TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIÊN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN
KIÊN GIANG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 7420201

Kiên Giang - năm 2019


KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN
KIÊN GIANG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số ngành: 7420201

Kiên Giang - năm 2020


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Từ được viết tắt

PSB

Phototrophic Bacteria

CFU

Colony Forming Unit

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribose Nucleic Acid

rpm

Revolutions Per Minute

3



CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Bình quân mỗi năm, hàng chục nghìn lượt tàu đánh cá, tàu vận chuyển
hải sản trên ngư trường trong và ngoài tỉnh cập bến, với sản lượng thủy - hải
sản qua cảng hàng trăm nghìn tấn cung ứng cho thị trường nội địa và chế biến
xuất khẩu.Người dân ở gần các cảng cá phải đối mặt và sống chung với ô
nhiễm môi trường, từ nước thải của các nhà máy chế biến thủy sản đổ ra sông
ô nhiễm về mùi, rất nồng nặc nguồn nước ở đây dùng cho sinh hoạt thì giờ
đây, nước sông đã dần chuyển sang màu đỏ đục, kèm theo mùi hôi tanh
(radiocand, 2017).
Còn theo Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, dọc hai bờ
sông Dương Đông và các nhánh phụ hiện có trên 10.000 hộ dân cùng 300 cơ
sở sản xuất kinh doanh.Gần như toàn bộ nước thải sinh hoạt, sản xuất từ đây
đều xả trực tiếp ra dòng sông nàyvà các nhánh suối, rạch hợp lưu tràn xuống
đẩy chất thải ra biển, dòng sông Dương Đông tuy ô nhiễm nhưng chưa đến
mức chuyển màu đen kịt và bốc mùi thối như năm nay.Theo cáo cáo mới nhất
của Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, tình trạng ô nhiễm tại
sông Dương Đông do nhiều nguyên nhân. Trong đó có việc cải tạo tăng dung
tích hồ chứa Dương Đông làm giảm lượng nước đổ xuống từ thượng
nguồn.Tiếp theo là tình trạng biến đổi khí hậu khiến mùa nóng trở nên gay gắt,
lượng mưa giảm mạnh so với các năm gần đây, nhưng nguyên nhân chính là
do lượng bùn tích tụ dưới đáy sông quá nhiều năm (Lê Thị Hiền, 2015). Đây
đều là chất thải sinh hoạt, sản xuất của hàng ngàn hộ dân cùng hàng trăm
doanh nghiệp dọc hai bờ sông thải ra hàng chục năm nay.Vì vậy, việc ứng
dụng vi khuẩn quang hợp (PSB) vào xử lý ô nhiễm môi trường nước hiện tại là
yếu tố cần thiết. Bởi vì, loại vi khuẩn này có lợi và an toàn, phân hủy nhanh
các chất thải hữu cơ tích lũy trong đất ao và nước. Có khả năngloại bỏ các chất

thải sinh học và các thành phần độc hại ra khỏi đất, ao và nước. Chính vì vậy,
đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh trưởng cải thiện môi trường nước
của hai loài Rhodobacter sphaeroides và Rhodobacter capsulatus tại Kiên
Giang” được thực hiện.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1 Mục tiêu chung
Phân lập và định danh chủng vi khuẩn Rhodobacter ở vùng biển Kiên
Giang.

4


1.2.2 Mục tiêu cụ thể
Phân lập, khảo sát đặc tính sinh hóa, định danh phân tử các chủng vi
khuẩn Rhodobacter ở vùng biển Kiên Giang.
1.2.3 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân lập chủng vi khuẩn Rhodobacter
- Nội dung 2: Khảo sát hàm lượng đường thích hợp.
- Nội dung 3: Khảo sát pH thích hợp.
- Nội dung 4: Khảo sát thời gian lên men thích h

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Thời gian: Từ tháng 12/2019 đến tháng 05/2020.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm của Trung tâm Thực hành Thí nghiệm,
Trường Đại học Kiên Giang.

5



CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1 TỔNG QUANG VỀ CHỦNG VI KHUẨN RHODOBACTER
2.1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp
Vi khuẩn quang hợp tía là những dạng sống đầu tiên trên Trái đất.
Chúng là những sinh vật vi sinh vật đơn bào có vai trò quan trọng trong việc
duy trì sự sống. Vi khuẩn quang hợp tía thuộc nhóm prokaryote, là các tế bào
gram âm, đơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy… đứng
riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài vi khuẩn quang hợp tía đều sinh sản bằng
cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảychồi. Chúng có khả năng
chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang
hợp kỵ khí. Sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b. Cơ quan
quang hợp là màng quang hợp được gắn với màng tế bào (Michal et al., 2006).
Năm 1907, Molisch là người ñầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc
tố màu đỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi vi khuẩn quang hợp
này là Rhodobacteria. Nhóm này gồm hai họ là Thiorhodaceae (là những vi
khuẩn tía có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và
Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt
“S” bên trong tế bào).
Nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố lục. Chất diệp lục
vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật. VKQH không sử dụng nước làm
nguồn hidro như thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng
sử dụng nguồn hidro là sunfit tiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra
nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa (Stefania et al., 2017).
Ðặc điểm của loại vi khuẩn này là tính thích ứng mạnh, bất kể là trong
nước biển hay trong nước ngọt, trong những điều kiện khác nhau có ánh sáng
mà không có oxy hoặc không có ánh sáng mà có oxy đều có thể lơị dụng chất
hữu cơ để phát triển. Trong điều kiện không có oxy, có ánh sáng, có thể lợi
dụng các sunfit, phân tử H hoặc vật hữu cơ khác làm thành dioxide carbon


