MỤC LỤC
Trang
Danh mục chữ viết tắt
1. Định nghĩa lao kháng thuốc..................................................................................................1
2. Dịch tễ học............................................................................................................................. 2
3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc..........3
3.1. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao...................................................................................3
3.2. Cơ chế kháng isoniazid (H)..................................................................................................5
3.3. Cơ chế kháng rifampicin......................................................................................................8
3.4. Cơ chế kháng Pyrazinamid...................................................................................................10
3.5. Cơ chế kháng Ethambutol....................................................................................................11
3.6. Cơ chế kháng Steptomycin...................................................................................................12
3.7. Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai.........................................................................12
4. Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc..........................................15
4.1. Kỹ thuật PCR-RFLP............................................................................................................16
4.2. Giải trình tự ADN................................................................................................................. 17
4.3. Kỹ thuật lai đầu dò...............................................................................................................21
4.4. Xét nghiệm Real-time PCR (RT-PCR).................................................................................24
5. Điều trị lao kháng thuốc.......................................................................................................28
5.1. Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc và lao kháng nhiều thuốc...........................................28
5.2. Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc......................................................................................29
5.3. Điều trị lao siêu kháng thuốc................................................................................................30
5.4. Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao tại Việt Nam........................30
Tài liệu tham khảo


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Tiếng Việt
LĐKT

: Lao đa kháng thuốc

LSKT

: Lao siêu kháng thuốc

Tiếng Anh
ahpC

: Alkyl-hydroperoxide reducatse

Alr

: Alanine racemase

AMK

: Amikacin

ARNP

: Polymerase ARN

CPM

: Capreomycin

Cs


: Cycloserin

DCS

: D-cycloserine

Ddl

: D-alanine ligase

E

: Ethambutol

embB

: embB gene

ERDR

: Ethambutol resistance determining region

ETH

: Ethionamide

FQ

: Fluoroquinolones


H

: Isoniazid

inhA

: Enoyl-acyl carrier protein reductase


kasA

: β-ketoacyl-ACP gene

katG

: Catalase-peroxidase gene

KM

: Kanamycin

LVF

: Levofloxacin

MfpA

: Mycobacterium tuberculosis MfpA protein

Mfx


: Moxifloxacine

MIC

: Minimum inhibitory concentration

NAD

: Nicotinamide adenine dinucleotide

NADH

: Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen

ndh

: NADH dehydrogenase gene

OFL

: Ofloxacin

Ofx

: Ofloxacin

POA

: Pyrazinoic acid


Pto

: Prothionamide

PZA

: Pyrazinamidase

QRDR

: Quinolone Resistance-Determining Region

R

: Rifampicin

RFLP

: Restriction fragment length polymorphism

rpoB

: RNA Polymerase Beta Subunit gen

rpsL

: rpsL gene

RRDR


: Rifampicin Resistance-Determining Region

Rrs

: 16S rRNA gene

S

: Streptomycin

VM

: Viomycin

WHO

: World Health Organization

Z

: Pyrazinamid


1

1. Định nghĩa lao kháng thuốc
Bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là lao đa kháng thuốc (LĐKT) và lao siêu kháng thuốc
(LSKT), ngày càng diễn biến phức tạp và đang có chiều hướng gia tăng, nhất là khi có phối
hợp với nhiễm HIV/AIDS, gây nhiều khó khăn cho công tác quản lý và kiểm soát bệnh lao,

đặc biệt ở những vùng có tỉ lệ nhiễm lao cao và hoạt động chương trình chống lao không
hiệu quả. Do đó, những tiến bộ trong việc hiểu biết cơ chế hoạt động và kháng thuốc lao của
vi khuẩn lao, đặc biệt là về khía cạnh di truyền học, góp phần giúp hiểu biết sâu sắc hơn về
sinh bệnh học của những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc và cũng là cơ sở khoa học giúp
giải quyết các vấn đề quan trọng như chẩn đoán bệnh lao, phát minh những thuốc kháng lao
mới và chiến lược điều trị lao thích hợp.
Về phương diện sinh học, một dòng vi khuẩn gọi là kháng thuốc lao khi số lượng vi
khuẩn kháng thuốc lao đạt tỷ lệ > 1%. Lao kháng thuốc được định nghĩa khi vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis kháng với ít nhất một loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất
(thực hiện trong ống nghiệm). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) [9] có 4 loại lao kháng
thuốc:
1. Lao đơn kháng thuốc: khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với một
loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất.
2. Lao kháng nhiều thuốc: khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với ít
nhất hai loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất nhưng không bao gồm cả hai loại thuốc
Rifampicin và Isoniazid.
3. Lao đa kháng thuốc (LĐKT): khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng
với cả hai loại thuốc Rifampicin và Isoniazid.
4. Lao siêu kháng thuốc (LSKT): là LĐKT kết hợp với kháng bất kỳ một thứ thuốc

fluoroquinolones và kháng tối thiểu với một trong ba thuốc kháng lao loại chích hàng
thứ hai (Capreomycin, Amikacin, Kanamycin…) [8, 21].
Ngày nay, để thuận lợi cho việc quản lý bệnh lao kháng thuốc theo chương trình
chống lao, lao kháng thuốc không còn được gọi là lao kháng thuốc tiên phát và lao kháng
thuốc mắc phải mà được chia thành 2 nhóm [11]:


Lao kháng thuốc mới: là khi một bệnh nhân chưa bao giờ điều trị lao trước đó hoặc đã
điều trị lao dưới một tháng có tiếp xúc với chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.



