BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  -----

CAO VIỆT PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1401474

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG
TẾ BÀO UNG THƢ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT ACYLHYDRAZON MỚI
MANG KHUNG
2H-BENZO[b][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ----CAO VIỆT PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1401474

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG
TẾ BÀO UNG THƢ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT ACYLHYDRAZON MỚI
MANG KHUNG
2H-BENZO[b][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:

TS. Trần Phƣơng Thảo
ThS. Lê Công Huân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dƣợc

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn đến những ngƣời trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động
viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những ngƣời thầy, ngƣời cô
đáng kính của tôi: TS. Trần Phƣơng Thảo, ThS. Lê Công Huân, - Bộ môn Hóa
Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện thuận
lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp
thời và động viên tôi những lúc khó khăn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học
Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa
Dƣợc - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm
nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc,đặc biệt là anh Dƣơng Tiến Anh, bạn Lê Công
Trực, em Phan Huy Đức, Bùi Xuân Trƣờng, và Hoàng Bảo Ngọc đã chia sẻ buồn
vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

1.1. CÁC ENZYM CASPASE ............................................................................... 2
1.1.1. Chu trình chết tự nhiên của tế bào (Apoptosis)......................................................... 2
1.1.2. Các enzym caspase .................................................................................................... 4

1.2. CÁC CHẤT HOẠT HÓA CASPASE-3 ......................................................... 6
1.2.1. Vai trò của ion kẽm với quá trình hoạt hóa caspase-3 ............................................. 6
1.2.2. Tác dụng hoạt hóa caspase của PAC-1..................................................................... 7
1.2.3. Những nghiên cứu tiếp theo về các chất hoạt hóa caspase....................................... 8

1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT MANG KHUNG 2HBENZO[B][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON .................................................................... 9
1.3.1. Tác dụng chống kết tập tiểu cầu ................................................................................ 9
1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm ..................................................................... 10
1.3.3. Hoạt tính kháng ung thư .......................................................................................... 11
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 12

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ................................................................ 12
2.1.1. Hóa chất .................................................................................................................. 12


2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................................... 12


2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 13
2.2.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 13
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được ......................................... 13

2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................. 13
2.3.1. Tổng hợp hóa học ........................................................................................... 13
2.3.2. Thử tác dụng sinh học .................................................................................... 15
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 16

3.1. HÓA HỌC ..................................................................................................... 16
3.1.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 16
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết .............................................................................................. 27
3.1.3. Xác định cấu trúc..................................................................................................... 29

3.2. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ .................................. 35
3.3. BÀN LUẬN .................................................................................................. 37
3.3.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 37
3.3.2. Khẳng định cấu trúc ................................................................................................ 39
3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư...................................................................... 42
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 44

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 44
4.1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc ........................................................................ 44
4.1.2. Về hoạt tính sinh học ............................................................................................... 44

4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 46



DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)

AcOH

: Acid acetic

ADN

: Acid desoxyribonucleic

d

: Vạch đôi trong phổ 1H-NMR (Doublet)

DCM

: Dicloromethan


dd

: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ 1H-NMR (Doublet of doublet)

DMF

: Dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

DMSO-d6

: Dimethylsulfoxid deuteri hóa

ESI

: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)

H (%)

: Hiệu suất


IC50

: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory
concentration)

IR

: Hồng ngoại (Infrared)

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ 1H-NMR

m

: Đa vạch trong phổ 1H-NMR (Multiplet)

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry)

NCI-H23

: Dòng tế bào ung thƣ phổi

NST


: Nhiễm sắc thể

PC-3

: Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt

Rf

: Hệ số lƣu giữ trong sắc ký lớp mỏng

s

: Vạch đơn trong phổ 1H-NMR (Singlet)


SW620

: Dòng tế bào ung thƣ đại tràng

t

: Vạch ba trong phổ 1H-NMR (Triplet)

tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

TLC


: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

δ

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

υ

: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1.Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các sản phẩm Va-c.

26

Bảng 3.2.Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các sản phẩm VIa-d.

27

Bảng 3.3. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất Va-c.


28

Bảng 3.4. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d.

29

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất Va-c.

29

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d.

30

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất Va-c.

31

Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d

31

Bảng 3.9.Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất Va-c, VIa-d.