6


CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; trong điều kiện có oxy và không
có ánh sáng chúng có thể lợi dụng vật hữu cơ như axit béo cấp thấp tạo nguồn
carbon để tiến hành tác dụng quang hợp (Stefania et al., 2017).
Rhodobacter là một loại vi khuẩn được chọn đã được sử dụng trong quá
khứ để điều tra quá trình chuyển hóa quang hợp của vi khuẩn. Chúng có thể
nhanh chóng phát triển trong một số chế độ quang hợp sáng và tối. Do khả
năng sử dụng nitrat làm chất nhận điện tử và amoni làm chất nền, vai trò của
Rhodobacter có thể được kiểm tra trong cả quá trình khử nitơ, khử nitri và
không chỉ về khả năng khử nitrat. Rhodobacter ổn định để lưu trữ lâu dài
trong điều kiện thích hợp, làm cho nó rất thuận lợi cho sử dụng công nghiệp
(Crosset et al., 2011).
2.1.2 Đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn quang hợp
Vi khuẩn quang hợp là nhóm vi khuẩn quang dưỡng, sống kỵ khí hoặc kỵ
khí tùy tiện trong môi trường có ánh sáng. Gồm vi khuẩn quang hợp tía lưu
huỳnh và vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh. Chúng là các vi sinh vật
điển hình, rất phổ biến ở nước ngọt cũng như nước mặn, thường cư trú nhiều
trên bề mặt các ruộng lúa, sông, đại dương và bùn các ao đầm tù, có nhiều bùn
cặn các xác động, thực vật.
Rhodobacter thường được tìm thấy trong các thủy vực nước ngọt hoặc
nước mặn có chứa hàm lượng sulfua cao. Ở các độ sâu khác nhau có thể thu
nhận được các loài khác nhau. Ngoài ra còn có thể gặp họ vi khuẩn này ở một
số thủy vực có điều kiện cực trị như các thủy vực kiềm hóa hoặc các suối nước
nóng.
Hệ sinh thái của Rhodobacter rất đa dạng, có thể gặp chúng trong các ao
hồ tù đọng, các vùng đầm nước lợ hoặc mặn. Nơi sống của chúng thường là
các thủy vực có hàm lượng chất hữu cơ cao, hàm lượng oxy hòa tan và lưu
huỳnh thấp. Ở một số vùng đất acid có thể gặp các chủng thuộc loài

Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonaspalustris.

7


2.1.3 Đặc điểm phân loại
Các đặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào và đặc tính sinh lí đều
rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn quang dưỡng. Phổ hấp thu
cực đại của huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin về loại diệp lục
khuẩn chính. Sự hiện hiện đa dạng của bacterichlorophyl (bcl) là yếu tố
hữu ích trong phân loại vi khuẩn quang hợp. Hầu hết các loài vi khuẩn quang
hợp tía đều chỉ có bchl a (Truper and Pfening, 1992)
Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác định các loại
carotenoid chính. Spirilloxanthin là thành phần chính cho màu sắc đỏ và
hồng nếu có thêm rhodopin thì màu chuyển sang sắc nâu, okenon màu đỏ tía,
và rhodoinal tạo màu tím tía. Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từ
nâu vàng đến đỏ nâu (màu được hình thành tùy thuộc vào các dẫn xuất bị
oxy hóa khi có sự hiện diện của oxy) và màu nâu xanh khi trong môi
trường có thể oxy hóa khử mạnh (Imhoff and Truper, 1992; Imhoff,
1992). Kết quả phân tích ñịnh lượng sắc tố của một mẫu tự nhiên có thể
phản ánh mối liên hệ khá quan trọng của nhiều nhóm vi sinh vật quang
dưỡng trong môi trường (Korthals and Steenbergen, 1985).
Isoprenoid quinone có vai trò quan trọng trong chuỗi truyền điện tử.
VKQH tổng hợp nhiều loại quinone khác nhau ở chiều dài và độ bão hòa của
chuỗi polypreinyl. Đ ặc điểm đa dạng này của quinone ở nhóm vi khuẩn
tía không lưu huỳnh có giá trị cao trong phân loại. Nhu cầu về vitamin và đặc
tính biến dưỡng nguồn cacbon là yêu cầu rất quan trọng trong việc định danh
một chủng thuộc họ Rhodospirillaceae. Giống và loài thường được phân biệt
dựa trên sự so sánh nhiều đặc tịnh về hình dang, kích thước tế bào, kiểu
tiêm mao, cấu trúc màng trong tế bào chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ các

base của DNA và các đặc tính sinh lí (như khả năng sử dụng hợp chất
nito, cabon, khả năng hô hấp hiếu khí và kị khí trong tối, tính mẫn cảm với
sulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt độ, pH), đặc tính sinh thái (môi trường tự nhiên
mà vi sinh vật thường phân bố) (Truper and Pfening, 1992). Những thông
tin về kích thước và trình tự cytochrome c, cấu trúc lipopolysaccharid và

