Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

Nghiên cứu tạo DNA macroarrays phát hiện nhanh tính kháng thuốc ở
vi rút viêm gan B
Development of DNA macroarrays for rapid detection of drug resistance in Hepatitis B virus

Lã Thị Quỳnh Như, Phạm Tiến Dũng, Lê Quang Hòa*
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội – Số 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng, Hà Nội
Đến Tòa soạn: 29-5-2018; chấp nhận đăng: 18-01-2019
Tóm tắt
DNA macroarrays với 7 mẫu dò kiểu dại và 12 mẫu dò kiểu đột biến đã được thiết kế thành công để phát
hiện các kiểu đột biến rtL180M và rtM204V/I, vốn liên quan đến tính kháng Lamivudine; rtA181T/V và
rtN236T, vốn liên quan đến tính kháng Adefovir; rtL180M, rtM204V/I, rtT184S/G; rtS202I và rtM250V/I, vốn
liên quan đến tính kháng Entecavir ở vi rút viêm gan B (HBV). Để quá trình lai có thể được thực hiện trong
ống eppendorf 2 ml, các điều kiện lai đã được tối ưu hóa bao gồm: nhiệt độ lai là 54C, tốc độ lắc 600
vòng/phút, lượng sản phẩm PCR sử dụng là 20 µl. Với điều kiện lai tối ưu này, 12 đột biến kháng thuốc đều
được phát hiện chính xác và không xảy ra hiện tượng dương tính giả do lai chéo. Ưu điểm chủ yếu của quy
trình phân tích mới này là nhanh và chỉ yêu cầu các thiết bị đơn giản.
Từ khóa: DNA macroarrays, kháng thuốc, viêm gan B, đột biến, phân tích nhanh
Abstract
DNA macroarrays containing 7 wild-type probes and 12 mutant-type probes were successfully developed to
detect common mutations associated with the resistance of Hepatitis B virus (HBV) to Lamivudine (LAM),
Adefovir (ADV) and Entecavir (ETV). These mutations include rtL180M and rtM204V/I, associated with LAM
resistance; rtA181T/V and rtN236T, associated with ADV resistance; rtL180M, rtM204V/I, rtT184S/G,
rtS202I and rtM250V/I, associated with ETV resistance. The optimal conditions for DNA macroarray
hybridization in 2-ml eppendorf tubes were: hybridization temperature of 54C, rotation speed of 600 rpm,
amount of PCR product of 20 µl. Under these optimal conditions, all target mutations were accurately
detected by DNA macroarrays without false positive problems due to cross-hybridization. The main
advantages of this new method, based on DNA macroarrays for detection of drug resistance in HBV, are
rapidity and simplicity (no special equipment required).
Keywords: DNA macroarrays, drug resistance, Hepatitis B virus, mutations, rapid detection

1. Đặt vấn đề*

bao gồm 4 khung đọc mở xếp chồng lên nhau mã hóa
các kháng nguyên bề mặt, kháng nguyên lõi, kháng
nguyên e, protein X và một DNA polymerase có cả
hai hoạt tính DNA-dependent DNA polymerase và
RNA-dependent
DNA
polymerase
(reverse
transcriptase) để phục vụ quá trình tái bản DNA của
vi rút thông qua pgRNA (pregenomic RNA) [3]. Do
tần suất sao chép sai của hoạt tính reverse
transcriptase là cao (10-7 trên mỗi nucleotide trong
một ngày) nên ở mỗi bệnh nhân tồn tại một quần thể
các loại vi rút có hệ gen liên quan đến nhau nhưng
không giống nhau hoàn toàn [4]. Ước tính mỗi ngày
có khoảng 107 sao chép lỗi trong quá trình tái bản của
HBV trong cơ thể người bệnh và một số các biến thể
này có thể trở thành các chủng đột biến chiếm đa số
dưới tác dụng của áp lực chọn lọc [4].