32

Bảng 3.10.Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất Va-c, VIa-d.

34


Bảng 3.11. Kết quả thử tác dụng ức chế sinh trƣởng một số dòng tế bào ung thƣ

36

của các dẫn chất Va-c, VIa-d.

Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất VIa, VIb.

37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Tiến trình apoptosis.

2

Hình 1.2. Phân loại các caspase

5

Hình 1.3. Cấu trúc của PAC-1.

7

Hình 1.4. Tác dụng ức chế hoạt tính của tế bào ung thƣ PC-3 khi có mặt ion kẽm

8


của PAC-1 (A) lƣợc đồ cơ chế PAC-1 hoạt hóa caspase-3 (B).
Hình 1.5. Cấu trúc của dẫn chất ZnA-DPA.

9

Hình 1.6. Cấu trúc dẫn chất WF-208 và WF-210.

9

Hình 1.7. Cấu trúc các dẫn chất có hoạt tính chống kết tập tiểu cầu trong nghiên

9

cứu của Tian và cộng sự.
Hình 1.8. Cấu trúc các dẫn chất có tác dụng kháng nấm trong nghiên cứu của

10

Bollu và cộng sự.
Hình 1.9. Cấu trúc các dẫn chất có độc tính với tế bào ung thƣ trong nghiên cứu

11

của Zhou và cộng sự.
Hình 3.1. Dẫn chất thế ái nhân acyl 2 lần.

39

Hình 3.2. Phổ đồ MS của chất Vc.


40

Hình 3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vb.

42

Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất VIa, VIb.

43


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung.

16

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II.

17

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất III.

18

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IV.

19

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất Va.


19

Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp dẫn chất Vb.

20

Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp dẫn chất Vc.

21

Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa.

22

Sơ đồ 3.9. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb.

23

Sơ đồ 3.10.Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc.

24

Sơ đồ 3.11.Cơ chế phản ứng tạo thành VId.

25

Sơ đồ 3.12.Cơ chế phản ứng tạo chất II.

38


Sơ đồ 3.13.Cơ chế phản ứng tạo chất III.

38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tìm kiếm những phƣơng pháp điều trị ung thƣ mới đã và đang là một đề tài thu hút
sự chú ý của các nhà khoa học. Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang
tính đột phá trong lĩnh vực sinh học, hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống
ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng đƣợc làm rõ. Các thuốc chống ung thƣ mới ra
đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc
tính so với các phƣơng pháp cổ điển nhƣ hóa trị hay xạ trị. Một số đích tác dụng mà các
thuốc chống ung thƣ hiện nay đang hƣớng đến nhƣ các caspase, HAT, HDAC… trong đó
đích caspase đang mở ra nhiều triển vọng. Nhiều nghiên cứu chỉ ra việc hoạt hóa các
caspase đóng vai trò then chốt để tiêu diệt khối u nhờ sự tiêu hủy tế bào theo chƣơng trình
[25], [22]. Hiện nay, trong các chất hoạt hóa caspase, nhóm các dẫn chất mang cấu trúc
acetohydrazid có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là PAC-1, hợp chất đƣợc tổng hợp
và công bố vào năm 2006 [29]. Nhóm hợp chất này đƣợc đƣa vào thử nghiệm lâm sàng
trên bệnh nhân ung thƣ vào năm 2015 và đƣợc FDA phê duyệt để điều trị các bệnh ung
thƣ hiếm gặp vào năm 2016. Bên cạnh đó, các dẫn chất mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on cũng thể hiện nhiều hoạt tính hứa hẹn, bao gồm cả hoạt
tính kháng ung thƣ [31], [43].
Trên cơ sở các nghiên cứu trên, tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính
kháng tế bào ung thƣ của một số hợp chất acylhydrazon mang khung 2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on”với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp một số hợp chất acylhydrazon mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin3(4H)-on.
2. Thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc.

