ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------- oOo ---------------

NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG

TRÍCH LY FLAVONOID TỪ LÁ CÂY HOÀN NGỌC TRẮNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SIÊU ÂM VÀ THỬ NGHIỆM
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO TRÍCH
(Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik, leaves
by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of antibacterial activity)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC
Mã số: 60520301

LUẬN VẲN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2019


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Minh Nam..............................................................

TS. Nguyễn Hữu Hiếu ........................................................

Cán bộ chấm nhận xét 1: ................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2: ................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Tp. HCM, ngày tháng năm 2019
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1 .......................................................................... - Chủ tịch
2 .......................................................................... - ủy viên phản biện 1
3 .......................................................................... - ủy viên phản biện 2
4

......................................................................... - ủy viên

5

......................................................................... -Thư kí
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau

khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

i


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG


Ngày, tháng, năm sinh: 16/08/1993

MSHV: 1770139

Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 60520301

I. TÊN ĐỀ TÀI:
Tên tiếng Việt: “Trích ly flavonoid từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử
nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích”
Tên tiếng Anh: “Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik, leaves
by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of antibacterial activity”
II. NHIỆM VỤ VA NỘI DUNG:
2.1. Tổng quan: cây hoàn ngọc trắng, flavonoid, hoạt tính của lá hoàn ngọc trắng, phương pháp trích
ly hỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng flavonoid, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
của cao trích, quy hoạch thực nghiệm.
2.2. Thực nghiệm
-Trích ly flavonoid (quercetin và kaempferol) từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu
âm.
-Khảo sát ảnh hường của từng điều kiện đến hàm lượng quercetin và kaempferol bao gồm: nồng độ
etanol, thời gian siêu âm, nhiệt độ trích ly và công suất siêu âm.
-Khảo sát ảnh hường đồng thời ba điều kiện nồng độ etanol, thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly
đến hàm lượng quercetin và kaempferol bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp tâm xoay bậc hai
với mô hĩnh Box-Wilson.
- Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 07/2018

IV. NGÀY HOÀN THANH NHIỆM VỤ: 07/2019
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.HOÀNG MINH NAM, TS. NGUYỄN HỮU HIẾU
Tp. HCM, ngày ... thảng... năm 2019
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PTN TĐ ĐHQG-HCM
CNHH & DK

TS. HOÀNG MINH NAM TS. NGUYỄN HỮU HIẾU TS. NGUYỄN HỮU HIẾU
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS. TS PHAN THANH SƠN NAM

ii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả thục hiện và
hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách
Khoa, ĐHQG-HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tác giả và tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả trong quá trình học
tập và hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến hai thầy TS. Hoàng Minh Nam và TS. Nguyễn Hữu Hiếu đã tận tình
hướng dẫn tác giả hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể nghiên cứu viên ở Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM
Công nghệ hóa học và Dầu khí (CEPP) đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và quý anh chị Trung tâm Kỹ thuật Tiêu
chuẩn Đo lường Chất lượng 3 (QUATEST 3) đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tác giả trong quá trình
thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Tháng 07 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

iii


TÓM TẮT
Trong luận văn này, hoạt chat flavonoid (quercetin và kaempferol) được trích ly từ lá hoàn ngọc
trắng bằng phương pháp sử dụng dung môi etanol có hỗ trợ siêu âm. Hàm lượng quercetin và
kaempferol trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (highperformance liquid chromatography - HPLC).
Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như nồng độ etanol (%), thời gian siêu âm (phút), nhiệt độ
trích ly (°C) và công suất siêu âm (W) đến hàm lượng quercetin và kaempferol được khảo sát bằng
phương pháp luân phiên từng biến để chọn ra ba điều kiện ảnh hưởng nhất. Sau đó, tiến hành khảo sát
đồng thời ba điều kiện này như nồng độ etanol, thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly bằng phương
pháp tâm xoay bậc hai với mô hình Box - Wilson, số liệu được xử lý bằng phần mềm Design Expert
11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất. Đồng thời phương
pháp trích ly không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm cũng được thực hiện để đối chứng.
Cao trích có hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất được thử hoạt tính kháng khuẩn để xác
định nồng độ ức chế tối thiểu trên hai vi khuẩn: Streptococcus agalactiae và Edwardsiella ỉctalurỉ.

