Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TRẦU KHÔNG
(PIPER BETLE L. PIPERACEAE)
Phan Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Mai Hương*, Nguyễn Nhật Anh*, Nguyễn Đinh Nga*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Nhằm khai thác nguồn dược liệu làm thuốc kháng nấm, đề tài được thực hiện với mục tiêu: “Khảo
sát một số điều kiện chiết cao từ lá Trầu không Piper betle L. Piperaceae”.
Phương pháp: Nguyên liệu (lá Trầu không tươi non, bánh tẻ, già hay bột lá khô) được chiết bằng các dung
môi khác nhau (ethanol 96%, 70%, 50%, 30% và nước) bằng các phương pháp khác nhau (ngâm lạnh, ngấm kiệt,
đun hồi lưu). Nguyên liệu và phương pháp chiết được lựa chọn dựa trên khối lượng và mức độ kháng vi sinh vật
của cao chiết. Một só điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được xác định nhờ vào sự hỗ trợ của phần
mềm BCPharsoft.
Kết quả: Lá Trầu không tươi loại bánh tẻ, chiết xuất với nước bằng đun hồi lưu với các điều kiện chiết xuất
đã được tối ưu hóa (tỉ lệ dược liệu – nước 1 : 5), đun hồi lưu trong 2 giờ, dịch chiết được cô đến 64 ml trước khi
lắc phân bố với dichlorometan).
Kết luận: Chiết xuất cao từ lá Trầu không tươi bằng phương pháp đun hồi lưu với nước cho hiệu suất kháng
nấm – kháng khuẩn và hàm lượng phenolic toàn phần cao nhất.
Từ khóa: cao Trầu không, BC Pharsoft.

ABSTRACT
RESEARCH SOME CONDITIONS IN EXTRACTION BETEL LEAVES PIPER BETLE L. PIPERACEAE
Phan Thi Thanh Thuy, Nguyen Mai Huong, Nguyen Nhat Anh, Nguyen Dinh Nga
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 251 - 255
Purpose: To use betel leaves as an antifungal material source, the aim of this study is “Research some
conditions in extraction betel leaves Piper betle L. Piperaceae”.
Method: Betel leaves (Piper betle L. Piperaceae) (fresh or powder); young, mature or old betel leaves were
used for extraction with different solvents (ethanol 96 %, ethanol 70%, ethanol 50%, ethanol 30% and water) in

different methods. Materials and method of extraction is selected by extract’s weight and antimicrobial effect.
Conditions affect to extraction process were determine by using BC Pharsoft software.
Result: Fresh betel mature leaves were extracted in optimized conditions to get betel extract which reach
maximum antimicrobial influence and maximum total phenolic compound such as: Solvent is water at 100 oC (1
litre for 200 g of leaves), extract time (3 hour), extract volume after reducing solvent before extracting with
dichloromethan (64 ml).
Conclutions: The conditions were determined to give good betle extract with phenolic compound in high
level, strong antimicrobial such as using fresh betel leaves; extracting with water at 100 0C in 3 hour.
Key words: betel extract, BC Pharsoft

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trầu không (Piper betle L. Piperaceae) là cây

thuốc được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ
truyền nước ta và một số nước châu Á trị hắc
lào, lang ben4. Đặc biệt tác dụng kháng nấm,

* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. Nguyễn Đinh Nga
ĐT: 0908836969

Chuyên Đề Dược Học

Email:

251


Nghiên cứu Y học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

kháng khuẩn của Trầu không đã được nhiều
nghiên cứu trên thế giới kiểm chứng(5). Khác với
tinh dầu Trầu không được chiết bằng cất kéo hơi
nước, với thành phần chính là eugenol, cao chiết
từ lá Trầu không với cồn ethyl có thành phần
chính là hydroxychavicol đã được chứng minh
là có tác động kháng nấm da, Malassezia furfur và
Candida spp.(5,1). Nhằm khai thác lá Trầu không
như nguồn nguyên liệu làm thuốc trị các bệnh ở
da và niêm mạc, góp phần xây dựng tiêu chuẩn
cho cao lá Trầu không, chúng tôi đặt vấn đề
“Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao lá Trầu không
cho tác động kháng vi sinh vật”.

Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát phương pháp chiết cao lá Trầu
không.
- Khảo sát điều kiện chiết xuất cao lá Trầu
không với hiệu suất chiết và hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm cao nhất.
- Xác định thời kỳ sinh trưởng để thu hái lá
Trầu không có hoạt tính kháng khuẩn và kháng
nấm tốt nhất.

dichloromethan, phân đoạn dichloromethan
được thu hồi dung môi để có cao Trầu không
(cao TKLK), hút ẩm đến trọng lượng không đổi
trước khi xác định khối lượng cao2.