1



CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CÁC ENZYM CASPASE
1.1.1. Chu trình chết tự nhiên của tế bào (Apoptosis)
1.1.1.1. Khái niệm
Apoptosis là tên gọi của quá trình chết tự nhiên của tế bào theo chƣơng trình. Thuật
ngữ này lần đầu đƣợc đƣa ra trong nghiên cứu của Kerr, Wyllie và Currienăm 1972nhằm
phân biệt với quá trình hoại tử (Necrosis) [19]. Cụ thể, tuy hai quá trình đều dẫn đến sự
tiêu diệt tế bào, nhƣng apoptosis có nhiều điểm khác biệt nhƣ tác nhân khởi phát, sự thay
đổi cấu trúc tế bào, sự duy trì của quá trình chuyển hóa, không rò rỉ các thành phần tế bào
chất, dẫn đến không gây ra đáp ứng viêm. Cụ thể, apoptosis là quá trình gồm 5 bƣớc cơ
bản đƣợc mô tả nhƣ hình dƣới đây, với số phận tế bào kết thúc bằng một sự li giải êm dịu
(xem hình 1.1).

Hình 1.1. Tiến trình apoptosis
1.1.1.2. Quá trình khởi động apoptosis
Quá trình apoptosis khi khởi động sẽ không thể bị ngƣng lại mà tất yếu dẫn đến sự
tiêu diệt tế bào. Vì vậy, nó đƣợckiểm soát nghiêm ngặt nhờ một sốdây chuyền khởi động.
Trong đó, hai con đƣờng khởi động dƣới đây đƣợc quan tâm và làm rõ hơn cả [15].
2


1.1.1.2.1. Con đường ngoại sinh (extrinsic pathway)
Con đƣờng ngoại sinh khởi động từ các kích thích ngoại bào, chẳng hạn nhƣ phóng
thích các yếu tố tăng trƣởng kích động sự gắn của các thụ thể chết xuyên màng (là một
tập hợp con họ thụ thể TNF, bao gồm TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-1 và TRAIL2…) với những ligand cùng nguồn gốc. Quá trình này kéo theo sự hoạt hóa của chúng,
cũng nhƣ phức hợp tín hiệu gây chết (death-inducing signaling complex – DISC) ở mặt tế
bào chất của màng bào tƣơng. Các nghiên cứu cho thấy vùng Fas liên quan đến cái chết là
thành phần bắt buộc trong những phức hợp này, chịu trách nhiệm lựa chọn và điều biến
sự kích hoạt tự động caspase khởi phát nhƣ caspase 8 hay caspase 10. Chính những
caspase khởi phát sẽ kích hoạt tiếp các caspase thực thi nhƣ caspase 3, caspase 6 và

caspase 7, đến khi tới đỉnh trong quá trình ly giải protein chất nền và chết tế bào [15].
1.1.1.2.2. Con đường nội sinh (extrinsic pathway)
Con đƣờng nội sinh dựa trên sự tăng tính thấm của màng ty thể để giải phóng các
yếu tố tiền apoptosis nhƣ cytochrom c - apoptosis từ khoảng gian màng của bào quan này.
Ngƣợc lại, trong điều kiện stress tế bào, những chất chống apoptosis trong họ protein Bcl2, cƣ trú trong màng ngoài ty thể, có thể mất ổn định thông qua giảm biểu hiện, hoặc bổ
sung các thành viên tiền apoptosis của họ Bcl-2 (Bax, Bad và Bak). Hệ quả là tỉ lệ giữa
các chất tiền apoptosis và chất đối kháng apoptosis ngày càng lớn, kéo theo sự lắp ráp các
oligomer Bax-Bak ở màng ngoài ty thể, cho phép xuất hiện những kênh protein ngoài
màng. Từ đó, những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể đƣợc phóng
thích vào tế bào chất. Trong số này, cytochrom-c hoạt hóa trực tiếp Apaf-1 và với sự hiện
diện của dATP hoặc ATP, phức hợp multimeric lớn, thể apoptosom hình thành. Thể này
tuyển lựa và điều biến quá trình tự hoạt hóa caspase khởi đầu, tiền caspase 9, rồi chất này
tiếp tục hoạt hóa caspase 3,6 và 7. Ngoài các chất thuộc họ Bcl-2, các tác nhân khác nhƣ
ceramid, các ROS và Ca2+ cũng có khả năng hoạt hóa apoptosis nhƣ trên [15].
1.1.1.3. Quan hệ giữa ung thư và chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis)
Quá trình apoptosis đƣợc Kerr và cộng sự liên hệ với sự loại bỏ các tế bào có nguy
cơ trở thành ác tính, cũng nhƣ ngăn chặn sự tăng sinh và hình thành khối u [19]. Ngƣợc
lại, ung thƣ là kết quả của một chuỗi những thay đổi về di truyền mà từ đó một tế bào
lành biến đổi tế bào ác tính. Trong những thay đổi này, đóng vai trò thiết yếu hàng đầu
3


