BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ UYÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ
TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG
(PHYLLANTHUS EMBLICA L.
EUPHORBIACEAE)
TRÊN THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI-2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ UYÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ
TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG
(PHYLLANTHUS EMBLICA L.
EUPHORBIACEAE)
TRÊN THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 8720205
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thùy Dương

2. PGS.TS. Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI-2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hà Nội đã tài trợ cho đề
tài này, là một phần của đề tài “Nghiên cứu bào chế thực phẩm bảo vệ sức khoẻ dạng
viên nang cứng có tác dụng bảo vệ gan từ quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.)”, mã
số 01C-06/03-2017-3.
Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Thùy Dương đã rộng lòng trao cho tôi cơ hội làm nghiên cứu thực nghiệm, đã
luôn cổ vũ, đưa ra những nhận xét nghiêm khắc, quan trọng trong suốt quá trình làm
nghiên cứu của tôi; đã cẩn thận đọc từng câu chữ, hiệu đính tỉ mỉ và nhiệt thành giúp tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà đã đưa ra ý
tưởng, đã chia sẻ, ủng hộ và ân cần góp ý với tôi để hoàn thiện quyển luận văn này.
Với lòng yêu mến và kính phục, tôi xin dành tặng quyển luận văn này tới Ths.
Phạm Đức Vịnh, người thầy đã dạy dỗ tôi những điều quan trọng cùng đầy lòng yêu
thương và tận tụy.
Cảm ơn em Trần Thảo Hương, một người cộng sự mà tôi vô cùng quý mến đã
đồng hành cùng tôi trong chặng đường làm đề tài này. Có thể nói, trong những ngày
tháng bộn bề công việc, nếu không có sự hỗ trợ của em thì tôi gặp nhiều khó khăn đến
nhường nào.
Cảm ơn toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các em sinh viên đang nghiên
cứu khoa học tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn san sẻ công
việc, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn này.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã
đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong gần hai năm học tập và nghiên cứu dưới
mái trường Dược thân yêu!


Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2019
Nguyễn Thị Uyên


MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................3
1.1.

Một số cơ chế liên quan đến tổn thương tế bào gan ..................................3

1.1.1.

Vai trò của stress oxy hóa và các gốc tự do đối với tổn thương tế bào gan 3

1.1.2.

Vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan........................................7

1.2.

Thông tin về dược liệu Me rừng ................................................................11

1.2.1.

Đặc điểm thực vật ........................................................................................11


1.2.2.

Phân bố, thu hái và chế biến .......................................................................12

1.2.3.

Thành phần hóa học ...................................................................................13

1.2.4.

Tác dụng dược lý của Me rừng ...................................................................14

1.3.

Các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Me rừng ..................20

1.3.1.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vivo ..............................21

1.3.1.1.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô gây độc gan bằng

CCl4………………………………………………………………………………….................21
1.3.1.2.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô hình gây độc gan


bằng ethanol………………………………………………………………………… 22
1.3.1.3.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên một số mô hình gây độc

gan bằng các tác nhân khác nhau .................................................................................23
1.3.2.

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vitro .............................23

PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........26
2.1.

Nguyên vật liệu thí nghiệm ........................................................................26

2.1.1.

Hóa chất, thuốc thử .....................................................................................26


2.1.2.

Thiết bị thí nghiệm.......................................................................................26

2.2.

Đối tượng nghiên cứu .................................................................................27

2.2.1.


Dược liệu và mẫu nghiên cứu .....................................................................27

2.2.2.

Động vật thí nghiệm ....................................................................................27

2.3.

Nội dung nghiên cứu...................................................................................27

2.3.1.

Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng

trên mô hình in vivo......................................................................................................27
2.3.2.

Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in

vitro…….. ......................................................................................................................28
2.4.

Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................29

2.4.1.

Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn

quả Me rừng trên mô hình in vivo ...............................................................................29
2.4.1.1.


Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây độc

gan cấp bằng CCl4 .........................................................................................................29
2.4.1.2.

Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây độc

gan mạn bằng ethanol ...................................................................................................30
2.4.1.3.

Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu của mô hình in vivo .........32

2.4.2.

Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn

quả Me rừng in vitro.....................................................................................................35
2.4.2.1.

Xác định nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp MTT

dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro ..................................................35
2.4.2.2.

Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao định chuẩn quả Me rừng

trên tế bào HepG2 bằng thử nghiệm Oil Red O ............................................................36
2.4.2.3.


Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK và ức chế ACC trên tế bào HepG2 của

cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp Western blot ....................................37
2.5.

