong nước ở môi trường acid và trung tính

(độ tan < 0,1 µg/mL ở 25°C) [27]. Curcumin tan được trong môi trường kiềm, tan
trong nhiều dung môi hữu cơ. Curcumin tan được trong một số dung môi như: aceton,
2-butanon, ethyl acetat, methanol, ethanol, 1,2-dichloroethan, 2-propanol; ít tan trong
hexan, cyclohexan; không tan trong ether [14].
 Sự hấp thụ ánh sáng: Curcumin có hai dải hấp thụ mạnh, một dải nằm trong
vùng nhìn thấy với cực đại hấp thụ dao động ở bước sóng 410-430 nm và dải còn lại
nằm trong vùng UV với cực đại ở bước sóng 265 nm [18].
1.1.2.2. Tính chất hóa học
 Tính chất của nhóm –OH phenol:
+ Tính acid: Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxy liên hợp mạnh
với vòng thơm làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxy trở nên linh động hơn do
vậy curcumin có tính acid [2].
2


+ Oxy hóa: nhờ nhóm hydroxy linh động trên vòng benzen, cùng với sự chuyển
nguyên tử hydro của nhóm methylen ở cacbon giữa mạch nên curcumin dễ phản ứng
với tác nhân oxy hóa [2], [18].
 Tính chất của nhóm β-diceton:
+ Hiện tượng hỗ biến: trong dung dịch, dạng β-diceton tạo cân bằng hỗ biến với
dạng enol được ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử (Hình 1.2). Trong dung dịch
nước, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dưới dạng diceton; ngược lại,
ở pH > 8, dạng enol chiếm ưu thế hơn [22].

Hình 1.2. Dạng hỗ biến ceto-enol trong dung dịch
+ Phản ứng tạo imin: nhóm β-diceton dễ phản ứng với các amin bậc một (R-NH2)
như hydroxylamin (R = -OH) hoặc phenylhydrazin (R = -NH-C6H5) tạo thành các dẫn
chất imin tương ứng [2].
+ Phản ứng tạo phức:
Curcumin có khả năng cho đi một hay nhiều cặp electron tự do trên các nguyên tử oxy

của cấu trúc ceton – enol, do vậy curcumin có thể tạo phức với nhiều ion kim loại khác
nhau: Mn2+, Fe2+, Cu2+… [4], [18].


Phản ứng hydro hóa
Cộng 1, 2 hoặc 3 phân tử H2 vào các vị trí không no để tạo thành

dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin [7]. Các sản phẩm này
cũng là chất chống oxy hóa (Hình 1.3) [10].

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin

3


1.1.3. Độ ổn định


Ảnh hưởng của ánh sáng
Curcumin không bền dưới tác dụng của ánh sáng, nhất là trong dung dịch. Sản

phẩm phân hủy chính gồm có vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic và acid ferulic,
ngoài ra còn có 4-vinylguaiacol và các sản phẩm ngưng tụ (Hình 1.4) [26]

Hình 1.4. Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng
Tốc độ phân hủy của curcumin phụ thuộc vào dung môi hòa tan, ví dụ: thời gian
bán thải của 40 µM curcumin trong methanol, ethyl acetat và acetonitril khi phơi
nhiễm với ánh sáng thường (400 - 750 nm) lần lượt là 50,2 h; 5,1 h; 1,3 h. Tốc độ phân
hủy tăng khi có mặt oxy hoặc các tác nhân oxy hóa [14].



Phân hủy trong môi trường kiềm
Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7.

Quá trình phân hủy curcumin trong khoảng pH = 7-10 được nghiên cứu bằng phương
pháp HPLC, sản phẩm của quá trình phân hủy là acid ferulic và feruloylmethan, sau đó
feruloylmethan tiếp tục phân hủy thành vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành
vinylguaiacol và CO2 (Hình 1.5) [24].

4


Hình 1.5. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
1.1.4. Tác dụng sinh học của curcumin
Với sự tiến bộ của khoa học, những nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên được thực
hiện ngày càng nhiều, trong đó có curcumin. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng curcumin
có hoạt tính sinh học đa dạng như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, điều trị
loét dạ dày, chống tiểu đường,…[23]. Một số tác dụng sinh học tiềm năng của
curcumin được trình bày ở Hình 1.6.