8


trình tự gen mã hóa rRNA 16S được dùng để xác định mối quan hệ tiến
hóa giữa các loài. Lai phân tử DNA –DNA là tiêu chí quan trọng để phân biệt
các loài gần nhau. Việc xác ñịnh thành phần GC của DNA có vai trò quan
trọng để mô tả loài (Debont et al., 1981)
2.2 ĐẶC ĐIỂM QUANG HỢP VÀ CƠ CHẾ ĐIỀU HÒA TRAO ĐỔI
CHẤT
2.2.1 Màng quang hợp
Ở vi khuẩn quang hợp ngoài màng cytoplasma (CM) còn có thêm hệ
thống màng Intracytoplasma (ICM) có hình thái đặc biệt ( D r e w s ,
1 9 8 1 ) . Người ta cho rằng ICM có nguồn gốc từ CM và được gắn với CM.
Hầu hết trong vi khuẩn quang hợp kí khí, ánh sáng và hàm lượng oxy có liên
quan đến sự hình thành ICM, ví dụ ICM được cảm ứng hình thành khi có
hàm lượng oxy thấp, ICM sẽ phát triển rộng khắp trong pha sinh trưởng kị
khí.

Sắc tố quang hợp của vi khuẩn quang hợp được gắn vào trong màng

ICM hoặc trong màng CM. Khi tế bào chứa hàm lượng các sắc tố quang
hợp cao, màng gập sâu vào phía trong vùng sinh chất. Các kiểu gập khác
nhau mang tính chất đặc trưng cho loài và được chia thành các dạng màng:
dạng ống, dạng túi (Dutton, 1971).

2.2.2 Sắc tố quang hợp
Đây là nhóm sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp. Hiện
nay, bacteriochlorophyll được chia thành 5 nhóm: a, b,c d, e dựa vào sự
khác nhau về cấu trúc phân tử và cực đại của phổ hấp thu trong vùng ánh
sáng đỏ thể hiện ở Bảng 2.1. Nhóm vi khuẩn quang hợp tía có chứa hai
loại bacteriochlorophyll a or b, nhóm vi khuẩn quang hợp màu xanh chứa
chủ yếu nhóm bacteriochlorophyll c, d or e. Trong khi đó, ở vi khuẩn tía
không lưu huỳnh Rhodospirillum chỉ có bacteriochlorophyll a (Harashima
et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993).

9


Bảng 2.1 Phổ cực đại hấp thu của bacteriochlorophyll
Bacteriochlorophyll

Phổ cực đại hấp thu (nm)
Trong tế bào

Chiết trong aceton

Bchl a

375, 590, 805, 830-911

385, 579, 680, 771

Bchl b

400, 605,

986-1035

368,407, 582, 795

Bchl c

457-460, 745-755

433, 663

Bchl d

450, 715-745

425, 654

Bchl e

460-462, 710-725

459, 468

835-850,

Giống như cholorphyll ở thực vật, Bchl bao gồm một vòng pyrol và
7 gốc hydrocacbon. Sự khác biệt giữa các gốc R dẫn đến sự khác biệt giữa
các loại Bchl. Khi so sánh hàm lượng của Bchl trong hai nhóm vi
khuẩn quang hợp kị khí và vi khuẩn quang hợp hiếu khí thì hàm
lượng Bchl trong nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí luôn cao hơn. Ví
dụ, trong tế bào của loài vi khuẩn quang hợp R.sphaeroides có chứa

khoảng 20 nmol Bchl/mg trọng lượng khô tế bào. Trong khi đó, hàm
lượng Bchl ở các loài vi khuẩn quang hợp hiếu khí như: E.longus là
2.0 nmol/mg trọng lượng khô của tế bào, R.hydrolyticum là 1 – 4
nmol/mg protein, A.rubrum là 0,7 nmol/mg trọng lượng khô tế bào. Tạo
nên màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp không chỉ do
bacteriochlorophyll mà còn do carotenoid trong tế bào của chúng
(Harashima et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993)..
2.2.3 Carotenoid
Carotenoid bao gồm một lớp các sắc tố được tìm thấy trong các thể
prokaryote quang và không quang tự dưỡng và các sinh vật eukaryote. Chức
năng của carotenoid là bảo vệ tế bào không bị phá hủy bởi phản ứng
quang oxy hóa, hấp thụ ánh sáng và là một thành phần cấu trúc sắc tố
quang hợp trong vi khuẩn quang hợp (Cogdell et al., 1996).