Phương pháp xử lý số liệu ..........................................................................39

PHẦN 3. KẾT QUẢ ....................................................................................................40


3.1. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me
rừng in vivo ...................................................................................................................40
3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me
rừng trên mô hình gây độc gan bằng CCl4..................................................................40
3.1.1.1. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT và ALAT
huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng CCl4 .........................................................40
3.1.1.2. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng MDA trong gan
của chuột bị gây độc gan bằng CCl4 .............................................................................41
3.1.1.3. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan
của chuột bị gây độc gan bằng CCl4 .............................................................................42
3.1.1.4. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ SOD trong gan
chuột bị gây độc gan bằng CCl4 ....................................................................................44
3.1.1.5. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hình ảnh vi thể của gan
chuột bị gây độc gan bằng CCl4 ....................................................................................45
3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me
rừng trên mô hình gây độc gan bằng ethanol .............................................................47
3.1.2.1. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT và ALAT
huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng ethanol .....................................................47
3.1.2.3. Ảnh hưởng của cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan của
chuột bị gây độc bằng ethanol.......................................................................................50

3.1.2.4. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ SOD trong gan của
chuột bị gây độc bằng ethanol.......................................................................................51
3.1.2.5. Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hình ảnh vi thể của gan của
chuột bị gây độc gan bằng ethanol................................................................................52
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me
rừng in vitro ..................................................................................................................54
3.2.1. Xác định nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp MTT
dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro ................................................54


3.2.2. Khả năng ức chế tích tụ lipid trên tế bào HepG2 của cao định chuẩn quả Me
rừng bằng thử nghiệm Oil Red O ................................................................................55
3.3.3. Khả năng hoạt hóa AMPK và ACC trong tế bào HepG2 của cao định chuẩn
quả Me rừng bằng phương pháp Western Blot ..........................................................58
PHẦN 4. BÀN LUẬN ..................................................................................................61
4.1. Bàn luận về kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn
quả Me rừng in vivo .....................................................................................................61
4.1.1. Tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình
gây độc gan cấp tính bằng CCl4 ...................................................................................61
4.1.2. Tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình
gây độc gan mạn tính bằng ethanol .............................................................................64
4.2. Bàn luận về kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn
quả Me rừng in vitro ....................................................................................................67
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................71


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)


ACC

Acetyl-CoA Carboxylase

AICAR

Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide

AMPK

AMP activated protein kinase

ALAT

Alanin amino transferase

ASAT

Aspartat amino transferase

CAT

Catalase

CCl4

Carbon tetraclorid

CPT I


carnitine palmitoyl transferase I

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DMF

Dimethylformamid

DTNB

5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

HepG2

liver hepatocellular cells

GSH

Glutathion dạng khử

GSH-Px

Glutathion peroxidase


IL-1β

Interleukin 1 beta

MCD

Malonyl-CoA decarboxylase

MDA

Malondialdehyd

MTT

3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid

NBT

Nitrotetrazolium clorid

LPO

Phosphoryl ACC

p-ACC

Phosphoryl AMPK



p-AMPK

Lipid peroxidation

PPARα

peroxisome proliferator-activated receptor-α

PUFAs

Polyunsaturated fatty acids

SREBP

Sterol regulatory element-binding protein

SOD

Superoxid dismutase

ROS

Reactive oxygen species

THF

Tetrahydrofuran

TGF-β


Transforming growth factor beta

TNF-α

Tumor necrosis factor alpha

VLDL

Very low-density lipoprotein


DANH MỤC BẢNG

STT

Bảng

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1.

Thành phần hóa học trong quả Me rừng

13

2


Bảng 1.2.

Tác dụng bảo vệ tế bào gan của Me rừng

16-17

3

Bảng 1.3.

Tác dụng bảo vệ tim mạch của Me rừng

18

4

Bảng 1.4

Tác dụng trên bệnh đái tháo đường của Me rừng

19

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng so đến hoạt độ
5

Bảng 3.1.

ASAT và ALAT huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng


40

CCl4
6

Bảng 3.2.

Tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót khi ủ với cao định chuẩn quả
Me rừng ở các mức nồng độ khác nhau

54


DANH MỤC HÌNH VẼ
STT

Hình

Tên Hình

Trang

1

Hình 1.1 Vai trò stress oxy hóa đối với tổn thương gan

6

2


Hình 1.2 Hệ thống cân bằng oxy hóa khử ở trong gan

6

3

Hình 1.3 Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ

9

4

Hình 1.4 Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu

11

5

Hình 1.5 Quả và lá cây Me rừng

12

6

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu

29

Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan
7


Hình 2.2 của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc

30

gan bằng CCl4
Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan
8

Hình 2.3 của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc

31

gan bằng ethanol
Sơ đồ phản ứng tạo phức giữa MDA và acid

9

Hình 2.4

10

Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng khử của anion superoxid và NBT

11

Hình 3.1

thiobarbituric


Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm
lượng MDA trong gan chuột bị gây độc gan bằng CCl4

33
34
40

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm
12

Hình 3.2 lượng GSH trong gan của chuột bị gây độc gan bằng

43

CCl4
13

Hình 3.3

Hình 3.4

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ
SOD trong gan của chuột bị gây độc gan bằng CCl4
Hình ảnh minh họa ảnh hưởng của cao định chuẩn quả
Me rừng trên vi thể tế bào gan chuột bị gây độc gan bằng

44

46



CCl4
Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ
14

Hình 3.5 ASAT huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng

48

ethanol
15

Hình 3.6

16

Hình 3.7

17

Hình 3.8

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm
lượng MDA trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol
Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm
lượng GSH trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol
Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ
SOD trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol

49


50

52

Hình ảnh minh họa ảnh hưởng của cao định chuẩn quả
18

Hình 3.9 Me rừng trên vi thể tế bào gan của chuột bị gây độc gan

53

bằng ethanol

19

20

21

22

23

Hình
3.10

Hình ảnh nhuộm Oil red O của tế bào HepG2 ở các mẫu
thử có mức nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng khác
nhau


Hình

Khả năng ức chế tích tụ lipid trên tế bào HepG2 của cao

3.11

định chuẩn quả Me rừng ở các mức nồng độ khác nhau

Hình
3.12

56

57

Hình ảnh các vết p-AMPK, p-ACC được phát hiện ở
mẫu thử có các mức nồng độ cao định chuẩn quả Me

59

rừng khác nhau

Hình

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng ở các nồng

3.13

độ khác nhau lên tỷ lệ biểu hiện của p-AMPK/β-actin


Hình

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng ở các mức

3.14

nồng độ khác nhau lên tỷ biểu hiện của p-ACC/ β-actin

59

60


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh gan đang ngày một gia tăng và là gánh nặng bệnh tật lớn ở nhiều quốc gia
trên thế giới. Nhiều nguyên nhân được biết đến có thể gây tổn thương gan, bao gồm
nhiễm virus viêm gan, nhiễm HIV, gan nhiễm mỡ do chế độ ăn giàu chất béo, sử dụng
rượu quá mức, rối loại tự miễn, rối loạn lipid máu, nhiễm nấm, phơi nhiễm các chất hóa
học và các loại thuốc gây độc gan...[11]. Hiện nay, trong số các phương pháp điều trị
các bệnh về gan, nghiên cứu và phát triển thuốc mới có nguồn gốc dược liệu là hướng
tiếp cận có tiềm năng và thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới.
Báo cáo về điều tra các thực vật có tác dụng bảo vệ gan của Adewusi và Afolayan năm
2010 cho thấy có hơn 100 loài thực vật với 58 hợp chất được chiết từ chúng có hiệu quả
điều trị các bệnh lý về gan [27]. Vì vậy, các nghiên cứu tương lai về những dược liệu có
tác dụng bảo vệ gan và các hoạt chất chiết từ những dược liệu này là rất cần thiết.
Cây Me rừng (tên khoa học Phyllanthus emblica L. hay Emblica oficinalis
Gartn.) đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn,
kháng viêm, bảo vệ tim mạch, chống ung thư, điều trị bệnh đái tháo đường, rối loạn lipid
và các chuyển hóa khác [30], [98], [96]. Đặc biệt, đã có không ít các nghiên cứu chỉ ra

rằng các thành phần từ cây Me rừng có tác dụng bảo vệ gan in vitro và in vivo với nhiều
loại tác nhân như ethanol, carbon tetrachlorid (CCl4), arsenic, ochratoxin, paracetamol,
thuốc kháng lao, N-nitrosodiethylamin…[9], [16], [22], [33], [47], [94]. Cơ chế gây tổn
thương gan do những tác nhân trên có liên quan đến nhiễm trùng và stress oxy hóa. Các
chất chống oxy hóa bao gồm acid ascorbic, acid gallic, các flavonoid, tannoid…trong
cao chiết quả Me rừng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan thông qua cơ chế
ngăn cản hình thành viêm và stress oxy hóa [16].
Hiện nay, ở Ấn Độ và Trung Quốc, Me rừng đã được thương mại hóa thành
nhiều sản phẩm như bột pha uống bổ sung vitamin C, mỹ phẩm chống lão hóa cho da,
viên nang hỗ trợ bệnh tim mạch... Ở Việt Nam, cây Me rừng mọc hoang nhiều nơi, đặc
biệt là ở khu vực Tây Bắc và đã được đưa vào trồng thử nghiệm. Trong dân gian, quả
Me rừng được sử dụng làm thức uống giải khát, sắc uống, ngâm rượu để trị ho, cảm
mạo, đau bụng, chữa đái tháo đường và cao huyết áp [2]. Mặc dù Me rừng đã được biết
đến rất rộng rãi song các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Me rừng vẫn còn rất

1


hạn chế và đặc biệt ở trong nước hiện tại chưa có nghiên cứu nào liên quan tác dụng bảo
vệ gan. Từ những thực trạng trên, với mong muốn tìm hiểu thêm về các tác dụng dược
lý của cây Me rừng, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của Me rừng (Phyllanthus emblica L.
Euphorbiaceae) trên thực nghiệm” với hai mục tiêu như sau:
1. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vivo trên
mô hình gây độc gan cấp tính bằng carbon tetrachlorid và mô hình gây độc gan
mạn tính bằng ethanol.
2. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro
trên khả năng ức chế tích tụ lipid bằng thử nghiệm Oil Red O; khả năng ảnh
hưởng lên AMPK và ACC bằng phương pháp Western Blot.


2


PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1.

