VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE
PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT
DI TRUYỀN NGƯỢC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học học

Hà Nội, 2019


Luận án được hoàn thành tại
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam, Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án phiên chính thức
Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi:

giờ

phút, ngày

tháng

năm 2019

Có thể tìm đọc Luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trang web của Bộ giáo dục và đào tạo (website: )
- Thư viện của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người và gia cầm, do virus cúm A
subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1
thể độc lực cao (HPAI H5N1) thường gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang
người nên luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng.

Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả là tiêm phòng vaccine.
Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch
cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng virus gốc
tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược có nguồn gốc từ nước ngoài. Sự phụ thuộc vào
chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính
chủ động và gặp nhiều khó khăn. Để chủ động đối phó với những diễn biến phức tạp của
các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần xây dựng và làm chủ qui trình
ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để chủ động tạo ra các chủng virus
vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lưu hành trong nước.
Trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lưu hành ở Việt Nam, clade 1.1
và clade 2.3.2.1c có tính tương đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền với nhiều clade
virus gây dịch ở Việt Nam nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine phòng chống
cúm A/H5N1.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo
chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền
ngược”.
Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng
chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c
gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các
protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen vào plasmid
pHW2000.
2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã được loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí
vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng
A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000.
3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen
khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade
2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và

rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân
lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền.
5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá
HI) của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi.
Đóng góp mới của luận án
1. Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di
truyền ngược để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A . Trong tương
lai, trên cơ sở đã nắm vững qui trình công nghệ tạo chủng virus gốc bằng di truyền


ngược, có thể kiểm soát kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 ở gia cầm bằng ứng dụng
công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus ứng viên cho sản
xuất vaccine có hiệu quả phòng vệ với các biến chủng virus mới xuất hiện.
2. Đã tối ưu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2
plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp.
3. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c) có khả năng thích ứng nhân lên với hiệu suất cao trong trứng
gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền và
kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi
(100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log 2 ở tuần 2 và
tuần 4 sau tiêm phòng).
Cấu trúc luận án
Luận án gồm 150 trang, được chia thành các phần:
- Mở đầu: 4 trang
- Chương 1. Tổng quan tài liệu: 34 trang
- Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 25 trang
- Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang
- Chương 4. Bàn luận kết quả: 14 trang

- Kết luận và kiến nghị: 1 trang
- Các công trình đã công bố của tác giả: 1 trang.
- Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh: 5 trang
- Tài liệu tham khảo: 16 trang
Luận án có 20 bảng số liệu, 36 hình và 172 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt và tài
liệu tiếng Anh.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N1
Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có genome RNA sợi đơn, âm (ss(-)RNA),
gồm 8 phân đoạn genome, trong đó 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa
các protein tạo bộ khung và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên (HA, NA) định vị
trên bề mặt virion.
Nhóm virus cúm A được phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên kháng nguyên
HA (Hemagglutinin) và NA (Neuraminidase) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype
NA (N1 - N11), có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm subtype khác nhau về độc tính và
khả năng gây bệnh. Trong số các subtype virus cúm A, subtype H5N1 đã được chứng minh có
khả năng lây nhiễm từ động vật sang người. Các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1- có thể lây nhiễm nhanh trên nhiều loại gia
cầm, động vật có vú và người với khả năng đột biến cao và tái tổ hợp di truyền lớn.
Protein HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân
(trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2
(27 kDa) nối với nhau bằng một đoạn oligopeptide ngắn giàu các amino acid kiềm arginine
(R) và lysine (K) ở vị trí amino acid 338 – 345/346. Đặc điểm của vị trí giàu các amino acid
kiềm giữa HA1 và HA2 quy định tính độc của virus nên được gọi là “vùng độc”: Ở vị trí
vùng độc, các chủng virus A/H5N1 độc lực cao chứa một nhóm amino acid kiềm, trong khi
các chủng virus A/H5N1 độc lực thấp chỉ chứa 1 amino acid kiềm arginin hoặc lysine
(Suzuki et al., 2005).
Protein NA có hoạt tính enzyme Neuraminidase, xúc tác phản ứng cắt mối liên kết
glycoside giữa thụ thể chứa sialic acid trên bề mặt tế bào chủ và gai glycoprotein trên vỏ



virus, giúp virus xâm nhiễm vào tế bào chủ (Yano et al., 2008; da Silva et al., 2015).
1.2. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 ở gia cầm
Vaccine cúm A cần được làm mới (thay đổi chủng giống) hàng năm để chắc chắn có
hiệu lực phòng vệ với các chủng virus đang lưu hành hay mới xuất hiện. Đây là một trong
những trở ngại, thách thức và gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine, nhưng là cần thiết để
thích ứng với khả năng tiến hóa rất nhanh, dễ xuất hiện biến chủng do sự chuyển dịch kháng
nguyên, đột biến và tái tổ hợp gen xảy ra phổ biến ở virus cúm (Pronker et al., 2012).
Hướng dẫn của WHO cho phát triển nhanh chủng virus vaccine vừa có đặc tính kháng
nguyên (quy định bởi phân đoạn gen HA và NA) giống các chủng virus đang lưu hành, vừa
có khả năng nhân lên tạo hạt virus với hiệu suất cao là tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng
viên vaccine có bộ gen được lắp ráp nhân tạo theo công thức 6 + 2 (6 phân đoạn gen khung
nguồn gốc từ virus A/PR/8/1934(H1N1) và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA và NA - của virus hoang dại đang lưu hành).
1.3. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Quá trình hình thành các clade cúm HPAI H5N1 đã từng gây dịch ở Việt Nam rất
phức tạp với các clade xuất hiện phổ biến như sau:
- Giai đoạn năm 2003 đến 2006: Clade 1 và clade 2.3.2 xuất hiện và gây dịch trên
phạm vi toàn quốc.
- Giai đoạn năm 2007 đến 2013: Xuất hiện chủ yếu các biến chủng thuộc ba clade:
1.1, 2.3.4 và 2.3.2.1. Trong đó: Clade 2.3.4 xuất hiện năm 2007 và gây dịch bệnh trên gia
cầm giai đoạn 2007 - 2010, từ năm 2011 đến 2013 không thấy xuất hiện; clade 1.1 phát sinh
từ clade 1, xuất hiện năm 2007 và gây bệnh chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, từ năm 2011 phân
nhánh thành clade 1.1.1 và clade 1.1.2; clade 2.3.2 xuất hiện lần đầu năm 2005, từ năm
2009 được phân nhánh thành clade 2.3.2.1, sau đó tiếp tục phân thành các nhánh 2.3.2.1
nhóm A (clade 2.3.2.1a), 2.3.2.1 nhóm B (clade 2.3.2.1b) và 2.3.2.1 nhóm C (clade
2.3.2.1c). Trong số các clade thuộc nhánh 2.3.2.1, virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây
dịch trên diện rộng (từ Bắc vào Nam).
- Giai đoạn từ năm 2014 đến nay: Clade 2.3.2.1c tiếp tục lưu hành, clade 2.3.4 phân
nhánh thành clade 2.3.4.4 và clade 1.1 có nguy cơ bùng phát trở lại (Chu et al., 2016,
Nguyen et al., 2017; Mellor et al., 2018).
1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu phòng chống virus cúm A

Kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) được ứng dụng phổ biến trên thế giới
trong nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A từ các cDNA của virus đã được tạo
dòng vào plasmid. Ưu điểm của kỹ thuật là cho phép thao tác với genome virus ở mức độ
phân tử để tạo hạt virus mang đặc tính mong muốn (Chen et al., 2012; Palese & Shaw, 2007;
Neumann et al., 2004).
Trong số các hệ thống di truyền ngược được ứng dụng hiệu quả và đáp ứng mục tiêu
trong thời gian ngắn tạo chủng virus vaccine hiệu quả là hệ thống gồm 8 plasmid pHW2000
mang PolI-PolII của Hoffmann và đtg (2000). Sự có mặt của phức hợp PolI-PolII trên cùng
một plasmid cho phép sinh tổng hợp cả mRNA của virus (nhờ PolII) và vRNA (nhờ PolI)
trong tế bào động vật từ cùng một phân đoạn cDNA của virus đã được dòng hóa vào
plasmid, cho phép hạt virus tái tổ hợp được tái tạo hiệu quả.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng NIBRG-14
Chủng NIBRG-14 do NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp là nguồn vật liệu cho phân
lập 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34.