10


Sự phân biệt màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp trong tự nhiên
là do sự khác nhau về thành phần các bacteriochlorophyll và carotenoid.
Carotenoid được chia thành 5 nhóm dựa vào cấu trúc phân tử và quang
phổ hấp thụ thể hiện ở Bảng 2.2. Khoảng 20 carotenoid khác nhau đã được
tìm thấy trong loài E. ramosum màu đỏ cam, trong đó có 10 loại đã được
tinh khiết và cấu trúc đặc trưng.
Bảng 2.2 Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp
Nhóm

Tên

Thành phần chính


1

2

3
4

5

11


Loài R. thiosulfatophilus chứa chủ yếu là hai sắc tố đỏ phân cực là
C30 carotene-dioate t (4,4 '-diapocarotene-4, 4'-dioate) và ester diglucosyl
tương ứng (di [β-d-glucopyranosyl] -4,4 - diapocarotene-4, 4'- dioate).
Chúng chiếm tới 95% trong tổng số carotenoid của tế bào. Carotenoid
được tìm thấy chủ yếu trong loài vi khuẩn quang hợp tía Rhodobacter là
spheroidenone. Carotenoid nhóm spirilloxanthin được tìm thấy chủ yếu
trong loài Rhodospirillum rubrum và một số vi khuẩn quang hợp khác. Như
vậy: các sắc tố hấp thụ ánh sáng chính trong tế bào vi khuẩn quang hợp
là Bchl và carotenoids. Những sắc tố này được gắn proteins màng bằng liên
kết không cùng hóa trị tạo thành trung tâm phản ứng quang hóa
(photochemical reaction center) và hệ thống thu nhận ánh sáng (LH – light
harvesting) (Cogdell et al., 1996).
Các vi khuẩn quang hợp có một hệ thống LH tương đối đơn giản bao
gồm một loại protein ăng – ten (LHI) liên kết chặt chẽ với trung tâm phản
ứng RC, và ở nhiều loài một hoặc nhiều khu phức hợp ăng-ten ngoại
vi (LHII) tất cả đều được nằm trong ICM. Lượng tử ánh sáng được tế bào
thu nhận qua hệ thống ăng ten. Từ đây năng lượng ánh sáng được chuyển
vào trung tâm phản ứng. Trung tâm phản ứng của vi khuẩn quang hợp

được cấu tạo từ 3 tiểu phần protein (L, M và H), cùng với các cofactors: 4
phân tử Bchls, 2 phân tử bacteriopheophytins, 2 phân tử quoinones, và
một phân tử nonheme – high spin Fe2+. Tâm phản ứng nằm trong mạch

12


vận chuyển điện tử. Trong mạch chuyển ñiện tử này xuất hiện dòng điện tử
khi ánh sáng gây ra quá trình tách điện tích ở tâm phản ứng (Drews, 1981).
2.2.4 Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ lưu huỳnh
Đa số các loài vi khuẩn quang hợp đều có thể sử dụng các hợp chất khử
của lưu huỳnh làm nguồn cho điện tử để cố định CO2. Quá trình oxy hóa các
hợp chất khử của lưu huỳnh có sự tham gia của nhiều enzyme và được thực
hiện theo nhiều cách khác nhau. Trong đó con đường oxy hóa Sox (Hình
2.1) được coi là quan trọng nhất. Phức hợp Sox là phức hợp nhiều enzyme
periplasmic thiosulphate – oxidizing, lần đầu tiên được tìm thấy trong
Paracoccus (Pcs.) versutus và Pcs. pantotrophus. Trong Pcs. Pantotrophus,
phức hợp Sox rất cần cho quá trình oxy hóa thiosulfate trong điều kiện in
vivo và xúc tác quá trình khử cặp cytochrome c coupled thành dạng oxy
hóa của thiosulfate, sulfide, sulfite và hợp chất sulfua cơ bản trong điều
kiện in vitro.

Hình 2.1 Hệ thống Sox trong vi khuẩn tía không lưu huỳnh (A) và vi
khuẩn tía lưu huỳnh (B).
Mức độ oxy hóa các hợp chất của lưu huỳnh ở các loài khác nhau là
khác nhau. Nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh tạo ra sản phẩm
trung gian là các giọt lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào khi sinh
trưởng quang tự dưỡng với các hợp chất khử của lưu huỳnh làm nguồn cho
điện tử. Nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh có khả năng oxi hóa các hợp
chất khử của lưu huỳnh nhưng không có khả năng tích lũy giọt lưu huỳnh

trong tế bào (Collins and Jones, 1981).

13


2.2.5 Cơ chế đều hòa quá trình trao đổi chất
Trong điều kiện có ánh sáng, vi khuẩn quang hợp tiến hành quang
hợp để thu nhận năng lượng sử dụng cho các hoạt động sống của tế bào.
Phương trình tổng quát quá trình quang hợp:
CO2 + 2H2 A + hv