4


ABSTRACT
In this assay, flavonoid (quercetin and kaempferol) is extracted from the Pseuderanthemum
palatiferum (Nees) Radik. (P. palatiferum) leaves by using ethanol solvent and ultrasound-assisted
method. The contents of quercetin and kaempferol were determined by high-performance liquid
chromatography method.
Effects of extraction conditions as ethanol concentration (%), ultrasonic time (min), extraction

temperature (°C) and the ultrasonic power (W) on quercetin and kaempferol contents in the extract,
which were investigated by alternate each variable method to choose the three most influential factor.
Then, carry out a survey of the simultaneous effects of three factors such as ethanol concentration (%),
ultrasonic time (min), extraction temperature (°C) by a quadratic rotation method with the Box Wilson model. Data are processed with Design Expert 11.0 software to find extraction conditions for
the highest quercetin and kaempferol content. At the same time, the check sample extracted with the
above conditions but without ultrasonic support was also tested to compare with the extraction sample
in suitable conditions.
Extract with the highest concentration of quercetin and kaempferol tested for antibacterial activity
to determine the minimum inhibitory concentration for Streptococcus agalactiae and Edwardsiella
ictaluri.

V


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và đuợc thục
hiện duới sụ huớng dẫn của hai thầy TS. Hoàng Minh Nam và TS. Nguyễn Hữu Hiếu, Phòng thí
nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM - Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách
Khoa, ĐHQG-HCM.
Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

vi


MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................. iii
TÓM TẮT ................................................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................................. V
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................ vi
MỤC LỤC .................................................................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................... xii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................................................ 2
1.1. Cây hoàn ngọc trắng .......................................................................................................... 2
1.1.1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố ................................................................. 2
1.1.2. Mô tả thực vật ....................................................................................................... 2
1.1.3. Thành phần hoá học của lá cây HNT...................................................................... 3
1.1.4. Công dụng ............................................................................................................. 5
1.1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................. 6
1.2. Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản .............................................................................................. 7
1.2.1. Tĩnh hình chung .................................................................................................... 7
1.2.2. Vi khuân Streptococcus agalactiae ....................................................................... 8
1.2.3. Vi khuân Edwardsiella ictaluri ............................................................................... 9
1.2.4. Khảng khuẩn ......................................................................................................... 11
1.3. Các phưong pháp trích ly ................................................................................................ 11
1.3.1. Phương pháp trích ly truyền thong ....................................................................... 11
1.3.2. Phương pháp trích ly hiện đại............................................................................... 12
1.4. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu và tính mói của
luận văn .............................................................................................................................................. 17
1.4.1. Tinh cấp thiết ........................................................................................................ 17
1.4.2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................. 18
1.4.3. Nội dung ................................................................................................................ 18

1.4.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 18
1.4.5. Tính mới của luận vãn........................................................................................... 24
7


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 25
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - dụng cụ và địa điểm thực hiện .................................. 25
2.1.1.

Nguyên liệu ........................................................................................................... 25

2.1.2.

Hóa chẩt................................................................................................................ 25

2.1.3.

Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................... 26

2.1.4.

Địa điểm thực hiện ................................................................................................ 27

2.2. Thí nghiệm

27

2.2.1.

Khảo sát quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT ..........................27


2.2.2.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao trích ....................................................33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................... 36
3.1.

Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng quercetin và kaempferol ..36
3.1.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện .............................................................................. 36
3.1.2. Ảnh hưởng đồng thời các điều kiện ...................................................................... 40
3.1.3.

3.2.

Kiểm chứng mô hình ............................................................................................. 54

Hoạt tính kháng khuẩn của cao trích ............................................................................ 56
3.2.1. Đổi với s. agalactiae ............................................................................................. 56
3.2.2. Đổi với E. ỉctalurỉ ................................................................................................58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ........................................................................................................61
TÀI LỆU THAM KHẢƠ
PHỤ LỤC
CÔNG TRÌNH CÔNG BÓ

8


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng ......................................................................................... 3
Hình 1.2: Công thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid .................. 4
Hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin................................................................................. 4
Hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol ............................................................................. 5
Hình 1.5: Vi khuẩn 5. agaỉactiae................................................................................................... 8
Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn 5. Agalactỉae gây bệnh trên cá diêu hồng ....................... 9
Hình 1.7: Vi khuẩn E. ỉctalurỉ ....................................................................................................... 9
Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn E. ỉctalurỉ