- Lá trầu tươi cắt nhỏ được chiết xuất với cồn
ethyl 70% hoặc nước cất bằng cách đun hồi lưu
(1000 g lá tươi được hiết xuất với 5 lít dung môi).
Cao chiết với cồn ethyl hoặc cao nước được lắc
phân bố với dichloromethan và xử lý tương tự
như chiết bột lá khô để có cao Trầu không (cao
TKLT).
- Hiệu suất chiết (X) được tính toán dựa theo
hai chỉ tiêu là khối lượng cao chiết được và tác
động kháng vi sinh vật (nồng độ tối thiểu ức chế
C. albicans) theo công thức sau:
X =

P (mg)
; P: khối lượng cao chiết
MIC ( mg )

được
Cách tính toán này giúp đánh giá hiệu quả
kháng vi sinh vật thật sự và độ tinh sạch của cao

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU

chiết: Hiệu suất chiết của cao Trầu không càng

Đối tượng

cao khi khối lượng cao chiết được càng lớn và

Lá Trầu không Bà Điểm-Hóc Môn tươi (LT)

hoặc được xử lý thành bột khô (LK).

giá trị MIC của cao phải càng nhỏ.
Mỗi loại dung môi và phương pháp chiết

Candida albicans ATCC 10231, M. furfur
ATCC 44344, Staphylococcus aureus ATCC
29213, E. coli ATCC 25922.

được lập lại ít nhất 6 lần. Sử dụng F-test để so

Phương pháp nghiên cứu

pháp chiết, một số điều kiện ảnh hưởng đến quá

Chiết xuất cao Trầu không
- Lá Trầu khô: Bột lá Trầu không được chiết
xuất với cồn ethyl ở các độ cồn khác nhau: 96%,
70%, 50%, 30% và nước bằng cách ngâm lạnh,
ngấm kiệt hoặc đun hồi lưu. Lượng dược liệu và
dung môi được sử dụng theo tỉ lệ 1/10. Quá trình
chiết xuất được lập lại 3 lần. Sau khi bốc hơi
dung môi còn 1/10 thể tích, các dịch chiết với cồn
được loại nhựa và chlorophyll bằng ether dầu
hỏa. Các dịch chiết cồn đã loại chlorophyll và
dịch chiết nước được lắc phân bố với

trình chiết như lượng dung môi, thời gian chiết

252


sánh hiệu suất chiết.
- Sau khi xác định dung môi và phương

xuất được khảo sát với sự hổ trợ của phần mềm
BC Pharsoft3.
- Các mẫu cao Trầu không được xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương
pháp vi pha loãng theo hướng dẫn của NCCLSM27 A26.
- Định lượng phenolic toàn phần trong cao
Trầu không bằng phương pháp Folin –
Ciocalteu7.

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu
không từ bột lá Trầu khô
Bảng 1: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế C.
albicans của các cao TKLK
Điều kiện chiết
xuất

Khối lượng cao MIC (µg/ml)
TB(g)/10g DL C. albicans
NL, EtOH 96%
0,27
256

NL, EtOH 70%
0,29
256
NL EtOH 50%
0,08
512
NL EtOH 30%
0,25
768
NK, EtOH 96%
1,2
512
NK, EtOH 70%
1,25
512
ĐHL, EtOH 70%
1,33
256
ĐHL, nước
0,25
512

X

Nghiên cứu Y học

lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng
phương pháp ngâm lạnh có ý nghĩa thống kê với
F = 404 > F0,05 = 4,96.
- Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi

lưu có hiệu suất chiết cao hơn chiết bằng
phương pháp ngấm kiệt có ý nghĩa thống kê với
F = 289 > F0,05 =4,96.

Khảo sát các điều kiện chiết xuất cao Trầu
không từ lá Trầu tươi

1055
1133
156
326
2344
2441
5195
488

Theo Ali và cộng sự3, cao trầu không chiết
xuất từ lá tươi, với nước cất bằng phương pháp
đun hồi lưu thu được cao Trầu không chứa
hydroxychavicol cao nhất và cho tác động kháng
vi sinh vật tốt nhất.

(NL: ngâm lạnh; NK: ngấm kiệt; ĐHL: đun hồi lưu;
TB: trung bình; -: không thử; khối lượng cao và MIC
là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm).

Kết quả ở bảng 1 cho thấy khi chiết xuất cao
TK từ bột lá Trầu với cồn 70% bằng cách đun hồi
lưu sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất.


Trong các dung môi sử dụng để chiết xuất
bột lá Trầu không, cồn ethyl 70% cho hiệu suất
chiết cao hơn các dung môi còn lại.

