----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TỔNG QUAN CƠ CHẾ PHÁT HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ
FLUOROQUINOLON TRONG DƯỢC PHẨM

NGƯỜI THỰC HIỆN: KIM THỊ THU HÀ
GV HƯƠNG DẪN: ThS. NGUYỄN THỊ MINH DIỆP

Việt Trì, ngày 30 tháng 5 năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Xuất phát từ một vai trò của một sinh viên ngành dược trường cao đẳng y-dược
Phú Thọ cùng với sự ham học hỏi, muốn tìm hiểu về lĩnh vực phân tích dược phẩm
bằng phương pháp phổ huỳnh quang, em đã chọn đề tài “Tổng quan cơ chế phát
huỳnh quang - ứng dụng để định lượng kháng sinh họ fluoroquinolon trong dược
phẩm” để làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Minh Diệp bộ môn hóa-lý đã hết
lòng hướng dẫn em trong suốt quá trình tìm hiểu và hoàn thành khóa luận. Đồng
thời em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa lý và các bạn sinh viên khóa
CD8 đã giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Với sự hiểu biết có hạn, khóa luận
khó tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý kiến của các thầy
cô, các anh chị, các bạn cùng với những người quan tâm để nội dung khóa luận
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên

Kim Thị Thu Hà

MỤC LỤC
I. MỞ ĐẦU................................................................................................................3
II. TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT QUANG. 3
II.1. Các khái niệm cơ bản......................................................................................3
II.2. Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích. Giản đồ Jablonski.................3
II.2.1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử....................................................3
II.2.2. Giản đồ Jablonski.....................................................................................3
II.3. Bản chất của phản ứng quang hóa...................................................................3
II.3.1. Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa................................................3
II.3.2. Các thông số của phản ứng quang hóa.....................................................3
II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang.................................................3
II.4. Phương pháp phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian
.................................................................................................................................3
II.4.1. Mối quan hệ giữa phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo
thời gian...............................................................................................................3
II.4.2. Phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved
fluorescence)........................................................................................................3
II.4.3. Phương pháp định lượng trên cơ sở phản ứng hóa phát quang...............3
III. ỨNG DỤNG HIỆU ỨNG PHÁT HUỲNH QUANG TRONG PHÂN TÍCH
ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONES...............................3
III.1. Tính chất quang của một số chất chất kháng sinh họ fluoroquinolones........3
III.1.1. Tính chất quang của một số kháng sinh họ flouroquinolones thế hệ 2....3
III.1.1.1-Công thức cấu tạo.................................................................................3
III.1.1.2- Tính chất quang....................................................................................3
III.1.2. Một nghiên cứu khác về tính chất quang của kháng sinh họ
flouroquinolone thế hệ 3 và 4..............................................................................3
III.2. Phân tích định lượng trên cơ sở phản ứng quang hóa....................................3


IV. KẾT LUẬN..........................................................................................................3

TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................3

DANH MỤC H
Hình 2- 1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử....................................................3
Hình 2- 2. Giản đồ năng lượng Jablonski..................................................................3
Hình 2- 3. Hiện tượng huỳnh quang trễ.....................................................................3
Hình 2- 4. Sự hấp thụ ánh sáng trong lớp mỏng........................................................3
Hình 2- 5. So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian3
Hình 2- 6. Biểu diễn Stern-Volumer...........................................................................3
Hình 2- 7. Các bước cơ bản của quá trình định lượng bằng phát quang hóa học...3
Hình 2- 8. Biêu diễn Stern-Volumer, sự phụ thuộc của tỷ lệ cường độ phát quang
(hoặc lifetime) và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang trong hai trường hợp tắt
huỳnh quang động và tắt huỳnh quang tĩnh ..............................................................3
YYHình

3-

1.