Plasmid và chủng khuẩn
Plasmid pHW2000 được cung cấp bởi Dr. Erich Hoffmann và Dr. Robert G. Webster
(Bệnh viện Nhi St. Jude, Mỹ), là plasmid chứa phức hợp PolI-PolII hai chiều.
Chủng E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1∆ lac U169
(φ80 lacZM15)] của hãng Invitrogen (Mỹ) được dùng trong chọn dòng và nhân dòng gen.
Cặp mồi sử dụng
Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu cho nhân bản và xác định trình tự 8 phân đoạn
gen của virus cúm A được thiết kế theo Hoffmann và đtg (2001).
Tế bào
Tế bào 293T và tế bào MDCK được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture
Collection, Mỹ).
Trứng gà sạch có phôi và gà sạch 3 ngày tuổi

Trứng gà sạch có phôi 9 - 11 ngày tuổi và gà sạch 3 ngày tuổi được cung cấp bởi
Trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương (Viện Chăn nuôi), đã được kiểm định sạch
virus/kháng thể đặc hiệu với virus A/H5N1 và Newcastle.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Tất cả các thí nghiệm biến nạp và tái tạo virus A/H5N1 tái tổ hợp bằng di truyền
ngược, nhân giống virus, kiểm tra virus đều thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn cấp 2 +
của Viện Công nghệ sinh học. Các thao tác tiến hành với virus (cấy truyền, thu nhận, xác
định sự có mặt của virus ...) được thực hiện trong box cấy an toàn sinh học cấp 2.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34
Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 (mang 6 phân đoạn gen khung từ virus
A/PR/8/34 [PR8] bằng kit Tripure Isolation Reagent (Invitrogen, Mỹ). Nhân bản sáu phân
đoạn gen khung của virus PR8 từ các mẫu vRNA tổng số bằng phương pháp RT-PCR hai
bước để chuyển hóa vRNA thành cDNA (bước 1) và PCR khuếch đại cDNA (bước 2) theo
phương pháp của Hoffmann và đtg (2001).
2.3.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c
Hai gen HA và hai gen NA của hai clade virus (clade 1.1 và 2.3.2.1c) được thiết kế có
cấu trúc: Tương ứng ở hai đầu gen là hai đoạn nucleotide không mã hóa chứa điểm bắt cặp
đặc hiệu của mồi xuôi và mồi ngược trong phản ứng PCR nhân gen; ở giữa là vùng mã hóa
chứa trình tự nucleotide của gen H5 HA và gen N1 NA tương ứng. Đặc biệt, để đảm bảo
virus tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược là virus độc lực thấp, hai phân đoạn gen H5
HA của hai clade virus đều được loại vùng độc (loại các nucleotide mã hóa các amino acid
kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí giữa HA1 và HA2) và tránh lại độc (Hình 2.1)

Hình 2.1. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c
trước và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc


2.3.3. Ghép nối các phân đoạn gen của virus cúm A vào plasmid pHW2000 tạo hệ
thống plasmid đơn gen

10 mẫu DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được chọn dòng (6 dòng dương tính
với plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung + 2 dòng dương tính với gen kháng
nguyên H5 và N1 của clade 1.1 + 2 dòng mang gen kháng nguyên H5 và N1 của clade
2.3.2.1c) được tách và tinh sạch, sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức). Các
plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn, thu nhận gen đích và ghép nối gen vào
plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001).
2.3.4. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái tổ
hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Thực hiện 2 công thức chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T: (i) 6 plasmid
mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng
nguyên H5 và N1 từ clalde 1.1; (ii) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng
A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên H5 và N1 từ clalde 2.3.2.1c.
Xác định sự có mặt của virus tái tổ hợp trong dịch nuôi cấy bế bào sau chuyển nhiễm
plasmid bằng kỹ thuật RT-PCR một bước. Các mẫu có kết quả RT-PCR dương tính với sự có
mặt của virus tái tổ hợp thế hệ P0 được thu nhận riêng rẽ và ghi ký hiệu là virus rg-A/H5N1
clade 1.1 hoặc rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tương ứng).
2.3.5. Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng
gà sạch có phôi
Các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c tái tổ hợp được cấy
nhân giống trong trứng gà sạch có phôi 9 - 11 ngày tuổi. Ủ trứng trong tủ ấm ở 35°C, độ ẩm
60% trong 48h. Thu hoạch dịch niệu trong từng quả trứng (chứa virus tái tổ hợp thế hệ P1)
riêng rẽ vào các ống vô trùng. Xác định sự có mặt của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trong dịch niệu trứng bằng các phương pháp: (i) Xác định hiệu giá
HA, (ii) xác định hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) và khả năng tạo plaque trên đĩa nuôi cấy
tế bào MDCK trong thí nghiệm plaque assay theo hướng dẫn của WHO (2011).
2.3.6. Phân lập chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c được phân lập từ các
mẫu virus thế hệ P1 có kết quả kiểm tra hiệu giá HA và hiệu giá virus cao. Thí nghiệm phân lập
virus thực hiện theo hướng dẫn của WHO (2011).
2.3.7. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác định tính ổn
định di truyền của chủng virus

Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 được cấy
truyền vào trứng gà sạch có phôi thêm 4 lần tiếp theo để thu nhận virus thế hệ từ P2 - P5. Xác
định hiệu giá HA, tính đầy đủ về di truyền (thể hiện ở sự có mặt của cả 8 phân đoạn gen trong
genome virus) và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên (thể hiện ở trình tự các gen kháng
nguyên H5 HA và N1 NA không bị biến đổi) của các chủng virus thế hệ P5.
2.3.8. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c
Dịch niệu trứng thu hoạch từ thế hệ P2 đến P5 của hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của chủng virus ứng viên vaccine (có khả năng
thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền
gen kháng nguyên H5 và N1) được làm đồng nhất đến cùng hiệu giá HA 1: 1024. Tiến hành vô
hoạt virus, tạo hai loại vaccine cúm vô hoạt nhũ dầu từ hai chủng virus.
2.3.9. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên gà sạch 3
ngày tuổi của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Vaccine từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau khi đã kiểm tra


đảm bảo tính an toàn được tiêm phòng cho gà sạch 3 ngày tuổi theo 2 công thức: (i) Tiêm 1 liều
0,5 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi; (ii) tiêm 2 liều: Liều 1 tiêm 0,2 ml vaccine cho gà 3 ngày
tuổi, tiêm nhắc lại (liều 2) 0,5 ml vaccine lúc gà 13 ngày tuổi. Mỗi công thức thí nghiệm tiêm
20 gà. Xác định hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của từng loại vaccine
bằng phương pháp xác định hiệu giá HI (hiệu giá ức chế khả năng gây ngưng kết hồng cầu) sau
2 tuần và 4 tuần tiêm phòng.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid
pHW2000
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung
nguồn gốc từ virus A/PR/8/34
Kiểm tra chất lượng các mẫu vRNA tổng số sau tách chiết bằng đo nồng độ và độ
tinh sạch trên máy Nanodrop cho kết quả nồng độ vRNA là 30,1 - 46,2 ng/µl và độ tinh sạch

thể hiện ở tỷ số A260/280 khoảng 1,86 - 1,92.
3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung
Sáu phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus
A/PR/8/34 [PR8] được nhân bản bằng kỹ thuật RT-PCR hai bước theo phương pháp của
Hoffmann và đtg (2001): Bước 1 - chuyển hóa vRNA → cDNA; bước 2 - PCR khuếch đại
cDNA → dsDNA. Trong phản ứng ở bước 1, sử dụng Reverse transcriptase với mồi Uni12
để chuyển toàn bộ các phân đoạn ssRNA sợi âm trong genome virus thành các phân đoạn
cDNA. Mồi Uni 12 có chiều dài 12 nucleotide (5’-AGCAAAAGCAGG- 3’), bắt cặp bổ
sung với 12 nucleotide bảo thủ có ở tất cả các đầu 3’ của các phân đoạn gen virus. Các phân
đoạn cDNA là sản phẩm của bước 1 được sử dụng làm khuôn cho bước 2: Thực hiện 6 phản
ứng PCR khuếch đại 6 gen khung với 6 cặp mồi đặc hiệu cho nhân bản từng gen khung.
Quá trình RT-PCR hai bước được sơ đồ hóa ở Hình 3.1.

Hình 3.1. Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng dụng
kỹ thuật RT-PCR hai bước với mồi Uni12
Kiểm tra sản phẩm của 6 phản ứng RT-PCR nhân bản riêng rẽ 6 phân đoạn gen
khung bằng điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 3.2) cho thấy: 6 phân đoạn gen khung PB2, PB1, PA, NP, M và NS - đã được nhân bản thành công từ mẫu vRNA của chủng
NIBRG-14, với sản phẩm RT-PCR của mỗi phân đoạn gen khung đều chứa ít nhất một mẫu
nhân bản thành công băng vạch đặc hiệu, sáng, rõ nét, kích thước tương ứng với kích thước
tính toán theo lý thuyết của từng gen.
Các sản phẩm RT-PCR của sáu phân đoạn gen khung được tách dòng vào plasmid


pBT, biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. Sàng lọc các dòng khuẩn mang plasmid pBT tái
tổ hợp bằng phương pháp conoly-PCR. DNA plasmid của các dòng vi khuẩn dương tính với
phản ứng conoly-PCR được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự nucleotide gen đích
với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi bắt cặp plasmid. Mỗi phân đoạn gen đều được
xác định trình tự nucleotide theo cả chiều xuôi và chiều ngược. Kết quả về trình tự nucletide
được so sánh để xác định trình tự đầy đủ và đúng của từng gen. Trên cơ sở về trình tự
nucleotide của từng gen đã nhận được, tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của phân

đoạn gen tương ứng ở virus PR8 trong ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI. Bên cạnh đó, kết quả
về trình tự nucleotide được chuyển sang trình tự amino acid suy diễn và so sánh có hay
không sự sai khác về trình tự amino acid của từng gen đã tách dòng trong plasmid pBT với
trình tự amino acid đầy đủ đảm bảo để thực hiện chức năng của các gen khung từ chủng
PR8.