chính là việc tế bào “lảng tránh” sự tiêu diệt [14]. Vì vậy, có thể nhận thấy sự suy giảm
hoặc cản trở apoptosis có mối liên hệ mật thiết tới cơ chế bệnh sinh của ung thƣ.
Cơ chế cụ thể hình thành tế bào ung thƣ liên quan đến apoptosis chia làm 3 hƣớng:
+ Mất cân bằng các protein, gia tăng biểu hiện các protein kháng apoptosis, điển
hình nhƣ Bcl-2 [30],[12], Bcl-Xl [23]và giảm biểu hiện các protein tiền apoptosis nhƣ
Bax, Bak, Bid, Bim [30].
+ Giảm hoạt tính Caspase [6], [34], [10].
+ Sai khác quá trình truyền tín hiệu thông qua thụ thể gây chết [11], [32].

Những phân tích về cơ chế cho thấy các enzym caspase đóng vai trò giao thoa của 2
con đƣờng apoptosis. Do đó, nếu hƣớng thứ nhất và hƣớng thứ ba kéo theo sự suy giảm
khởi động chu trình chết tự nhiên của tế bào lần lƣợt theo con đƣờng nội sinh và ngoại
sinhthì hƣớng thứ 2 dẫn đến sự suy giảm khởi động của cả hai con đƣờng. Vì vậy, đây
chính là vấn đề đƣợc quan tâm và tìm hiểu kĩ càng, đặc biệt là những nghiên cứu liên
quan đến khôi phục hoạt tính cho enzym thực thi caspase-3.
1.1.2.Các enzym caspase
1.1.2.1. Khái niệm
Caspase là một họ enzym thủy phân aspartat phụ thuộc cystein, hoạt động theo cơ
chế duy nhất: phân tử amino acid cystein tại trung tâm hoạt động đóng vai trò là tác nhân
nucleophil tấn công vào phân tử protein đích, từ đó cắt liên kết peptid tạo bởi nhóm COOH của acid aspartic [1].
1.1.2.2. Phân loại caspase:
Cho đến nay đã phát hiện ra 14 thành viên của họ enzym caspase tồn tại ở ngƣời và
động vật. Các enzym này đƣợc phân loại theo chức năng nhƣ sau [13]:

4


Hình 1.2.Phân loại các caspase.
1.1.2.3. Vai trò của caspase với quá trình apoptosis
Các caspase tham gia vào quá trình apoptosis đƣợc chia làm hai phân nhóm [21]:
- Các caspase khởi phát: caspase 2, caspase 8, caspase 9, caspase 10.
- Các caspase thực thi: caspase 3, caspase 6, caspase 7.
Các caspase tồn tại trong tế bào ở dạng tiền enzym và cần hoạt hóa để phát huy hoạt
tính [3]. Đối với các caspase khởi phát, những nghiên cứu gần đây chứng tỏ chúng đƣợc
hoạt hóa nhờ quá trình dimer hóa từ các tiền enzym mà không trải qua sự phân cắt [36].
Quá trình này xảy ra sau khi những tiền enzym đƣợc lựa chọn tại các phức hợp đa protein
hoạt hóa nhờ đặc tính đầu N-tận của chúng. Tiếp theo, đến lƣợt chính các enzym này hoạt
hóa những caspase thực thi, vốn đã tồn tại ở dạng dimer, bằng phản ứng phân tách những
tiểu đơn vị lớn và nhỏ, từ đó lắp ghép các trung tâm hoạt động của hai dimer, tạo ra một

protease hoàn chỉnh [33]. Quá trình hoạt hóa này là điều kiện cần và đủ dẫn tới những sự
kiện trực tiếp dẫn tới sự tiêu hủy tế bào.
1.1.2.4. Vai trò quan trọng của caspase-3
Caspase-3 là một caspase thực thi đóng vai trò trung tâm của sự tiêu hủy tế bào theo
chƣơng trình. Enzym này có khả năng xúc tác cho phản ứng phân cắt của ít nhất 42 trong
5