5


Chống
ung thư
Chống

Chống

viêm


oxy hóa

Tác dụng sinh

Điều trị loét dạ

học tiềm năng

dày-tá tràng

Liền sẹo, lành
vết thương

của Curcumin

Điều trị đái

Kháng

tháo đường

khuẩn
Bảo vệ
gan

Hình 1.6. Tác dụng sinh học tiềm năng của curcumin
 Tác dụng chống oxy hóa
Các gốc oxy hóa tự do như anion superoxid (O2-·), hydroperoxid (OH·), gốc ·NO
không bền, nó có xu hướng cho đi điện tử tự do và lấy hydro của chất khác. Curcumin

có 3 nhóm phản ứng: nhóm β-diceton và hai nhóm OH phenol. Cả ba vị trí hoạt động
này có thể cho hydro, tham gia nhận điện tử của các gốc oxy hóa. Trong đó, các
nghiên cứu cho thấy hydro của –OH phenol dễ cho đi nhất tạo gốc tự do phenoxy bền
hơn gốc oxy hóa tự do ban đầu do nó có cân bằng cộng hưởng qua cấu trúc ceton-enol.
Điều này giải thích hoạt tính chống oxy hóa mạnh của các sản phẩm chứa curcumin và
các dẫn chất của curcumin còn nhóm –OH phenol [18].

6


Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa còn do curcumin thúc đẩy hoạt động của nhiều
enzyme chống oxy hóa như catalase, superoxide dismutase (SOD), glutathione
peroxidase (GPx) và hem oxygenase-1 (OH-1),… của cơ thể [19].
Các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa của curcumin mạnh tương
đương với vitamin C, vitamin E và β-caroten [7].
 Tác dụng chống viêm
Curcumin có khả năng năng ức chế một số lượng lớn các phân tử khác nhau liên
quan đến phản ứng viêm, bao gồm phospholipase, lipooxigenase, cyclooxygenase 2,
leukotrien, thromboxan, prostaglandin, nitơ oxid, collagenase, elastase, hyaluronidase,
monocyte chemoattractant protein-1, protein cảm ứng interferon, yếu tố hoại tử khối u
(TNF), và interleukin-12 [11].
Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy hiệu quả của curcumin trong việc điều trị
bệnh viêm khớp do gút, viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp [22].
 Chống ung thư
Curcumin là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự hủy
diệt từng phần các tế bào ác tính, có tác dụng kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai
đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối [20]. Các nghiên cứu trên động vật cũng
như các nghiên cứu in vitro sử dụng các dòng tế bào của người đã chứng minh rằng:
curcumin có khả năng ức chế sinh ung thư ở ba giai đoạn: khởi phát u, hình thành
mạch và phát triển khối u. Hơn nữa, curcumin cũng có khả năng ức chế hoạt động của

một số chất gây đột biến phổ biến và chất gây ung thư trong nhiều loại tế bào trong cả
in vivo và in vitro [7]. Cơ chế của tác dụng chống ung thư của curcumin có thể là do
nó ức chế các yếu tố phiên mã, yếu tố tăng trưởng khác nhau, các protein kinase và
một số các chất trung gian gây viêm như các các interleukin (IL), yếu tố hoại tử khối u
(TNF), yếu tố nhân kappa B (NF-kB), cyclooxygenase 2 (COX-2), các gen gây ung
thư STAT 3, enzyme cảm ứng sinh nitơ oxid (iNOS),…. Ngoài ra, curcumin còn ức
chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào
và/hoặc gây ra apoptosis cho các tế bào này [21].


Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, làm lành vết thương và liền sẹo

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng dịch chiết nghệ và curcumin có tác dụng ức chế
sự phát triển của một số vi khuẩn, điển hình là trực khuẩn lao (Plasmodium
7


falciferum), tụ cầu vàng (Staphylococus aureus), Salmonella paratyphi, Mycrocus
pyogenes. Dịch chiết ethanol của nghệ có tác dụng chống lại Entamoeba histolytica [7].
Quá trình làm lành vết thương là do sự giải phóng chậm các chất chống oxy hóa và
sự hỗ trợ tái tạo mô của collagen. Một số nghiên cứu tạo liên kết giữa curcumin và
collagen cho thấy: hoạt tính chống oxy hóa của curcumin có hiệu quả trong việc dọn
các gốc tự do gây viêm loét. Kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của
collagen, curcumin đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thương ở mô [1].
 Điều trị loét dạ dày – tá tràng
Nghệ đã được chứng minh làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày- tá
tràng, tăng gastrin, secretin, bicarbonat, và bài tiết enzym tụy. Nghệ cũng được chứng
minh có tác dụng ức chế hình thành vết loét, chống lại tác động của các yếu tố gây loét
như stress, rượu, một số thuốc như indomethacin, reserpin… làm tăng đáng kể chất
nhầy ở thành dạ dày chuột. Bên cạnh đó, curcumin ức chế quá trình tạo kháng nguyên

gây viêm và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn H. pylori. Điều đó cho thấy
curcumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày khởi phát từ H. Pylori [7].


Tác dụng khác
Dịch chiết nghệ có tác dụng làm giảm cholesterol và triglycerid, giảm tính nhạy

cảm của LDL đối với sự peroxy hóa lipid và ức chế kết tập tiểu cầu [1].
Curcumin có thể tạo phức chelat với nhiều ion kim loại nặng như đồng, thủy
ngân, chì… làm giảm độc tính của các kim loại, tăng cường khả năng miễn dịch [13].
1.2. Tiền thuốc succinat và ứng dụng trong biến đổi cấu trúc curcumin
1.2.1. Tiền thuốc succinat
Một trong những con đường làm tăng sinh khả dụng của những chất có hoạt tính
tốt nhưng kém tan trong nước và độ ổn định kém là tạo ra các tiền thuốc. Tổng hợp
tiền thuốc là một trong những chiến lược sửa đổi phân tử được biết đến rộng rãi nhằm
mục đích tối ưu hóa tính chất hóa lý và dược lý của thuốc để cải thiện độ tan và các
tính năng dược động học cũng như giảm độc tính của thuốc. Các tiền thuốc này tan
trong nước hơn, dễ qua màng tế bào hơn và sẽ giải phóng ra thuốc mẹ qua quá trình
biến đổi sinh học nhờ các enzyme. Các tiền thuốc hay gặp thường là ester, amid,
carbamat, carbonat, ether, imin, phosphat,… [8]. Một trong những dạng ester hay
được sử dụng làm tiền thuốc là ester succinat.

8


Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy một số hoạt chất sau khi tạo dạng ester
succinat đều thu được kết quả sinh khả dụng đáng mong đợi và thể hiện hoạt tính sinh
học cao hơn so với thuốc mẹ.
Ví dụ: Artemisinin khi acyl hóa tạo dạng ester succinat là artesunat có tác dụng
mạnh hơn artemisinin 5,5 lần, hòa tan được trong nước nên có thể bào chế cả dạng

thuốc tiêm và thuốc viên [3]. (Hình 1.7)

Hình 1.7. Tiền thuốc của artemisinin
α-tocopheryl succinat là chế phẩm dược dụng của tocopherol vì nó bền vững với
tác nhân oxy hóa hơn tocopherol. Một số nghiên cứu invitro đã chỉ ra rằng αtocopheryl succinat là dạng vitamin E hiệu quả nhất so với α-tocopherol, α-tocopheryl
acetat và α-tocopheryl nicotinat trong ức chế tăng sinh tế bào và gây chết tế bào ung
thư [17]. (Hình 1.8)

Hình 1.8. Tiền thuốc của α-tocopherol
1.2.2. Các dẫn chất succinat của curcumin
1.2.2.1. Một số nghiên cứu về dẫn chất succinat của curcumin
Năm 2011, W. Wichitnithad và các cộng sự đã thực hiện tổng hợp một số dẫn chất
succinat của curcumin trong đó dẫn chất curcumin diethyl disuccinat (Hình 1.9) thể
hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô đại trực tràng ở người (Caco-2) in vitro
tốt hơn (IC50 (μM) ± SD = 1,84 ± 0,11) so với curcumin (IC50 (μM) ± SD = 3,31 ±

9


0,16). Đồng thời, dẫn chất này có độ ổn định hóa học cao hơn curcumin trong dung
dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7,4) ở 37○C [25].