Cấu

trúc

chung

của

quinolone

và


fluoroquinolone………………………... 3
Hình 3- 2. Công thức cấu tạo của (a) Norfloxacin; (b) Ciprofloxacin; (c) fleroxacin
....................................................................................................................................3
Hình 3- 3. Phổ hấp thụ của một số FQs tiêu biểu, trong đệm phosphat tại nồng độ
5.10-3 M, pH 7.4, 20oC,...............................................................................................3
Hình 3- 4. Phổ hấp thụ của CIP tại các nồng độ khác nhau của HCl 1-10M,
C=5.10-5M..................................................................................................................3
Hình 3- 5. Phổ huỳnh quang ở nhiệt độ phòng của norfloxacin tại pH 1.2 (1); 3.4
(2); 7.4 (3) và 10.8 (4) ...............................................................................................3
Hình 3- 6. Hiệu suất huỳnh quang Φ và thời gian sống huỳnh quang τ của
Norfloxacin.................................................................................................................3


Hình 3- 7. Phổ phân giải theo thời gian của CIP 10-5M, HCl 1M.............................3
Hình 3- 8. Phổ hấp thụ của MOX (a) và LEV (b) trong ─ACN, -- H2O, …PBS.......3
Hình 3- 9. Phổ huỳnh quang của MOX (a), LEV (b) trongdung môi ─ACN,
--H2O,..PBS................................................................................................................3
Hình 3- 10. Phổ hấp thụ phân giải theo thời gian của (a) MOX và (b) LEV trong
đệm PBS.....................................................................................................................3
Hình 3- 11. Phổ huỳnh quang của 4-FQ trước và sau khi tạo phức với axit
Cloranilic...................................................................................................................3
Hình 3- 12. Cơ chế dịch chuyển điện tử và sự hình thành phức của axit cloranilic
với 4-FQs tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR....................................3
Hình 3- 13. Phổ kích thích và phát xạ của LEV (1µg/ml) (A) trong dung dịch chưa
tạo mixen (B) trong dung dịch tạo mixen với SDS 8mM............................................3
Hình 3- 14. Phổ phát xạ (a), phổ kích thích (b) của Eu 3+–MOX–SDBS. (1)Eu3+;
(2)MOX; (3)Eu3+–MOX; (4)Eu3+–MOX–SDBS, pH 9.2.............................................3

DANH MỤC BẢNG



Bảng 3. 1. Đặc tính quang của FQ ở dạng trung hòa và dạng proton hóa, CFQ =
5.10-5M.......................................................................................................................3
Bảng 3. 2. Tính chất huỳnh quang của MOX và LEV trong các dung môi................3
Bảng 3. 3. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên.................3
Bảng 3. 4. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên.................3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11

Chữ viết tắt

Tiếng anh

FQs


Fluoroquinolones

UV-Vis

Ultraviolet – visible

Tia tử ngoại – khả kiến

Nor

Norfloxacin

Norfloxacin

CIP

Ciprofloxacin

Ciprofloxacin

FLE

Fleroxacin

Fleroxacin

LEV

Levofloxacin


Levofloxacin

MOX

Moxifloxacin

Moxifloxacin

PBS

-

Đệm muối phosphat

ACN

Acetonitril

Acetonitril

CL

Cloranilic

Cloranilic

7,7,8,8,TCNQ

tetracyanoquino

dimetan

12
13
14
15

SDS

Sodium dodecyl sulfat

Tiếng việt
Kháng sinh họ
fluoroquinolone

7,7,8,8,- tetracyanoquino
dimetan
Sodium (natri)dodecyl

Sodium dodecyl benzen

sulfat
Sodium (natri) dodecyl

sulfat

benzen sulfat

LOD


Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Lilit of quantitation

Giới hạn định lượng

SDBS


16

High Performance
HPLC

Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
17
18
19
20
21
22
23

24
25
26
27
28
29
30

Q

Quencher

Chất làm tắt huỳnh quang

IR

Infra red

Tia hồng ngoại

F

Fluorescence

Huỳnh quang

P

Phosphorescence


Lân quang

VR

Relaxation of vibration

Sự phục hồi do dao động

A

Adsorption

Hấp thụ

IC

Internal conversion

Chuyển hóa nội phân tử

Internal and external

Chuyển hóa nội và ngoại

conversion

phân tử- dưới dạng nhiệt

ISC


Intersystem crossing

Kết hợp nội phân tử

DF

delay phosphorescence

Huỳnh quang trễ

S

singlet

Trạng thái đơn bội

T

Tripllet

Trạng thái tam bội

ADN

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxy ribonucleic

VN


-

Viên nén

IEC


31
32

NT

-

Nước tiểu

HT

-

Huyết thanh


I. MỞ ĐẦU
Fluoroquinolones (FQs) là một trong những loại thuốc kháng sinh phổ rộng,
có hiệu quả điều trị cao, thuốc được dung nạp tốt và tác dụng phụ tương đối hạn
chế.FQs có các nhóm thế hoạt động, chứa nguyên tử oxy và ni tơ, chúng được biết
đến là yếu tố cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của thuốc. Tuy nhiên, có những
cải tiến về mặt cấu trúc chỉ ra rằng quinolone khi bổ sung các nhóm thế sẽ có hoạt
tính kháng khuẩn và sinh khả dụng tốt hơn[1][2], vì vậy dựa vào cấu trúc và các