số 58 cơ chất đã biết của họ caspase. Cơ chất này gồm các protein quan trọng mà sự biến
đổi của chúng có thể dẫn đến những thay đổi bƣớc ngoặt cho toàn tế bào.
Năm 1997, công bố của Kothahoka và cộng sự [20]cho thấy caspase-3 có khả năng
phân cắt protein gelsolin, dẫn đến sự cắt đứt không kiểm soát các vi sợi actin. Năm 1998,
nghiên cứu của Janicke và cộng sự [16] trên dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 chứng minh
rằng caspase-3 là enzym thiết yếu cho quá trình phân giải α-fodrin, là protein có khả năng
liên kết với vi ống và vi sợi actin, qua đó khởi đầu cho sự ly giải tế bào. Cũng trong năm
này, Tang và Kidd [37] phát hiện vai trò cần thiết của caspase-3 để hoạt hóa enzym CAD
endonuclease thông qua phân giải chất ức chế tƣơng ứng với nó là ICAD/DFF-45. Kết
quả đó làm sáng tỏ hoàn toàn tính “thực thi” của caspase-3 trong sự chết rụng tế bào theo
chƣơng trình, bởi CAD endonuclease là chất xúc tác quan trọng cho sự phân mảnh ADN.
Tƣơng tự các thành viên khác, caspase-3 tồn tại trong tế bào ở dạng tiền enzym
procaspase-3 và bắt buộc phải đƣợc hoạt hóa để phát huy hoạt tính. Nhiều dòng tế bào
ung thƣ đã ghi nhận nồng độ cao bất thƣờng của procaspase-3 [9], [24], [17]. Với hoạt
tính quan trọng của caspase-3, việc gia tăng hoạt hóa chúng đƣợc coi là hƣớng đi phù hợp
để ức chế những dòng tế bào này sinh trƣởng.
1.2. CÁC CHẤT HOẠT HÓA CASPASE-3
1.2.1. Vai trò của ion kẽm với quá trình hoạt hóa caspase-3
Ion kẽm từ lâu đã đƣợc biết đến nhƣ một yếu tố đóng vai trò bảo vệ tế bào nhờ hoạt
tính chống oxi hóa [28]. Quá trình tiêu hủy tế bào theo chƣơng trình cũng bị ion kẽm ngăn
cản bằng việc thay đổi cấu hình của các enzym caspase. Cụ thể, ion kẽm gắn trực tiếp vào
trung tâm hoạt động, trung tâm điều hòa hoặc các vùng ngoài của những enzym này, tùy

thuộc vào từng loại caspase cụ thể. Với caspase-3 nói riêng, nghiên cứu của Eron và cộng
sự [8] chứng tỏ rằng caspase-3 có khả năng tạo liên kết cùng lúc với 3 ion kẽm, và 1 trong
3 vị trí có tác dụng ngăn cản quá trình chuyển hóa từ procaspase-3 trở thành caspase-3.
Một nghiên cứu khác của Truong Tran và cộng sự [39] cho rằng kẽm ức chế caspase-3
thông qua tƣơng tác với nhóm thiol của cys163 tại trung tâm hoạt động của enzym này.
Vì vậy, có thể thấy việc giải phóng caspase-3 khỏi ion kẽm đóng vai trò tiên quyết
trong quá trình hồi phục hoạt tính cho enzym này ở các tế bào ung thƣ.
6


1.2.2. Tác dụng hoạt hóa caspase của PAC-1
PAC-1 (hình 1.3) là phân tử đƣợc công bố lần đầu bởi Putt và cộng sự từ năm 2006.
Nghiên cứu đăng trên tạp chí Nature cho thấy phân tử này có khả năng cảm ứng hiện
tƣợng apoptosis ở tế bào ung thƣ đại tràng in vitro, cũng nhƣ ức chế tăng trƣởng khối u
trên chuột; tác dụng này thu đƣợc nhờ hoạt hóa procaspase-3 để đạt nồng độ đáng kể
caspase-3, từ đó khởi động lại quá trình apoptosis [29]. Nhiều nghiên cứu khác chứng
minh đƣợc hoạt tính của PAC-1 trên những dòng tế bào ung thƣ có nồng độ procaspase-3
cao bất thƣờng nhƣ ung thƣ tủy [42], ung thƣ vú [27] và ghi nhận đƣợc hoạt tính ức chế
tăng trƣởng khối u rất khả quan.