2



Lao kháng thuốc xảy ra ở những bệnh nhân đã có điều trị lao trước đó như lao tái phát,
lao bỏ trị, lao thất hại với phác đồ I và II (thường do điều trị lao không đúng nguyên tắc
như bệnh nhân tự ý bỏ trị, hoặc dùng thuốc lao không đủ liều, không đủ thời gian, hoặc
cơ địa bệnh nhân đang mắc bệnh nặng trầm trọng gây suy giảm miễn dịch nhất là tình
trạng nhiễm HIV/AIDS, đái tháo đường, sử dụng corticoid kéo dài, bệnh lý ác tính…)

2. Dịch tễ học


Năm 1947, Pyle mô tả sự xuất hiện của kháng thuốc khi dùng Streptomycin để điều trị



lao.
Vào thập kỷ 50, đã chứng minh được sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong dòng



hoang dại M. tuberculosis ngay cả khi chưa dùng thuốc kháng lao.
Năm 1970, David chứng minh rằng kháng thuốc trong lao xuất phát từ sự xuất hiện đột
biến tự nhiên và ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn. David tính được tỷ lệ đột
biến kháng với từng loại thuốc kháng lao như Streptomycin (S), Isoniazid (H),
Rifampicin (R), Ethambutol (E). Tỷ lệ dòng đột biến kháng các loại thuốc đối với 106 vi
khuẩn như sau: 40 vi khuẩn kháng với S; 5 vi khuẩn kháng với H: 0,1 vi khuẩn kháng với
R, 10 vi khuẩn kháng với E. Và khả năng đột biến ngẫu nhiên kháng cùng lúc với 2 thuốc




R và H là 0,1/106 x 5/106.
Năm 1997, trong một khảo sát của WHO về tình trạng lao kháng thuốc trên toàn tầu đã
cho thấy tỷ lệ LĐKT mắc phải ở Nepal, Ấn Độ, NewYork, Bolivia, Hàn Quốc lần lượt là



48%, 34%, 30%; 15%, và 15% [21].
Một cuộc khảo sát khác của WHO trong giai đoạn 1999-2002 trên 55.779 trường hợp cho
thấy tỷ lệ đề kháng với một loại thuốc lao như sau: 6,3% kháng S, 5,9% kháng H; 1,4%



kháng R, và 0,8% kháng E. Tỷ lệ đa kháng thuốc lao trung bình là 1,1% (0- 14,2%) .
Năm 2004, một báo cáo của WHO cho thấy tỷ lệ LĐKT của một số nước trên toàn cầu
như sau: cao nhất là Parkistan (9,6%); kế tiếp là Afghanistan (7,3%); Nga (6,0%); Trung
quốc (5,3%); Cambodia (4,2%); Ấn Độ (3,4%); Philippines (3,25%); Việt nam (2,3%);
Tanzania (2,1%); Zimbabwe (1,9%); Nam Phi 11,5%); Myanmar (1,5%); Indonesia



(0,7%); Thái lan (0,5%); và Kenya (0%) [19].
Thống kê của WHO năm 2005 ước tính tối thiểu có 104 nước có ít nhất một trường hợp
LĐKT trong đó đa số nước có từ 50 trường hợp LĐKT trở lên.


3




Năm 2006 trong khi các chương trình chống lao trên thế giới chưa giai quyết được tình
irạng LĐKT thì nhân loại phải đối mặt với một tình trạng kháng thuốc lao mới, đó là



LSKT.
Năm 2007, trên toàn thế giới ước tính có khoảng 0,5 triệu trường hợp LĐKT, trong đó có
27 nước có tần suất mắc LĐKT cao nhất, đứng hàng đầu là Ấn Độ (131.000 trường hợp),
kế đến là Trung Quốc (112.000), Liên Bang Nga (43.000), Nam Phi (16.000) và
Bangladesh (15.000). Đồng thời, có 35 nước có tối thiểu 1 trường hợp LSKT, trong đó có



Việt Nam [20].
Đến tháng 11/2009, trên toàn thế giới có 57 nước và vùng lãnh thổ có ít nhất 1 trường



hợp LSKT [22].
Tại Việt nam, tỷ lệ LĐKT mới gia tăng từ 2,3% (vào năm 1997) đến 2,7% (vào năm
2007) và tỷ lệ LĐKT ở những bệnh nhân đã điều trị lao trước đó cũng gia tăng từ 14%
(vào năm 2004) đến 19% (vào năm 2007) [7].

3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc
3.1. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Hầu hết các loại vi khuẩn thường dùng một số cơ chế để đề kháng với các loại thuốc
kháng sinh. Những cơ chế này có thể chia thành ba nhóm:
1. Cơ chế làm vững thành tế bào (giảm tính thấm đối với thuốc và bơm đẩy).