[

CH2O]n + 2A + H2O

Ở tảo hay thực vật bậc cao: H2O đóng vai trò của H2A. Ở VKQH: H2A
có thể là các chất hữu cơ đơn giản, các hợp chất khử của lưu huỳnh
hoặc hydro phân tử. Trong đó, các chất hữu cơ vừa đóng vai trò làm chất
cho điện tử, vừa làm nguồn cacbon trong quá trình quang hợp dị dưỡng.
Ở ngoài sáng, tất cả các loài vi khuẩn quang hợp Rhodobacter đều ưa
thích điều kiện sinh trưởng dị dưỡng, sử dụng các chất hữu cơ đơn vừa làm
nguồn cho điện tử, vừa làm nguồn C. Nhiều đại diện của họ vi khuẩn này có
khả năng sinh trưởng quang tự dưỡng cacbon với sự có mặt nguồn cho
điện tử là các hợp chất khử của lưu huỳnh hay H2. Đa số các đại diện của
các loài đã biết của họ vi khuẩn này đều có khả năng sinh trưởng ở điều
kiện vi hiếu khí trong tối theo kiểu hóa dưỡng, một số loài có thể sinh
trưởng khá tốt ở điều kiện vi hiếu khí tối. Tuy nhiên, khả năng chịu oxy
hóa của các chủng rất khác nhau. Trong điều kiện sinh trưởng quang
hợp, khả năng dinh dưỡng hô hấp của các loài này bị ức chế bởi ánh sáng.
Ở điều kiện kỵ khí tối, một số loài như Rhodobacter capsulatus,

Rhodospirillum rubrum có thể tồn tại nhờ quá trình trao đổi chất theo kiểu hô
hấp kị khí với sự có mặt của các chất nhận điện tử như nitrat, nitrit,
NO,dimethylsulfua, hay trimethylamin N – oxit. Khi quang hợp, chu trình
Calvin, hệ thống cố định nito, hệ thống DMSO/DMSOR được tế bào sử
dụng để duy trì thế oxy hóa khử. Các phản ứng của chu trình Calvin cho
phép CO2 có chức năng thu nhận các lực khử dư thừa do trao ñổi chất các
chất hữu cơ như malate, succinate. Do đó, vai trò của chu trình Calvin trong
suốt quá trình sinh trưởng quang dị dưỡng là giữ thế cân bằng oxy hóa khử
trong tế bào. Khi tế bào sinh trưởng trong điều kiện quang tự dưỡng thì vai

14


trò chủ yếu của chu trình calvin là cố định CO2 để tổng hợp các vật liệu tế
bào. Chính nhờ tính lưỡng cực này mà chu trình Calvin có vai trò điều
khiển giữa hai quá trình quang tự dưỡng và quang dị dưỡng.
Quá trình cố định nito luôn đi kèm với việc khử các proton tạo hydro
và đòi hỏi rất nhiều lực khử, là quá trình tiêu tốn năng lượng. Hệ thống này
không chỉ đóng vai trò chính là trao đổi nito mà còn có vai trò điều khiển
thế cân bằng oxy hóa trong tế bào. Tế bào sẽ tổng hợp nitrogenase khi sinh
trưởng quang dị dưỡng với nguồn N nghèo như glutamat. Ở những điều kiện
sinh trưởng như vậy, lực khử dư thừa được tạo ra do quá trình oxy hóa cơ
chất lại bị tiêu dùng vào việc khử các proton và giải phóng phân tử hydro do
hoạt tính hydrogenase của hệ thống nitrogenase. Khi sinh trưởng ở điều
kiện quang hợp, trong tế bào vi khuẩn quang hợp Rhodobacter xuất hiện
một mối tương tác giữa các hệ thống, giữ thế cân bằng oxy hóa khử của tế
bào và hệ thống quang hợp. Hệ thống điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn tía
rất linh hoạt, bởi vậy chúng là những đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu về
trao đổi chất ở vi sinh vật (Burris, 1991).
2.3 ỨNG DỤNG

Những ứng dụng nổi bật của VKQH Rhodobacter là xử lý nước thải,
cải thiện môi trường, sản xuất hydro phân tử, sinh khối. Các VKQH
Rhodobacter nói chung là nguồn cung cấp các thành phần của chuỗi truyền
điện tử trong quang hợp và tạo ATP, nguồn vitamin và các phân tử hữu cơ
khác.
2.3.1 Xử lý nước thải
Nước thải chứa hỗn hợp các chất hữu cơ phân tử lượng nhỏ, là nguồn
cơ chất tốt cho vi khuẩn Rhodobacter để tăng trưởng trong điều kiện kị
yếm khí và vi hiếu khí.; VKQH thường được ứng dụng cùng với các vi
sinh vật dị dưỡng yếm khí, hiếu khí và vi tảo trong các hệ thống làm sạch
nước thải. Các loài thường ñược sử dụng trong xử lý nước thải là:
R.Capsulatus, R.sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum
fulvum….
15