Hình 1.9. Công thức cấu tạo curcumin diethyl disuccinat
Một nghiên cứu khác đánh giá về độ ổn định và hoạt tính kháng một số dòng tế bào
ung thư của mPEG2000–succinyl–curcumin (Hình 1.10) với curcumin [26] cho kết quả
dưới đây:
-

Độ ổn định hóa học của mPEG2000–succinyl–curcumin cao hơn so với


curcumin trong dung dịch đệm phosphate 0,1M (pH = 7,4) ở 37○C.
- mPEG2000–succinyl–curcumin thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu mô
KB, tế bào ung thư phổi NCI-H187 trong nghiên cứu in vitro mạnh hơn so với
curcumin (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc của mPEG2000–succinyl–curcumin và
curcumin trên hai dòng tế bào ung thư.
Hợp chất

IC50 (μM)
Tế bào KB

Tế bào NCI-H187

mPEG2000–succinyl–curcumin

1.56 ± 0.21

1.10 ± 0.15

Curcumin

3.53 ± 0.09

1.23 ± 0.14

Hình 1.10. Công thức cấu tạo của mPEG2000–succinyl–curcumin

10



1.2.2.2. Một số phương pháp tổng hợp dẫn chất succinat của curcumin


Sử dụng tác nhân anhydrid succinic
Năm 2004, Andre Rieks và cộng sự tiến hành tổng hợp dẫn chất succinat của

curcumin sử dụng tác nhân anhydrid succinic trong dung môi pyridin ở 20○C [9].
(Hình 1.11).

Hình 1.11. Phản ứng tạo dẫn chất succinat của curcumin


Sử dụng tác nhân halogenid acid
Năm 2011, W. Wichitnithad và các cộng sự đã thực hiện tổng hợp dẫn chất

curcumin diethyl disuccinat bằng tác nhân ethyl-4 cloro-4-oxobutyrat sử dụng xúc tác
4-(N, N-dimethlyamino)pyridin (DMAP) trong dung môi dicloromethan (DCM) [25].
(Hình 1.12)

Hình 1.12. Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat
1.3. Lựa chọn hướng nghiên cứu
1.3.1. Lựa chọn hướng tổng hợp
Từ các tài liệu tìm hiểu được, chúng tôi nhận thấy một số dạng dẫn chất succinat
của curcumin có độ ổn định cao hơn và thể hiện hoạt tính tốt hơn chất mẹ ban đầu, như
11


curcumin diethyl disuccinat [25], mPEG2000–succinyl–curcumin [26]. Những dẫn chất
này đều là sản phẩm của quá trình acyl hóa trực tiếp nhóm –OH phenol.
Trong khóa luận này chúng tôi thay đổi đích tác dụng, không sử dụng acyl hóa trực

tiếp nhóm –OH phenol mà acyl hóa nhóm –OH alcol của dẫn chất mono-O-(2hydroxyethyl)-curcumin để tạo dẫn chất succinat (Hình 1.13). Đây là hướng tổng hợp
chưa có tài liệu nào đề cập đến.

Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp S-2
1.3.2. Lựa chọn phép thử hoạt tính sinh học
Chúng tôi lựa chọn phép thử hoạt tính chống ung thư (in vitro) với 4 dòng tế bào
ung thư gan HepG2, ung thư cổ tử cung Hela, tế bào ung thư vú MCF7 và tế bào ung
thư bạch cầu cấp K562 cùng với phép thử chống oxy hóa hệ DPPH và phép thử chống
viêm để đánh giá hoạt tính của dẫn chất tổng hợp được.