gây bệnh trên cá da trơn.................. 10

Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol ................................. 11
Hình 1.10: Phổ điện từ ................................................................................................................. 12
Hình 1.11: Một số loại enzyme thông dụng................................................................................. 13
Hình 1.12: Giản đồ áp suất - nhiệt độ của CŨ2 ........................................................................... 14
Hình 1.13: Tần số của âm thanh .................................................................................................. 15
Hình 1.14: Mô hình tâm xoay bậc hai ......................................................................................... 19
Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý máy HPLC ...................................................................................... 21
Hình 1.16: Cách đo đường kính vòng kháng khuẩn .................................................................... 23
Hình 2.1: Lá HNT đã sấy khô và xay nhuyễn ............................................................................. 25
Hình 2.2: (a) Bể siêu âm, (b) Máy HPLC-30 Nexera .................................................................. 26
Hình 2.3: Quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT ................................................ 27
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH .................................................................................... 36
Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm ................................................................................ 37
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly .................................................................................. 38
Hình 3.4: Ảnh hưởng của công suất siêu âm ............................................................................... 39
Hình 3.5: Hàm lượng quercetin từ số liệu thực nghiệm và dự đoán ............................................ 43
Hình 3.6: Sự ảnh hưởng đồng thời của ba điều kiện khảo sát ..................................................... 44
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến ............................................ 45
hàm lượng quercetin .................................................................................................................... 45

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến .......................................... 46
hàm lượng quercetin .................................................................................................................... 46
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến .............................................. 47
ix


hàm lượng quercetin .................................................................................................................... 47
Hình 3.10: Hàm lượng kaempferol từ số liệu thực nghiệm và dự đoán ...................................... 50
Hình 3.11: Sự tác động của ba điều kiện khảo sát ....................................................................... 51
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến .......................................... 52
hàm lượng kaempferol ................................................................................................................. 52
Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến ........................................ 53
hàm lượng kaempferol ................................................................................................................ 53
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến ............................................ 54
hàm lượng kaempferol ................................................................................................................ 54
Hình 3.15: Hoạt tính kháng khuẩn s. agalactỉae của cao trích HNT ........................................... 56
Hình 3.16: Kết quả kháng khuẩn 5. agalactỉae bằng kỹ thuật pha loãng tới hạn của cao
trích HNT ..................................................................................................................................... 57
Hình 3.17: Hoạt tính kháng khuẩn E. ỉctalurỉ của cao trích HNT ............................................... 58
Hình 3.18: Kết quả kháng khuẩn E. ỉctalurỉ bằng kỹ thuật pha loãng tới hạn của cao
trích HNT ..................................................................................................................................... 59

X


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Chuẩn và hoá chất sử dụng ..........................................................................................25
Bảng 2.2: Thiết bị, dụng cụ sử dụng ............................................................................................26
Bảng 2.3: Thí nghiệm khảo


sát nồng độ EtOH.....................................................................28

Bảng 2.4: Thí nghiệm khảo

sát thời gian siêu âm ................................................................29

Bảng 2.5: Thí nghiệm khảo

sát nhiệt độ trích ly...................................................................30

Bảng 2.6: Thí nghiệm khảo

sát công suất siêu âm ...............................................................30

Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Wilson ...........................................................31
Bảng 2.8: Chuẩn bị chất chuẩn làm việc ..................................................................................... 33
Bảng 2.9: Nồng độ dịch trích pha loãng ..................................................................................... 35
Bảng 3.1: Khoảng biến thiên .......................................................................................................40
Bảng 3.2: Mức thí nghiệm ...........................................................................................................40
Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với quercetin....41
Bảng 3.4: Kết quả phân tích ANOVA đối với quercetin .............................................................42
Bảng 3.5: Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm ......................................43
Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với kaempferol 48
Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA đối với kaempferol ..........................................................49
Bảng 3.8: Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm ......................................50
Bảng 3.9: Điều kiện hiệu chỉnh từ mô hình .................................................................................55
Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng mô hình ....................................................................................55

xi



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẤT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ANOVA

Analysis of variation

Phân tích phương sai

DAD

Diode-Array Detector

Đầu dò dãy diode

DMSO

Dimethylsulfoxide

Dimetyl sulfoxit

High-performance liquid
HPLC

FAO

MIC

chromatography
Food and Agriculture Organization of
The United Nations
Minimal Inhibitory Concentration

xii

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên Hợp Quốc
Nồng độ ức chế tối thiểu