2. Tiết ra men làm giảm hay bất hoạt tác dụng của thuốc, chẳng hạn men β-lactamases.
3. Làm thay đổi mục tiêu tác dụng của thuốc như đột biến điểm trên vùng gen khóa.


4

Hình 1. Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn
Vi khuẩn lao về cơ bản không khác biệt so với các vi khuẩn khác trong việc sử dụng
các cơ chế kháng thuốc kháng lao [10]. Cơ chế 1 và 2 thường được phát hiện trong sự đề
kháng tự nhiên của vi khuẩn lao đối với các loại thuốc kháng lao được sử dụng thường
xuyên. Tuy nhiên cơ chế 3, cơ chế đột biến gen, mới là cơ chế chính dẫn đến LĐKT và
LSKT.
Về mặt lâm sàng lao kháng thuốc chủ yếu xảy ra trong quá trình điều trị bằng thuốc
kháng lao (gọi là kháng thuốc mắc phải). Việc điều trị bằng thuốc khang lao dẫn đến áp lực
lựa chọn các dòng M. tuberculosis đột biến gen có thể chống chịu với các thuốc kháng lao.
Một số yếu tố khác góp phần dẫn đến áp lực lựa chọn chính là việc sử dụng đơn trị liệu
thuốc kháng lao, bác sĩ kê toa không phù hợp và quan trọng nhất là bệnh nhân không tuân
thủ phác đồ điều trị [8].
Mặc dù tỷ lệ xảy ra đột biến ở vi khuẩn lao tương đối thấp (10 -6-10-8 lần nhân lên của
vi khuẩn), nhưng nếu đột biến xảy ra tại một điểm (đột biến điểm) sẽ tạo ra dòng vi khuẩn
lao đơn kháng thuốc và nếu đột biến xảy ra nhiều điểm trên nhiều gen khác nhau sẽ tạo ra
dòng vi khuẩn LĐKT [15]. Các dòng kháng thuốc kháng lao này theo thời gian sẽ dần chiếm


5

ưu thế so với các dòng khác và sẽ được phát tán vào cộng đồng. Những người nhiễm dòng
lao kháng thuốc sẽ có thể mắc phải thể lao kháng thuốc trước khi được điều trị (kháng thuốc
nguyên phát).
Một số ít trực khuẩn lao

có sức đề kháng tự nhiên
với thuốc kháng lao
Chọn lọc

Đề kháng mắc phải
Sinh sản dòng kháng
thuốc trên cùng vật chủ

Đề kháng nguyên phát
Lây truyền dòng kháng
thuốc sang vật chủ khác

Hình 2. Cơ chế sinh học phân tử của lao kháng thuốc
3.2. Cơ chế kháng isoniazid (H)
H có thể nói là thuốc kháng lao hàng thứ nhất hiệu quả nhất trong phác đồ điều trị lao.
Trực khuẩn lao nhạy cảm cao với H (nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của H chỉ từ 0,02-0,2
μg/ml) vì vậy H có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt các trực khuẩn lao đang phân chia. H có
khả năng chống lại các dòng vi khuẩn lao kháng với các loại thuốc kháng lao khác, tuy nhiên
lại là thuốc dễ bị kháng lại nhất trong phác đồ ngắn ngày 6 tháng.
3.2.1. Cơ chế kháng vi khuẩn lao của isoniazid
H sẽ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn lao dưới dạng tiền thuốc và được kích hoạt bằng
men catalase-peroxidase (men katG). Hoạt động peroxidase (oxi hóa) của men katG sẽ kích
hoạt H trở thành một dạng chất gây độc (isonicotinc acid ) đối với màng tế bào vi khuẩn lao.
Dạng chất gây độc của H tác động đến hai chất chính là men inhA và men kasA đóng vai trò
quan trọng trong quá trình tổng hợp mycolic acid, là thành phần cấu tạo nên màng tế bào.
Nếu vi khuẩn thiếu mycolic acid sẽ không thể duy trì tính bền vững của tế bào và sẽ bị chết
[4].