A

D

B

C

E

F

Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân bản sáu phân đoạn gen
mã hóa các protein khung của virus NIBRG-14
Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas)
A. Phân đoạn gen PB2 có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB2
B. Phân đoạn gen PB1 có 2 mẫu (1, 2) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB1
C. Phân đoạn gen PA có 1 mẫu nhân bản băng đặc hiệu kích thước tương ứng gen PA
D. Phân đoạn gen NP có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NP
E. Phân đoạn gen M có 2 mẫu (2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen M
F. Phân đoạn gen NS có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NS

Kết quả so sánh về trình tự nucleotide và amino acid làm cơ sở cho chọn dòng
plasmid trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy: Tương ứng với mỗi phân đoạn gen khung, đều chọn

lọc được 1 - 3 dòng khuẩn mang cDNA có trình tự nucleotide mã hóa trình tự amino acid
khộng thay đổi (giống 100%) so với trình tự của sáu gen khung của virus PR8 trong NCBI
( Số lượng các dòng khuẩn chuyển nạp plasmid tái
tổ hợp mang gen quan tâm có trình tự nucleotide không thay đổi so với trình tự gen tương
ứng của chủng PR8 như sau: Gen PB2 - 2 dòng; gen PB1 - 3 dòng; gen PA - 1 dòng; gen NP
- 2 dòng; gen M - 2 dòng và gen NS - 2 dòng. Bên cạnh các dòng mang gen đích có trình tự
nucleotide không thay đổi so với virus PR8, có một số dòng có trình tự nucleotide xuất hiện
đột biến điểm làm thay đổi 1 bp trên gen, dẫn đến sự thay đổi 1 amino acid của protein do


gen mã hóa hoặc không thay đổi về trình tự amino acid (trường hợp thay đổi nucleotide
nhưng bộ ba nucleotide thay đổi vẫn mã hóa cùng một amino acid). Sự biến đổi này có khả
năng xuất phát từ các đột biến điểm xảy ra trong hệ genome của quần thể virus NIBRG-14
trong dịch niệu trứng, và là kết quả của sai sót xảy ra trong sao chép genome của phức hợp
polymerase - RdRp - của virus cúm A (loại virus điển hình về khả năng tiến hóa nhanh, dễ
biến đổi di truyền và xuất hiện đột biến điểm trong quá trình sao chép genome do
polymerase khi hoạt động có tần số xuất hiện đột biến cao).
Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen khung đã
phân lập với các gen tương ứng của chủng PR8
Gen Ký hiệu
Kích thước Vị trí thay đổi so với trình tự gen
dòng khuẩn gen
tương ứng của chủng PR8
lạc
(nucleotide) Vị trí nucleotide
Vị trí amino acid
thay đổi
thay đổi
cl1
T1855C

F619L
PB2
cl2
KTĐ
KTĐ
2341+29
cl3
KTĐ
KTĐ
cl4
A1574G
E525G
cl1
KTĐ
KTĐ
PB1
cl2
T290C
L97S
2341+29
cl3
KTĐ
KTĐ
cl4
KTĐ
KTĐ
PA
cl1
2233+29
G861A, T1879C W627R

cl2
KTĐ
KTĐ
cl1
G567A
KTĐ
NP
1565+29
cl2
KTĐ
KTĐ
cl3
KTĐ
KTĐ
cl1
KTĐ
KTĐ
M
1027+29
cl2
C395T
T132I
cl3
KTĐ
KTĐ
NS
cl1
890+29
KTĐ
KTĐ

cl2
KTĐ
KTĐ
KTĐ: Không thay đổi; 29: Các nucleotide thiết kế thêm ở hai đầu của mồi nhân gen

Để tạo bộ plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung có trình tự nucleotide
đầy đủ và không thay đổi so với các trình tự gen khung của virus PR8, luận án lựa chọn
tương ứng với mỗi gen khung một dòng DNA plasmid có trình tự nucleotide của gen đích
giống 100% so với phân đoạn gen khung tương ứng của virus PR8 trên ngân hàng NCBI để
dòng hóa vào plasmid pHW2000.
3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000
Sáu phân đoạn gen khung được cắt thu nhận từ plasmid pBT tái tổ hợp để tách dòng
vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). Sáu plasmid pBT tái
tổ hợp được cắt bằng BsmBI hoặc BsaI. Sản phẩm của 6 phản ứng cắt được điện di kiểm tra
trên gel agarose 2% (Hình 3.3). Các băng vạch có kích thước đúng với kích thước lý thuyết
của từng gen khung trên bản điện di được cắt và thu nhận bằng phương pháp thôi gel, tinh
sạch gen. Ghép nối riêng rẽ 6 phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 đã được cắt mở
vòng bằng BsmBI tạo 6 plasmid tái tổ hợp mang 6 phân đoạn gen khung.
Kiểm tra sự có mặt của 6 phân đoạn gen khung trong 6 mẫu plasmid pHW2000 tái tổ
hợp bằng phương pháp PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu cho nhân bản từng phân đoạn
gen và mồi bắt cặp trên plasmid. Sản phẩm PCR nhân bản 6 phân đoạn gen bằng mồi đặc


hiệu gen đều xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước đúng kích thước theo tính
toán lý thuyết của từng gen (gen PB2: ~ 2350 bp, gen PB1: ~ 2350 bp, gen PA: ~ 2250 bp,
gen NP: ~ 1600 bp, gen M: ~ 1050 bp và gen NS: ~ 900 bp). Sáu phản ứng nhân gen bằng
mồi bắt cặp plasmid đều có kích thước lớn hơn khoảng 0,2 kb so với sản phẩm phản ứng
PCR nhân các phân đoạn gen tương ứng bằng mồi đặc hiệu gen. Kết quả nhận được chứng
tỏ 6 phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M và NS đã được biến nạp thành công và gắn đúng
vị trí trên 6 plasmid pHW2000 (mỗi plasmid mang một phân đoạn cDNA mã hóa protein

khung của virus (Hình 3.4).

.

Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen khung
nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 bằng enzyme giới hạn
Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas); M1: Marker High Ranger 1kb DNA Ladder
A. Gen PB2 (PB2-K: Plasmid pBT-PB2 không cắt với enzyme; PB2-C: Sản phẩm cắt pBT-PB2)
B. Gen PB1 (PB1-K: Plasmid pBT-PB1 không cắt; PB1-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-PB1)
C. Gen PA (PA-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-PA; PA-K: Plasmid pBT-PA không cắt với enzyme)
D. Gen NP (NP-K: Plasmid pBT-NP không cắt với enzyme; NP-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-NP)
E. Gen M (M-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-M; M-K: Plasmid pBT-M không cắt với enzyme)
F. Gen NS (NS-K: Plasmid pBT-NS không cắt với enzyme; NS-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-NS)

.
Hình 3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung với mồi
đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000
M: Marker 1kb (Fermentas); (-): Đối chứng âm; 1, 2: Phân đoạn gen M; 3, 4: Phân đoạn gen NP; 5,
6: Phân đoạn gen NS; 7, 8: Phân đoạn gen PA; 9, 10: Phân đoạn gen PB1; 11, 12: Phân đoạn gen PB2


3.2. Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c
vào plasmid pHW2000
Trình tự nucleotide của hai phân đoạn gen H5 clade 1.1 và H5 clade 2.3.2.1c đã được
thiết kế, tổng hợp nhân tạo và lưu giữ trong plasmid (Hình 3.5). Trình tự nucleotide của hai
gen H5 có kích thước: Gen H5 clade 1.1 - 1825 bp, gen H5 clade 2.3.2.1c - 1822 bp. Hai
gen H5 đều có đặc điểm: Hai đoạn nucleotide ở hai đầu không mã hóa, là vị trí gắn mồi đặc
hiệu chứa điểm nhận biết của enzyme BsmBI; ở giữa là vùng mã hóa amino acid tạo protein
HA: Gen HA clade 1.1 - 1698 bp (1695 bp mã hóa 565 amino acid và 3 bp là bộ ba kết
thúc), gen HA clade 2.3.2.1c - 1695 bp (1692 bp mã hóa 564 amino acid và 3 bp tương ứng

với bộ ba kết thúc).