Một số cơ chế liên quan đến tổn thương tế bào gan
Quá tải gốc tự do dẫn tới stress oxy hóa tế bào gan là một trong những cơ chế

chính gây nên tổn thương tế bào gan với nhiều tác nhân khác nhau như ethanol, thuốc,
ô nhiễm môi trường hay tia xạ…. Nghiên cứu in vivo và in vitro đều cho thấy các chất
chống oxy hóa có tiềm năng lớn đối với đa số bệnh lý liên quan đến gan [51]. Mặt khác,
tổng quan về các đích phân tử liên quan đến bệnh lý về gan cho thấy Adenosin
monophosphat (AMP)-activated protein kinase (AMPK) là một đích phân tử gần đây
được khá nhiều nhà nghiên cứu quan tâm khi đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của
các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên [31]. AMPK liên quan chặt chẽ với cơ chế phân tử
của các bệnh lý tim mạch, thoái hóa thần kinh, viêm, cũng như trong các bệnh ung thư,
rối loạn chuyển hóa và đặc biệt là bệnh lý về gan như bệnh gan nhiễm mỡ, bệnh gan do
rượu hay xơ gan [52], [55], [106]. Vì vậy, trong một khuôn khổ tương đối giới hạn, phần
tổng quan này sẽ tập trung làm rõ hai cơ chế quan trọng liên quan đến bệnh lý về gan
bao gồm vai trò của stress oxy hóa và vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan.
1.1.1. Vai trò của stress oxy hóa và các gốc tự do đối với tổn thương tế bào gan
Gốc tự do (Reactive oxygen species – ROS) có thể được định nghĩa là bất kỳ
tiểu phân hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập có chứa một electron chưa ghép cặp
trong obitan nguyên tử. Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành chất khử hoặc
nhận điện tử để trở thành chất oxy hóa [56]. Vì đặc tính hóa học đó, ROS có thể gây ra
peroxy hóa lipid, phá vỡ chuỗi ADN, tổn thương các phân tử trên màng và mô sinh học.
Tuy nhiên, cơ thể lại có khả năng đào thải các gốc oxy hóa ở một mức độ nào đó, nên
với nồng độ thấp, gốc oxy hóa không có hại. Sản sinh gốc tự do là một chức năng sinh
lý của cơ thể, đóng vai trò trong quá trình hình thành tế bào bao gồm dẫn truyền tín hiệu,

hàng rào ngăn chặn các vi sinh vật, bộc lộ gen khởi động quá trình phát triển hay chết
của tế bào [19]. Stress oxy hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng
nghiêm trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxy hóa bảo vệ trong cơ thể, có
thể gây ảnh hưởng các loại phân tử bao gồm cả lipid, protein và acid nucleic, dẫn đến
cơ chế tự chết hay hoại tử tế bào [23].
Gan là một cơ quan bị tổn thương nghiêm trọng bởi các ROS [81]. Khi ROS
3


quá tải, hệ thống cân bằng bị phá vỡ, xảy ra stress oxy hóa gây nên tổn thương tế bào
gan và những rối loạn mãn tính kèm theo. Ty thể của các tế bào nhu mô gan tạo ra ROS,
điều hòa yếu tố kiểm soát chuyển hóa lipid và đường (peroxisome proliferator-activated
receptor-α – PPARα), có vai trò quan trọng đối với quá trình β-oxy hóa acid béo. Hơn
thế nữa, tế bào Kuffer, tế bào hình sao hay tế bào nội mô của gan được biết đến có vai
trò trong việc nhạy cảm tiếp xúc với stress oxy hóa. Stress oxy hóa kích thích tế bào
Kuffer sản sinh chất gây viêm như TNF- α, IL-1β, Interleukin…những chất này gây
khởi phát nhiễm trùng và quá trình tự chết của tế bào. Đồng thời, stress oxy hóa cũng
dẫn tới quá trình peroxy hóa lipid, gây kích hoạt tế bào hình sao tăng sinh tổng hợp
collagen, khởi phát xơ hóa tế bào gan [18]. Stress oxy hóa không chỉ gây kích hoạt tế
bào Kuffer, tế bào hình sao, phá hủy không hồi phục các lipid, protein và DNA mà còn
ảnh hưởng đến những chức năng khác bao gồm dẫn truyền gen, chu trình tự chết của tế
bào, hệ thống miễn dịch... Những cơ chế này liên quan đến các bệnh gan khác nhau như
bệnh gan do rượu, viêm gan virus mạn tính, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu…[87].
Ngoài ra, cơ chế liên quan các bệnh lý về gan còn được cho rằng do sự kết hợp của các
yếu tố nguy cơ gây bệnh, nhiễm trùng, hệ thống miễn dịch, quá tải các gốc tự do. Cơ
chế stress oxy hóa gây tổn thương tế bào gan được thể hiện trong hình 1.1 [51] (trang
bên).