nhóm thế mà cho tới thời điểm hiện tại FQs đã được nghiên cứu và phân loại đến
thế hệ thứ 4 với nhiều loại thuốc khác nhau phù hợp cho từng đối tượng. Đối với
các FQs trong dược phẩm,một trong số các yêu cầu nghiêm ngặt đó là cần phải
đúng công thức về hàm lượng như đã ghi trên nhãn của nhà sản xuất, đối với thuốc
đã được sử dụng điều trị thì cần phải biết được quá trình chuyển hóa, thải trừ, sinh
khả dụng…, hoặc cần phải định lượng chính xác trong giai đoạn nghiên cứu điều
chế thuốc mới. Do đó việc nghiên cứu phương pháp định lượng FQs trong thuốc và
trong dịch sinh học (nước tiểu, huyết tương, huyết thanh…) đã được các nhà phân
tích trong và ngoài nước nghiên cứu từ rất lâu. Có rất nhiều phương pháp định
lượng FQs được nghiên cứu thành công, trong đó có phương pháp phát quang, đó
là phương pháp định lượng chất phân tích dựa trên cường độ ánh sáng phát xạ.
Trong đó có thể là phương pháp phổ huỳnh quang, phản ứng hóa phát quang hoặc
phản ứng quang hóa… Không chỉ là những nghiên cứu định lượng thông thường
mà các nhà phân tích còn quan tâm tới tính chất quang, cơ chế phản ứng, cơ chế
phát quang, để hiểu được bản chất và có những cải tiến cho phương pháp để có
được kết quả chính xác, dễ thực hiện và giảm chi phí. Trong chuyên đề này chúng
tôi tìm hiểu cơ bản về cơ chế phát huỳnh quang nói chung trong các phương pháp
phân tích bằng huỳnh quang. Chủ yếu là trong phản ứng quang hóavà ứng dụng cơ
chế này vào định lượng FQs trong dược phẩm và dịch sinh học, dựa trên các
nghiên cứu đã được công nhận. Về cơ bản thì sự phát huỳnh quang phụ thuộc vào
1


cấu trúc của FQs, dung môi và pH của dung dịch.Dựa vào các yếu tố đó có thể khắc
phục các sai khác trong quá trình định lượng.
II. TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT
QUANG
II.1. Các khái niệm cơ bản
Quang hóa học(photochemistry)là lĩnh vực nghiên cứu: phản ứng hóa học dưới tác
dụng của tia bức xạ thuộc vùng tử ngoại xa đến hồng ngoại; và hiệu ứng phát xạ

của phản ứng hóa học.
Phản ứng quang hóa (photochemical reaction):là phản ứng hóa học xảy ra do hấp
thụ tia bức xạ tử ngoại (UV) hoặc nhìn thấy (VIS) hoặc hồng ngoại (IR)[3][4].
Cơ chế phát quang:hiện tượng phát quangbao gồm
- Phát quang âm cực
- Phát quang nhiệt
- Quang phát quang

- Phát quang hóa học
- Phát quang sinh học
- Phát quang điện và phát quang ma sát

- Nếu phân tử được kích thích bằng tia bức xạ (UV, VIS, IR) mà phát sáng thì sự
phát quang đó gọi là quang phát quang (photoluminescence).
- Nếu năng lượng của một phản ứng được phát ra dưới dạng ánh sáng thì sự phát
quang đó gọi là hóa phát quang (chemiluminescence).
…
Mọi dạng phát sáng trên đều giống nhau về bản chất được gọi chung là phát quang
(luminescence)[5][6].
II.2. Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích. Giản đồ Jablonski
II.2.1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử
Khi nhận năng lượng, một electron ở orbital liên kết hoặc không liên kết có thể
chuyển lên các orbital phản liên kết còn trống ở mức năng lượng cao hơn. Khi đó
xảy ra các bước chuyển điện tử sau:
- Bước chuyển mức N → V
- Bước chuyển mức N →Q
2