6


3.2.2. Cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao
Cho đến nay cơ chế kháng H của trực khuẩn lao vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn.
Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp lao kháng H đều phát hiện các đột biến một số gen
trong hệ gen của trực khuẩn lao. Các gen thường bị đột biến nhất là các gen katG, inhA,
ahpC, kasA, và ndh. Ngoài ra có ít nhất 16 gen khác cũng đột biến gây kháng H [4].
Đột biến tại gen katG
Gen katG chính là gen mã hóa tổng hợp nên men katG. Các nghiên cứu thử nghiệm
trong ống nghiệm cho thấy nếu gen katG của vi khuẩn bị mất đi thì vi khuẩn sẽ có tính
kháng H, ngược lại nếu gen katG được phục hồi vi khuẩn sẽ lại nhạy cảm với H. Tuy nhiên
trên lâm sàng, các mẫu phân lập được vi khuẩn lao kháng H đều cho thấy gen katG hầu hết
đều bị đột biến chứ không mất đi. Đột biến gen katG dẫn đến giảm hoạt tính của men katG,
từ đó gây kháng H.
Có đến 40-95% các trường hợp kháng H là do các biến đổi của gen katG. Các nghiên
cứu cho thấy đột biến của gen katG thường xảy ra trong đoạn gen từ codon 138-328 trong đó
đột biến tại codon 315 là phổ biến nhất (75-90%). Có đến 53-96% các trường hợp đột biến
tại codon 315 là dạng đột biến thay thế một nucleotide (gọi là đột biến S315T). Việc tại sao
đột biến lại thường xảy ra trong đoạn codon 138-328 được các nhà khoa học lý giải là do đột
biến tại đoạn này vừa có thể làm suy giảm hiệu quả dược lực của H vừa không làm mất đi
hoạt tính của men katG.
Mặc dù đột biến S315T là đột biến phổ biến nhất nhưng các dạng đột biến tại các
codon khác như V33Stop, D65E, D94A, G99E, H108E, N138S/H, S140A/N, D142A,
L150A, S160L, A172T, T180C, V200Stop, F252L, T262R, P275T, Q294Stop, W299G,
W328G, I335T, A350S của gen katG cũng ảnh hưởng đến việc tổng hợp và chức năng của
men katG và vì vậy cũng đóng vai trò không nhỏ trong việc kháng H của vi khuẩn lao.
Đột biến tại gen ahpC
Các nghiên cứu cho thấy khi có đột biến tại gen katG làm giảm hoạt tính của men
katG thì đồng thời xảy ra quá trình tăng tổng hợp men alkyl hydroperoxide reductase (men
ahpC) có tác dụng khử độc các gốc peroxide bị tổn hại do tác dụng oxi hóa của H. Lý giải



7

hiện tượng này các nhà khoa học chứng minh rằng dưới tác dụng oxi hóa của H, men katG
buộc phải tăng tổng hợp tạo điều kiện cho việc chuyển hóa H thành chất gây độc đối với tế
bào vi khuẩn lao, do đó men ahpC phải được tăng tổng hợp để ngăn chặn các tác động oxi
hóa của H.
Việc tăng tổng hợp men ahpC xảy ra là do các đột biến tại gen ahpC. Có 5 loại biến
đổi nucleotide trong vùng khởi động của gen ahpC đã được phát hiện có thể dẫn đến việc
tăng tổng hợp men ahpC bao gồm −48(G→A), −51(G→A), −54(C→T), −74(G→A) và
−81(C→T) [17]. Ngoài ra các đột biến tại vùng chuyển tiếp gen oxyR-ahpC cũng dẫn đến
việc tăng tổng hợp men ahpC, tuy nhiên mối quan hệ này cần phải được nghiên cứu thêm.
Đột biến gen inhA
Trong tế bào vi khuẩn, men inhA (được mã hóa bởi gen inhA) trong điều kiện bình
thường sẽ kết hợp với NADH tạo thành phức hợp tham gia vào quá trình tổng hợp mycolic
acid. Tuy nhiên khi có sự hiện diện của H dạng hoạt tính, phân tử H hoạt tính sẽ gắn với
phức hợp inhA-NADH gây ức chế quá trình tổng hợp mycolic acid.
Các nghiên cứu cho thấy đột biến tại gen inhA mã hóa cho men inhA là một trong các
nguyên nhân gây lao kháng H. Men inhA được mã hóa trên một operon tạo thành từ gen
inhA và mabA. Hiện nay đã phát hiện được 6 loại đột biến điểm gây kháng H liên quan đến
cấu trúc của gen inhA (I16T, I21T, I21V, I47T, V78A, và I95P), tuy nhiên tỷ lệ các trường
hợp lao kháng H do đột biến tại gen inhA rất thấp chỉ vào khoảng 0-5%. Có đến 8-20% các
trường hợp đột biến tại gen inhA xảy ra tại vùng khởi động của operon, phổ biến là các vị trí
−24(G-T), −16(A-G), hoặc −8(T-G/A) và −15(C-T). Đột biến tại gen inhA không chỉ gây
kháng H mà còn có thể gây kháng chéo với thuốc kháng lao hàng hai là ethionamide (ETH)
vì thuốc này có cấu trúc tương tự với H.
Đột biến gen kasA và ndh
Gần đây các nhà khoa học còn phát hiện thêm các đột biến gây kháng H trên các gen
kasA và ndh, nhưng tỷ lệ các trường hợp đột biến hai gen này rất thấp.
Gen kasA mã hóa tổng hợp men β-ketoacyl-ACP synthase (men KasA) tham gia vào

quá trình tổng hợp mycolic acids của vi khuẩn. Đột biến tại gen kasA có thể gây kháng H
với MIC là 0,1 μg/ml. Các phân tích di truyền trên gen kasA bị đột biến cho thấy một số