4



Hình 1.1. Vai trò của stress oxy hóa đối với tổn thương gan
Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể bao gồm những chất có bản chất là enzym
và cả những chất không có bản chất là enzym. Cả hai loại enzym này đều cần thiết cho
khả năng chống oxy hóa khi cơ thể gặp bệnh lý. Do vậy, những enzym chống oxy hóa
như catalase (CAT), superoxid dismutase (SOD), và glutathion peroxidase (GSH-Px)
cũng như thụ thể không có bản chất là enzym như glutathion (GSH) thay đổi theo quá
trình stress oxy hóa và được sử dụng làm chỉ số đánh giá mức độ stress oxy hóa của cơ
thể [25]. Đặc biệt, yếu tố nhân erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) là một yếu tố phiên
mã trung tâm điều khiển các hệ thống bảo vệ chống oxy hóa và hệ thống chống viêm
của cơ thể [114]. Nrf2 hoạt động bằng cách gắn vào một đoạn trình tự nhất định có trong
hệ gen có tên gọi là yếu tố phản ứng chống oxy hóa (antioxidant response element –
ARE). Khi có mặt một số dưỡng chất nhất định, Nrf2 sẽ đi đến nhân tế bào để điều khiển
hoạt động tế bào sản xuất enzym chống oxy hóa như CAT, SOD, GSH-Px…[93]. Tình
trạng cân bằng hệ thống oxy hóa khử ở gan được thể hiện ở hình 1.2 [51] (trang bên).

5


Hình 1.2. Hệ thống cân bằng oxy hóa khử ở gan
Các gốc tự do là những phân tử chỉ tồn tại trong cơ thể một thời gian ngắn, gây
ảnh hưởng tại chỗ ở cơ quan. Tuy nhiên, các gốc tự do lại tấn công các acid béo đa
không bão hòa (polyunsaturated fatty acids – PUFAs), dẫn đến khởi động quá trình
peroxy hóa lipid (lipid peroxidation – LPO) trong tế bào, tạo ra các chất chuyển hóa cuối
cùng như trans-4-hydroxy-2-nonenal và malondialdehyd (MDA). Những phân tử này có
thời gian bán thải dài hơn so với các ROS và có khả năng khuếch tán ra khỏi vị trí ban
đầu đến những cơ quan đích, làm trầm trọng hơn quá trình stress oxy hóa. Đặc biệt,
MDA không chỉ tăng đồng thời cùng với mức độ peroxy hóa lipid mà MDA còn dễ định
lượng được trong máu thông qua phản ứng màu với acid thiobarbituric, vì vậy MDA là
một dấu ấn sinh học đánh giá mức độ stress oxy hóa cũng như mức độ tổn thương gan.

Quá trình peroxyd hóa các thành phần trên màng ty thể tế bào gan góp phần làm giảm
chức năng của ty thể đồng thời gây tăng cường stress oxy hóa tế bào gan [84]. Một
nghiên cứu của Pan M và cộng sự đã chứng minh rằng peroxyd hóa các PUFAs khiến
mạng lưới nội chất tiết ra một số chất trung gian làm phân hủy ApoB dẫn đến giảm mức
độ Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (very low density lipoprotein – VLDL) ở chuột [67].
Giảm VLDL có thể là một nguyên nhân làm tăng tích lũy triglycerid ở gan. Không chỉ
vậy, peroxyd hóa các PUFAs tạo nên các chất trung gian là các aldehyd làm rối loạn cân
bằng nội mô của tế bào. Các chất này ảnh hưởng đến sự tổng hợp nucleotid, protein, làm
6


thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên như glutathion và tiết các cytokin gây viêm như
TNF-α (Tumor necrosis factor alpha), IL-1β (Interleukin-1-beta) dẫn đến nhiễm trùng
tế bào gan, khởi phát xơ hóa tế bào gan [63].
1.1.2. Vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan
Những năm gần đây, protein kinase được hoạt hóa bởi AMP (AMP activated
protein kinase – AMPK) đang là một đích điều trị chiến lược trong các bệnh lý như đái
tháo đường, nhiễm trùng, béo phì và đặc biệt là các bệnh về gan. AMPK là một enzym
có vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng và cân bằng giữa nhu cầu năng lượng
cần thiết với lượng thức ăn đưa vào cơ thể, enzym này liên quan trực tiếp đến các bệnh
rối loạn chuyển hóa, có vai trò hoạt hóa enzym tham gia quá trình β-oxy hóa, làm tăng
quá trình thoái hóa chất béo và tăng chuyển hóa glucose ở cơ, đồng thời ức chế quá trình
tổng hợp cholesterol ở gan [100].
 Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ
Hoạt hóa AMPK gây phosphoryl hóa một số enzym trong bào tương trong đó
cơ chất chính của AMPK là acetyl coenzym A carboxylase (ACC) và 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzym A reductase (HMG-CoA Reductase). AMPK được hoạt hóa
dẫn đến làm giảm tích lũy mỡ tại gan liên quan đến cơ chế bất hoạt enzym ACC và
HMG-CoA reductase thông qua gây phosphoryl hóa hai enzym này [99]. HMG-CoA
reductase chịu trách nhiệm chính trong quá trình tổng hợp acid béo và cholesterol. ACC
là enzym xúc tác cho phản ứng tổng hợp malonyl-CoA từ acetyl-CoA, có vai trò chính