- Bước chuyển mức N →R


Hình 2- 1.Các bước chuyển điện tử trong phân tử
II.2.2. Giản đồ Jablonski

Hình 2- 2.Giản đồ năng lượng Jablonski
So : trạng thái cơ bản
S1 : trạng thái kích thích có độ bội đơn
3


T1 : trạng thái kích thích có độ bội 3
A: hấp thu (adsorption)
F: huỳnh quang (fluorescence)
P: lân quang (phosphorescence)
→ Quá trình phát xạ
~~–> Quá trình không phát bức xạ
SR(VR) Relaxation of vibration – Hồi phục do dao động
Khi phân tử hấp thụ năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang
(photon). Ở trạng thái cơ bản So, phân tử hấp thụ năng lượng từ môi trường bên
ngoài và chuyển thành năng lượng của các electron, nhận năng lượng, các electron
này sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn, gọi là trạng thái kích thích S *, đây là
một trạng thái không bền, do đó electron sẽ mau chóng nhường năng lượng dưới
dạng nhiệt để về trạng thái kích thích nhưng năng lượng thấp hơn S o*, thời gian tồn
tại của electron giữa mức năng lượng So→So* vào khoảng 10-9 đến 10-12 giây, sau
khi về trạng thái kích thích So*, electron lại một lần nữa phát năng lượng dưới dạng
photon để về mức thấp hơn, hiện tượng này gọi là huỳnh quang phân tử. Cùng là
hiện tượng này còn có hiện tượng lân quang (phosphorescence) và huỳnh quang trễ
(delay phosphorescence), hình vẽ 2-4.

Hình 2- 3.Hiện tượng huỳnh quang trễ


4


Các quá trình giải tỏa năng lượng phân tử
Quátrình hấp thụ năng lượng (A): Khi hấp thu sóng điện từ, phân tử bị kích thích
điện tử chuyển từ trạng thái So → S1 hoặc S2, t= 10-16 - 10-15giây (femo giây)
Trạng thái này không bền, electron có xu hướng giải tỏa năng lượng đã hấp
thu để trở về trạng thái có năng lượng thấp, bền vững hơn. Sự giải tỏa năng lượng
có thể thực hiện theo nhiều cách tùy thuộc vào cấu trúc phân tử. Quá trình làm
mất hoạt tính năng lượng ở trạng thái kích thích có thể không kèm theo sự phát
proton hν.
- IC (chuyển hóa mội phân tử)–năng lượng cho quá trình chuyển vị nội phân tử (S 2
→S1)
- VR (sự phục hồi do dao động) – mất năng lượng do dao động và do sự quay (S1
(v’)→ S1(0); T1 (v’) → T1 (0)).
- IEC (sự chuyển hóa dưới dạng nhiệt) – chuyển năng lượng cho các phần tử
xung quanh (dung môi) dưới dạng nhiệt.
- ISC (kết hợp nội phân tử)– chuyển năng lượng giữa các mức có độ bội khác nhau
(S1 (v’= 0) →T1 (v’=1,2,3…), khi thỏa mãn 2 điều kiện:
- Nếu trong phân tử đường cong thế năng S 1 và T1cắt nhau, khi ΔE =ES1 - ET1

<10kcal

- Mức dao động v’= 0 của S1 bằng với v’cao của T1.
- F (phát xạ huỳnh quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển S 1
(v’= 0) →So (v=0,1,2…), thời gian thực hiện bước chuyển 10-9 -10-6 s.
- P (phát xạ lân quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển T 1 (v’= 0) → So
(v=0,1,2,3…); thời gian thực hiện bước chuyển 10-4 -10-2 .
- DF (huỳnh quang trễ): do trước khi bức xạ photon, phân tử ở trạng thái triplet

một thời gian, sau đó trở về trạng thái So.