Hình 1.3. Cấu trúc của PAC-1
Liên quan tới cơ chế tác dụng của PAC-1, nghiên cứu của Peterson và cộng sự [26]
chỉ ra hợp chất này có khả năng tạo phức với ion kẽm. Nhƣ vậy, PAC-1 đóng vai trò nhƣ
một tác nhân “bắt giữ” ion kẽm, khiến chúng không thể ức chế các enzymthông qua gắn
vào những vị trí quan trọng, từ đó cho phép chuyển hóa từ procaspase-3 thành caspase-3
diễn ra thuận lợi, kéo theo sự xảy ra quá trình apoptosis với tần suất cao hơn (hình 1.4).
Để phát huy hoạt tính này, phần cấu trúc acetohydrazid của PAC-1 đóng vai trò quyết
định. Đây chính là vị trí trực tiếp tạo phức bền vững với ion kẽm, đã đƣợc chứng minh
qua nhiều nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học thông qua tƣơng tác với ion
kim loại nói chung [18], [5].


7


Hình 1.4. Tác dụng ức chế tế bào ung thư PC-3 khi có mặt ion kẽm của PAC-1 (A) và
lược đồ cơ chế PAC-1 hoạt hóa caspase-3 (B).
1.2.3. Những nghiên cứu tiếp theo về các chất hoạt hóa caspase
Một loạt các dẫn chất mới của PAC-1 đƣợc tổng hợp nhờ giữ nguyên hợp phần cấu
trúc acetohydrazid và thay đổi các hợp phần còn lại. Năm 2013, Astrand và cộng sựtổng
hợp dẫn chất mới ZnA-DPA (hình 1.5) bằng cách thay thế nhóm benzyliden của PAC-1
bởi nhóm dipicolylamin. Phân tử này có ái lực với ion kẽm cao hơn và độc tính mạnh hơn
PAC-1 trên dòng tế bào ung thƣ PC-12 [2].

Hình 1.5. Cấu trúc của dẫn chất ZnA-DPA
Trong khi đó, nghiên cứu của Gong và Wu [40] năm 2014 tổng hợp các dẫn chất
oxadiazol của PAC-1, với nhóm phenoxymethyl phenyl gắn với vòng piperazin, còn phần
cấu trúc benzyliden có gắn thêm một trong các nhóm thế allyl, benzyloxy và piperonyl
mang cầu nối thiazol. Kết quả cho thấy: trong 19 dẫn chất thu đƣợc, dẫn chất WF-208
(hình 1.6) cho hoạt tính vƣợt trội so với PAC-1, thể hiện ở giá trị IC50 thấp hơn hơn 2 lần
ở dòng tế bào HL-60. Tƣơng tự, dẫn chất WF-210 (hình 1.6) ức chế các dòng tế bào ung
thƣ gan, ung thƣ túi mật và ung thƣ vú mạnh hơn, cũng nhƣ ít độc tính trên tế bào lành
hơn so với PAC-1[41].
8


Hình 1.6. Cấu trúc các dẫn chất WF-208 và WF-210.
Các kết quả trên càng củng cố thêm giả thiết về vai trò thiết yếu của phần cấu trúc
acetohydrazid trong các phân tử hoạt hóa caspase-3, hơn nữa những thay đổi ở phần cấu
trúc khác cũng gợi mở một hƣớng nghiên cứu triển vọng để tìm ra các dẫn chất có hoạt
tính khả quan hơn trong tƣơng lai.

1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT MANG KHUNG 2HBENZO[B][1,4]OXAZIN-3(4H)-ON
1.3.1. Tác dụng chống kết tập tiểu cầu
Liên quan đến tác dụng chống kết tập tiểu cầu, một trong những nghiên cứu quan
trọng đầu tiên thực hiện bởi Dudley và công sự năm 2000, trong đó những dẫn chất mang
hợp phần cấu trúc 2-phenyl-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-on đƣợc chứng minh hoạt tính
chống kết tập tiểu cầu thông qua ức chế yếu tố Xa [7].Mới đây, nhóm nghiên cứu của Tian
tổng hợpnhững dẫn chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on, có nhóm thế ở
vị trí 4 và 7 (hình 1.7) đều có hoạt tính chống kết tập tiểu cầu khả quan [38].