ĐẶT VẤN ĐỀ
•
Trên thị trường thủy sản hiện nay sản phẩm cá diêu hồng và da trơn xuất khẩu của Việt Nam đã được
xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, các sản
phẩm cá xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần như toàn bộ thị phần thế giới, kim ngạch xuất khẩu
cá đạt hơn 500 triệu đô la và dự kiến trong 2018 sẽ có 600 ngàn tấn cá xuất khẩu, thu về gần 2 tỷ đô la Mỹ.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam còn đưa ra dự kiến trong vòng 10 năm tới diện tích
nuôi cá sẽ tăng gấp đôi so với hiện nay, đẩy mạnh đầu tư hai khu vực sông Tiền và sông Hậu.
Tuy nhiên, bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển phức tạp, ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt cá
và người nuôi cá. Phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng thuốc kháng sinh, song có thể dẫn đến rủi
ro do hiện tượng kháng thuốc. Với thực trạng đó, ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến các loại
kháng sinh có nguồn gốc thực vật, nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh ở thủy sản. Các loại hoạt
chất có khả năng kháng khuẩn đang nhận được nhiều sự quan tâm như carotenoid, flavonoid, alkaloid,
terpenoid, trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn cao và được tìm thấy nhiều

trong các bộ phận của cây hoàn ngọc trắng, đặc biệt chứa nhiều trong lá cây.
Dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp ngâm trích
truyền thống dễ thực hiện, đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid thấp, các phương
pháp trích ly hiện đại như sử dụng hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất siêu tới hạn và hỗ trợ siêu âm có ưu
điểm thời gian trích ly nhanh, hàm lượng flavonoid cao nhưng thiết bị lại đắt tiền. Phương pháp trích ly sử
dụng dung môi có hỗ trợ siêu âm với giá thành hóa chất và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích
ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt và thiết bị dễ sử dụng là những
ưu điểm nổi trội phương pháp này.
Vì vậy, đề tài “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trọ siêu âm và
thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích” được chọn để nghiên cứu.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cây hoàn ngọc trắng
Phân loại khoa học và khu vực phân bố

1.1.1.

Cây hoàn ngọc hắng (HNT) còn có tên gọi khác là Xuân Hoa, Tu Lình, Nhật Nguyệt. Cây đuợc tìm
thấy lần đầu tiên ở Miền Bắc Việt Nam, thường mọc hoang ở các vùng núi Cao Lạng và hiện nay được
trồng với quy mô lớn tại Tây Ninh [1,2]. Hoàn ngọc trắng có phân loại khoa học như sau:

1.1.2.

-

Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik.

-


Ngành: thực vật có hoa (Angiospermae)

-

Lớp: hai lá mầm (Eudicots)

-

Bộ: Hoa Môi (Lamiales)

-

Họ: Ô Rô (Acanthaceae)

-

Chi: Xuân hoa (Pseuderanthemum)

-

Loài: Pseuderanthemum palatiferum
Mô tả thực vật

Cây mọc thành bụi, cao 0,6-1,5 m, là cây lâu năm. Khi cây còn non, thân trơn nhẵn, các đốt có màu
hơi vàng, lá mọc đối xứng và có cuống dài, có hình mũi giác; khi già chuyển thành màu nâu, phân ra thành
nhiều nhánh. Lá mọc đối, phiến lá bầu dục dài; mép lá nguyên hoặc lượn sóng, có khía; cuống lá dài 1,52,5 cm. Mặt trên hầu như nhẵn với rất ít lông che chở đa bào ngắn hoặc lông tiết có chân đơn bào, dọc gân
chính nhiều lông; mặt dưới nhẵn; gân phụ 5-6 cặp như được thể hiện ở hình 1.1. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu
cành, cụm hoa dài 10-16 cm. Hoa lưỡng tính, không đều, màu trắng. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm
lịch [1],


Hình 1.1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng
Các bộ phận của HNT đều được dân gian sử dụng để chữa bệnh. Đặc biệt là lá vì trong đó có chứa
2


nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học [3].
1.1.3. Thành phần hoá học của lá cây HNT
Bằng các phương pháp phân lập, định danh và định lượng bởi các thiết bị hiện đại như sắc kí lỏng
hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography - HPLC), sắc kí khí (Gas Chromatography - GC),
phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier Transform InfraRed - FT-IR), khối phổ (Mass Spectrometry
- MS), quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy - NMR) cho thấy
lá HNT chứa nhiều hoạt chất như flavonoid, apigenin, triterpenoids, saponin, 0-sitosterol, stigmasterol, axit
salicylic, phenolic và axit ascobic [4, 5].
1.1.3.1. Flavonoid
Flavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên, là một
loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy nhiên, một so flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có
một số khác lại không có màu [6].
Theo danh pháp IUPAC, nhóm flavonoid có thể được chia thành: flavone (2-phenylchromen-4-one),
isoflavonoid (3-phenylchromen-4-one (3-phenyl- l,4benzopyrone)) và neoflavonoid (4-phenylcoumarine
(4-phenyl-l,2-benzopyrone)). Các công thức hóa học được thể hiện ở hình 1.2 [7].