Hệ thống xử lý nước thải có sự tham gia của VKQH Rhodobacter có
những ưu ñiểm sau:
- Không cần thiết phải khử trùng nước trước khi xử lý.
- Sinh khối thu ñược sau quá trình xử lý giàu protein, vitamin,
carotenoid và nhiều hoạt chất sinh học khác nên có thể ñược tái sử dụng
trong y học, nông nghiệp và chăn nuôi.
- Khi xử lý nước thải đậm đặc hữu cơ bằng vi khuẩn quang hợp tía thì
không cần phải pha loãng (Kobayshi and Hirotani, 1987).
2.3.2 Sản xuất protein đơn bào
VKQH là nguồn cung cấp protein đơn bào có giá trị vì sinh khối
VKQH giàu protein, vitamin và carotenoid. Ở tế bào VKQH hàm
lượng protein thường chiếm 60 – 70% trọng lượng khô, số lượng cũng
như hàm lượng các acid amin không thay thế của chúng có thể tương đương
với đậu tương, thịt, trứng gà. Ở loài Rhodopseudomonas capsulatus, protein

và acid nucleic chiếm 61% và 6% trọng lượng sinh khối; lượng acid amin
khi ly giải tế bào tương đương với Chlorella vulgaris, nhưng chứa thành
phần methionin cao hơn. Các loại chất thải hay vật liệu rẻ tiền thường
ñược tận dụng làm nguyên liệu để nuôi cấy VKQH thu sinh khối. Khi
nuôi cấy đồng thời Rubriviax delatinosa và Rhodobacter sphaeroides
trên bã mì, lượng vi tamin B12 và carotenoid thu được là 44 và 230 µg/g
chất khô. Sinh khối VKQH giàu vitamin, acid amin thiết yếu và acid amin có
lưu huỳnh là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phiêu sinh vật và tôm cá. Giá trị
dinh dưỡng của VKQH khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được
chứng minh trong thực tiễn. Mức ñộ sống sót của cá giống, tốc độ sinh
trưởng va trọng lượng của chúng được gia tăng khi nuôi bằng thức ăn
có bổ sung tế bào VKQH. Việc bổ sung sinh khối của VKQH vào thức
ăn của gà mái đã giúp cải thiện số lượng, chất lượng trứng gà ((Kobayshi
and Kurata, 1978).
2.3.3 Sản xuất kháng sinh

16


Một trong những ñặc tính của VKQH là có khả năng sinh các chất
kháng vi sinh vật bao gồm: các chất kháng sinh, các chất kháng khuẩn
và kháng virus (Hirotani et al., 1991).
Hoạt chất kháng virus có thể được tìm thấy trong khá nhiều chủng
thuộc loài R.rubrum, R.capsulatus. Chất này thường tấn công vào các virus
gây bệnh cho cá và các coliphage mà không gây hại cho vật chủ
R.capsulatus có thể loại bỏ được 97% coliphage khi sử dụng chúng trong
xử lý nước thải chăn nuôi (Kobayshi and Hirotani, 1987).
2.3.4 Sản xuất Ubiquinone
Ubiquinone 10 (Q10) là thành phần quan trọng trong của chuỗi vận
chuyển điện tử trong hệ quang của VKQH. Q10 được biết đến là loại

ubiquinone có giá trị về dược liêu, chúng có tác dụng kích thích cơ tim,
được sử dụng trong điều trị các bệnh về phổi và còn có thể sử dụng như một
chất chống oxy hóa trong sản xuất dược phẩm, mỹ phẩm. Tế bào VKQH
chứa hàm lượng Q10 cao hơn ở các loài vi sinh vật khác. Thành phần này
đã được chiết tách, tinh chế từ Rhodopseudomonas sphaeroides,
Rhodopseudomonas sulfidophilus, và Rhodospirillum rubrum (Sasilala and
Ramana, 1995).
2.3.5 Sản xuất hoocmon thực vật
Người ta đã phát hiện ra rằng một số hoocmon thực vật cũng có mặt
trong tế bào VKQH Rhodobacter với vai trò điều chỉnh quá trình quang hợp.
Các hoocmon tách ra từ R.rubrum có hoạt tính sinh lý khá cao và bao gồm
ba loại cytokinin (hàm lượng1mg/g sinh khối tươi) có nguồn gốc adenin.
Dịch thế bào R.spharroides đã nuôi cấy bằng nước thải có chứa kinetin
(hàm lượng 4,7 g/l) và zeatin với hàm lượng 2g/l. Ngoài ra, người ta cũng
tìm thấy một số chất kích thích sinh trưởng khác như auxin, idol – 3 –
axetic axit (IAA), indol – 3 – butiric axit (ABA) trong tế bào chủng
R.sphaeroides IFO 12203 (Sasilala and Ramana, 1995).

17


.

CHƯƠNG 3

18


PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm và thời gian
- Thời gian từ tháng 12/2019 đến tháng 03/2020
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Thực hành vi sinh của Trung tâm Thực
hành Thí nghiệm, Trường Đại Học Kiên Giang.
3.1.2 Nguyên liệu
+ Các chủng vi khuẩn Rhodobacter được phân lập ở vùng ven biển
Kiên Giang.
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Sử dụng trang thiết bị hiện có tại Trung tâm Thực hành Thí nghiệm,
Trường Đại Học Kiên Giang.
a.Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình phân lập vi khuẩn như: máy
đo pH, Đĩa petri, bình tam giác, bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000
(Đức), tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (Đức),
máy lắc mẫu, ống nghiệm, kính hiển vi, Tủ lạnh -4 oC Akira (Việt Nam), tủ
lạnh -20oC Electrolux Confor plus (Thụy Điển), cân điện tử,...
b. Một số thiết bị, dụng cụ khác: máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy phân
tích vi tính và lưu trữ số liệu, một số dụng cụ khác như: que cấy, que trang,
đầu cone (vàng, xanh, trắng), lam, lammen, que thủy tinh, cốc đựng dung dịch,
chai lọ thủy tinh, bọc nylong, ống đong, đèn cồn,........
3.1.4 Hóa chất và môi trường
a. Hóa chất
NaCl, NaHCO3, NaOH, HCl.
b. Môi trường
Đề tài sử dụng môi trường SSM đặc trưng cho vi khuẩn quang hợp
Rhodobacter ở nước mặn.