Hai điều kiện này được áp dụng để chiết
xuất cao từ lá Trầu không tươi:

Với cùng dung môi chiết là EtOH 70%:
- Cao TK chiết bằng phương pháp đun hồi

Lá Trầu tươi được chiết xuất bằng cách đun
hồi lưu với hai dung môi là cồn ethyl 70% và
nước cất. Kết quả được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của các cao TKLT
Loại cao

Khối lượng cao TB (g)

Cao TKLT - EtOH70%
Cao TKLT – nước

1,5
3,2

MIC (µg/ml)
M. furfur
E. coli
512
256

512
128

C. albicans
256
256

S. aureus
64
32

khối lượng cao và MIC là kết quả trung bình của kết quả 6 lần thí nghiệm.

Kết quả ở bảng 2 cho thấy cao TK chiết từ
lá tươi với nước cất cho hiệu suất cao hơn
chiết với EtOH 70%.
Cao TK chiết từ lá tươi tinh sạch hơn, màu
nâu sáng hơn cao chiết từ dược liệu khô. Thực
nghiệm cho thấy khi chiết bột lá Trầu khô với
cồn cao độ, sau khi bốc hơi dung môi, quá
trình xử lý cao cồn sau chiết xuất rất khó khăn,
quá trình loại các tạp chất như nhựa,
chlorophyll,…đã ảnh hưởng rất nhiều đến
hiệu suất chiết.

Hiệu
suất
100
80
TKLT - EtOH70%


60

TKLT - nước
40

TKLK - EtOH70%
TKLK- nước

20
0
C. albicans M. furfur

E. coli

S. aure us

Biểu đồ 1. So sánh hiệu suất chiết xuất cao TK ở các
điều kiện khác nhau (TKLT: cao TK chiết từ lá tươi;
TKLK: cao TK chiết từ bột lá khô).
So sánh hiệu suất chiết cao TK từ dược liệu
khô và lá tươi với hai dung môi EtOH 70% và
nước ở biểu đồ 1 cho thấy: Cao TK chiết từ lá

Chuyên Đề Dược Học

253


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014


Nghiên cứu Y học

tươi với nước bằng cách đun hồi lưu sẽ cho
hiệu quả tốt nhất.

Khảo sát giai đoạn thu hái lá Trầu không
thích hợp
Lá Trầu không tươi ở 3 giai đoạn phát triển
già, bánh tẻ, non được chiết xuất với nước cất,
bằng cách đun hồi lưu. Kết quả ở bảng 3 cho
thấy sử dụng lá bánh tẻ thích hợp nhất cho việc
chiết xuất cao trầu không.

Bảng 3: Khối lượng và nồng độ tối thiểu ức chế vi
sinh vật của các cao TK
Nguyên
liệu

Khối
MIC trung bình (µg/ml)
lượng
S.
cao TB C. albicans M. furfur E. coli
aureus
(g)
Lá già
0,57
256
512

256
64
Lá bánh tẻ 0,64
256
512
256
32
Lá non
0,45
256
512
256
64

Khảo sát điều kiện chiết xuất cao Trầu
không với sự hỗ trợ của phần mềm
BCPharsoft
Các điều kiện cố định
Nguyên liệu: Lá Trầu không bánh tẻ tươi 200
g/lô; dung môi: nước cất
Phương pháp chiết : đun hồi lưu
Các điều kiện khảo sát:
x1: lượng nước (lít);
x2: thời gian đun hồi lưu (h).
x3: lượng dịch chiết sau khi cô để lắc phân bố
với dichloromethan (ml). Trong qui trình chiết
xuất, lượng dịch chiết sau khi cô cần phải điều
chỉnh thích hợp để tránh tạo nhũ quá nhiều khi
lắc phân bố với dichloromethan, sẽ ảnh hưởng
đến hiệu suất chiết.

Bảng 4: Các mức khảo sát đối với mỗi điều kiện
1
2
3
4

x1 (lít)
0,4
0,6
0,8
1,0

x2 (giờ)
1
2
3

x3 (ml)
20
60
100

Mô hình thực nghiệm
Dựa vào mô hình D – Optimal với các mức
khảo sát như bảng trên, mô hình thực nghiệm

254

được xây dựng gồm 24 thí nghiệm. Thực hiện
chiết theo qui trình đun hồi lưu với dung môi

nước. Các biến số phụ thuộc được xác định đối
với từng thí nghiệm.
Hiệu suất chiết được tính theo mức độ
kháng vi sinh vật và khối lượng cao chiết
y1: Mức độ kháng C. albicans
y2: Mức độ kháng S. aureus
Y3: Hàm lượng phenolic toàn phần được
tính bằng đơn vị đương lượng gam acid
gallic/gam cao chiết.
Bảng 4: Dữ liệu thực nghiệm điều kiện chiết xuất cao
Trầu không

