Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Nghiên cứu Y học

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG SINENSETIN
TRONG CAO KHÔ SẤY PHUN RÂU MÈO
Nguyễn Thị Thu Thùy*, Huỳnh Trần Quốc Dũng**, Nguyễn Đức Hạnh*, Nguyễn Minh Đức***,
Nguyễn Phương Dung****

TÓM TẮT
Mở đầu - mục tiêu: Râu mèo là dược liệu cổ truyền được sử dụng trong nhiều bài thuốc với công dụng
chính là lợi tiểu. Sinensetin là thành phần chính có tác dụng sinh học quan trọng của Râu mèo, được Dược điển
Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu. Định lượng sinensetin đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất
lượng sản phẩm cao chiết từ Râu mèo. Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Đối tượng và Phương pháp: Phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo
được thẩm định theo hướng dẫn của ICH với các chỉ tiêu gồm tính tương tích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến
tính, độ chính xác và độ đúng.
Kết quả: Điều kiện HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo gồm: Cột Thermo
Syncronis RP18 (250 × 4,6 mm; 5 μm), bước sóng phát hiện 258 nm, nhiệt độ 30oC, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể
tích tiêm mẫu 20 μl. Pha động gồm acetonitril và nước với tỷ lệ acetonitril là 42%, 65% lần lượt trong các
khoảng thời gian 0 - 20 phút, 21 - 30 phút. Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống,
tính tuyến tính (ŷ = 50,53x với R2 = 0,9988), độ chính xác trung gian (% RSD = 1,51%), độ đúng với tỷ lệ hồi
phục trong khoảng 95,98% - 102,43%.
Kết luận: Phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đã được thẩm định và có thể
được ứng dụng để xây dựng chỉ tiêu định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo.
Từ khóa: Sinensetin, HPLC, Râu mèo, thẩm định.

ABSTRACT
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN HPLC METHOD FOR SINENSETIN ANALYSIS FROM
ORTHOSIPHON STAMINEUS SPRAY-DRIED EXTRACT

Nguyen Thu Thu Thuy, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Hanh, Nguyen Minh Duc,
Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 123 - 128
Objectives: Orthosiphon stamineus is a traditional herbal medicine with the well-known diuretic activity.
Sinensetin, a major bioactive compound of O. stamineus, is officially used as a biomarker for O. stamineus by
British Pharmacopoeia 2016. For quality control of O. stamineus extract and its products, it is important to
determine sinensetin content. This study aimed at developing and validating an HPLC method for sinensetin
analysis from O. stamineus spray-dried extract.
Methods: HPLC conditions for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract were
screened and the best condition was selected. The HPLC analytical method was validated according to the ICH
guidelines for its system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy.
Results: The best HPLC condition for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract
employed Thermo Syncronis RP18 column (250 × 4.6 mm; 5 μm), a detection wavelength of 258 nm, a column


**
Khoa Dược - Đại Học Y Dược TP. HCM
Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP. HCM
*** Khoa Dược - Đại Học Tôn Đức Thắng
**** Khoa Y Học Cổ Truyền - Đại Học Y Dược TP. HCM
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh
ĐT: 0913576748
Email:

123


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Nghiên cứu Y học


temperature of 30oC, a flow rate of 1 ml/min, and an injection volume of 20 μl. Mobile phase was mixtures of
acetonitrile and water with a gradient program. The ratios of acetonitrile were 42% and 65% at 0 – 20 min and
21 – 30 min, respectively. The specificity and suitability of the analytical method were found to meet the
requirement. A good correlation between peak areas and sinensetin concentrations was obtained with R2 = 0.9988.
The % RSD value of inter-day precision was found to be at 1.51%. The HPLC method accuracy met the
requirement with recovery percentages of 95.98 – 102.43%.
Conclusions: An HPLC method for sinensetin determination from O. stamineus spray-dried extract
successfully developed. This method met the requirements of validation and could be useful for improving the
quality of O. stamineus spray-dried extract and the related products.
Keywords: Sinensetin, HPLC, Orthosiphon stamineus, Râu mèo, validation.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Râu mèo là một dược liệu cổ truyền được sử
dụng với tác dụng chính là lợi tiểu. Râu mèo
được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc dân
gian, đồng thời cũng là một thành phần quan
trọng trong nhiều chế phẩm Đông dược trên thị
trường hiện nay dùng điều trị các bệnh về thận,
bàng quang cũng như một số bệnh về khớp(2).
Sinensetin (Hình 1) là một trong những thành
phần hóa học quan trọng của Râu mèo, được
Dược điển Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu
để kiểm soát chất lượng cho dược liệu này(1).
Việc áp dụng các dạng bào chế hiện đại và
tiêu chuẩn kiểm nghiệm vào các sản phẩm từ
thiên nhiên đang là xu hướng chung của nền y
học cổ truyền nhằm tạo ra sản phẩm thuận tiện
và chất lượng phục vụ cho người tiêu dùng.
Trong đó, cao chiết là một trong những bán
thành phẩm quan trọng trong quá trình sản xuất

các thuốc từ dược liệu, việc đánh giá chất lượng
thông qua hàm lượng hoạt chất là yếu yếu tố cần
thiết, quyết định cho hiệu quả điều trị của sản
phẩm cuối cùng.
OMe
OMe