Hình 3.5. Trình tự nucleotide của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c không chứa
vùng độc
A. Trình tự nucleotide; B. Trình tự amino acid

Với hai trình tự gen H5 HA đã thiết kế, khi khuếch đại gen bằng phản ứng PCR sẽ
tạo sản phẩm có kích thước 1799 bp (1698 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 1.1 và
1796 bp (1695 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 2.3.2.1c.
Đặc biệt, trình tự amino acid của protein HA được mã hóa bởi gen HA clade 1.1 và
HA clade 2.3.2.1c đã thiết kế đều được loại bỏ vùng độc (loại bớt các amino acid kiềm ở vị
trí nhận biết của protease) và tránh hiện tượng lại độc. Cụ thể, trình tự amino acid mã hóa
bởi phân đoạn gen H5 clade 1.1 đã thiết kế, vị trí 338-344 là QREGT-RG, trong khi ở chủng
gốc A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1), vị trí 338-347 là QREGRRKK-RG (chứa 4


amino acid kiềm –RRKK- ở vị trí nhận biết của protease). Như vậy, so với chủng gốc, trình
tự gen H5 clade 1.1 đã thiết kế làm gen ứng viên cho sản xuất vaccine đã được loại vùng
độc: Loại 2 arginine (R), 1 lysine (K) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); và tránh
lại độc: Hai arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc được thay đổi mã bộ ba - AGA thành
CGA - cũng mã hóa cho arginine nhưng sẽ giúp chủng virus tái tổ hợp không từ dạng độc
lực thấp chuyển thành dạng độc lực cao. Trình tự amino acid mã hóa bởi gen HA clade
2.3.2.1c loại vùng độc đã thiết kế, vị trí 338-343 là QRET-RG, trong khi ở chủng gốc
A/duck/Viet Nam/HT-02/2014(H5N1), vị trí 338-346 là QRERRRK-RG (chứa 4 amino acid
kiềm -RRRK- ở vị trí vùng độc) (Hoàng Thị Thu Hằng et al., 2008). So với chủng virus
gốc, gen ứng viên vaccine HA clade 2.3.2.1c đã được loại vùng độc: Loại 3 arginine (R) và
thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); tránh lại độc: 2 arginine (R) ở hai đầu ngay sát
vùng độc được thay đổi 1 nucleotide từ AGA thành CGA.
Trình tự amino acid suy diễn được dịch mã từ 2 gen H5 HA đã thiết kế cho thấy: Các
vị trí quan trọng đảm bảo việc thực hiện chức năng và thể hiện tính kháng nguyên của

protein HA đều có và không thay đổi vị trí so với chủng virus gốc, gồm: Vị trí liên kết với
thụ thể của tế bào chủ: QSG ở cả 2 clade (amino acid 238-240); các vị trí có tính kháng
nguyên và sinh đáp ứng miễn dịch mạnh: ANPV ở clade 1.1 và PNPA ở clade 2.3.2.1c
(amino acid 99-102); SHEASL ở clade 1.1 và NHEASL ở clade 2.3.2.1c (amino acid 140145); PYLGKS ở clade 1.1 và SYQGNS ở clade 2.3.2.1c (amino acid 152-157); vị trí
glycosyl hóa: NST ở clade 1.1 và DNA ở clade 2.3.2.1c (amino acid 170-172).
Gen HA clade 1.1 và gen HA clade 2.3.2.1c tổng hợp nhân tạo đã được ghép nối
riêng rẽ vào plasmid pHW2000. Kiểm tra sự có mặt của phân đoạn gen HA trong plasmid
pHW2000 bằng các phương pháp: PCR với hai cặp mồi (đặc hiệu gen, đặc hiệu plasmid);
cắt bằng enzyme giới hạn và xác định trình tự gen. Kết quả kiểm tra thể hiện ở Hình 3.6.

A

B

Hình 3.6. Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c trong
plasmid pHW2000
Ghi chú. M: Marker 1 kb
A. Kiểm tra bằng PCR nhân gen HA với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid;
1, 2: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 2.3.2.1c.
B: Cắt kiểm tra bằng cặp enzyme NheI và SmaI; H1.1: Sản phẩm cắt pHW2000-HA clade 1.1;
H2.3.2.1: Sản phẩm cắt pHW2000-HA clade 2.3.2.1c.

Kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen HA
và mồi đặc hiệu plasmid chỉ xuất hiện một băng đặc hiệu duy nhất có kích thước đúng theo
lý thuyết: Sản phẩm nhân gen bằng mồi đặc hiệu gen có kích thước khoảng 1800 bp (tương
ứng với kích thước gen HA), nhân gen bằng mồi đặc hiệu plasmid có kích thước khoảng
1950 bp (tương ứng với kích thước gen HA và một phần trình tự nucleotide của plasmid
pHW2000 ở hai đầu gen HA) (Hình 3.6A).



Sản phẩm cắt kiểm tra 2 plasmid tái tổ hợp với cặp enzyme NheI và SmaI trên bản
điện di đều xuất hiện 2 băng vạch: Băng thứ nhất có kích thước lớn tương ứng với kích
thước plasmid pHW2000 và băng thứ hai kích thước nhỏ hơn tương ứng với kích thước của
gen HA (khoảng 1800 bp) (Hình 3.6B).
Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen đích cũng chứng minh gen HA clade 1.1
và HA clade 2.3.2.1c đã được tạo dòng thành công vào plasmid pHW2000 với kích thước và
trình tự nucleotide chính xác 100% so với các trình tự đã thiết kế. DNA plasmid của các
dòng dương tính với gen HA được tách chiết và tinh sạch để sẵn sàng sử dụng cho thí
nghiệm tái tạo chủng virus vaccine cúm A/H5N1 tái tổ hợp.
3.3. Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c
vào plasmid pHW2000
Trình tự nucleotide gen N1 NA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c được thiết kế dựa trên
trình tự nucleotide của gen NA đã phân lập từ hai chủng virus cúm độc lực cao
A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Vietnam/HT-02/2014(H5N1)
(clade 2.3.2.1c) tương ứng, có kích thước và cấu trúc đều gồm 1453 bp với: 1 vùng mã hóa
kích thước 1350 bp, trong đó 1347 bp (bắt đầu bằng bộ ba khởi đầu dịch mã - ATG) mã hóa
449 amino acid, và 3 bp tương ứng với 1 bộ ba kết thúc không mã hóa; 2 vùng không mã
hóa nằm ở hai đầu với kích thước và trình tự nucleotide tương ứng là 46 bp - 5’
tagtactaagcatattggtctcagggagcaaaagcaggagttcaaa
3’
và
57
bp
5’tttgttcaaaaaactccttgtttctactaatacgagaccatattagtactaagcata 3’, trong đó các nucleotide in
nghiêng là vị trí gắn đặc hiệu của mồi xuôi và ngược trong phản ứng PCR nhân gen,và các
nucleotide gạch chân là vị trí nhận biết/trình tự bổ sung với vị trí nhận biết của BsaI. Với
cấu trúc gen NA đã thiết kế của cả hai clade, khi thực hiện phản ứng PCR nhân gen NA sẽ
tạo sản phẩm đặc hiệu có kích thước gồm vùng mã hóa và hai đoạn nucleotide không mã
hóa ở hai đầu gen, bắt đầu ở vị trí gắn mồi đặc hiệu, với tổng số nucleotide là 1434 bp (1350
bp + 84 bp).

So sánh sự tương đồng về trình tự amino acid suy diễn do gen NA clade 1.1 và NA
clade 2.3.2.1c mã hóa bằng chương trình ClustalW và BLAST thì độ tương đồng giữa hai
trình tự là 92%. Đặc biệt, protein do gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c mã hóa đều
gồm 449 amino acid (Hình 3.7) với đầy đủ các vị trí quan trọng đảm bảo chức năng và tính
kháng nguyên của protein NA như:

Hình 3.7. Trình tự amino acid của gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c
Các amino acid được đánh dấu trong khung hình bầu dục gồm 7 amino acid tạo thành vị trí thực hiện
chức năng xúc tác của neuraminidase, các nucleotide trong khung hình vuông/chữ nhật là các vị trí Nglycosyl hóa trong gen.