8

codon bị đột biến thay thế bao gồm codon 66 (GAT→AAT), codon 121 (AGG→AAG),
codon 269 (GGT→AGT), codon 312 (GGC→AGC), codon 387 (GGC→GAG) và codon
413 (TTC→TTA). Mặc dù, đột biến tại gen kasA cũng được phát hiện trong các trường hợp
lao vẫn còn nhạy với H, nhưng đột biến tại gen kasA có thể là một cơ chế có khả năng gây
kháng H của trực khuẩn lao.
Gen ndh là gen mã hóa tổng hợp men NADH gắn kết với protein inhA tham gia tổng
hợp mycolic acid, gần đây được phát hiện cũng gây kháng H và E trên chủng M. bovis. H
dưới dạng hoạt tính sẽ gắn kết cộng hóa trị với NAD là một phân tử bị khử oxi hóa của men
NADH. Phức hợp H-NAD sẽ cạnh tranh với men NADH gắn kết với men inhA ức chế tổng
hợp mycolic acid của tế bào vi khuẩn. Khi đột biến xảy ra ở gen ndh, sẽ làm suy giảm hoạt
động oxi hóa của men NADH làm chúng không thể oxi hóa thành NAD, vì vậy làm giảm sự
kết hợp với H, hay nói cách khác làm giảm hiệu lực của H. Có khoảng 9,5% các trường hợp
lao kháng H có đột biến điểm gen ndh tại các codon 110 và 168, và các đột biến này không
thấy ở các trường hợp còn nhạy với H.
3.3. Cơ chế kháng rifampicin
3.3.1. Cơ chế kháng lao của rifampicin
Men polymerase ARN (ARNP) đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình dịch
mã. Ở vi khuẩn, ARNP chịu trách nhiệm tổng hợp nên ARNm, ARNr và ARNt. Nhân của
men ARNP có trọng lượng 400 KDa bao gồm 5 tiểu đơn vị là nhị phân tử α (α2), tiểu đơn vị
β, tiểu đơn vị β’ và tiểu đơn vị ω. Các tiểu đơn vị sẽ gắn với tiểu đơn vị σ tạo thành men
hoàn chỉnh để kích hoạt quá trình dịch mã tại vùng vận hành. Các gen mã hóa cho các tiểu
đơn vị α, β, β’, ω và σ được kí hiệu là rpoA, rpoB, rpoC, rpoZ và rpoD.
Rifampicin (R) là thuốc kháng lao hàng thứ nhất có hiệu quả điều trị cao vì R sẽ gắn
vào tiểu đơn vị β, và chặn việc tạo thành chuỗi ARN ngay khi chỉ mới 2-3 nucleotid được

gắn vào chuỗi ARN.
Tỷ lệ kháng R tương đối thấp chỉ vào khoảng 10 -7-10-8 lần phân chia của vi khuẩn
lao. Do đó các trường hợp đơn kháng với R rất hiếm, ngoại trừ ở bệnh nhân nhiễm HIV. Trên
90% các trường hợp kháng R cũng kháng với H vì vậy kháng R được xem như là yếu tố chỉ
điểm các trường hợp LĐKT. R không chỉ có tác dụng với các vi khuẩn lao đang phát triển


9

mà còn trên cả thể tiềm ẩn với MIC từ 0,05-1 μg/ml trên môi trường cấy lỏng hoặc đặc
nhưng có MIC cao hơn trong môi trường trứng (MIC = 2.5 - 10 μg/ml). Các dòng có MIC <
1 μg/ml khi cấy trong môi trường agar hoặc môi trường lỏng hoặc MICs ˂ 40 μg/ml trong
môi trường Lowenstein-Jensen được xem là còn nhạy với R.
3.3.2. Cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao
Các nghiên cứu phân tích các trường hợp lao kháng R cho thấy có rất nhiều loại đột
biến xảy ra trên gen rpoB của vi khuẩn lao. 94% - 98% các trường hợp lao kháng R có đột
biến xảy ra tại một vùng gồm 81 cặp base trên gen rpoB tương ứng từ codon 507 đến 533
gọi là vùng quyết định kháng rifampicin (RRDR). Có khoảng 69 kiểu đột biến thay thế một
nucleotid, 3 kiểu chèn nucleotid, 16 kiểu loại bỏ nucleotid và 38 kiểu thay thế nhiều
nucleotid trên vùng RRDR [9]. Đột biến tại codon 531 và 526 là phổ biến nhất (81%) và
thường dẫn đến mức độ kháng kiểu hình cao (MIC > 64 µg/ml) và gây kháng chéo với các
loại thuốc khác thuộc nhóm rifamycins. Đột biến tại codon 511, 516, 518 và 522 dẫn đến
mức kháng thấp đối với R và rifapentine; và đôi khi làm tăng nhạy đối với rifabutin. Ngoài
các codon trong vùng RRDR bị đột biến, một số ít trường hợp lao kháng R (< 5%) có đột
biến xảy ra ngoài vùng RRDR chẳng hạn như đột biến tại codon 481, 490, 498, 505, 534,
535, 553, 561, 571, 572, 633, và 672.