MeO

O

MeO
OMe

O

Hình 1. Công thức cấu tạo của sinensetin

124

Nhằm hướng đến mục tiêu bào chế các sản
phẩm từ Râu mèo với tiêu chuẩn chất lượng
được đánh giá thông qua hàm lượng hoạt chất
sinensetin. Nhóm nghiên cứu bước đầu thực
hiện đề tài với nội dung “Xây dựng và thẩm
định quy trình định lượng sinensetin trong
cao khô sấy phun Râu mèo bằng phương pháp
HPLC”.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

Đối tượng và nguyên liệu
Cao khô sấy phun Râu mèo (số lô 0041117)
được cung cấp bởi PGS.TS. Nguyễn Phương
Dung. Sinensetin chuẩn làm việc (hàm lượng
98,63% tính theo dạng khan) do Ban Nghiên Cứu
Khoa Học – Thư Viện, Đại học Y Dược Thành
phố Hồ Chí Minh cung cấp. Ethanol (EtOH) đạt
tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức). Acetonitril
(Scharlau, Tây Ban Nha) và nước cất 2 lần đạt
tiêu chuẩn dùng cho HPLC.
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo
Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo sử dụng
máy HPLC Azura (Knauer, Đức), detector UVD
2,1L (Đức), cột sắc ký Thermo Syncronis RP18
(250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột HQ 105 C18
(10×4,6 mm; 5 µm) (Thermo Scientific, Mỹ), nhiệt
độ 30oC, bước sóng phát hiện 258 nm, thể tích
tiêm mẫu 20 µl. Thăm dò một số chương trình
pha động gồm: 3 chương trình gradient sử dụng
hỗn hợp acetonitril - nước làm dung môi. Chọn


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
điều kiện HPLC sao cho pic sinensetin tách khỏi
các pic tạp và các thông số sắc ký đạt yêu cầu.
Quy trình định lượng

Nghiên cứu Y học

a (%): Hàm lượng của sinensetin chuẩn.
Thẩm định quy trình định lượng sinensetin
trong cao khô sấy phun Râu mèo

Mẫu thử
Cân chính xác khoảng 263 mg cao khô sấy
phun Râu mèo, cho vào bình định mức 5 ml,
thêm khoảng 3 ml EtOH 30%, siêu âm trong 15
phút, để nguội, bổ sung EtOH 30% đến vạch, lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,2 µm.

Thẩm định quy trình định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo
theo hướng dẫn của ICH(3) về tính tương thích
hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ
chính xác và độ đúng.

Mẫu chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng
1,9 mg chuẩn sinensetin cho vào bình định mức
10 ml, thêm 3 ml ethanol, siêu âm trong 15 phút,
để nguội rồi thêm ethanol đến vạch, lắc đều.

Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo

Dung dịch chuẩn (nồng độ sinensetin
khoảng 13,6 µg/ml): Cho chính xác 360 µl
dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 5 ml,
thêm ethanol đến vạch, lắc đều và lọc qua

màng lọc 0,2 µm.

Bảng 1. Các điều kiện pha động HPLC định lượng
sinensetin

Điều kiện HPLC
Hệ thống HPLC: Knauer Azura đầu dò UV
D 2.1L (Đức).
Cột sắc ký: Thermo Syncronis RP18 (250 x 4,6
mm; 5 µm).
Bước sóng phát hiện: UV 258 nm.
Chương trình pha động: Dựa trên kết quả
khảo sát điều kiện.
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Nhiệt độ cột 30oC.
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.
Hàm lượng sinensetin (X, µg/g) trong cao
khô sấy phun Râu mèo được tính theo công thức:

St, Sc: Diện tích pic sinensetin của mẫu thử và
mẫu chuẩn.
C: Nồng độ dung dịch sinensetin chuẩn
(µg/ml).
mt: Khối lượng cân của cao khô sấy phun
Râu mèo.

KẾT QUẢ

Khảo sát các điều kiện pha động với các tỷ lệ
dung môi acetonitril – nước khác nhau trình bày

trong Bảng 1.