tham gia tổng hợp acid béo tại tế bào gan. Hoạt hóa AMPK (do phosphoryl hóa phân tử
threonin 172 trên AMPK) gây ức chế ACC (do phosphoryl hóa phân tử serin 79 trên
ACC) làm giảm nồng độ malonyl-CoA trong tế bào, giảm tổng hợp acid béo [12].
Malonyl-CoA không chỉ là tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp acid béo mà còn là chất
ức chế quá trình β-oxy hóa acid béo tại ty thể thông qua con đường ức chế enzym
carnitine palmitoyl transferase I (CPT I) [76]. Vai trò của CPT I là chất vận chuyển chất
béo vào màng trong ty thể tế bào gan để vào chất khuôn (matrix) – nơi chúng bị oxy
hóa. [4]. Vì vậy, giảm malonyl-CoA dẫn tới tăng hoạt hóa CPT I, tăng vận chuyển acid
béo vào ty thể và tăng quá trình β-oxy hóa acid béo tại ty thể tế bào gan. Bên cạnh đó,
malonyl-CoA đồng thời bị phân hủy bởi enzym malonyl-CoA decarboxylase (MCD).
7


Khi MCD được kích hoạt, sẽ góp phần làm giảm malonyl-CoA [76]. Một số nghiên cứu
đã chứng minh AMPK là protein kinase chính chịu trách nhiệm cho sự bất hoạt của ACC
và kích hoạt MCD, dẫn đến giảm nồng độ malonyl-CoA và tăng β-oxy hóa acid béo ở
gan, tim và cơ xương…[79], [105].
Ngoài ra, hoạt hóa AMPK còn ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp acid béo tế bào
gan thông qua yếu tố phiên mã nhạy cảm với AMPK là sterol regulatory element-binding
protein 1 (SREBP-1). SREBP-1 là một yếu tố phiên mã thúc đẩy sự tổng hợp acid béo
thông qua tăng bộc lộ gen sinh tổng hợp lipid, có vai trò quan trọng trong bệnh lý rối
loạn chuyển hóa gan [59].
Bệnh gan nhiễm mỡ có thể đơn thuần hoặc kết hợp viêm, có thể xảy ra ở những
người có sử dụng rượu hoặc không (bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu). Đây là bệnh
lý có thể diễn tiến từ không triệu chứng đến có biểu hiện viêm gan (viêm gan nhiễm mỡ
không do rượu) và cuối cùng là xơ gan. Metformin và Thiazolidinedion làm giảm rõ rệt
tình trạng bệnh gan nhiễm mỡ trên mô hình in vivo và trên cả lâm sàng, cơ chế được cho
rằng thông qua kích hoạt AMPK ở gan [54], [5]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu đã
đánh giá vai trò của AMPK trên mô hình chuột được gây kích hoạt AMPK thông qua
các đột biến gen như thiếu hụt enzym Stearoyl CoA desaturase – enzym có vai trò tổng

hợp acid béo đơn bão hòa hay đột biến gen γ1 subunit (γ1D316A). Kết quả cho thấy
rằng kích hoạt AMPK làm tăng quá trình β-oxy hóa acid béo, dẫn tới giảm nhiễm mỡ ở
gan chuột trong các nghiên cứu này [26], [106].
Hình 1.3 thể hiện vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ [99] (trang bên).

8


Hình 1.3. Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ
 Vai trò của AMPK trong xơ hóa tế bào gan
Xơ hóa gan là sự tích tụ quá nhiều chất cơ bản ngoại bào (extracellular matrix –
ECM), hình thành mô sẹo, kết quả của tình trạng viêm và các tế bào chết của gan, xảy
ra ở hầu hết các bệnh gan mạn tính. Nguyên nhân có thể từ tế bào gan bị tổn thương bởi
virus, rượu, gan nhiễm mỡ, các chất độc, chấn thương hoặc các yếu tố khác, hệ thống
miễn dịch bắt đầu sửa chữa thiệt hại. Theo Hiệp hội chuyên khoa bệnh gan Friedman
của Mỹ, xơ hóa tế bào gan là con đường duy nhất tiến triển từ bệnh gan mạn tính thành
bệnh xơ gan không hồi phục [34]. Xơ hóa tế bào gan trải qua ba giai đoạn bao gồm tổn
thương nhiễm trùng, hoạt hóa tế bào hình sao – một nguồn mạnh của các peroxid lipid
gây xơ hóa; tăng tiết và tích tụ ECM [52]. Trước tiên, tổn thương nhiễm trùng kích hoạt
chuyển đổi yếu tố tăng trưởng chuyển dạng TGF-β từ dạng tiềm ẩn đến dạng tiền gây
xơ hóa hoạt động, tuy nhiên may mắn là TGF-β được cho rằng bị ức chế bởi AMPK, từ
đó dẫn tới làm giảm khởi phát xơ hóa tế bào gan. Một số nghiên cứu trên mô hình chuột
bị gây xơ gan bằng CCl4 hay tế bào gan nhiễm virus viêm gan C cho thấy kích hoạt
AMPK làm giảm tín hiệu yếu tố chuyển đổi TGF-β trong gan, từ đó giảm đáng kể xơ
hóa tế bào gan [40], [45].
Bên cạnh làm giảm yếu tố chuyển đổi TGF-β, hoạt hóa AMPK còn có khả năng
làm ngăn cản quá trình tăng sinh, giảm tính hóa ứng động – di chuyển theo hướng sức
9