Viêm gan B là một bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm ở gan do vi rút HBV (Hepatitis B virus) gây ra.
Theo một nghiên cứu của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO), trong năm 2015, có đến hơn 250 triệu ca
mắc viêm gan B mãn tính trên toàn thế giới [1]. Việt
Nam là một trong những quốc gia có gánh nặng về
bệnh viêm gan B mãn tính trầm trọng nhất trên thế

giới với khoảng 8,6 triệu ca [2]. Nếu không được điều
trị đúng cách, bệnh viêm gan B mãn tính là nguyên
nhân chính gây xơ gan và ung thư gan. Trong năm
2015, HBV là nguyên nhân của gần 900000 ca tử
vong trên toàn thế giới [1].
Thuộc họ Hepadnaviridae với nhiều đặc tính
tương tự một số loại retrovirus, HBV có hệ gen là
một phân tử DNA dạng vòng, xoắn kép không hoàn
chỉnh với kích thước khoảng 3,2 kb [3]. Hệ gen này

Hiện nay, để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính,
có thể sử dụng liệu pháp điều trị bằng chất tương tự
nucleoside/nucleotide (NA) hoặc liệu pháp IFNα (cụ
thể PegIFNα). Ưu điểm chính của liệu pháp sử dụng

*

Địa chỉ liên hệ: Tel.: (+84) 912.361.276
Email:
94


Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

PegIFNα là cho phép kích hoạt hệ thống miễn dịch
của người bệnh nhằm kiểm soát sự nhân lên của vi rút
ngay cả khi đã ngừng sử dụng thuốc. Tuy nhiên, liệu
pháp này có nhiều điểm hạn chế như tỷ lệ đáp ứng
thuốc thấp, gây nhiều hiệu ứng phụ và có giá thành
cao [5]. Do vậy, ở nước ta hiện nay, NA được sử

dụng chủ yếu để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính
do khả năng đáp ứng thuốc rất tốt của liệu pháp này.
Tuy nhiên, hạn chế chủ yếu của liệu pháp này là nguy
cơ xuất hiện các đột biến kháng thuốc sau một thời
gian sử dụng. Cho đến nay, nhiều đột biến kháng NA
đã được phát hiện bao gồm: rtL180M, rtM204V/I liên
quan đến tính kháng Lamivudine; rtA181T/V,
rtN236T liên quan đến tính kháng Adefovir;
rtL180M, rtM204V/I, rtT184S/G; rtS202I; rtM250V/I
liên quan đến tính kháng Entecavir [6].

phiên bản plasmid DNA kiểu dại và 25 µl GoTaq®
Colorless Master Mix 2X; 2,5 pmol mồi xuôi InnoHBV-F; 50 pmol mồi ngược Inno-HBR-Biotin (trình
tự như ở trên nhưng được biến đổi biotin ở đầu 5’).
Chương trình nhiệt của phản ứng như sau: 95oC, 3
phút; 50 chu kỳ (95oC, 30 giây; 53oC, 30 giây; 72oC,
50 giây); 72oC, 2 phút.
2.3. Cố định mẫu dò lên màng nylon
Màng Amersham Hybond-N (GE Healthcare)
được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước 2,0 × 1,2 cm
và được chia đều thành 3 cột × 5 hàng tương đương
với 15 điểm cố định. Sau đó, dùng pipet để chấm 0,2
µl các mẫu dò lên từng vị trí (Hình 1). Bảy mẫu dò
kiểu dại được trộn với nhau để đạt nồng độ cuối của
mỗi mẫu dò là 5 µM trước khi được chấm lên vị trí số
1 trên màng. Các mẫu dò kiểu đột biến được pha
loãng trong đệm TE về nồng độ 10 µM và được chấm
riêng rẽ lên 12 vị trí khác nhau trên màng.
Oligonucleotide (T)20 gắn biotin ở đầu 3’(2 µM)
được chấm lên màng ở 2 vị trí còn lại để làm kiểm

chứng. Sau khi chấm mẫu, màng được sấy ở 80oC
trong 2 tiếng để cố định mẫu dò và bảo quản ở nhiệt
độ phòng trong túi nhôm hàn kín có gói hút ẩm.