Chương trình
I
II
III

Thời gian
(phút)
0 – 15
16 – 25
0 – 20
21 – 30
0 – 20
21 – 30

Tỷ lệ dung môi pha động
CH3CN-H2O (tt/tt)
50:50
65:35
46:54
65:35
42-58
65:35

Kết quả khảo sát các điều kiện pha động
được trình bày trong Hình 2. Chọn điều kiện pha
động III để thẩm định quy trình định lượng.
Thẩm định quy trình định lượng sinensetin
trong cao sấy phun Râu mèo


Tính tương thích hệ thống
Bảng 2. Tính tương thích hệ thống của phương pháp
HPLC định lượng sinensetin trong mẫu thử (n=6)
STT
1
2
3
4
5
6
TB
SD
%RSD

tR (phút) S (mAU.s)
As
Rs
14,7
790,2
1,12
3,5
14,8
786,0
1,10
3,7
14,7
792,5
1,08
3,5

14,7
778,3
1,08
3,3
14,6
800,3
1,12
3,5
14,7
793,9
1,03
3,6
14,7
790,2
1,09
3,5
0,063
7,487
0,8 ≤ As≤ Rs ≥
1,2
1,5
0,39%
0,60%

N
60387
58392
59983
60377
61837

57268
59707
-

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
của phương pháp HPLC định lượng sinensetin

125


Nghiên cứu Y học
cao khô sấy phun Râu mèo theo điều kiện sắc ký
pha động III được trình bày trong Bảng 2.
Thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) của pic
sinensetin đều nhỏ hơn 2%.
Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,2.
Độ phân giải lớn hơn 1,5.
Vì vậy, phương pháp HPLC định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt
tính tương thích hệ thống.

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu khảo sát tính đặc hiệu
gồm: Mẫu trắng (EtOH 30%), mẫu chuẩn (như
trên), mẫu thử (như trên), mẫu thử thêm chuẩn
(thêm sinensetin chuẩn vào dung dịch mẫu thử).
Tiến hành: Sắc ký các mẫu trên theo phương
pháp HPLC đã chọn, kết quả được trình bày
trong Hình 3.


Hình 2. Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với các điều kiện pha động khác nhau

Hình 3. Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun
Râu mèo: (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, (c) mẫu thử và (d) mẫu thử thêm chuẩn

126


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
Mẫu trắng (Hình 3a) không cho pic trùng với
thời gian lưu của sinensetin trong mẫu chuẩn
(Hình 3b) và mẫu thử (Hình 3c).
Sắc ký đồ mẫu thử (Hình 3c) cho pic có thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của
sinensetin trong mẫu chuẩn (Hình 3b). Pic
sinensetin tách hoàn toàn các pic khác trong mẫu
chuẩn (Hình 3b) và mẫu thử (Hình 3c).
Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn (Hình 3d) có
chiều cao và diện tích pic sinensetin tăng lên so
với mẫu thử (Hình 3c).

Nghiên cứu Y học
Kết quả xử lý thống kê cho thấy giá trị F thực
nghiệm lớn hơn giá trị F0,05 nên phương trình hồi
quy tương thích. Giá trị t của hệ số B lớn hơn t0,05
nên hệ số B có ý nghĩa. Giá trị t của hệ số B0 nhỏ
hơn t0,05 nên hệ số B0 không có ý nghĩa. Vậy,
phương trình hồi quy tuyến tính là: ŷ = 50,53x
với (R2 = 0,9988).

Bảng 3. Kết quả xử lý thống kê khảo sát tính tuyến
tính của phương pháp HPLC định sinensetin trong
cao khô sấy phun Râu mèo
2

R
Phương trình hồi quy ŷ = Bx + B0
Hệ số B
Giá trị t của hệ số B
Hệ số B0
Giá trị t của hệ số B0
Giá trị F
Giá trị F0,05
Giá trị t0,05
Khoảng nồng độ khảo sát (μg/ml)

Phổ UV – Vis tại thời gian lưu của sinensetin
trong mẫu thử trùng với phổ UV – Vis tại thời
gian lưu của pic tương ứng trong mẫu chuẩn
(Hình 4).

0,9988
ŷ = 50,535x
50,535
57,21
0,1236
0,0034
3273,9
7,71
2,74

3,22 – 66,40

Hình 4. Phổ UV – Vis của (a) sinensetin chuẩn và (b)
sinensetin trong mẫu thử
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic
với đầu dò PDA trên hệ thống HPLC Water cho
thấy pic sinensetin trong mẫu chuẩn và mẫu thử
đạt yêu cầu về độ tinh khiết pic.
Vậy, phương pháp HPLC định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo đạt
tính đặc hiệu.

Tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương
pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô
sấy phun Râu mèo được trình bày trong Hình 5.
Kết quả khảo sát tính tuyến tính của
sinensetin được xử lý bằng phần mềm Ms –
Excel 2010 và các trắc nghiệm thống kê cho thấy
có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh
và nồng độ sinensetin. Kết quả xử lý thống kê
được trình bày trong Bảng 3.

Hình 5. Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
sinensetin (n=6)

Độ chính xác
Bảng 4. Độ lặp lại và độ lặp lại trung gian của
phương pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao
khô sấy phun Râu mèo

Hàm lượng sinensetin (μg/g)
Giá trị thống kê 3 ngày
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
1 297,26 294,49 295,36
2 289,85 286,62 294,79
3 295,97 298,02 300,00
4 301,67 296,31 293,21
TB: 296,88 (μg/g)
5 300,19 302,09 304,12
SD: 4,49
RSD: 1,51%
6 294,49 297,03 302,42
TB 296,57 295,76 296,12
SD
4,23
5,15
4,49
RSD 1,43%
1,74%
1,51%
STT

127


Nghiên cứu Y học
Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ lặp lại trung
gian của phương pháp HPLC định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo
được trình bày trong Bảng 4.

RSD % ứng với độ lặp lại và độ lặp lại trung
gian của sinensetin đều dưới 2%. Vậy, phương
pháp HPLC định lượng sinensetin trong cao khô

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu về độ lặp lại và
độ lặp lại trung gian.

Độ đúng
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
HPLC định lượng sinensetin trong cao khô sấy
phun Râu mèo được trình bày trong Bảng 5.

Bảng 5. Độ đúng của phương pháp định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo (n=9)
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Tỉ lệ chuẩn
thêm vào (%)
80

100


120

Lượng sinensetin
Lượng
Lượng sinensetin
trong mẫu thử
sinensetin tìm
chuẩn cho vào (μg)
(μg)
thấy (μg)
78,20
62,48
61,60
78,80
62,48
62,30
76,15
62,48
60,75
78,25
78,10
78,80
77,25
78,10
79,35
76,20
78,10
80,00
78,35

93,72
89,95
76,70
93,72
90,65
77,45
93,72
92,15
TB

Tỉ lệ hồi
phục (%)

Tỉ lệ hồi phục
trung bình (%)

%RSD

98,51

1,26

101,64

0,76

97,01

1,24


99,05

1,08

98,59
99,71
97,23
100,90
101,60
102,43
95,98
96,72
98,32

BÀN LUẬN

KẾT LUẬN

Trong thử nghiệm khảo sát điều kiện
HPLC định lượng sinensetin trong cao sấy
phun Râu mèo, các điều kiện I và II, pic
sinensetin dính với các tạp phân cực, không
đạt độ tinh khiết pic. Ở điều kiện III, pic
sinensetin tách hoàn toàn với các tạp khác, các
thông số của pic đạt yêu cầu. Do vậy, điều
kiện III được chọn để tiến hành định lượng
sinensetin trong cao sấy phun Râu mèo.

Phương pháp HPLC định lượng sinensetin
trong cao khô sấy phun Râu mèo đã được thẩm

định các tiêu chí theo hướng dẫn của ICH. Kết
quả thẩm định đạt các yêu cầu về tính tương
thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ
chính xác cao (RSD% độ lặp lại trung gian là
1,51%), độ đúng với độ phục hồi trong khoảng
95,98% - 102,43%. Vì vậy, phương pháp này có
thể được ứng dụng để định lượng sinensetin
trong mẫu cao sấy phun Râu mèo, hướng tới tiêu
chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng cao.

Theo yêu cầu của ICH, phương pháp HPLC
định lượng sinensetin ứng với nồng độ khảo sát
đạt yêu cầu khi độ phục hồi trong khoảng 90 107%(3) và % RSD ≤ 5,3%. Kết quả thẩm định cho
thấy, phương pháp kiểm nghiệm đạt yêu cầu về
độ đúng.
Như vậy, phương pháp HPLC định lượng
sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo
đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ
chính xác và độ đúng và có thể ứng dụng để
định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun
Râu mèo.

128

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.

Bristish Pharmacopoeia Commisssion (2016). Bristish

Pharmacopoeia 2016. The Stationery Office, pp. 237-238.
Đỗ Huy Bích (2006). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập II. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr. 623-625.
International Conference on Hamonization (1997). “Guideline
on Validation of Analytical Procedures: Methodology”. Fed.
Regist; 62:27464-27467.

Ngày nhận bài báo:

25/04/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

20/06/2018

Ngày bài báo được đăng:

20/09/2018