hút hóa học đối với cytokin, giảm hình thành xơ hóa đồng thời khởi phát tự chết theo
chu trình của tế bào hình sao trong quá trình xơ hóa tế bào gan [101]. AICAR
(aminoimidazol-4-carboxamid ribonucleotid) – một yếu tố kích hoạt biểu hiện của
AMPK được chứng minh có tác dụng ức chế sự tăng sinh nguyên bào cơ xơ có nguồn
gốc từ tế bào hình sao trên mô hình chuột bị gây độc gan bằng CCl4, đồng thời làm giảm
mức độ collagen I và xơ hóa. Li và cộng sự đã sử dụng mô hình tương tự để chứng minh
berberin ức chế sự tăng sinh của tế bào hình sao cũng như giảm biểu hiện của yếu tố
nguyên bào sợi cơ, thông qua cơ chế kích hoạt AMPK. Đáng chú ý là nghiên cứu đã
phát hiện ra rằng tác dụng chống tăng sinh của chất kích hoạt AMPK phụ thuộc vào mức
nồng độ chất kích hoạt AMPK và thời gian sử dụng [50]. Adiponectin – một chất gây
tăng biểu hiện của AMPK cũng được chứng minh có khả năng ngăn cản quá trình tăng
sinh của tế bào hình sao trên chuột bị gây độc gan bằng CCl4 dẫn tới làm giảm sự xơ
hóa tế bào gan [73]. Không chỉ vậy, AMPK cũng đóng vai trò quan trọng đối với giai
đoạn tăng tiết ECM, hoạt hoá AMPK còn có tác dụng ngăn cản quá trình xơ hóa tế bào
gan thông qua làm giảm ECM, do đó giảm hình thành sẹo và mô xơ [58].
 Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu
Tổn thương gan do rượu được chia thành ba giai đoạn kế tiếp nhau là gan nhiễm
mỡ (steatosis hepatis), viêm gan do rượu (alcoholic steatohepatitis – ASH) và xơ gan do
rượu, các giai đoạn này thường chồng chéo lên nhau, trong đó gan nhiễm mỡ hay gặp
nhất, chiếm > 90% các bệnh gan do rượu. Cơ chế phân tử của bệnh gan nhiễm mỡ do sử
dụng ethanol dài ngày liên quan đến các đích phân tử bao gồm yếu tố phiên mã kiểm
soát chuyển hóa chất béo và đường (PPARα), protein điều hòa chuyển hóa lipid
(SREBP-1), và AMP-dependent protein kinase (AMPK). Các đích phân tử này liên quan
trực tiếp đến một số yếu tố ảnh hưởng lên sự tổng hợp lipid và quá trình β-oxy hóa acid
béo tại ty thể tế bào gan như ACC, CPT I, MCD, TNF-α, adiponectin receptor 2…[110].
Sử dụng ethanol dài ngày gây kích hoạt ACC và bất hoạt CPT I trong tế bào gan, từ đó
làm giảm quá trình β-oxy hóa acid béo tại tế bào gan dẫn đến bệnh gan nhiễm mỡ do
rượu [32]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng ủng hộ bằng chứng ethanol gây tăng biểu
hiện yếu tố SREBP-1 trên cả mô hình in vivo và in vitro. Đã có một số mô hình nghiên
cứu in vivo gây bệnh gan nhiễm mỡ do ethanol cho thấy chuột bị gây độc gan bởi chế


10


độ ăn chứa ethanol trong thời gian từ 4-6 tuần có tăng biểu hiện yếu tố SREBP-1 trong
tế bào gan [111]. Kết quả nghiên cứu của Min You và cộng sự đã cho thấy ethanol gây
tăng biểu hiện yếu tố điều hòa sinh acid béo SREBP-1 trên tế bào gan H4IIEC3; McARH 7777 đồng thời nghiên cứu chứng minh hai yếu tố kích hoạt AMPK là metformin
và AICAR có khả năng làm giảm biểu hiện yếu tố điều hòa sinh acid béo SREBP-1 trên
dòng tế bào gan được ủ với ethanol [112]. Rõ ràng, ACC, CPT I hay yếu tố SREBP-1
đều có mối quan hệ chặt chẽ với AMPK, cụ thể là hoạt hóa AMPK làm tăng hoạt hóa
CPT I đồng thời làm bất hoạt ACC dẫn tới tăng quá trình β-oxy hóa acid béo tại tế bào
gan [99], [79]. Ngoài ra, hoạt hóa AMPK sẽ điều hòa làm giảm yếu tố SREBP-1, từ đó
giảm tổng hợp acid béo tại tế bào gan [29]. Như vậy, hoạt hóa AMPK có vai trò quan
trọng trong các giai đoạn của bệnh gan do rượu thông qua việc làm tăng quá trình β-oxy
hóa và giảm tổng hợp acid béo tại gan đồng thời làm giảm quá trình hình thành xơ hóa
tế bào gan. Hình 1.4 thể hiện vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ do rượu [112].