5


II.3. Bản chất của phản ứng quang hóa
II.3.1. Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa
Các định luật quang hóa: phản ứng quang hóa chỉ xảy ra theo các định luật sau đây
1- Định luật Grotthuss và Draper: Chỉ ánh sáng bị hệ hấp thụ mới có khả năng
gây ra phản ứng, nói cách khác, phản ứng quang hóa chỉ có khả năng xảy ra
nếu phân tử bị hấp thụ ánh sáng.
2- Định luật Einstein: Một photon hay lượng tử ánh sáng bị hấp thụ chỉ có khả
năng kích thích một phân tử trong giai đoạn sơ cấp, định luật này còn gọi là
định luật đương lượng quang hóa.
3- Quy luật do Kashe tổng kết: Khi hấp thụ photon, phân tử có xác xuất nhất
định bị kích thích lên trạng thái singlet thấp nhất S 1 hoặc triplet thấp nhất T 1.
Trong phần lớn phản ứng quang hóa hữu có trong dung dịch phân tử bị kích
thích lên trạng thái S1 hoặc T1. Quy luật này do Kasha tổng kết từ thực
nghiệm chủ yếu đối với các phản ứng quang hóa hữu cơ.
4- Đinh luật Lambert – Beer về sự hấp thụ ánh sáng: giả thiết có một luồng ánh
sáng đơn sắc có cường độ Io ec/cm2.s đi qua một dung dịch có tiết diện 1cm2.

Hình 2- 4.Sự hấp thụ ánh sángtrong lớp mỏng
Giả thiết ở độ sâu l, cường độ ánh sáng là I, khi đi qua lớp mỏng δl cường độ giảm
đi δI. Gọi n là số phân tử chất hấp thụ ánh sáng trong 1cm 3. Như vậy số phân tử
trong lớp mỏng δl là δn và δn = nδl. Vì số photon bị hấp thụ tỉ lệ với số phân tử hấp
thụ ánh sáng nên có thể viết = kδn = knδl

(2.1)


6


Trong đó k là hệ số tỉ lệ.phương trình (II.1) là biểu thức toán học của định luật
lambert Beer. Lấy tích phân (2.1) và chú ý đến điều kiện đầu I = Io, khi Io = 0
ta được ln= -knl (2.2) hoặc = e-knl (2.3). Tỉ số T = gọi là độ truyền quang,
-logT = A gọi là độ hấp thụ (trước đây gọi là mật độ quang).
Trong các biểu thức trên, n là nồng độ tính bằng phân tử/cm 3. Nống độ tính bằng
mol/l và ký hiệu C, ta có: kn = ɛC (2.4)
Nghĩa là = = 6.1020
Khi đó biểu thức (2.3) trở thành = e-ɛCl (2.5)
k: hệ số hấp thụ phân tử
ɛ: hệ số tắt hay hệ số hấp thụ
Theo định luật Lambert Beer thì tỉ sô δI/I không phụ thuộc vào cường độ I
của ánh sáng. Điều này chỉ đúng với sự chiếu sáng thông thường, nếu ánh sáng có
cường độ rất lớn thì định luật này bị vi phạm.
Phản ứng quang hóa bao gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn hấp thụ photon: trong đó phân tử chuyển từ trạng thái cơ bản
sang trạng thái kích thích electron.
+ Giai đoạn quang hóa sơ cấp: trong đó các phân tử bị kích thích tham gia
trực tiếp vào phản ứng.
+ Giai đoạn quang hóa thứ cấp: còn gọi là giai đoạn phản ứng tối hoặc phản
ứng nhiệt, trong đó có các sản phẩm của giai đoạn sơ cấp tham gia phản ứng.
II.3.2. Các thông số của phản ứng quang hóa
1-Cường độ huỳnh quang: Khi chiếu một chùm tia tử ngoại (bức xạ kích thích) vào
một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định tùy thuộc
từng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chúng[6].
2- Hiệu suất phát quang: đánh giá sự biến đổi hiệu dụng giữa E ex sang Eem. Có 2
loại hiệu suất phát quang:
7



Hiệu suất năng lượng (ΦNL: là tỉ số năng lượng huỳnh quang của chất khảo
sát Eem và năng lượng ánh sáng kích thích Eex.
ФNL = ≤1

(2.6)

Hiệu suất lượng tử (ΦLT ): là tỉ số giữa số lượng tử huỳnh quang Nem và số
lượng tử ánh sáng kích thích (hấp thu).
ФLT = ≤1

(2.7)

3- Thời gian sống huỳnh quang (lifetime)τ0 hay thời gian của trạng thái kích thích là
τ0 =

thời gian cần thiết để số phân tử kích thích ban đầu giảm e lần[7].