Vị trí thực hiện chức năng xúc tác (catalytic site) của neuraminidase: Ở cả hai clade
đều được hợp thành từ 7 amino acid nằm đúng vị trí, phân bố trên bề mặt của cả 4 tiểu đơn
vị hợp thành đầu tetramer dạng cầu của NA, gồm: Arg (R) - 98, Asp (D) - 131, Glu (E) 258, Arg (R) - 273, Arg (R) - 348, Tyr (Y) - 382, Glu (E) - 405. Các công bố về trình tự gen
NA của virus H5N1 clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c trên ngân hàng NCBI đã khẳng định vai
trò của những vị trí này trong việc đảm bảo chức năng thực hiện hoạt tính enzyme của
protein NA ( />Vị trí N-glycosyl hóa (glycosylation site): Ở protein NA clade 1.1 có 2 vị trí glycosyl
hóa là 68NSS và 126NGT. Protein do gen NA clade 2.3.2.1c mã hóa có 3 vị trí glycosyl hóa
với 2 vị trí có trình tự và thứ tự amino acid giống protein NA clade 1.1 và thêm 1 vị trí là
215NGS.
Vùng cuống (stalk region): Ở subtype N1 NA, vùng cuống được tạo thành bởi
khoảng gần 50 amino acid, tương ứng với vị trí amino acid 40 - 90 tính từ đầu tận cùng N
của protein, và cần có ít nhất 1 gốc Cys (C) và 1 vị trí glycosyl hóa (Reid et al., 2000). Các
đặc điểm này đều có ở protein mã hóa bởi hai trình tự gen NA đã thiết kế. Cụ thể, trong
vùng amino acid vị trí 40 - 90 mã hóa bởi gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c đều có 1
gốc Cys ở amino acid 72 và 1 vị trí glycosyl hóa là 68NSS.
Sau khi tách dòng và kiểm tra sự có mặt của gen NA trong plasmid pHW2000 bằng
PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid, kết quả chỉ ra đã biến
nạp thành công hai gen NA tương ứng với hai clade vào hai plasmid pHW2000 (Hình
3.8A). Kết quả tạo dòng cũng được kiểm tra bằng 2 phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp với

enzyme giới hạn: Cắt bằng cặp NheI và SmaI, và cắt bằng SacI. Sản phẩm phản ứng cắt
được điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy: Sản phẩm cắt pHW2000-NA clade 1.1 và
pHW2000-NA clade 2.3.2.1c bằng cặp NheI và SmaI (Hình 3.8B) hay bằng SacI (Hình
3.8C) cũng đều xuất hiện hai băng vạch: Băng thứ nhất có kích thước lớn tương ứng với
kích thước plasmid pHW2000, băng thứ hai kích thước nhỏ tương ứng kích thước gen NA.
Bên cạnh đó, do điểm cắt của SacI trên plasmid pHW2000 nằm xa hơn so với điểm cắt của
NheI và SmaI trên pHW2000 tính từ vị trí gắn gen NA, nên sản phẩm phản ứng cắt cho
băng vạch tương ứng chứa gen NA khi cắt bằng SacI có kích thước lớn hơn so với cắt bằng
NheI và SmaI.

A

B

C

Hình 3.8. Kiểm tra kết quả tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000
M: Marker 1kb; M1: Marker HighRanger 1kb DNA Ladder
A. PCR nhân gen NA bằng cặp mồi đặc hiệu gen và cặp mồi đặc hiệu plasmid; 1, 2: Sản phẩm PCR
nhân gen NA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen NA clade 2.3.2.1c.
B. Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (5) và clade 2.3.2.1c (6) bằng NheI và SmaI.
C. Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (7) và clade 2.3.2.1c (8) bằng SacI

Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen đích trong plasmid tái tổ hợp cũng
khẳng định gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c đã được tách dòng thành công vào hai
plasmid pHW2000.


3.4. Tạo chủng virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng
di truyền ngược

3.4.1. Xác định loại hóa chất và thời gian chuyển nhiễm thích hợp cho tái tạo virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T
Ảnh hưởng của loại hóa chất chuyển nhiễm
Kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy: Các công thức chuyển nhiễm sử dụng
Lipofectamine-2000 và TransIT-LT đã kích thích các plasmid chuyển nhiễm vào tế bào 293T, từ
đó tái tạo thành công virus tái tổ hợp, thể hiện ở hiệu giá HA (log 2) đạt 4,5 - 7,0 ở cả 2 công thức
bổ sung chất kích thích chuyển nhiễm, trong khi công thức đối chứng (bổ sung đệm PBS thay
chất chuyển nhiễm) cho kết quả hiệu giá HA âm tính.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp
rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Loại hóa chất
Hiệu giá HA (log2) của công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus
chuyển nhiễm
rg-A/H5N1 clade 1.1
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Đối chứng (PBS)
Lipofectamine-2000
TransIT-LT

6,83a ± 1,17
4,5b ± 0,84

7,0a ± 0,89
5,17b ± 0,75

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05; (-): Hiệu
giá HA âm tính - không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.

Trong số 2 loại chất chuyển nhiễm, Lipofectamine-2000 cho hiệu quả chuyển nhiễm (HA
log2) tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 6,83 và virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,0 - cao
hơn so với hiệu quả chuyển nhiễm của TransIT-LT chỉ đạt HA log2 là 4,5 và 5,17 tương ứng với 2

clade virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Kết quả so sánh bằng phương
pháp thống kê chỉ ra sự khác biệt giữa các công thức là có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05. Do
vậy, luận án lựa chọn Lipofectamine-2000 làm yếu tố kích thích chuyển nhiễm plasmid ngoại lai
vào tế bào 293T.
Ảnh hưởng của thời gian chuyển nhiễm
Tối ưu thời gian ủ plasmid với tế bào 293T trong sự có mặt của Lipofectamine-2000 có
khả năng nâng cao hiệu quả chuyển nhiễm.
Trong nghiên cứu này, các công thức thí nghiệm chuyển nhiễm plasmid vào tế bào được
bố trí trong các khoảng thời gian 10 - 60 phút. Số liệu nhận được (Bảng 3.3) cho thấy: Tương ứng
với các thời gian chuyển nhiễm khác nhau đã nhận được hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp thông
qua hiệu giá HA khác nhau. Thời gian chuyển nhiễm 10 phút là chưa đủ để đạt hiệu quả chuyển
nhiễm cao của plasmid vào tế bào - hiệu giá HA của virus là thấp nhất. Công thức có thời gian
chuyển nhiễm là 30 phút và 60 phút cho hiệu giá HA (log 2) của virus cao. So sánh hiệu quả
chuyển nhiễm của hai khoảng thời gian là 30 phút và 60 phút cho phép lựa chọn thời gian chuyển
nhiễm plasmid vào tế bào 293T trong sự có mặt của Lipofectamine-2000 là 30 phút: Hiệu giá HA
(log2) của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 7,17 và của virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,33.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Thời gian chuyển
Hiệu giá HA (log2) của công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus
nhiễm
rg-A/H5N1 clade 1.1
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
10 phút
20 phút
30 phút
60 phút

2,33a ± 0,52
5,33b ± 0,52
7,17c ± 0,75

7,00c ± 0,89

2,50a ± 1,75
5,83b ± 0,75
7,33c ± 0,82
7,17c ± 0,98

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

3.4.2. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T


Hai công thức chuyển nhiễm dựa trên nguyên tắc 6 + 2 plasmid được thực hiện để tái
tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Các đĩa tế bào sau
chuyển nhiễm plasmid được ủ ở 37ºC, 5% CO 2 trong 48h để thu nhận dịch sau biến nạp
chứa thế hệ P0 của virus tái tổ hợp. Tương ứng với mỗi loại virus rg-A/H5N1 clade 1.1 hoặc
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c, luận án đều thu nhận được các mẫu dịch sau biến nạp có khả
năng có sự có mặt của virus. Ký hiệu của các mẫu virus thế hệ P0.
Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus tái tổ hợp bằng phản ứng RT-PCR nhân gen HA
và xác định trình tự gen HA trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.9 đều khẳng định đã tái tạo
thành công virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
Bảng 3.4. Kiểm tra sự có mặt và đặc điểm di truyền gen HA của virus rg-A/H5N1 clade
1.1 và rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P0
Công thức
Thu
Ký
Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus tái
chuyển
nhận từ
hiệu

tổ hợp
nhiễm cho
lần
mẫu
RT-PCR Xác định
Sự có mặt của các
tái tạo virus
chuyển
virus
trình tự gen amino acid kiềm ở
nhiễm
HA
vùng độc
P0.1.1
+
KTĐ
1
P0.1.2
+
KTĐ
P0.1.3
+
KTĐ
rg-A/H5N1
P0.2.1
+
KTĐ
clade 1.1
2
P0.2.2

+
KTĐ
P0.2.3
+
KTĐ
P0.3.1
+
KTĐ
3
P0.3.2
+
KTĐ
P0.3.3
+
KTĐ
P0.1.1
+
KTĐ
1
P0.1.2
+
KTĐ
P0.1.3
+
KTĐ
P0.2.1
+
KTĐ
rg2
P0.2.2

+
KTĐ
A/H5N1
P0.2.3
+
KTĐ
clade 2.3.2.1c
P0.3.1
+
KTĐ
3
P0.3.2
+
KTĐ
P0.3.3
+
KTĐ
(+): Sản phẩm RT-PCR dương tính với một băng đặc hiệu kích thước khoảng 1,8 kb; KTĐ: Trình tự
nucleotide gen HA không thay đổi so với các trình tự gen đã thiết kế; (-): Không có các amino acid kiềm ở vị
trí vùng độc của gen HA.