3


o

(a)

(c)


Hình 1.2: Công thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid
Flavonoid phổ biến ở nhiều loài thực vật và có nhiều chức năng. Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc
tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để
thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Trong thực vật bậc cao, flavonoid tham gia vào lọc tia cực tím, cộng
sinh cố định đạm và sắc tố hoa. Flavonoid có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều
chỉnh sinh lý, có thể hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào [8].
Trong flavonoid, nổi bật có hai hoạt chất có hoạt tính sinh học là quercetin và kaempferol.
1.1.3.2. Quercetin
Quercetin có danh pháp IUPAC là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-H- chromen-4-one, là
một flavone phân bố rộng rãi trong thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin
Quercetin thường có mặt dưới dạng glycosit và được chuyển đổi thành liên hợp glucuroniưsunphat
trong quá trình hấp thu ở ruột và do đó chỉ có các chất chuyển hóa liên hợp được tìm thấy trong máu lưu
thông. Quercetin đã được chứng minh là tương tác với một số thụ thể, đặc biệt là thụ thể hydrocacbon aryl,
có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do một số hóa chất gây ra. Quercetin cũng đã được chứng
minh là điều chỉnh một

4


số đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến quá trình viêm và gây ung thư. Các nghiên cứu động vật gặm
nhấm đã chứng minh rằng việc sử dụng quercetin trong chế độ ăn kiêng ngăn ngừa ung thư đại tràng và
các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rang quercetin có thể liên quan đến việc ngăn ngừa ung thư phổi. Do
đó, quercetin trong chế độ ăn uống là một tác nhân đầy hứa hẹn để ngăn ngừa ung thư và nghiên cứu sâu
rộng hơn [9].
1.1.3.3.

Kaempferol


Kaempferol (3,4,5,7-tetrahydroxyflavone) là một flavone được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và
thực phẩm có nguồn gốc thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình
1.4.

OH õ
Hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol
Kaempferol là một chất rắn kết tinh màu vàng với điểm nóng chảy là 276 °C, ít tan trong nước, tan
nhiều trong EtOH nóng, ete và dimethyl sulfoxide (DMSO). Kaempferol có hoạt tính kháng khuẩn, kháng
oxy hóa cao, có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư khác nhau.
1.1.4.

Công dụng

Theo các bài thuốc dân gian, HNT có khả năng chữa nhiều loại bệnh:
-

Phòng và hỗ trợ điều trị bệnh u bướu.

-

Chữa rối loạn tiêu hóa, kích thích tiêu hóa, tốt cho bệnh nhân bị dạ dày, đại tràng, đường ruột. Với

người bệnh đau bụng đi ngoài, chỉ cần nhai sống 3 lá HNT trong 3 lần là khỏi.
-

Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột.

-

Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh.


-

Tác dụng cầm máu cực kỳ hiệu quả, bạn chỉ cần nhai lá HNT đắp vào vùng bị sưng đau, chảy máu,

vết thương sẽ được cầm máu ngay.

5


-

Hỗ trự điều trị bệnh huyết áp, tim mạch.

-

Tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, tiểu ra máu, tiểu buốt, tiểu gắt [10, 11].

Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã nổi lên phong trào trồng cây HNT để chữa những bệnh thuộc đường
tiêu hoá hoặc tiểu đường và hầu hết các công dụng đó đều đã và đang được khoa học chứng minh bằng các
công trình nghiên cứu trong và ngoài nước.
1.1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.5.1. Ngoài nước
Năm 2013, khả năng kháng viêm của cao trích lá HNT được đánh giá bằng xét nghiệm phù tai do ethyl
phenylpropiolate gây ra trên chuột nhắt trắng. Cao trích cho thấy khả năng kháng viêm cấp tính và mãn
tính đáng kể. Cao trích ở hàm lượng thấp được sử dụng trong xét nghiệm viêm cấp tính (1 mg/tai chuột)
có tác dụng kháng viêm cấp tính tương đương với hoạt chất kháng viêm chuẩn - phenylbutazone. Tác dụng
kháng viêm mãn tính phụ thuộc vào hàm lượng cao trích và có tác dụng tốt hơn so với chất đối chứng
diclofenate [12].
Năm 2015, hai hợp chất stigmasterol và sitosterol-3-O-D-glucopyranoside đã được phân lập từ lá HNT