Hình 3. Đột biến sai nghĩa ở gen rpoB gây kháng với R



10

Hình 4. Đột biến sai nghĩa ngoài vùng RRDR của gen ropB gây kháng R
Tần suất và bản chất của các trường hợp lao kháng R không chỉ phụ thuộc vào các đột
biến trên gen rpoB mà còn thay đổi tùy vào khu vực địa lý cũng như chủng tộc. Kapur và
cộng sự tiến hành thu thập mẫu lao kháng R tại Mỹ cho thấy dòng vi khuẩn lao có đột biến
thay thế CAC→TAC tại codon 526 trên gen rpoB chiếm đến 30% nhưng tại 9 quốc gia khác
đột biến dạng này chỉ chiếm 12% [18]. Một nghiên cứu của Taniguchi phát hiện các dòng
lao kháng R và dòng nhạy với R đều có đột biến tại codon 533 [16], nhưng các nghiên cứu
tại Brazil, Pháp, và tại Việt Nam lại cho thấy đột biến dạng này chỉ xảy ra ở dòng kháng R
[5, 14].
3.4. Cơ chế kháng Pyrazinamid
3.4.1. Cơ chế kháng vi khuẩn lao của pyrazinamid
Pyrazinamid (Z) là thuốc kháng lao hàng thứ nhất quan trọng không kém H và R
trong điều trị lao bởi vì Z có thể tiêu diệt vi khuẩn lao thể tiềm ẩn tồn tại tại các tổn thương
lao có nồng độ pH toan mà các thuốc khác không thể tiêu diệt được. Z chỉ có hoạt lực trong
môi trường pH toan, nhưng thậm chí trong môi trường pH toan hoạt lực của Z tương đối
thấp với MIC từ 6.25- 50 μg/ml.
Z là một tiền thuốc cần phải được chuyển thành dạng hoạt tính (pyrazinoic acid
(POA)) bằng men pyrazinamidase (PZAse)/nicotinamidase được mã hóa bởi gen pncA của


11

vi khuẩn lao. Z sẽ tiếp cận bề mặt tế bào vi khuẩn, thâm nhập vào nội bào qua con đường
khuyếch tán thụ động. Sự tích tụ POA và POA proton hóa sẽ làm giảm nồng độ pH nội bào
tạo thành môi trường kém thuận lợi cho một số quá trình sinh hóa của vi khuẩn như quá
trình tổng hợp acid mỡ và các chức năng vận chuyển màng. Bên cạnh đó các POA proton
hóa cũng sẽ mang các proton vào tế bào vi khuẩn gây hiện tượng toan hóa tế bào chất và làm
giảm chức năng vận chuyển màng tế bào bằng cách phá hủy lực vận chuyển proton của

màng tế bào.
3.4.2. Cơ chế kháng pyrazinamid của vi khuẩn lao
Cơ chế lao kháng Z cho đến nay vẫn chưa rõ. Ở các dòng lao kháng Z, các nhà khoa
học phát hiện các dòng này thiếu hoạt động của men PZA và có các đột biến tại gen pncA.
Có đến 72-95% các trường hợp lao kháng Z xảy ra là do đột biến tại gen pncA và các đột
biến này xảy ra tại nhiều nơi trên toàn bộ gen, mặc dù có 3 khu vực hay xảy ra đột biến cụm
xung quanh các acid amino 3-71, 61-85 và 132 – 142.
3.5. Cơ chế kháng Ethambutol
3.5.1. Cơ chế kháng vi khuẩn lao của ethambutol
Ethambutol (E) là một trong 4 thuốc thiết yếu dùng để ngăn ngừa các trường hợp
kháng thuốc. E có tác dụng tiêu diệt các trực khuẩn đang sinh trưởng nhưng lại không có tác
dụng trên trực khuẩn thể tiềm ẩn.
Có nhiều giả thuyết được đặt ra để giải thích cơ chế tác dụng của E đối với vi khuẩn
lao, nhưng giả thuyết được cho hợp lý nhất chính là E gây ra những biến đổi có hại trên cấu
trúc màng tế bào vi khuẩn. E sẽ ức chế hoạt động của men Arabinosyl transferase, là một
men dùng để tổng hợp arabinogalactan, chất trung gian dùng để tổng hợp arabinogalactan và
lipoarabinomannan, hai chất cấu thành nên màng tế bào vi khuẩn.
3.5.2. Cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao
Men Arabinosyl transferase được mã hóa bởi gen embB. Gen embB cùng với gen
embC và embA tạo thành một operon 10-kb được đặt tên là embCAB. Các đột biến tại
operon embCAB, mà cụ thể là gen embB, tạo ra các dòng lao kháng E. Có đến > 68% các
trường hợp lao kháng E là do đột biến tại codon 306 trên gen embB, do đó vùng này còn gọi
là vùng quyết định kháng E (ERDR). Trong vùng này thường xảy ra đột biến dạng thay thế


12

trong đó amino acid M306 thường được thay thế bằng isoleucine, leucine hoặc valine. Tuy
nhiên vẫn có khoảng 35% các trường hợp lao kháng E không có các đột biến tại gen embB.
Điều này gợi ý rằng vẫn còn một cơ chế khác gây ra lao kháng E.