1
�k i
i

Trong đó ki là hằng số tốc độ của quá trình giải hoạt i ( bức xạ hoặc phi bức xạ).
4- Nồng độ mol/l các chấtở các trạng thái tương ứng [S1], [T1]…
II.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang
1-Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang
Cấu tạo phân tử:
- Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang. Càng nhiều dây nối
đôi liên hợp thì khả năng phát quang càng cao. Ví dụ: Các chất vô cơ hay các chất

hydrocacbon no hầu như không phát quang. Các hợp chất thơm có khả năng phát
quang và càng nhiều vòng thơm ngưng tụ thì hiệu suất huỳnh quang càng lớn.
- Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang.
Ví dụ: -OH, -OCH3..
- Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang.
Ví dụ: -NO2, -COOH, -CHO,......
- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc làm giảm hiệu suất
huỳnh quang. Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên
8


nhân thơm, cũng làm tăng hiệu suất huỳnh quang. Ngược lại vị trí meta thì làm
giảm hiệu suất huỳnh quang.
- Đồng phân cis làm tăng khả năng phát quang và đồng phân trans làm giảm khả
năng phát quang của hợp chất.
 Độ cứng nhắc của phân tử.Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát
quang
cao và ngược lại. Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh
Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang
 Chất tạo dẫn: Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo
dẫn
chất thì phát quang mạnh.
Ví dụ:Không phát quang Phát quang mạnh
Tetracyclin Tetracyclin + Ca2++ Barbiturat
Hydrocortison Hydrocortison + H2SO4+ ethanol
Vitamin B1 Thiocrom
Adrenalin Adrenochrom
2-Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang
Sự có mặt của các chất tan khác nhau: Có thể gây ra hiện tượng sau:
- Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác nhau có thể không phát quang nhưng lại hấp thụ

ánh sáng của chất phát quang làm giảm cường độ huỳnh quang.
- Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cường độ phát
quang do va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học của chất phát quang.
Cơ chế: F + hνF*
F* →F + hν

9


Trong đó F là chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang ( F*). Do va chạm
nên:
F* + Q  F + Q *
Khi đó Q đóng vai trò là chất làm tắt huỳnh quang (quencher).
Ví dụ: Cl- là Q của Quinin cho nên trong môi trường HCl thì Quinin không phát
quang. ADN là Q của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng
Acridin trong định lượng.
Nồng độ ion H+, vai trò của pH:
pH có ảnh hưởng lớn đến cường độ phát quang. Một số chất có tính axit yếu
hay bazơ yếu thì cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH. Ví dụ: Ta có axit
AH, trong nước AH phân ly theo phương trình: AH  A- +H+
Nếu dạng phát quang là AH thì khi H+ tăng, phản ứng xảy ra theo chiều nghịch, khi
đó

F

tăng. Nếu dạng phát quang là A- thì F sẽ giảm trong môi trường axit và tăng trong
môi
trường kiềm.

 Ảnh hưởng của dung môi:

Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và những tác
động
khác nhau. Ví dụ:
- Sự tắt huỳnh quang do dung môi: Quininsulfat phát quang mạnh trong môi
trườngH2SO4, nhưng không phát quang trong môi trường HCl.
- Oxi hòa tan trong dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang, do đó oxi có
ảnh hưởng đến cường độ phát quang.
- Độ nhớt làm tăng cường độ phát quang.
10


- Độ tinh khiết của dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch kết quả
của phép đo.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ tăng làm giảm cường độ phát quang do
làm tăng tần số va chạm của phân tử làm cho hiện tượng bất hoạt tăng lên. Do vậy
trong máy quang phổ huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kính
cách nhiệt hoặc có bộ phận làm mát đèn.
 Ánh sáng kích thích: Khi λex ngắn (ánh sáng kích thích có năng lượng lớn)
phân tử chất huỳnh quang có thể bị phân li, điển hình như:
- Liên kết C – C có thể đứt khi sử dụng λex ~ 200nm;
- Liên kết C – N có thể đứt khi sử dụng λex ~ 250nm
Trong phổ huỳnh quang thường λex ≥ 250nm.
 Ảnh hưởng của oxi: do sự che phủ của vân phổ huỳnh quang và vân phổ hấp
thụ mặc dù không có và chạm đàn hồi.
II.4. Phương pháp phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời
gian
II.4.1. Mối quan hệ giữa phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo
thời gian
Phương pháp đo huỳnh quang có hai loại, một là đo huỳnh quang tĩnh hay