được nghiên cứu điều trị bệnh tiểu đường. Với liều 0,25 và 0,50 mg/kg cao trích được cho chuột bị tiểu
đường điều trị trong 21 ngày. So sánh lượng đường huyết lúc đói (Fasting blood glucose - FBG) vào các
ngày 0, 4, 7, 10, 14, 17 và 21 với một thuốc chống tiểu đường - glibenclamine cho thấy lượng đường trong
máu ở tất cả các liều điều trị đã giảm đáng kể, cùng với sự gia tăng đồng thời của insulin. Stigmasterol 0,5
mg/kg có hiệu quả hạ đường huyết tốt nhất. Ngoài ra, hai hoạt chất này cũng làm tăng lượng cholesterol
tot (High-Density Lipoprotein - HDL), làm giảm lượng cholesterol xấu (Low- Density Lipoprotein - LDL),
hàm lượng urê trong máu, creatinine, v.v. [13].
Năm 2016, cao trích EtOH của lá HNT được thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường bằng khả năng ức
chế enzyme a-amylase và a-glucosidase in vitro. Ket quả cho thấy cao trích có khả năng ức chế cả aamylase và a-glucosidase với các giá trị ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration - IC50)
tương ứng là (11,79 ± 8,10) mg/mL và (1,00 ± 0,11) mg/mL [5],
1.1.5.2. Trong nước
Năm 2004, các hợp chất 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit panmitic và axit salicylic được
phân lập từ cây HNT [14].
Năm 2005, nghiên cứu về thử độc tính và tác dụng ức chế quá trình peroxit hoá lipid màng tế bào, thử
nghiệm chữa bệnh dịch tả đối với heo chưa cai sữa, phân lập triterpenoid và steroid từ lá HNT bằng phương
pháp NMR lần lượt được thực hiện [15,16].
Năm 2006, tám hợp chất: dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloaratanol, lolionlide, 06


sitosterol, 0-sitoterol 3-0-O-D-glucopyranoside và stigmasterol 3-0-O-D- glucopyranoside lần đầu tiên
được phân lập trong lá HNT, đồng thời khảo sát khả năng kháng khuẩn đường ruột của cao trích [17].
Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao trích lá HNT trồng tại Việt Nam vẫn chưa
được tìm hiểu về chiều sâu. Bên cạnh đó, tình hình kháng thuốc kháng sinh của các loại vi khuẩn đang diễn
ra phổ biến trên người và kể cả động vật, nhất là đối với thủy sản.
1.2. Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản
1.2.1. Tình hình chung
Theo một thông báo đặc biệt được hệ thống thông tin và cảnh báo sớm của Tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations - FAO), sự bùng
phát dịch bệnh trên thuỷ sản cần được quan tâm đặc biệt nên cần áp dụng các biện pháp quản lý thích hợp
như tăng cường kiểm tra chẩn đoán, thực thi các giấy chứng nhận sức khoẻ, triển khai các biện pháp kiểm

dịch và lập kế hoạch dự phòng [18].
Tại Việt Nam, cá diêu hồng và cá da trơn là các loài cá có sức khoẻ tốt, khả năng kháng bệnh cao, là
hai loại cá được xuất khẩu đến rất nhiều nước trên thế giới mang về lợi nhuận rất lớn cho ngành thủy sản.
Năm 2015, sản lượng cá diêu hồng và da trơn trên thế giới từ cả nuôi trồng thủy sản và đánh bắt lên tới 6,4
triệu tấn, với giá trị ước tính là 9,8 tỷ đô la Mỹ, thương mại toàn cầu đạt 1,8 tỷ đô la Mỹ. FAO còn cho biết
cá diêu hồng là đối tượng của an ninh lương thực và dinh dưỡng toàn cầu [19].
Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra trên cá diêu hồng, bệnh đốm trắng (hay
bệnh hoại tử nội tạng) ở cá da trơn do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có nguy cơ lan rộng, gây thiệt
hại lớn về kinh tế và đời sống của người nuôi trồng thuỷ sản.
Người nuôi trồng thủy sản và các nhà khoa học đã ỷ thức được rằng bệnh do cảc loài vỉ khuẩn khác
nhau gẳỵ ra cố thề trở thành mối đe dọa số một đối với ngành thủy sản. Streptococcus agaỉactìae được coi
là vi khuẩn gây bệnh cỏ ảnh hưởng lớn nhất trên cá diêu hồng, có thể gây chết cá với số lượng lớn và gây
thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi ửồng.
1.2.2.