So sánh trình tự gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
2.3.2.1c thế hệ P0 với hai trình tự gen HA đã thiết kế tương ứng với hai clade, nhận được kết
quả: Trình tự gen HA của 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c thế hệ P0 đều đồng nhất (giống 100%) so với trình tự gen HA đã thiết kế. Bên cạnh
đó, các trình tự gen HA được nhân bản từ các mẫu dịch virus không chứa vùng giàu các
amino acid kiềm độc.
Do RT-PCR là phương pháp có độ nhạy và tính chính xác cao, nên kết quả nhận được
cho phép khẳng định: (i) Đã tái tạo thành công hạt virus tái tổ hợp ở cả hai công thức
chuyển nhiễm, với tỷ lệ chuyển nhiễm thành công đạt 100% (tất cả các mẫu dịch sau chuyển

nhiễm đều cho kết quả kiểm tra dương tính với phản ứng RT-PCR nhân gen HA); (ii) các
mẫu virus tái tạo là an toàn ở mức độ phân tử (không chứa vùng độc ở gen HA); (iii) các


mẫu thế hệ P0 của cả hai clade virus đều thể hiện tính ổn định di truyền gen kháng nguyên.

Hình 3.9. Trình tự nucleotide gen HA của thế hệ P0 virus A/H5N1 clade 1.1 và
virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc
A. Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA của
chủng A/H5N1 clade 1.1 trên ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.1, HA-H5N1 clade
1.1.P0.1.2, HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.3: Gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 không chứa vùng
độc
B. Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA
của chủng A/H5N1 clade 2.3.2.1c trên ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.1,
HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.2, HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.3: Gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc

3.5. Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi
Tiêu chí để lựa chọn chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ở gia cầm không chỉ
căn cứ vào đặc điểm di truyền và tính kháng nguyên, mà còn xét đến khả năng thích ứng
nhân lên trong trứng gà sạch có phôi, vì phương pháp nhân giống virus cho sản xuất vaccine
cúm gia cầm hiện nay vẫn chủ yếu là nhân trong trứng.
Các mẫu chứa virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 thu
nhận sau biến nạp, đã được kiểm tra và chắc chắn an toàn về mức độ phân tử (đều là virus
có độc lực thấp) được cấy truyền vào trứng gà sạch có phôi. Sau 48h ủ trứng đã cấy giống
virus ở 35°C, độ ẩm 60%, nước trứng có chứa virus tái tổ hợp ký hiệu thế hệ P1 trong từng
quả được thu hoạch riêng rẽ và tiến hành kiểm tra vô trùng, xác định hiệu giá HA và khả
năng tạo thành vết tan trên tế bào MDCK của từng mẫu.
Trong số 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
đã khảo sát khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, luận án đã sàng lọc được 3 mẫu virus

rg-A/H5N1 clade 1.1 (mẫu P1.1.1, P1.2.1 và P1.3.3) có hiệu giá HA ≥ 1: 1024 và 3 mẫu
virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (P1.1.2, P1.2.2 và P1.3.2 có hiệu giá HA ≥ 1: 512. Các mẫu
virus này được lựa chọn cho phân lập chủng virus có khả năng thích ứng nhân lên trong
trứng gà có phôi với hiệu giá HA cao (Hình 3.10).


A

B

Hình 3.10. Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h nuôi cấy trong trứng gà sạch có phôi
ĐC: Mẫu đối chứng
A. Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1.
B. Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1.

Kết quả xác định khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trên tế bào MDCK trình bày ở Hình 3.11. Các đĩa 6 giếng chứa tế
bào MDCK đã cấy truyền virus ở các thời điểm sau 24h, 48h nuôi cấy được quan sát dưới
kính hiển vi soi ngược để quan sát động thái phát triển của tế bào, và so sánh với mẫu đối
chứng (không lây nhiễm virus).
Kết quả nhận được cho thấy: Sau 24h cấy truyền virus, bề mặt đáy ở những giếng
nhất định của đĩa nuôi cấy của cả 2 loại virus đều xuất hiện các vùng mà ở đó các tế bào bị
phá hủy tạo hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE - Cytopathic effect), trong khi mẫu đối chứng (tế
bào MDCK không cấy truyền virus) không xuất hiện CPE (tế bào vẫn tiếp tục biệt hóa, phân
chia với trên 90% tế bào sống). Bên cạnh đó, diện tích của các vùng có CPE ở khi quan sát
dưới kính hiển vi ở thời điểm sau 48h cấy truyền cho thấy các vùng này lan rộng hơn và số
lượng CPE cũng nhiều hơn.
Các đĩa tế bào MDCK nuôi cấy virus khi được nhuộm với gentian violet đã chỉ ra sự
sự xuất hiện các plaque (vết tan tế bào) (Hình 3.11).



A

B

C

D

E

F

Hình 3.11. Sự tạo thành CPE và plaque khi nuôi cấy virus trên tế bào MDCK
A, B, C. Quan sát đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus để phát hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) dưới
kính hiển vi: Công thức đối chứng (tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất hiện CPE (A); tế bào
MDCK lây nhiễm virus rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1 xuất hiện các CPE ở vị trí các mũi tên màu đỏ trong các
giếng sau 24h (B) và 48h (C) lây nhiễm virus.
D, E, F. Nhuộm các đĩa tế bào MDCK với gentian violet để xác định sự tạo thành plaque: Công thức đối
chứng (đĩa tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất hiện plaque (D); đĩa tế bào MDCK cấy truyền virus
xuất hiện plaque sau 24h (E) và 48h (F) cấy truyền virus.

Kết quả nhận được của luận án phù hợp với nhiều công bố khoa học trên thế giới
khẳng định MDCK là loại tế bào rất thích hợp cho virus A/H5N1 lây nhiễm và nhân lên
theo phương thức nhiễm sinh sản (Chen et al., 2012; Milián et al., 2017).
3.6. Phân lập chủng virus và kiểm tra tính ổn định di truyền của giống
Các chủng virus tái tổ hợp (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c) đã
phân lập được tiếp tục cấy truyền 4 lần liên tiếp vào trứng gà có phôi để thu nhận các thế hệ
virus P2, P3, P4 và P5. Thu hoạch riêng rẽ các thế hệ virus trong dịch niệu trứng để kiểm
tra: (i) Hiệu giá HA của mỗi thế hệ tương ứng với từng chủng; (ii) RT-PCR nhân bản 8 phân

đoạn gen trong genome virus với mồi đặc hiệu của từng gen và xác định trình tự nucleotide
của hai gen kháng nguyên (HA, NA) của virus thế hệ P5; (iii) kiểm tra khả năng thích ứng
nhân lên của các chủng virus ở thế hệ P5 trên tế bào MDCK. Kết quả nhận được thống kê ở
Bảng 3.5.
Kết quả xác định hiệu giá HA của các chủng virus trong dịch niệu trứng cho thấy:
Trong số các chủng virus, có 5/6 chủng (chủng 1.1, 2.1 và 3.3 của clade 1.1 + chủng 1.2 và
3.2 của clade 2.3.2.1c) có hiệu giá HA luôn ổn định ở mức HA ≥ 1: 1024 ở các thế hệ virus
từ P2 đến P5 (100% dịch niệu trứng có hiệu giá HA ≥ 1: 1024).
Yêu cầu về chất lượng giống của chủng virus ứng viên vaccine không những cần thể
hiện ở hiệu giá HA cao, mà còn cần đảm bảo đặc điểm di truyền và biểu hiện protein kháng
nguyên đúng đặc điểm di truyền qui định bởi gen kháng nguyên ổn định qua các thế hệ và ít
bị đột biến. Kết quả kiểm tra nhanh sự có mặt của đầy đủ các phân đoạn vRNA của các
chủng virus ở thế hệ P5 khẳng định thế hệ P5 của các chủng virus đều cho kết quả RT-PCR
một bước dương tính với cả 8 phân đoạn vRNA.


Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, tế bào MDCK và
tính ổn định di truyền của các chủng virus
Clade
Ký hiệu Tỷ lệ trứng có hiệu giá RTTrình
Trì Khả năng
chủng
HA ≥ 1: 1024 ở các thế PCR
tự gen nh tự
tạo CPE
virus
hệ (%)
nhân 8 HA
gen NA trên
gen

MDCK
P2
P3
P4
P5
1.1
100 100 100 100 +
KTĐ
KTĐ
+
1.1
2.1
100 100 100 100 +
KTĐ
KTĐ
+
3.3
100 100 100 100 +
KTĐ
KTĐ
+
1.2
100 100 100 100 +
KTĐ
KTĐ
+
2.3.2.1c 2.2
66,7 100 100 66,7 +
KTĐ
KTĐ

+
3.2
100 100 100 100 +
KTĐ
KTĐ
+
(+): Sản phẩm PCR dương tính với 8 phân đoạn gen có kích thước đúng theo tính toán/ có khả năng tạo
plaque; (KTĐ): Trình tự gen không thay đổi

Kết quả xác định trình tự gen H5 và N1 của 3 chủng virus thuộc clade 1.1 và 3 chủng
thuộc clade 2.3.2.1c ở thế hệ P5 chỉ ra: Gen kháng nguyên HA và NA của các chủng này
không thay đổi so với các trình tự gen HA và NA đã thiết kế tương ứng với hai clade virus.
Bên cạnh đó, vị trí qui định độc lực của virus ở trình tự gen H5 của 3 chủng rg-A/H5N1
clade 1.1 ở amino acid 338-344 là QREGTR ↓ G, và ở 3 chủng rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
các amino acid 338-343 là QRETR ↓ G. Kết quả nhận được khẳng định các chủng virus đã
kiểm tra đặc điểm di truyền đều có tính kháng nguyên giống chủng gốc, chứa gen H5 mã
hóa protein HA không chứa vùng độc và không bị lại độc.
Tiếp theo, để kiểm tra tính thích nghi của các chủng virus khi nhân giống trên tế bào
MDCK, các chủng virus tái tổ hợp nguồn gốc di truyền ngược thu nhận từ dịch trứng được
cấy truyền trên các đĩa 6 giếng nuôi cấy tế bào MDCK. Kết quả nhận được (Bảng 3.5)
khẳng định: Các mẫu nước trứng đã thu hoạch sau khi pha loãng trong đệm PBS và cấy
truyền trên tế bào MDCK đều cho kết quả xuất hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE cytopathic effect) do virus nhân lên và phá hủy tế bào MDCK. Hình ảnh thu thập trong quá
trình nghiên cứu thể hiện một phần ở Hình 3.12.

A

B

Hình 3.12. Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rg-A/H5N1
vào tế bào MDCK

A. Quan sát CPE xuất hiện ở các đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus dưới kính hiển vi quang học
B. Nhuộm phát hiện CPE với gential violet

Kết quả kiểm tra các chủng virus tái tổ hợp về hiệu suất nhân giống qua các thế hệ
nhân trong trứng, tính ổn định di truyền và khả năng thích ứng nhân lên trong tế bào MDCK
đều chỉ ra luận án đã tái tạo và sàng lọc được các chủng virus đáp ứng yêu cầu của chủng
virus ứng viên vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm.


3.7. Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí nghiệm và xác định
khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine
Hai loại chế phẩm vaccine được sản xuất từ hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và
rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1 có màu trắng đục, đồng nhất, không phân lớp.
Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu (hiệu giá HA, hiệu giá virus của dịch niệu trứng chứa
virus tái tổ hợp trước khi vô hoạt và sau khi vô hoạt, tính vô trùng đối với vi khuẩn hiếu khí
và kỵ khí, nấm men, nấm mốc) của hai chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kiểm tra một số chỉ tiêu của kháng nguyên virus trong vaccine, tính vô hoạt
và vô trùng của chế phẩm vaccine
Nội dung kiểm tra
Hiệu giá HA
Hiệu giá virus (EID50/ml)
Vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn yếm khí
Nấm
Nấm men

Trước vô hoạt
Sau vô hoạt
Trước vô hoạt
Sau vô hoạt

Trước vô hoạt
Sau vô hoạt
Trước vô hoạt
Sau vô hoạt
Trước vô hoạt
Sau vô hoạt
Trước vô hoạt
Sau vô hoạt

Kháng nguyên virus rg-A/H5N1
Clade 1.1
Clade 2.3.2.1c
1: 1024
1: 1024
108
108,6
-

Số liệu ở Hình 3.13 trình bày kết quả xác định hiệu giá HI của từng cá thể gà trong
các công thức tiêm phòng vaccine sản xuất từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1
clade 2.3.2.1c.

Hình 3.13. Hiệu giá kháng thể (HI log2) của các lô gà tiêm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1
và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau 2 và 4 tuần tiêm phòng
Gà 3 ngày tuổi ở tất cả các lô trong thí nghiệm trước tiêm phòng đều không có miễn
dịch (huyết thanh không chứa kháng thể thụ động) với virus cúm A/H5N1, thể hiện ở hiệu
giá kháng thể trung bình hình học (GMT - Geometric mean titer) < 1/2 log2. Sau 2 và 4 tuần


tiêm phòng, hiệu giá kháng thể của 100% cá thể gà (20/20) ở các lô tiêm chế phẩm vaccine

rg-A/H5N1 clade 1.1/ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tiêm 1 liều hoặc tiêm 2 liều) và lô chứng
dương đều đạt HI ≥ 4 log2, trong khi 20/20 gà ở lô chứng âm không có đáp ứng tạo kháng
thể với HI <1/2 log2. Theo qui định của Cục Thú y, một loại vaccine cúm gia cầm được công
nhận có khả năng bảo hộ đàn gia cầm nếu có tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng đạt ít nhất 70% số
cá thể kiểm tra có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log 2 (Cục Thú y, 2009). Như vậy, có thể khẳng
định hai chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đã sản xuất
đều có khả năng bảo hộ ở mức độ kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu
(hiệu giá HI ≥ 4 log2) cho 100% gà 3 ngày tuổi tiêm phòng 1 liều hoặc 2 liều vaccine (HAU
1: 1024) với bệnh do virus cúm HPAI H5N1 clade 1.1 và HPAI H5N1 clade 2.3.2.1c (tương
ứng) gây nên.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Ưu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong kỹ thuật di truyền ngược tạo
chủng virus ứng viên vaccine cúm A
Theo Engelhardt (2012), có nhiều phương pháp phát triển vaccine cúm A, nhưng di
truyền ngược (RG - Reverse Genetics) luôn được ưu tiên lựa chọn cho phát triển nhanh
chủng virus ứng viên vaccine bởi những ưu điểm: Trong thời gian ngắn (3 - 6 tháng) có thể
tái tạo chủng virus vaccine độc lực thấp bằng loại bỏ một số amino acid kiềm ở vị trí cắt của
protease trên gen HA, có hiệu suất nhân giống cao (trong trứng gà có phôi, trong tế bào).
Trong số các kỹ thuật RG cho tái tạo virus cúm tái tổ hợp, kỹ thuật RG dựa trên plasmid
được ứng dụng phổ biến hơn cả. Luận án cũng lựa chọn ứng dụng kỹ thuật RG dựa trên
plasmid cho mục tiêu tái tạo virus tái tổ hợp lắp ráp nhân tạo, phục vụ sản xuất chủng virus
vaccine cúm A/H5N1 sử dụng cho gia cầm.
Căn cứ vào những minh chứng khoa học khẳng định hiệu quả tái tạo virus cúm A
bằng RG của hệ thống gồm 8 plasmid pHW2000 của Hoffmann và đtg (2000), luận án đã
lựa chọn hệ thống plasmid pHW2000 cho tách dòng các phân đoạn cDNA của virus cúm.
Kết quả nhận được trong luận án đã thể hiện hiệu quả chuyển nhiễm cho tái tạo hạt virus
của hệ thống plasmid pHW2000 với sự lắp ráp thành công 2 virus tái tổ hợp rg-A/H5N1
clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c từ hệ thống gồm 6 + 2 plasmid pHW2000 đơn gen: 6
plasmid mang 6 phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34, kết hợp với 2 plasmid mang 2
phân đoạn gen kháng nguyên H5 HA và N1 NA của virus HPAI H5N1 clade 1.1 và clade

2.3.2.1c đang lưu hành.
4.2. Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 trong việc
nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng virus ứng viên vaccine cúm A
Theo WHO (2018), virus tái tổ hợp tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược - ứng viên cho
sản xuất vaccine cúm sống nhược độc và vaccine cúm vô hoạt - nên có đặc điểm di truyền
với 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ các chủng cho
(donor strain) đã được khẳng định về hiệu suất sinh sản trong trứng và tế bào. Các virus
cúm A thuộc loại virus cho có 6 phân đoạn gen khung đảm bảo tiềm năng nhiễm sinh sản
của virus được WHO khuyến cáo sử dụng gồm: Virus A/Puerto Rico/8/34 [PR8], virus
A/Ann Arbor/6/60 và virus A/Leningrad/134/17/57. Trong số các virus cho, virus PR8 được
sử dụng phổ biến hơn cả trong nghiên cứu sản xuất virus vaccine tái tổ hợp. Đến nay, đã có
nhiều công trình khoa học khẳng định tính ưu việt của bộ gen khung từ virus PR8: Là yếu tố
đảm bảo hiệu suất lây nhiễm theo phương thức nhiễm sinh sản (high-growth) của virus tái tổ
hợp (Jung et al., 2010; Verity et al., 2011; Engelhardt et al., 2012; Uchida et al., 2014).
Hiệu quả của bộ gen khung từ virus PR8 trong luận án thể hiện ở kết quả xác định
hiệu giá HA và hiệu giá virus của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade


2.3.2.1c khi cấy truyền vào trứng và tế bào MDCK: Có 4/9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1
và 7/9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c có hiệu giá HA thế hệ P0 khi cấy truyền vào
trứng luôn đạt trên 1: 512, hiệu giá virus (log 10 PFU/ml) đạt 7,91 - 9,16. Tiếp tục sàng lọc để
lựa chọn chủng virus có tính ổn định di truyền và có hiệu giá HA cao khi cấy truyền nhiều
lần trong trứng, luận án đã lựa chọn được 3 chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 2 chủng
virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c có hiệu giá HA luôn đạt trên 1: 1024 ở tất cả các trứng
thuộc các thế hệ từ P1 đến P5, và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên HA và NA thể
hiện với trình tự nucleotide đến thế hệ P5 không thay đổi.
4.3. Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không chứa các amino acid
kiềm độc
Trong qui trình tạo chủng virus vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngược, cDNA
của phân đoạn gen H5 HA trong plasmid cần được xử lý bằng loại bỏ các amino acid kiềm ở

vị trí vùng độc (WHO, 2018). Để loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc, có một số
phương pháp thường được sử dụng: (i) PCR đột biến điểm định hướng sử dụng enzyme giới
hạn (site-directed mutagenesis PCR using restriction enzyme); (ii) đột biến sản phẩm PCR
sử dụng mồi bắt cặp ở trước và sau vùng độc (PCR mutagenesis using blunt end primers);
(iii) sinh tổng hợp gen nhân tạo (artificial gene synthesis) có trình tự nucleotide không chứa
vùng độc.
Trong số các phương pháp thường được ứng dụng để loại bỏ các amino acid kiềm ở
vị trí vùng độc, sinh tổng hợp gen nhân tạo còn được biết đến như phương pháp DNA
printing - gen nhân tạo được sinh tổng hợp trong phòng thí nghiệm với kích thước không
giới hạn và trình tự chính xác mà không cần sợi khuôn hay primer như phương pháp PCR.
Hiện nay, phương pháp sinh tổng hợp gen nhân tạo thường được sử dụng trong nghiên cứu
và sản xuất vaccine, và đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu tạo vaccine phòng chống vi sinh
vật gây bệnh bởi những ưu điểm: Trình tự gen được tổng hợp nhanh, chính xác và an toàn.
Khai thác thuận lợi của việc thiết kế gen HA là hai trình tự gen H5 HA của hai clade
virus A/H5N1 - clade 1.1 và 2.3.2.1c, đã và đang lưu hành ở Việt Nam - đã được xác định
và công bố trên ngân hàng NCBI, luận án đã thiết kế hai gen H5 HA không chứa vùng độc
và tránh lại độc dựa trên các trình tự đã công bố, sau đó đặt sinh tổng hợp gen nhân tạo.
Việc sử dụng phương pháp sinh tổng hợp gen nhân tạo đã giúp rút ngắn thời gian và tiết
kiệm kinh phí thực hiện so với các phương pháp truyền thống khi không phải thực hiện
nhiều thao tác và công đoạn như: Thu thập mẫu virus, tách chiết vRNA, sinh tổng hợp
cDNA từ vRNA bằng phương pháp RT-PCR, tách dòng sản phẩm RT-PCR vào plasmid,
biến nạp plasmid mang gen HA vào E. coli, khuếch đại plasmid tái tổ hợp, tách chiết và tinh
sạch plasmid, thực hiện kỹ thuật PCR gây đột biến điểm định hướng trên gen HA.
4.4. Ảnh hưởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm tái tổ hợp rg-A/H5N1
clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c
Các công bố khoa học về ứng dụng di truyền ngược để chuyển nhiễm các cDNA của
virus cúm A vào tế bào chủ yếu sử dụng 3 công thức tế bào: (i) Chuyển nhiễm vào đĩa/giếng
nuôi cấy tế bào 293T (mật độ 0,2 - 1 x 10 6 tế bào) (Jung et al., 2010; Milian et al. 2017); (ii)
chuyển nhiễm vào đĩa/giếng đồng nuôi cấy 2 loại tế bào 293T và MDCK theo tỷ lệ 1 : 1 với
tổng số lượng hai loại tế bào trong môi trường nuôi cấy đạt 0,2 - 1 x 10 6 tế bào (MartínezSobrido & García-Sastre, 2010; Verity et al., 2011); (iii) chuyển nhiễm vào tế bào Vero

(Nicolson et al., 2005; Neumann et al., 2005, Song et al., 2013).
Dựa trên kinh nghiệm nghiên cứu nhiều năm về việc lựa chọn loại tế bào biến nạp
phù hợp, nhóm nghiên cứu của Hoffmann và Webster (Bệnh viện St Jude, Mỹ) đã tối ưu quá
trình chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào động vật và đã xác định được loại
tế bào thích hợp nhất cho chuyển nhiễm plasmid cho tái tạo virus tái tổ hợp là chỉ sử dụng


dòng tế bào 293T. Do vậy, luận án lựa chọn công thức tế bào cho chuyển nhiễm là sử dụng
dòng tế bào 293T nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng (mật độ 0,5 x 106 PFU/đĩa).
Kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm chuyển nhiễm các plasmid mang các phân đoạn
cDNA vào tế bào 293T là một minh chứng khẳng định tế bào 293T khi có với mật độ cao
trong môi trường chuyển nhiễm đã cho hiệu quả tái tạo hạt virus di truyền ngược cao sau
48h biến nạp: 100% mẫu dịch virus thu nhận trong các giếng biến nạp sau khi tách chiết
RNA tổng số và thực hiện phản ứng RT-PCR nhân gen HA đều cho kết quả dương tính với
phản ứng RT-PCR.
4.5. Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c trong trứng và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên của virus
Hiện nay, trên thế giới, công nghệ sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm chủ
yếu sử dụng phương pháp nhân giống virus trên trứng gà sạch có phôi bởi những ưu điểm:
Dễ thực hiện, hiệu suất nhân giống virus cao, giá thành rẻ, không đòi hỏi kỹ thuật phức
tạp... Do vậy, tiêu chí để đánh giá tính phù hợp của chủng virus ứng viên vaccine: Là chủng
độc lực thấp (LPAI), ổn định về di truyền và có hiệu suất nhân giống cao trong trứng.
Luận án đã sàng lọc được 3 chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 2 chủng virus rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c có độc lực thấp, có khả năng thích ứng nhân lên và ổn định về di
truyền gen kháng nguyên khi cấy truyền nhiều lần trong trứng, thể hiện ở đặc điểm: Có hiệu
giá HA của các thế hệ virus từ P2 - P5 đạt ≥ 1: 1024, tính ổn định di truyền thể hiện ở
protein kháng nguyên được mã hóa bởi trình tự nucleotide của gen HA và NA đến thế hệ P5
không bị biến đổi.
4.6. Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm
Vaccine cúm A/H5N1 vô hoạt nhũ dầu thuộc loại vaccine an toàn (kháng nguyên vô
hoạt) nên có thể tiêm phòng cho gà ở các lứa tuổi khác nhau: 1 - 3 ngày tuổi (Jang et al.,,

2018), 2 tuần tuổi và 3 tuần tuổi (Uchida et al., 2014). Trong luận án, gà thịt 3 ngày tuổi
được lựa chọn cho xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.
Kết quả kiểm tra tính an toàn của vaccine sản xuất từ chủng virus ứng viên rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c cho thấy: Vaccine đảm bảo tính an toàn 100% gà tiêm 2 liều vaccine (ở tất cả các lô thí nghiệm) đều sống sau 4 tuần tiêm phòng và
không biểu hiện trạng thái viêm/sưng ở vùng da cổ, không biểu hiện tình trạng bệnh lý cúm
gia cầm, trọng lượng cơ thể không khác biệt so với công thức đối chứng.
Hiệu quả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine thể hiện ở kết quả: Gà sạch 3
ngày tuổi chỉ cần tiêm 1 liều 0,5 ml vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1/ rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c đã đạt hiệu quả bảo hộ cao với 20/20 (100%) gà có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log 2 ở
tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng.
Các kết quả nhận được chứng minh luận án đã làm chủ công nghệ di truyền ngược để
lắp ráp nhân tạo thành công hai virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade
2.3.2.1c từ hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen. Sản phẩm khoa học của luận án gồm: (i) Qui
trình tái tạo chủng plasmid tái tổ hợp từ hệ thống plasmid đơn gen đã được tối ưu; (ii) 6
plasmid pHW2000 mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các protein khung của virus PR8 đã
được chuẩn bị sẵn sàng cho sự phối hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên của subtype
virus cúm A (đang lưu hành hay sẽ xuất hiện) để tái tạo chủng virus ứng viên vaccine; (iii)
các chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của
chủng ứng viên vaccine (có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng với hiệu suất nhân
giống cao, có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên và có khả năng kích thích sinh đáp
ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu đạt hiệu quả bảo hộ cao ở gà thí nghiệm).