Hình 1.4. Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu
1.2.

Thông tin về dược liệu Me rừng

1.2.1. Đặc điểm thực vật
Phyllanthus emblica (hay Embellica officinallis), tiếng Việt gọi là Me rừng, me
mận, du cam tử, chùm ruột núi hoặc là mắc kham [1]. Ngoài ra, tên gọi phổ biến của Me

11


rừng ở Trung Quốc là Ganlanshu, Youganzi, hay ở Ấn Độ là Amla. Đây là một loài thực

vật có hoa với quả ăn được, trong họ Thầu dầu Euphorbiaceae [30].
Me rừng là dạng cây nhỡ, phân cành nhiều, cao 5-6 cm, vỏ cây màu xanh xám.
Cành cây mọc lộn xộn, dài khoảng 40 cm, có khoảng 100 lá cây mỗi nhánh. Lá nhỏ
thuôn hẹp, dài 9-10 mm, rộng 2-3 mm, xếp sít thành 2 dãy, như lá kép lông chim, mặt
trên màu lục xám, mặt dưới nhạt hơi hồng, lá kèm rất nhỏ. Cụm hoa mọc ở kẽ lá ở cuối
cành thành xim hoặc tản, hoa đơn tính cùng gốc màu vàng gồm nhiều hoa đực và ít hoa
cái, hoa cái có cuống ngắn hơn hoa đực nhiều, có 6 đài dày hơn, bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2
noãn. Quả thịt hình cầu có kích thước 1,8-2,5 cm, to bằng quả táo ta, có khía rất mờ, vị
chua chát, chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ cam khi chín [1], [30]. Hình 1.5 minh
họa hình ảnh lá và quả của cây Me rừng (nguồn ảnh: caythuoc.org).

Hình 1.5. Quả và lá cây Me rừng
1.2.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Me rừng mọc nhiều ở nhiều nước vùng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc
(Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia [30]. Ở Việt Nam,
cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa và trung du thuộc
nhiều tỉnh từ Bắc vào Nam, đặc biệt ở các tỉnh miền núi trung du phía Bắc. Cây ưa ánh
sáng, chịu được khô hạn. Quả, rễ, lá và vỏ cây được sử dụng để làm thuốc. Trong công
nghiệp người ta còn dùng vỏ thân, làm nguồn nguyên liệu chế tannin. Rễ thu hái quanh
năm, đào vể rửa sạch đất cát, phơi hay sấy khô. Quả thu hái vào mùa thu, đồ hơi nước
rồi phơi hay sấy khô [1].

12


1.2.3. Thành phần hóa học
Các thành phần của cây Me rừng chứa nhiều chất dinh dưỡng với thành phần
hóa học đa dạng bao gồm các annin, acid mucic, amino acid, alkaloid, flavon glycosid,
phenolic glycosid, flavonol glycosid, acid phenolic, sesquiterpenoid, norsesquiterpenoid
và carbohydrat [49]. Quả Me rừng chứa hàm lượng đáng kể các muối khoáng, protein

và các amino acid như acid glutamic, prolin, acid aspartic, alanin, cystin, lysin. Bên cạnh
đó, các nghiên cứu về thành phần hóa học trong quả Me rừng cũng tìm thấy các chất
như acid gallic, acid ellagic, acid chebulinic, acid chebulagic, emblicanin A, emblicanin
B, punigluconin, pedunculagin, acid citric, ellagotannin, trigallayl glucose,
isostrictiniin, corilagin, pectin, 1-O-galloyl-β-D-glucose, 1,6-di-O-galloyl-β-D-glucose,
acid 3-ethylgallic (acid 3-ethoxy-4,5-dihydroxy benzoic), 3,6-di-O-galloyl-D-glucose
[104]. Ngoài ra, nghiên cứu đã xác định flavonoid trong quả Me rừng bao gồm quercetin,
kaempferol [30], [49]. Thành phần hóa học của quả Me rừng được liệt kê trong Bảng
1.1 [78].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong quả Me rừng
Nhóm

Tên hợp chất

Các tannin tan

Emblicanin A and B, punigluconin, pedunculagin, acid

trong nước

chebulinic (ellagitannin), acid chebulagic (benzopyran tannin),
corilagin (ellagitannin), geraniin (dehydroellagitannin),
ellagotannin

Các alkaloids

Phyllantin, phyllembein, phyllantidin

Chất phenolic


Acid gallic, methyl gallate, acid ellagic, trigallayl glucose

Amino acids

Acid glutamic, prolin, acid aspartic, alanin, cystin, lysin

Carbonhydrat

Pectin

Vitamin

Acid ascorbic

Flavonoid

Quercetin, kaempferol

13