huỳnh quang ở trạng thái dừng và phương pháp đo huỳnh quang phân giải theo thời
gian. Mẫu được chiếu tia bức xạ liên tục sau đó cường độ và phổ phát xạ được ghi
lại như hình vẽ 2-5bằng thang đo thời gian ns ở trạng thái dừng, khi mẫu đầu tiên
được chiếu sáng, trạng thái dừng gần như đạt được tức thì. Thứ 2 là đo huỳnh
quang phân giải theo thời gian, sử dụng phép đo cường độ phân giải hoặc dị hướng
phân giải. Mẫu được đặt vào xung ánh sáng, độ rộng của xung ngắn hơn thời gian
phân giải mẫu, hình vẽ 2-5, cường độ phân giải được ghi bằng hệ thống phát hiện
tốc độ cao, cho phép đo cường độ bằng thang thời gian ns. Mối quan hệ giữa trạng
dừng và thời gian phân giải được biểu thị bằng biểu thức:
11


I = I0.e-t/τ(2.8)
Giá trị I0 là thông số phụ thuộc vào nồng độ của chất phát huỳnh quang và một số
thông số của thiết bị đo. Do đó huỳnh quang trạng thái dừng tỷ lệ với thời gian
sống huỳnh quang. Điều này chứng tỏ được hiệu suất huỳnh quang Φ tỷ lệ với τ.
Đo huỳnh quang ở trạng thái tĩnh có thể hiểu rằng đó là thời gian trung bình của
phép đo huỳnh quang phân giải theo thời gian[8].

HÌnh 2- 5.So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian
Phương pháp huỳnh quang tĩnh (steady - state luminescence) là phương pháp đo
cường độ phát xạ tương ứng ở λex/λem thích hợp, khi phân tử đã trở về trạng thái
cơ bản. Do cường độ huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ chất phát huỳnh quang trong
dung dịch, đó là cơ sở để định lượng.
II.4.2. Phươngpháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved
fluorescence)
1) Phức ở trạng thái kích thích phân hủy theo phương trình động học bậc 1:
[P*]t = [P*]oe-t/τ (2.9)
Hay It = Ioe-t/τ(2.10)
Trong đó:

[P*]o.và [P*]t là nồng độ của phức chất ở trạng thái kích thích thời điểm t = 0 và
sau thời gian t.
I0 và It là cường độ phát xạ huỳnh quang của phức chất ở trạng thái kích thích thời
điểm
12


t = 0 và sau thời gian t.
τ: thời gian “sống” (lifetime) của phức ở trạng thái kích thích trong dung dịch
nghiên cứu.
Nếu dung dịch nghiên cứu chỉ có phức chất (phức không tham gia phản ứng hóa
học) thì τ = τ0 và k0 =1/τ0 với k0 được gọi là hằng số tốc độ phân hủy (decay) của
phức chất ở trạng thái kích thích.
2) Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (k q) được xác định theo phương
trình Stern-Volumer [9]:
kq[Q] (2.11)
Trong đó:
và tương ứng là thời gian sống của phức ở trạng thái kích thích trong dung dịch
nghiên cứu không có và có chất phân tích (Q); các giá trị này thu được từ dữ liệu
thực nghiệm ghi phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của phức chất.
[Q]: nồng độ chất phân tích trong dung dịch.
Giá trị kq được tính từ hệ số góc của đường thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa đại
lượng và [Q].

0/- 1

0/- 1

2


1

0

[Q]/M

Hình 2- 6.Biểu diễn Stern-Volumer
13


Từ 1), 2) cho thấy đây là cơ sở của phương pháp định lượng bằng huỳnh quang
phân giải theo thời gian. Một số nghiên cứu đã thành công, định lượng FQ trong
dược phẩm [10], sữa [11], dịch sinh học [12]..
II.4.3. Phương pháp định lượng trên cơ sở phản ứng hóa phát quang
1)-Phản ứng hóa phát quang (chemiluminescence)hay phát quang hóa học là
sự phát sáng từ một phản ứng hóa học khi phân tử có điện tử ở trạng thái kích thích
chuyển về trạng thái cơ bản, thời gian thực hiện bước chuyển 10-9-10-6s.
Khác với phản ứng quang hóa, phát quang hóa học là sự phát xạ ánh sáng từ một
phản ứng hóa học mà không cần nguồn ánh sáng kích thích từ bên ngoài vào. Tuy
nhiên kỹ thuật phân tích huỳnh quang dựa trên cơ sở tương tự nhau.
Hiệu suất lượng tử của quá trình phát quang hóa học ΦCL được định nghĩa là:
ΦCL =
ΦCLphụ thuộc vào điều kiện thực nghiệm đó là tỷ lệ giữa cường độ phát quang hóa
học và sự giảm nồng độ của chất phản ứng, nó được biểu thị bằng biểu thức đại số
[13]:
ΦCL = ICL.