Để phát hiện tính kháng thuốc NA ở HBV, hai
loại phương pháp thường được sử dụng hiện nay là
phương pháp giải trình tự và phương pháp lai ngược
(reverse hybridization) dựa trên sinh phẩm thương
mại INNO-LiPA. Hạn chế chủ yếu của của phương
pháp giải trình tự là yêu cầu trang thiếtảm bảo khả năng lai đồng đều, các
mẫu dò được thiết kế sao cho Tm của chúng dao động
trong khoảng từ 55 đến 60C với các thông số nồng
độ mẫu dò và trình tự đích đều là 0,2 µM và nồng độ
Na+, K+ là 800 mM vốn là nồng độ Na+ của dung dịch
5X SSPE được dụng trong quá trình lai). Cuối cùng,
với mỗi đột biến cần phát hiện, chúng tôi đều thiết kế
thêm các mẫu dò kiểu dại tương ứng. Điều này giúp
hạn chế phản ứng chéo của DNA kiểu dại của HBV
với mẫu dò kiểu đột biến do vậy giúp đảm bảo độ đặc
hiệu của quy trình phân tích. Để đảm bảo khả năng cố
định của các mẫu dò trên màng nylon, đuôi poly(T)20
được thêm vào đầu 5’ của mỗi trình tự mẫu dò. Kết
quả thiết kế các mẫu dò kiểu dại và mẫu dò kiểu đột
biến để phát hiện các đột biến rtL180M, rtA181T/V,
rtT184S/G;
rtS202I;
rtM204V/I;
rtN236T;
rtM250V/I liên quan đến tính kháng Lamivudine,
Adefovir và Entecavir được trình bày trong Bảng 1 và

Bảng 2. Tổng cộng có 7 mẫu dò kiểu dại và 12 mẫu
dò kiểu đột biến đã được thiết kế. Tm bắt cặp đúng
của 19 mẫu dò này là dao động trong khoảng từ 55,3
đến 60,1C. Các sai khác về Tm (Tm) giữa phản ứng

3.2.1. Tối ưu nhiệt độ lai
Nhiệt độ lai có ảnh hưởng quyết định đến độ đặc
hiệu và độ nhạy của phản ứng lai. Nhiệt độ lai thấp sẽ
làm giảm độ đặc hiệu trong khi nhiệt độ lai quá cao sẽ
giảm cường độ tín hiệu lai. Như đã nói ở trên, mục
tiêu của nghiên cứu này là phát hiện các dạng đột
biến nên cần loại bỏ các phản ứng lai chéo của DNA
HBV kiểu dại với các mẫu dò kiểu đột biến. Các kết
quả lai của mẫu DNA HBV kiểu dại với màng DNA
macroarrays ở các nhiệt độ 52, 54 và 56C cho thấy ở
tất cả các nhiệt độ lai thử nghiệm, vị trí mẫu dò kiểu
dại đều cho tín hiệu rõ có thể quan sát bằng mắt
thường (Hình 1). Tuy nhiên, nhiệt độ lai càng cao thì
cường độ tín hiệu càng giảm. Ở nhiệt độ lai 52C,
xuất hiện tín hiệu lai không đặc hiệu tại các vị trí mẫu
dò 180L-M, 181A-T, 184T-S1, 202S-I, 204M-V,
204M-I, 236N-T, 250M-V và 250M-I. Ở các nhiệt độ
lai 54 và 56C, hiện tượng lai chéo này được loại bỏ
triệt để. Từ đây, chúng tôi đã lựa chọn 54C là nhiệt
độ lai cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Tối ưu tốc độ lắc
Trong các lò lai phân tử truyền thống, các ống
lai được quay tròn một cách liên tục giúp các phân tử
DNA trong dung dịch được phân bố đều trên màng
mặc dù dịch lai không ngập hết màng. Điều này giúp