3.6. Cơ chế kháng Steptomycin
3.6.1. Cơ chế kháng lao của Streptomycin
Streptomycin (S) là một aminocyclitol glycoside được WHO khuyến cáo dùng thay
thế được cho các thuốc kháng lao hàng thứ nhất. S có hoạt lực đối với các trực khuẩn lao
đang sinh trưởng với MIC từ 2- 4 μg/ml, nhưng lại bất hoạt đối với các trực khuẩn không
sinh trưởng hoặc tồn tại nội bào. S là aminoglycosides ít gây độc nhất nhưng lại có tốc độ
kháng rất nhanh.
Cơ chế tác dụng của S được chứng minh là ở cấp độ ribosom trên nhiều loại vi khuẩn
khác nhau trong đó có trực khuẩn lao. S sẽ gắn kết với tiểu đơn vị 30S của ribosom vi khuẩn
tương tác với ARNr 16S và protein ribosom S12 gây biến đổi ribosom từ đó gây dịch mã sai
ARNm và ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn.
3.6.2. Cơ chế kháng Streptomycin của vi khuẩn lao
Lao kháng S xảy ra khi có các đột biến xảy ra tại các gen tổng hợp nên ARNr 16S
(gen rrs) và protein ribosom S12 (gen rpsL). Có đến 65-67% các trường hợp lao kháng S là
do các đột biến xảy ra tại hai gen rrs và rpsL. 50% các trường hợp lao kháng S có đột biến
gen rpsL tại các vị trí codon 43 (AAG→AGG/ACG; K→R/T) và codon 88
(AAG→AGG/CAG; K→R/Q). Có khoảng 20% các trường hợp lao kháng S có đột biến
điểm thay thế C→T tại vị trí 491, 512 và 516, và A→C/T tại vị trí 513 trên vùng lặp 530 của
phân tử ARNr 16S.
Các nghiên cứu cho thấy các đột biến thay thế amino acid trên gen rpsL sẽ tạo ra
dòng vi khuẩn lao có sức kháng thuốc cao trong khi đột biến tại gen rrs sẽ tạo ra dòng kháng
trung bình và các đột biến xảy ra ngoài hai gen này đều tạo ra dòng kháng yếu.
3.7. Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai
Nhóm thuốc fluoroquinolones
Levofloxacin (LVF) và ofloxacin (OFL) là hai thuốc thuộc nhóm FQ được sử dụng
làm thuốc điều trị kháng lao hàng hai. Cơ chế tác dụng của hai thuốc này cũng như các thuốc


13


khác cùng nhóm chính là ức chế men ADN gyrase (topoisomerase II) và topoisomerase IV
(là hai men thiết yếu chịu trách nhiệm duy trì hình dạng đặc trưng của nhiễm sắc thể của vi
khuẩn) dẫn đến vi khuẩn lao bị chết.
Men ADN gyrase là một tứ phân A2B2 trong đó tiểu đơn vị A mang vị trí hoạt hóa tái
kết hợp/phân rã và tiểu đơn vị B kích hoạt thủy phân adenosine triphosphate. Vi khuẩn lao
có gen gyrA và gen gyrB mã hóa các tiểu đơn vị A và B. Trên hai gen này đều có các vùng
quyết định kháng với quinolone (QRDR) gồm 320 cặp base và 375 cặp base. Hiện nay các
đột biến với thuốc FQ đều liên quan đến đột biến tại vùng QRDR của gen gyrA còn đột biến
gen gyrB chỉ mới phát hiện trong thực nghiệm.
Tỷ lệ các dòng lao kháng với FQ được phát hiện trong nhiều nghiên cứu cũng rất
khác nhau dao động từ 2-100%. Điều này là do có sự khác biệt về độ phủ của hệ gen vi
khuẩn lao, định nghĩa ngưỡng MIC và có lẽ là do có cơ chế khác gây kháng FQ chưa được
phát hiện. Gần đây một nghiên cứu phát hiện một cơ chế gây kháng FQ mới trong đó phân
tử MfpA (một loại phân tử lặp pentapeptid) có khả năng gắn vào ADN gyrase và ức chế hoạt
động của men này [13]. Tuy nhiên cơ chế này gây mức độ kháng thấp do đó ít được quan
tâm.
Nhóm aminoglycoside
Kanamycin (KM) và chiết xuất là amikacin (AMK), là các thuốc thuộc nhóm
aminoglycoside có tác dụng ức chế tổng hợp protein thông qua cơ chế làm thay đổi cấu trúc
ribosome tại ARNr 16S. Các thuốc này sẽ gắn kết với ribosome của vi khuẩn và gây rối loạn
quá trình nối amino acid vào chuỗi peptid của vi khuẩn. Vì cơ chế của KM và AMK tương
tự như S nên có thể gây khả năng kháng chéo, mặc dù không phải 100% các trường hợp lao
kháng S đều kháng với KM và AMK. Các đột biến tại vị trí 1400, 1401 và 1483 của gen rrs
(tổng hợp ARNr 16S) sẽ gây ra kháng với KM và AMK.
Nhóm polypeptid
Viomycin (VM) và capreomycin (CPM) là các kháng sinh thuộc nhóm polypeptide có
cơ chế tác dụng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên nhóm này được biết là có khả
năng ức chế tổng hợp protein prokaryotic và được dùng làm thuốc kháng lao hàng thứ hai.