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất môi trường SSM phân lập vi khuẩn

19



STT

Thành phần

1
2

Sodium malate
Sodium succinate

3

KH2PO4

4

K2HPO4

5

(NH4)2SO4

6

MgSO4.7H2O

7

NaCl


8

CaCl2.2H2O

9

Na2S2O3.5H2O

1
1
0.
0.
1.
0.
.2
0.0
00

10

Cao nấm men

11

Hỗn hợp vitamin

12

Dung dịch vi lượng


13

pH

Dung dịch vi lượng:
STT

Hàm lượng (g/l)

0.
1.
m
1
m–7
6.8

Thành phần

Hàm lượng

1
2

EDTA-2Na
FeCl3

1.0 g
2.0 g


3

ZnCl2

4

MnCl2

0
.
0.1g

5

H3BO3

0.1 g

6

CoCl2.6H2O

20 mg

7

Na2MO4.2H2O

10 mg


8

CuCl2.2H2O

10 mg

9

Na2SeO3

5.0 mg

10

Nước cất

1000 ml

Hỗn hợp vitamin

20


STT

Thành phần

1
2


Thiamin – HCl
Niacin

3

p-aminobenzoic acid

4

Pyridoxal-HCl

5

Biotin

6

Vitamin B12

7

Nước cất đủ

Hàm lượng (mg)
5
5
0
3
0
1

50
5.
. ml
100

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phân lập vi khuẩn
3.2.1.1 Mục đích thí nghiệm
Phân lập các dòng vi khuẩn Rhodobacter ở vùng ven biển có khả năng
cải thiện môi trường nước.
3.2.1.2 Cách tiến hành
Tiến hành lấy 1 mL mẫu nước hoặc 1g mẫu bùn cho vào ống nghiệm
chứa 9 mL chứa đầy môi trường dịch thể SSM. Ủ bình dưới ánh sáng đèn
sợi đốt 40W với khoảng cách 20cm. Sau 5 -7 ngày quan sát sinh khối VKQH
với màu sắc đặc trưng từ nâu vàng đến đỏ tía.
Phân lập và làm thuần: huyền phù sinh khối VKQH lấy từ môi trường
nuôi tích lũy được pha loãng và ria trên môi trường thạch SSM. Sau đó đặt
đĩa này dưới ánh sáng của bóng đèn sợi đốt 40W, cách 20cm tới đèn. Sau 5–
7 ngày, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ, với màu sắc đặc trưng, huyền phù
hóa từng khuẩn lạc trong nước cất vô trùng và ria trên môi trường thạch mới
để làm thuần.
3.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của chủng vi khuẩn phân
lập được
3.2.2.1 Khảo sát hình thái, kích thước tế bào

21


Tế bào VKQH được nuôi trong môi trường dịch thể SSM ở điều kiện
yếm khí trong ống nghiệm, được chiếu sáng từ 5-7 ngày. Quan sát hình thái

và đo kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học với vật kính 40X.
3.2.2.2 Xác định thành phần sắc tố
Nuôi VKQH trong môi trường dịch thể trong 5 ngày, thu sinh khối, rửa
tế bào bằng nước cất và huyền phù lại tế bào trong dịch dịch sucrose
60%. Dung dịch nồng ñộ cao này chống lại sự tán xạ ánh sáng. Phổ hấp
thu ánh sáng cực đại của sắc tố tế bào được xác định khi quét huyền phù tế
bào ở dãy bước sóng từ 190 – 1100nm bằng máy đo quang phổ. Dựa vào
phổ hấp thu cực đại của huyền phù tế bào, loại diệp lục được xác định theo
Bảng 2.2. Loại carotenoid chính được dự đoán dựa vào tạp chí hệ
thống phân loại vi khuẩn.
3.2.2.3 Khảo sát đặc tính sinh lý
Việc xác định nhu cầu và nồng độ NaCl, khả năng sử dụng nguồn
cacbon và chất cho điện tử trong quang hợp và khoảng pH thích hợp cho sự
tăng trưởng… được thực hiện như sau: sinh khối của chủng khảo sát được
pha loãng 1000 lần trong nước cất vô trùng tạo huyền phù tế bào không
còn các hóa chất của môi trường nhân giống. Bổ sung 100µl huyền phù tế
bào này vào các ống nghiệm có chứa đầy môi trường khảo sát sao cho mật
4

độ tế bào đạt 10 tế bào/ml. Sau 5–7 ngày nuôi yếm khí, chiếu sáng, sự
tăng trưởng của các chủng của các chủng vi khuẩn được đánh giá bằng cách
xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 660nm –
OD660 trên máy đo quang phổ.
3.2.3 Thí nghiệm 4: Định danh chủng vi khuẩn phân lập được
Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo Sambrook gồm các bước sau:
+ Dịch tế bào vi khuẩn đang sinh trưởng ở pha log được đưa vào ống
eppendoff, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ dịch nuôi.