giảm thể tích của phản ứng lai, tăng nồng độ của
96


Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

DNA đích kết quả là giúp tăng độ nhạy. Ở trong
nghiên cứu này, thể tích của phản ứng lai thực hiện
trong ống eppendorf 2 ml đã được giảm xuống chỉ
còn 1,2 ml để đảm bảo màng luôn nằm trong dung
dịch lai. Câu hỏi được đặt ra ở đây là liệu có cần thực
hiện quá trình đảo trộn nữa hay không. Để trả lời câu
hỏi này, chúng tôi đã thử nghiệm phản ứng lai trong
các điều kiện không khuấy trộn và có khuấy trộn trên
máy ổn nhiệt có lắc ThermoMixer (Eppendorf) ở các
tốc độ 0, 300, 600 và 900 vòng/phút. Kết quả lai
(Hình 2) cho thấy cường độ tín hiệu lai đạt mức cao
nhất khi tốc độ lắc là 600 vòng/phút. Ở tốc độ 900
vòng/phút, cường độ tín hiệu lai bị giảm có thể là do
tác động phối hợp của tác động cơ học và nhiệt độ lai
cao đã làm giảm hiệu quả của phản ứng lai.

Để giảm chi phí cho bước khuếch đại vùng gen đích
bằng PCR nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy của phản ứng
lai, lượng sản phẩm PCR sử dụng trong một phản ứng
lai đã được tối ưu hóa. Một cách cụ thể, 6 phản ứng
PCR với nồng độ khuôn ở mức cận ngưỡng là 50
phiên bản/phản ứng đã được thực hiện và sản phẩm
của các phản ứng này được trộn lại thành một hỗn
hợp duy nhất để sử dụng trong các phản ứng lai với

các thể tích sản phẩm PCR dao động từ 5 đến 50 µl.
Kết quả lai (Hình 3) cho thấy lượng sản phẩm PCR
sử dụng càng nhiều thì cường độ tín hiệu lai thu được
càng mạnh và không xuất hiện phản ứng lai chéo
ngay cả khi sử dụng 50 µl sản phẩm PCR. Tuy nhiên,
giữa hai thể tích 20 và 50 µl sản phẩm PCR được sử
dụng, sự gia tăng cường độ tín hiệu là không đáng kể.
Do vậy, lượng sản phẩm PCR sử dụng trong phản
ứng lai cho các thí nghiệm tiếp theo được cố định ở
mức 20 µl.

3.2.3. Tối ưu lượng sản phẩm PCR sử dụng trong
phản ứng lai

Bảng 1. Trình tự và đặc tính nhiệt động học của các mẫu dò kiểu dại
STT

Tên
mẫu dò

Trình tự mẫu dò (5’-3’)

1
2
3
4
5
6
7


180L
181A
184T
202S
204M
236N
250M

ttttttttttttttttttttTTTCTCCTGGCTCA
ttttttttttttttttttttCTCCTGGCTCAGT
ttttttttttttttttttttCAGTTTACTAGTGCC
ttttttttttttttttttttGCTTTCAGTTATATGG
ttttttttttttttttttttCAGTTATATGGATGATG
ttttttttttttttttttttACATTTGAACCCTAA
ttttttttttttttttttttTTAACTTCATGGGATAT

Tm bắt
cặp đúng
(oC)
60,1
59,7
57,2
55,7
55,9
55,3
56,5

Tm bắt cặp
với các kiểu
đột biến (oC)

46,6
44,0 - 49,3
41,5 - 50,8
49,2
47,3 - 49,9
51,0
47,9 - 48,3

Tm (oC)
13,5
10,4 - 15,7
6,4 - 15,7
6,5
6,0 - 8,6
4,3
8,2 - 8,6

Chú thích: Trình tự mẫu dò được viết hoa; đuôi poly(T)20 viết thường; các vị trí xảy ra đột biến được gạch chân