Hình 2- 7. Các bước cơ bản của quá trình định lượng bằng phát quang hóa học
(a) hỗn hợp phản ứng của thuốc thử và chất phân tích, ánh sáng phát xạ được xác
định bởi một dectector, (b) đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang

14


vào thời gian sau hỗn hợp bắt đầu phản ứng hay sự phân giải tín hiệu bởi sự tiêu
thụ của chất phản ứng và sự thay đổi của hiệu suất huỳnh quang vào thời gian, (c)
đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích vào thời gian phản ứng.
2)- Sự tắt huỳnh quang của phản ứng hóa học là sự giảm một phần hay hoàn
toàn hiệu ứng huỳnh quang, bởi sự tương tác hay va chạm của các chất trong phản
ứng. Do đó nếu quan sát thấy hiện tượng tắt huỳnh quang có nghĩa là phản ứng phát
quang hóa học kết thúc. Tắt huỳnh quang có hai loại đó là tắt huỳnh quang tĩnh và
tắt huỳnh quang động. Tắt huỳnh quang tĩnh là sự tương tác của phân tử chất phát
huỳnh quang và chất làm tắt huỳnh quang ở trạng thái cơ bản (trạng thái tĩnh) tạo
thành phức chất không phát huỳnh quang, hiệu suất huỳnh quang này ảnh hưởng
bởi sự hình thành hệ số của phức cũng như bởi nồng độ của chất làm tắt huỳnh
quang, ví dụ như sự tắt huỳnh quang của axit salicylic bởi Cu(II).
Sự tắt huỳnh quang động(hay sự tắt huỳnh quang theo thời gian) là chất làm
tắt huỳnh quang phản ứng với chất phát huỳnh quang trong suốt thời gian “sống” ở
trạng thái kích thích (τq). Hiệu suất tắt huỳnh quang Φ q phụ thuộc vào độ nhớt của
dung dịch, τ0 ở trạng thái kích thích của chất phát quang và nồng độ của chất làm
tắt huỳnh quang.
Công thức Stern-Volumer [13]:

(2.12)

Trong đó kq là hằng số tốc độ của phản ứng giữa chất làm tắt huỳnh quang và chất
phát huỳnh quang; Φ, Φq là hiệu suất huỳnh quang khi không và có nồng độ của
chất làm tắt huỳnh quang, tương ứng.

15



Hình 2- 8. Biêu diễn Stern-Volumer, sự phụ thuộc của tỷ lệ cường độ phát quang
(hoặc lifetime) và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang trong hai trường hợp tắt
huỳnh quang động và tắt huỳnh quang tĩnh [13]
Từ 1) và 2) là cho thấy đây là cơ sở của phép phân tích định lượng bằng kỹ thuật
phát quang hóa học.
Phương pháp hóa phát quang có nhiều ưu điểm so với phương pháp phổ
huỳnh quang: đo trưc tiếp ánh sáng phát ra, không ảnh hưởng bởi hiện tượng tán xạ
của nền, tín hiệu phân tích phân biệt được với tín hiệu phát quang của dung dịch vì
không có nguồn ánh sáng bên ngoài để đưa phân tử lên trạng thái kích thích.
III. ỨNG DỤNG HIỆU ỨNG PHÁT HUỲNH QUANG TRONG PHÂN TÍCH
ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONES
III.1. Tính chất quang của một số chất kháng sinh họ fluoroquinolones
Trong cấu tạo của nhóm quinolone có hai loại cấu trúc vòng: Một là nhân
naphthyridine với nitrogen ở vị trí 1 và 8 (như trong nalidixic acid), và một là nhân
quinoline chỉ có một nitrogen ở vị trí 1 (như trong oxolinic acid) (hình 3-1). Tất cả
các hợp chất, cả quinolone và naphthyridone đều chứa nhóm xeton ở vị trí 4 và bên
cạnh là nhánh carboxylic acid ở vị trí 3.Các dẫn xuất của quinolone là những hợp
chất có gắn thêm nhánh các hợp chất hữu cơ tại vị trí 1, 2, 6, 8 trong nalidixic acid
hoặc oxolinic acid.
16