22



+ Hòa tan trở lại trong 400 µl dịch thủy phân (10mM tris – HCl, pH
=8, 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 25% sacaroza). Thêm 10µl
lysozym 10mg/ml. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
0

+ Thêm 15 µl protease 1mg/ml và tiếp tục ủ ở 56 C trong 1h.
+ Thêm 450 µl hỗn hợp phenol/chloroform có tỷ lệ 1:1, ñảo nhẹ ống.
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy pipet hút nhẹ
dung môi ở phía trên sang một ống khác.
+ Chiết lại bằng 450 µl chloroform
+ Thêm 0,1 V CH3COOK 3M, pH = 5,2. Thêm 2V cồn tuyệt đối
0

lạnh, đặt ở 20 C trong 3h.
o

+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ñộ 4 C, loại bỏ
phần dịch.
+ Rửa lại bằng cồn 70%, tiếp tục ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15
0

phút ở nhiệt ñộ 4 C.
+ Cô chân không trong 5 phút.
+ Hòa tan trong 40 µl đệm TE.
+ Lấy 3 µl kiểm tra ñiện di trên gel.
Phản ứng PCR nhân đoạn gen mã hoá rRNA 16S: sử dụng cặp mồi 20F
và 1500R để khuếch đại đoạn gen mã hóa cho phân tử rRNA 16S nguyên
vẹn, (kích thước khoảng 1500bp). Mỗi phản ứng PCR được thực hiện ở
dung tích 50 µl với các thành phần sau: 1 µl DNA mẫu, 1 µl mồi 20F, 1

µl mồi 1500R, 5M dung dịch ñệm 10X, 4 µl dNTP, 0.5 µl Ex Taq polymeras
o

và 37.5 µl nước cất vô trùng. Chù trình PCR: 1 chu kì 94 C trong 1 phút;
o

35 chu kì mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tính ở 96 C trong 30 giây, bắt cặp ở
o

o

o

55 C trong 30 giây, kéo dài ở 72 C trong 2 phút; 1 chu kỳ 72 C trong 5
o

phút. Sản phẩm PCR ủ ở 4 C cho đến khi sử dụng.
Tinh sạch sản phẩm khuếch đại: điện di 45 µl sản phẩm PCR của phản
ứng PCR I trên gel agarose. Thu nhận vạch khuếch ñại rRNA 16S từ gel
agarose bằng bộ kit QIAEX II theo hướng dẫn.

23


Giải trình tự các đoạn ngắn thuộc rRNA 16S được khuếch đại bằng
phản ứng PCR II dựa vào phương pháp dideoxy nucleic acid ( Cycle
sequencing by PCR method). Các phân đoạn khác nhau trong rRNA 16S
được khuếch đại dựa trên khuôn là DNA mạch đơn của rRNA 16S (từ phản
ứng PCR I) và giải trình tự bằng phản ứng PCR II với 6 mồi (20F, 520F,
920F, 520R, 920R, 1500R). Phản ứng PCR được thực hiện trong dung tích

20 µl gồm các thành phần: 1 µl sản phẩm DNA của phản ứng PCR I, 1 µl
mồi, 8 µl ABI Prims

TM

Bigdye và 10 µl nước cất vô trùng. Chương trình
o

phản ứng PCR II: 1 chu kì 96 C trong 5 phút; 25 chu kì mỗi chu kì gồm 3
o

o

bước: biến tính ở 96 C trong 10 giây, bắt cặp ở 50 C trong 5 giây, kéo dài ở
o

o

o

60 C trong 47 phút; 1 chu kỳ 72 C trong 5 phút. Sản phẩm PCRII ủ ở 4 C
cho đến khi điện di.
Điện di giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S: sản phẩm PCRII được
tinh sạch bằng phương pháp tủa DNA với sodium acetate 3mM trong
ethanol lạnh 95‰ sau ñó dược huyền phù trong 15µl dung dịch Template
o

Suppresion Reagent và được biến tính ở 96 C trong 2 phút trước khi được
phân tích bằng thiết bị giải trình tự tự động.
3.2.4 Phương pháp phân tích số liệu

Tất cả các nghiệm thức được thực hiện với 3 lần lặp lại, số liệu được xử
lý thống kê bằng phần mềm Excel và Statgraphics Plus 5.1.

24


CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ DỰ KIẾN
- Phân lập được một số dòng Rhodobacter ở vùng ven biển Kiên Giang
- Định danh một số dòng Rhodobacter bằng kỹ thuật giải trình tự DNA.

Kiên Giang, ngày
Cán bộ hướng dẫn
(Ký tên)

tháng

năm 2019

Sinh viên thực hiện
(Ký tên)

Chủ tịch hội đồng xét duyệt
(Ký tên)

25