Bảng 2. Trình tự và đặc tính nhiệt động học của các mẫu dò kiểu đột biến
STT

Tên mẫu
dò

Trình tự mẫu dò

1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12

180L-M
181A-T
181A-V
184T-S1
184T-S2
184T-G
202S-I
204M-V
204M-I
236N-T
250M-V
250M-I

ttttttttttttttttttttTTTCTCATGGCTCA
ttttttttttttttttttttTCTCCTGACTCAGTT
ttttttttttttttttttttCTCCTGGTTCAGTT
ttttttttttttttttttttCAGTTTTCTAGTGCC
ttttttttttttttttttttCAGTTTAGTAGTGCC
ttttttttttttttttttttCAGTTTGGNAGTGC
ttttttttttttttttttttGGCTTTCATTTATATGG

ttttttttttttttttttttCAGTTATGTGGATGAT
ttttttttttttttttttttCAGTTATATCGATGATG
ttttttttttttttttttttACATTTGACCCCTAA
ttttttttttttttttttttTTAACTTCGTNGGATAT
ttttttttttttttttttttCTTAACTTCATAGGATATA

Tm bắt
cặp đúng
(oC)
57,3
59,9
57,9
58,0
57,2
57,2
57,3
57,1
56,0
58,0
59,6
55,4

Tm bắt cặp
với kiểu dại
(oC)
51,6
49,8
51,1
49,4
51,2

34,5
50,1
48,7
43,7
44,2
52,2
48,2

Chú thích: Trình tự mẫu dò được viết hoa; đuôi poly(T)20 viết thường; các vị trí xảy ra đột biến được gạch chân

97

Tm (oC)
5,7
10,1
6,8
8,6
6,0
22,7
7,2
8,4
12,3
13,8
7,4
7,2


Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

A


B

C

D

Hình 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ đặc hiệu của phản ứng lai giữa DNA HBV kiểu dại với các mẫu dò.
A: 52oC; B: 54oC; C: 56oC; D: vị trí các mẫu dò, 1: hỗn hợp mẫu dò kiểu dại; 2: 180L-M; 3: 181A-T; 4: 181AV; 5: 184T-S1; 6: 184T-S2; 7: 184T-G; 8: 202S-I; 9: 204M-V; 10: 204M-I; 11: 236N-T; 12: 250M-V; 13:
250M-I; CT: (T)20-Biotin.

A

B

C

D

E

Hình 2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến cường độ tín hiệu của phản ứng lai giữa DNA HBV kiểu dại với các mẫu
dò. A: 0 vòng/phút; B: 300 vòng/phút; C: 600 vòng/phút; D: 900 vòng/phút; E: vị trí các mẫu dò như ở Hình 1.

A

B

C


D

E

Hình 3. Ảnh hưởng của lượng sản phẩm PCR sử dụng đến cường độ tín hiệu của phản ứng lai giữa DNA HBV
kiểu dại với các mẫu dò. A: 5 µl; B: 10 µl; C: 20 µl; D: 50 µl; E: vị trí các mẫu dò như ở Hình 1.

98


Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

I

A

B

C

D

E

F

G

H


J

K

L

M

Hình 4. Độ đặc hiệu của phản ứng lai giữa DNA của các kiểu đột biến với các mẫu dò. A: 180L-M; B: 181A-T;
C: 181A-V; D: 184T-S1; E: 184T-S2; F: 184T-G; G: 202S-I; H: 204M-V; I: 204M-I; J: 236N-T; K: 250M-V;
L: 250M-I; M: vị trí các mẫu dò như ở Hình 1.
3.3. Xác định độ đặc hiệu của DNA macroarrays
phát hiện các kiểu đột biến liên quan đến tính
kháng thuốc của HBV

cho phép phát hiện các đột biến liên quan đến tính
kháng thuốc hay không. Để trả lời câu hỏi này, chúng
tôi đã sử dụng các oligonucleotide được biến đổi
biotin ở đầu 3’ và có trình tự bắt cặp bổ sung với các
mẫu dò kiểu đột biến cần phát hiện để thực hiện phản
ứng lai với DNA macroarrays trong điều kiện lai đã
được xây dựng. Các kết quả lai (Hình 4) cho thấy các
tín hiệu lai thu nhận được đều có tính đặc hiệu cao và
hoàn toàn không xảy ra phản ứng lai chéo giữa DNA