Hình 1.7. Cấu trúc các dẫn chất có hoạt tính chống kết tập tiểu cầu
trong nghiên cứu của Tian và cộng sự.
9


1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm
Trong số các nghiên cứu liên quan đến tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm, nổi bật
là nghiên cứu vào năm 2016 của Smist và cộng sự, trong đó thực hiện phản ứng tạo khung
2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on với nhóm thế tại vị trí số 2, 6 hoặc 7. Các hợp chất này
đƣợc đem thử hoạt tính trực tiếp hoặc thực hiện thêm phản ứng thế vào dị tố N. Kết quả
thử hoạt tính kháng nấm cho thấy một số dẫn chất cho tác dụng mạnh tƣơng đƣơng với
những hoạt chất kháng nấm đối chứng, đặc biệt dẫn chất có nhóm thế ở dị tố N cho kết
quả ức chế 100% ở tất cả các chủng nấm khảo sát [35].
Năm 2017, Bollu và cộng sự đã tổng hợp 16 dẫn chất thế nhóm cấu trúc 1,2,3triazol vào dị tố N của khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on (8 chất) và 6-chloro-2Hbenzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on (8 chất) (hình 1.8). Kết quả thử hoạt tính cho thấy các hợp
chất này đều có khả năng ức chế và tiêu diệt các chủng vi khuẩn nhƣ Staphylococcus
aureus, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella planticola,
Pseudomonas aeruginosa, và vi nấm Candida albicans. Đáng chú ý, một số dẫn chất mới
này còn cho tác dụng ức chế và tiêu diệt chủng nấm Candida Albicans tốt hơn so với chất
đối chứng là Miconazol [4].

Hình 1.8. Cấu trúc các dẫn chất có tác dụng kháng nấm

trong nghiên cứu của Bollu và cộng sự
10


1.3.3. Hoạt tính kháng ung thư
Nghiên cứu của Rajitha năm 2011 thực hiện phản ứng thế phần cấu trúc triaryl
pyrazol vào vị trí số 6 của khung 2H-benzo [b][1,4]oxazin-3(4H)-on, tạo ra 13 dẫn chất
mới. Kết quả thử độc tính với 3 dòng tế bào ung thƣ A549 (ung thƣ phổi), DLD-1 (ung
thƣ đại tràng), MV4-11 (ung thƣ bạch cầu) cho thấy các dẫn chất này có hoạt tính tốt hơn
những hoạt chất đã đƣợc phê duyệt nhƣ Gefitinib, Imatinib, Vandetanib, Erlotinib,
Sorafenib, Sunitnib, đặc biệt ở trên tế bào DLD-1 [31].
Một nghiên cứu khác vào năm 2014 của Zhou và cộng sự thực hiện tổng hợp 7 dẫn
chất 6-cinnamoyl-2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on (hình 1.9) và thử hoạt tính của chúng
trên dòng tế bào ung thƣ phổi A549. Kết quả cho thấy một số dẫn chất có độc tính tƣơng
đƣơng với 5-Flourouracil [43].

Hình 1.9. Cấu trúc các dẫn chất có độc tính với tế bào ung thư
trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự.
Với mục đích đồng thời khai thác hoạt tính của các nhóm cấu trúc đã đề cập, qua đó
tìm ra những dẫn chất có hoạt tính chống khối u tiềm năng, trong đề tài này, khóa luận
thực hiện tổng hợp những hợp chất acetohydrazid mang khung 2H-benzo [b][1,4]oxazin3(4H)-one và thử hoạt tính của chúng trên một số dòng tế bào ung thƣ. Nội dung chi tiết
các phần của đề tài sẽ đƣợc trình bày chi tiết ở các chƣơng tiếp theo trong khóa luận.