1
2
3

X1
(lít)
1
0,6
0,6

X2
(giờ)
2
1
3

X3
(ml)

100
60
100

4
5
6
7
8

0,6
0,8
0,6
1
1

1
1
2
3
3

20
100
100
20
60

9
10

11

0,8
1
0,4

3
1
1

12
13
14
15
16

0,6
0,8
0,6
0,8
0,4

17
18
19
20
21
22
23
24


Y1

Y2

Y3

2539
1836

20313
14688

2227

17813

1,09091
1,04132
1,23140

1367
2422

10938
19375

2148
1484


17188
11875

2734

21875

20
20
60

1367
1445

10938
11563

1367

10938

3
2
2
3
1

20
20
20

60
20

1445
1328

11563
10625

1367
2656

10938
21250

977

7813

1
1
0,8

2
1
3

60
100
100


2656
2344

21250
18750

2695

21563

0,4
0,4
0,4
0,4
0,8

2
2
1
3
1

20
60
100
100
60

1445

1758

11563
14063

1563
1953

12500
15625

2344

18750

1,21488
1,06612
1,29752
1,04959
1,30579
1,15702
1,30579
1,09917
1,28926
1,23967
1,07438
1,29752
1,30579
1,13223
1,30579

1,04132
1,04959
1,04132
1,36364
1,04959
1,28926

Dữ liệu trong bảng 4 được dùng làm yếu tố
đầu vào cho phần mềm BC Pharsoft
Bảng 5: Mức độ liên quan nhân quả
Y1
Y2
Y3

X1
+
+
+

X2
+
+
+

X3
+
+
+

Giá trị dự đoán

2610
21290
1,36

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Kiểm chứng các điều kiện phần mềm tính
toán bằng thực nghiệm
Lá Trầu không tươi được chiết 6 lần với cùng
điều kiện đã xác định theo mô hình. Kết quả
thực nghiệm được so sánh với các giá trị dự
đoán.

cao và mức độ kháng vi sinh vật cao nhất. Việc
áp dụng phần mềm thông minh trong khảo sát
điều kiện chiết xuất giúp giảm chi phí và thời
gian thực nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bảng 5: Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 5
Lần 6

Trung bình
Dự đoán

Y1
2812,5
2890,6
2773,4
2812,5
2851,6
2773,4
2819,0
2610,0

Y2
22500
23125
22188
22500
22813
22188
22552
21290

Y3
1,31405
1,32231
1,33884
1,32231
1,33058
1,31405

1,32369
1,36200

Kết quả thử nghiệm và kết quả dự đoán bởi
mô hình được xây dựng bằng phần mềm BC
Pharsoft.khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(F=0,29 < F0,05 = 18,51).
Từ kết quả khảo sát, các điều kiện chiết xuất
cao Trầu không được đề nghị như sau:
Nguyên liệu sử dụng là lá Trầu tươi, loại
bánh tẻ; dung môi dùng chiết xuất là nước cất
với tỉ lệ 1 : 3 (w/v); đun hồi lưu trong giờ sẽ cho
cao TK đạt hiệu suất chiết tính trên trong lượng

Chuyên Đề Dược Học

Nghiên cứu Y học

2.
3.

4.
5.

6.

7.

Amonkar AJ et al, (1986), “Hydroxychavicol: A new Phenolic
Antimutagen from Betel Leaf”, Food and Chemical Toxycology,

24 (12): 1321 – 1324.
Bhattacharya S et al, (2005), “Radioprotective property of the
ethanolic extract of Piper betleleaf”, J. Radiat. Res., 46:165 – 171.
Chung KK, Đỗ QD (2010), Xây dựng phần mềm BCPharSoft
giải quyết bài toán tối ưu hoá công thức và quy trình sản xuất
dược phẩm. Tạp chí Dược học, (4):48-51.
Đỗ HB và cs. (2004), “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt
nam”, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tập I.
Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh, (2010), Thành phần
và tác động kháng Candida spp của tinh dầu và cao chiết từ lá
Trầu không Việt Nam, Tạp chí Dược học,(410), tr.27.
The National Committee for Clinical Labolatory Standards
(2002), “Reference Method for Broth Dilution Antifungal
Susceptibility testing of Yeasts”, Approved Standard-Second
Edition, M 27-A2.22, 15:1-30.
Wen D, Li E, Di H, Liao Y, and Liu H (2005), A universal
HPLC method for the determination of phenolic acids in
compound herbal medicines, J. Agric. Food Chern., 53: 66246629.

Ngày nhận bài báo:

11.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2012
Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

255