Các kết quả nghiên cứu trình bày ở trên đã cho
thấy quy trình lai DNA macroarrays cho phép phát
hiện chính xác kiểu dại của HBV tại tất cả các vị trí
có thể xảy ra đột biến kháng thuốc. Câu hỏi được đặt
ra ở đây là liệu quy trình lai đã được tối ưu này có

99


Tạp chí Khoa học và Công nghệ 132 (2019) 094-100

đích với mẫu dò kiểu dại và các mẫu dò kiểu đột biến
khác. Cường độ tín hiệu thu nhận được ở các mẫu dò
khá đồng đều, hoàn toàn có thể quan sát được bằng
mắt thường. Các kết quả thử nghiệm độ nhạy của quy
trình PCR kết hợp với lai (không được trình bày ở
đây) cho thấy ngưỡng phát hiện của các mẫu dò kiểu
dại và kiểu đột biến là nằm trong khoảng từ 5-50
phiên bản/phản ứng PCR, hoàn toàn đáp ứng được
yêu cầu phát hiện tính kháng thuốc của HBV trong
các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Tài liệu tham khảo

4. Kết luận
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế
được bộ mẫu dò cho phép phát hiện được các kiểu đột
biến liên quan đến tính kháng thuốc Lamivudine,
Adefovir và Entecavir của HBV. Các điều kiện lai
trong ống eppendorf 2 ml cũng đã được tối ưu giúp
đơn giản hóa được quy trình phân tích. Ưu điểm của
quy trình phân tích đã xây dựng là thời gian phân tích
nhanh, không yêu cầu thiết bị phức tạp và đây là hệ
thống phân tích mở có thể được bổ sung thêm các
mẫu dò phát hiện các kiểu đột biến mới nếu cần.
Lời cảm ơn


[1]

WHO, Global hepatitis report (2017).

[2]

/>tsheet/vi/

[3]

T.J. Liang, Hepatitis B: The Virus and Disease,
Hepatology. 49 (2009) 13-21.

[4]

S. Locarnini, Hepatitis B viral resistance: mechanisms
and diagnosis, J Hepatol. 39 (2003) 124-132.

[5]

European Association for the Study of the Liver,
EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the
management of hepatitis B virus infection, J Hepatol.
67 (2017) 370-398.

[6]

J. Fan, Y. Zhang, H. Xiong, Y. Wang, X. Guo,
Nucleotide analogue-resistant mutations in hepatitis B

viral genomes found in hepatitis B patients, J Gen
Virol. 96 (2015) 663-670.

[7]

T. Shaw, A. Bartholomeusz, S. Locarnini, HBV drug
resistance: Mechanisms, detection and interpretation,
J Hepatol. 44 (2006) 593-606.

[8]

Y.P. Yang , N. Corley, J. Garcia-Heras, Reverse dotblot hybridization as an improved tool for the
molecular diagnosis of point mutations in congenital
adrenal hyperplasia caused by 21-hydroxylase
deficiency, Mol Diagn. 6 (2001) 193-199.

[9]

T.T.T. Bui, T.T. Tran, M.N. Nghiem, P. Rahman ,
T.T.T. Tran, M.N.H. Dinh, M.H. Le, V.V.C. Nguyen,
G. Thwaites, M. Rahman, Molecular characterization
of hepatitis B virus in Vietnam, BMC Infect Dis. 17
(2017) 601.

Tập thể tác giả trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục
và Đào tạo đã cấp kinh phí thực hiện nghiên cứu này
(mã số đề tài B2015-01-109).

100