12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất
Nguyên liệu ban đầu là curcumin được tinh chế từ hỗn hợp bột curcuminoid chiết
xuất từ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) tại phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược,
Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, đạt hàm lượng > 96%.
Các nguyên liệu và hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày
trong Bảng 2.1:
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu - hóa chất
STT

Tên hóa chất

Tiêu chuẩn, xuất xứ

1

2-Bromoethanol


>95%, Mỹ

2

4-methyl-2-pentanon

99,5%, Hàn Quốc

3

Aceton

AR, Trung Quốc

4

Acetonitril

AR, Trung Quốc

5

Acid acetic

AR, Trung Quốc

6

Acid hydroclorid


AR, Trung Quốc

7

Anhydrid succinic

99%, Mỹ

8

Butan-2-on

99,8%, Hàn Quốc

9

Dicloromethan

AR, Trung Quốc

10

Dimethylformamid

AR, Trung Quốc

11

Kali carbonat


AR, Trung Quốc

12

Methanol

AR, Trung Quốc

13

Natri carbonat

AR, Trung Quốc

14

Natri clorid

AR, Trung Quốc

15

Natri sulfat khan

AR, Trung Quốc

16

Nước cất


Việt Nam

17

Pyridin

AR, Trung Quốc

13


2.2. Dụng cụ – Thiết bị
Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong khóa luận được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ - thiết bị
STT

Thiết bị, dụng cụ

Xuất xứ

1

Bản mỏng silica gel 60 F254

Đức

2

Bình cầu 1 cổ 50 mL, 100 mL, 500 mL


Đức

3

Bình cầu 2 cổ 150 mL, 500 mL

Đức

4

Bình chiết 100 ml, 250 mL, 500 mL

Đức

5

Bình nón 100 mL, 250 mL, 400mL.

Đức

6

Bình sắc ký

Trung Quốc

7

Bộ lọc hút chân không Buchner


Trung Quốc

8

Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S

Thụy Sĩ

9

Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

Đức

10

Đèn soi UV sắc ký CN6

Đức

11

Máy cất quay chân không Buchi R210, R220

12

Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt

Mỹ


13

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 MHz

Mỹ

14

Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700

Nhật

15

Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS Agilent 1290/6460

Mỹ

16

Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA

Đức

17

Nhiệt kế

Đức


18

Pipet chia vạch 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL

Đức

19

Sinh hàn hồi lưu

Đức

20

Thiết bị phản ứng có áo nhiệt 5L

Đức

21

Tủ sấy Memmert

Đức

14

Thụy Sĩ



2.3. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu quy trình tổng hợp
 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) và khảo sát yếu tố
ảnh hưởng hiệu suất phản ứng.
 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) và khảo sát yếu
tố ảnh hưởng.
 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích
hợp, soi bản mỏng dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và đo nhiệt độ nóng chảy.
 Xác định cấu trúc của các sản phẩm bán tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại
(IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR).
 Thử hoạt tính của chất đã tổng hợp được:
+ Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
+ Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH.
+ Thử hoạt tính ức chế sinh NO
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Tổng hợp hóa học
 Bán tổng hợp các dẫn chất của curcumin bằng các phản ứng O-alkyl hóa, acyl
hóa theo sơ đồ sau (Hình 2.1):

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2)

15


 Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng silica
gel 60 F254 Merck với các hệ dung môi khai triển khác nhau: hệ A - dicloromethan :
methanol (9,0 : 1,0); hệ B - dicloromethan : methanol :acid acetic (9,0 : 1,0 : 0,1).
Quan sát sắc kí đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại.
 Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp: chiết, cất, lọc, kết tinh.
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết



Sử dụng phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở mục 2.4.1. Dựa

vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm.


Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy

EZ-Melt. Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết
của sản phẩm.
2.4.3. Xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ bao gồm phổ khối
lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 13CNMR).
 Phổ hồng ngoại (IR): Phòng Hóa vô cơ, khoa Hóa trường Đại học Khoa học
tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén KBr.
Các mẫu rắn được phân tán trong tinh thể KBr với tỉ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film
mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
 Phổ khối lượng (MS): được ghi tại khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự
nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, trên máy Bruker evoq qube với chế độ đo ESI, sử
dụng dung môi là methanol.
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR,

13

C-NMR): được ghi tại

Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, trên máy
Bruker 500 MHz Ascend, sử dụng dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội là
tetramethylsilan.

2.4.4. Thử hoạt tính sinh học
Hoạt tính sinh học được thử tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
2.4.4.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH


Hóa chất:

- DPPH (Sigma)
16