11


CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất

Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC.
Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học đƣợc nhập từ công ty SigmaAldrich hoặc Merck. Các hóa chất này đƣợc sử dụng trực tiếp mà không cần trải qua bất
kỳ quá trình tinh chế nào, bao gồm:
- Các isatin:

- Các benzaldehyd:

- 2-aminophenol

+ Isatin

+ Benzaldehyd

- Chloroacetyl chlorid

+ 5-Cloroisatin

+ 4-Clorobenzaldehyd

- Ethyl chloroacetat

+ 5-Methylisatin

+ 4-Methoxybenzaldehyd - Hydrazin monohydrate

+ 5-Methoxyisatin
Các dung môi, hóa chất khác nhƣ: nƣớc cất, isobutylmethyl ceton, aceton,
dicloromethan (DCM), ethanol (EtOH), acid acetic (AcOH), K2CO3, KI…
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC.

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón,
bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại.
- Bình chạy sắc ký Camag.
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bƣớc sóng 254 nm và 366 nm.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu.
- Máy cất quay chân không Buchi R-200.
- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm.
- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR.

12


- Máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL để ghi phổ MS, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
- Máy cộng hƣởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR đặt tại Khoa
Hóa học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 7 chất:
 N'-benzyliden-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid
(Va).
 N'-(4-chlorobenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4yl)acetohydrazid (Vb).
 N'-(4-methoxybenzylidene)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4yl)acetohydrazid (Vc).
 2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)-N'-(2-oxoindolin-3yliden)acetohydrazid (VIa)
 N'-(5-chloro-2-oxoindolin-3-yliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (VIb)
 N'-(5-methyl-2-oxoindolin-3-yliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (VIc)
 N'-(5-methoxy-2-oxoindolin-3-yliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4Hbenzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (VId)
- Kiểm tra độ tinh khiết.

- Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp đƣợc.
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp đƣợc
- Thử khả năng ức chế sinh trƣởng tế bào ung thƣ.
- Thử độc tính trên một số tế bào ung thƣ: ung thƣ đại tràng (SW620), ung thƣ
phổi(NCI-H23), ung thƣ biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3).
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
13


2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên các nguyên tắc và phƣơng pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành
tổng hợp các chất theo thiết kế. Các phản ứng sử dụng:
+ Phản ứng ngƣng tụ của 2-amino phenol với tác nhân chloroacetyl chlorid.
+ Phảnứngthế ái nhân với tác nhân chloroethyl acetat.
+ Phản ứng thế ái nhân với tác nhân hydrazin.
+ Phản ứng ngƣng tụ với các isatin và benzaldehyd.
- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được
Các chất sau khi đƣợc tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết đƣợc xác định cấu
trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng
Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét
phổ trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn đƣợc phân tán trong KBr
đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng
thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.
- Phổ khối lƣợng (MS): đƣợc ghi bằng máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL để ghi phổ

MS, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoạt động theo phƣơng
pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi MeOH.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): đƣợc ghi bằng máy Bruker
AV-500 tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở
tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) đƣợc
biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan
(TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6.

14


2.3.2. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng ức chế mức độ sinh trƣởng tế bào và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
ngƣời (thử độc tính tế bào) in vitro đƣợc tiến hành tại Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia
Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.
Các chất trƣớc hết đƣợc thử khả năng ức chế mức độ sinh trƣởng tế bào (cell growth
percentage - CGP) ở nồng độ chất là 30 µg/ml, sử dụng 5-fluorouracil (5-FU) làm chất
đối chiếu dƣơng tính. Sau đó, các chất cho kết quả ức chế tế bào tốt tiếp tục đƣợc đem
thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thƣ ở các nồng độ chất khác nhau nhằm xác
định giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % số lƣợng tế bào ung thƣ).
Độc tính tế bào đƣợc thử trên các dòng tế bào: ung thƣ đại tràng (SW620), ung thƣ
phổi (NCI-H23), ung thƣ biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3). Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc
lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn
Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh
bào thai bò). Thử độc tính tế bào theo phƣơng pháp Sulforhodamin B (SRB).
* Nguyên tắc thử
Dựa trên khả năng gắn thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế
bào, sử dụng phƣơng pháp đo màu để tính tổng lƣợng protein, từ đó suy ra số lƣợng tế
bào.
* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm
chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy). Kết quả cuối cùng là giá trị
trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính
dựa theo phƣơng pháp Probits.

15