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Streptococcus agaỉactiae (S. agaỉactíae) là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, phân chia tế bào theo trục
dọc thành chuỗi. Hình ảnh dưới kính hiển vỉ có độ phóng đại lớn về vi khuẩn này được thề hiện ở hình ỉ
.5.

7


Hình 1.5: Vi khuẩn s. agaỉactiae [20]
Biểu hiện của cá khi nhiễm phải vi khuẩn s. agaỉactìae như sau:
-

Cá bơi lờ đờ trên tầng mặt, một số cả bị bệnh nặng bơi nghiêng mình trên mặt nước và quay tròn


một vài vòng sau đó tử vong.
-

Mắt cá bị lồi một bên và trên mắt kéo một lớp màng màu trắng đục.

-

Phía trong nắp mang bị xuất huyết, có màu đỏ nhưng không bị thối.

-

Hậu môn sưng đỏ.

-

Giải phẫu ưong xoang bụng chứa nhiều dịch, ruột xuất huyết và chứa các bọt khí, quan sát thấy

mật sưng to [20,21].
Các biểu hiện trên được thể hiện ở hình 1.6.

8


Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn s. Agaỉactiae gây bệnh trên cá diêu hồng [20]
Cá bị nhiễm trùng loại vi khuẩn này dễ dẫn đến nhiễm trùng máu và các bệnh liên quan đến hệ thần
kinh của cá dẫn đến tử vong tỷ lệ từ 30 đến 50% [20].
1.2.3.

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri


Edwardsiella ictaluri (E. ictaỉuri) là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thuớc 1x2-3 pm, không sinh
bào tủ, là vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, đuợc thể hiện ở hình 1.7.

Hình 1.7: Vi khuẩn E. ictaluri
Biểu hiện của cá khi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri như sau:
-

Cá kém ăn hay bỏ ăn, gầy yếu.

-

Bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi.

-

Giải phẫu cơ quan nội tạng gan, lá lách, thận bị hoại tử thành những đốm màu trắng đục đường

kính 0,5-2,5 mm, còn gọi là bệnh đốm trắng như thể hiện ở hình 1.8.

9


Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vỉ khuẩn E. ỉctaluri gây bệnh trên cá da tron
E. ictaỉuri gây bệnh trên cá da trơn với tốc độ nhiễm bệnh và bệnh phát triền rất nhanh. Bệnh nhiễm
khuẩn trên cá đang phát triển rất phức tạp và phương phảp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng kháng sinh tân
dược. Các loại thuốc này có hoạt tính mạnh, có thể thẩm thấu trực tiếp vào máu, mang đến hiệu quả nhanh
chóng, đặc biệt là tiêu diệt các ổ nhiễm khuẩn tồn tại trong cơ thể. Tuy nhiên, vì chất kháng sinh tổng hợp
là một hoạt chất có tính kháng khuẩn, nên khỉ người dùng không tuân thủ liệu trình điều trị thì sẽ chưa tiêu
diệt hoàn toàn vi khuẩn và lúc này vi khuẩn sẽ tự thích nghi bằng cách sinh ra một cơ chế phòng vệ với
kháng sinh đỏ. Lâu ngày, vi khuẩn sẽ thích nghi hoàn toàn với kháng sinh và dẫn tối tình ưạng kháng thuốc

(tức là thuốc không còn tác dụng kháng khuẩn với vỉ khuẩn đó nữa) [15].
Kháng sinh thực vật là sự phối hợp nhiều loại hợp chất với tác dụng kháng khuẩn theo nhiều cơ chế
phức tạp. Khi đó, vi khuẩn không cỏ khả năng nhận diện cơ chế tác động của kháng sinh thực vật để hình
thành khả năng phòng vệ và gần như không có khả năng kháng thuốc. Vì vậy, ngày nay, hướng nghiên cứu
về kháng sinh thực vật đang nhận được nhiều sự quan tâm trên thế giới.

10


Các loại kháng sinh thực vật được nghiên cứu khá nhiều và có tác dụng diệt khuẩn cao như flavonoid,
polyphenol, triterpenoid. Trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có tác dụng kháng khuẩn cao trên nhiều
dòng vi khuẩn khác nhau và nhóm hoạt chất này có chứa nhiều trong lá HNT. Do đó, cần nghiên cứu về
các phương pháp trích ly flavonoid từ lá HNT để thay thế kháng sinh tân dược trong việc điều trị bệnh thủy
sản.
1.2.4. Kháng khuẩn
Quercetin và kaempferol là hai hoạt chất được tìm thấy trong lá HNT, với cấu tạo vòng gắn các nhóm
OH như hình 1.9, các nhóm OH này làm tăng khả năng kháng khuẩn với cơ chế liên kết với adhesin - yếu
tố độc lực của vi khuẩn làm ức chế giải phóng acetylcholine - thành phần lớp phospholipid ở màng tế bào
làm mất chức năng của vi khuẩn [22, 23].

Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol
1.3. Các phương pháp trích ly
Hiện nay, dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, cơ bản được chia làm hai
loại là phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại.
1.3.1. Phuong pháp trích ly truyền thống
Trong phương pháp truyền thống, nguyên liệu được ngâm vào trong dung môi thích hợp để hòa tan
các hợp chất mong muốn, có sử dụng kết hợp với nhiệt độ hoặc khuấy trộn. Sắc thuốc là một dạng trích ly
truyền thống đã được con người sử dụng từ hàng ngàn năm nay trong lịch sử y học. Nhìn chung, phương
pháp trích ly truyền thống đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên, tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid
trích ly thấp.

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, các phương pháp trích ly cổ điển này đang dần được
thay thế bởi các máy móc, trang thiết bị hiện đại hơn.

11


1.3.2.

Phương pháp trích ly hiện đại

Các phương pháp hiện đại đã và đang phổ biến hiện nay như trích ly hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất
siêu tới hạn và đặc biệt là siêu âm.
L Hỗ trợ vỉ sóng

1.3.2.

Vi sóng là sóng cực ngắn hay sóng siêu tần. Trong phổ điện từ, vi sóng nằm trong khoảng tần số từ
4x1 o10- 3X1011 Hz như thể hiện ở hình 1.10.

0

Radio

.9xl014 3xlO16 3xlO19 Tẩn SỐ (Hz)

4xl010 3X1011 4xl014

sóng

1


Hóng
ngoại

Tia
cực 1
tím

Khả kiến

Tia

Tia
Gamma

Hình 1.10: Phổ điện từ

Năng lượng của vi sóng là năng lượng điện từ. Năng lượng photon của vi sóng rất thấp, tại tần số 2450
MHz, năng lượng photon là 0,0016 eV (xấp xỉ 0,037 kcal/mol), trong khi năng lượng của các liên kết hóa
học vào khoảng 80-120 kcal/mol. Do đó, vi sóng không ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử của hợp chất hữu
cơ. Sự kích thích phân tử của vi sóng đơn thuần là tác động về động học.
Khi vi sóng chạm đến vật liệu, một phần năng lượng của nó bị phản xạ trở lại, một phần đáng kể sẽ bị
hấp thu vào trong vật liệu. Năng lượng này sẽ được chuyển hóa thành nhiệt và giảm dần khi nó truyền đi
trong vật liệu.
Sự đun nóng của vi sóng là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion. Nhiệt được sinh ra do sự dẫn
truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại sự dịch chuyển của các ion trong điện
trường. Sự quay lưỡng cực là quá trình thay đổi hướng của một phân tử phân cực theo chiều của điện
trường. Các phân tử phân cực có xu hướng sắp xếp theo chiều điện trường. Tuy nhiên, điện trường xoay
chiều có tần số cao (MHz) gây ra sự ma sát với vận tốc xoay rất lớn giữa các phân tử, làm cho vật chất
nóng lên.

Những hợp chất càng phân cực thì dưới tác động của vi sóng sẽ nóng càng nhanh. Trong đó, nước có
độ phân cực mạnh và cấu trúc bất đối xứng, do đó, nước là một chất rất dễ đun nóng bằng vi sóng.
Phương pháp trích ly có hỗ ượ của vi sóng có hàm lượng flavonoid cao hơn so với các phương pháp
thông thường, sản phẩm trích lỵ cỗ chất lượng tốt, thời gian chiết nhanh, thiết bị dễ sử dụng, thân thiện vối
môi trường, không cỗ quán tính nhiệt và cố tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực. Do đó, phương
pháp này có hạn chế vớỉ các phân tử không phân cực, khó áp dụng quy mô công nghiệp vì chi phí tốn kém
để xây dựng, một số dung môi đạt nhiệt độ sôi nhanh cố thể gây nỏ [24].
12