14

Bởi vì nhóm thuốc này có hoạt lực chống lại các dạng lao mạn tính do đó các nhà
khoa học cho rằng cơ chế tác dụng của nhóm này có thể có tác dụng ngoài ribosom. Men
ARNr methyl transferase được mã hóa bởi gen tlyA được chứng minh là có mối liên quan
với kháng CPM và VM. Men này giúp bổ sung nucleotide C1409 tại vòng xoắn 44 của
ARNr 16S và nucleotide C1920 tại vòng xoắn 69 của ARNr 23S. Ngoài ra đột biến tại gen
rrs mã hóa ra ARNr 16S cũng đóng vai trò trong việc kháng với VM và CPM, đặc biệt là các
đột biến thay thế nucleotide G→T tại codon 1484. Kháng chéo giữa KM, AMK, CPM và
VM cũng đã được phát hiện.
Nhóm D-cycloserin và Ethionamide
Ethionamide (ETH) là một thuốc quan trọng trong điều trị LĐKT và có cơ chế tác
dụng cũng như cấu trúc tương tự như H. Giống như H, ETH được cho là một tiền thuốc. Tuy
nhiên ETH được kích hoạt bằng một cơ chế phụ thuộc vào katG dẫn đến việc hình thành một
chất chuyển hóa S-oxide có hoạt lực đáng kể so với thuốc gốc. Các nghiên cứu cho thấy gen
ethA (hay còn gọi là etaA) mã hóa cho men flavin mono-oxy-genase chịu trách nhiệm kích
hoạt ETH.
Cơ chế tác dụng của dạng hoạt hóa của ETH chính là ức chế gen inhA sản xuất men
inhA. Thuốc được hoạt hóa sẽ phá hủy việc sinh tổng hợp màng tế bào bằng cách ức chế
tổng hợp mycolic acid. Đột biến tại vùng vận hành của gen inhA và ethA có liên quan đến
kháng ETH. Chỉ có các đột biến tại gen inhA mới có thể dẫn đến dạng lao kháng chéo giữa
H và ETH.
D-cycloserine (DCS) là một đồng phân vòng của amino acid D-alanine, là một trong
nhiều phân tử đóng vai trò quan trọng trong các bước liên kết chéo trong quá trình tổng hợp
peptideoglycan. DCS sẽ ức chế alanine racemase (Alr) và D-alanine. Men D-alanine ligase
(Ddl) tổng hợp nên nhân pentapeptide bằng cách sử dụng D-alanine; cả hai men này đều
thiết yếu trong tổng hợp peptidoglycan và tổng hợp màng tế bào và duy trì màng tế bào. Các
đột biến xảy ra tại gen alr mã hóa cho alanine racemase, đặc biệt là đột biến ngược G→T tại
vùng vận hành sẽ gây ra kháng DCS.



15

Bảng 5. Bảng tóm tắt các đột biến gây kháng các loại thuốc kháng lao
Thuốc
Rifampicin
Isoniazide
Ethionamide
Streptomycin
Pyrazinamide
Ethambutol

Gen bị đột biến

Tần suất xuất hiện trong các

RNA Polymerase (rpoB)
Catalase peroxidase (KatG)
Alky-hydro-reductase (OxyR-ahpc)
Enoyl-ACP reductase (inhA)
protein ribosom S12 (rpsl)
16S RNA (rrs)
pyrazinamidase (pncA)
Arabinosyl transferase (EmbCAB)

dòng lao kháng thuốc
>95
60-70
–20
<10

60
<10
70-100
69

4. Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc
Việc chẩn đoán LĐKT bằng phương pháp kháng sinh đồ cổ điển thường cho kết quả
chậm, vì vậy làm tăng khả năng mắc thêm các loại lao kháng thuốc khác cho bệnh nhân,
đồng thời làm tăng sự phát tán các dòng lao kháng thuốc trong dân số. Chính điều này dẫn
đến việc nghiên cứu các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán LĐKT một cách nhanh chóng
hơn. WHO đã khuyến cáo trên toàn cầu cần phải sử dụng các xét nghiệm kiểu gen nhanh
nhằm chẩn đoán LĐKT. Các xét nghiệm này cần có khả năng phát hiện đột biến gây kháng
H và R. Trong trường hợp LSKT, các đột biến chịu trách nhiệm gây kháng với streptomycin,
amikacin, kanamycin, capreomycin và FQ cũng phải được tầm soát.
Các phương pháp xét nghiệm kiểu gen (xét nghiệm sinh học phân tử) dùng để phát
hiện các thể LĐKT trên bệnh nhân có thể trả kết quả trong vòng 1-2 ngày và có thể thực hiện
trực tiếp trên mẫu đàm dương tính hoặc các mẫu bệnh phẩm khác [12]. Mặc dù các phương
pháp xét nghiệm sinh học phân tử được phát triển nhằm phát hiện kháng các thuốc dòng thứ
nhất và thứ hai nhưng các xét nghiệm phát hiện kháng R vẫn được sử dụng phổ biến rộng rãi
hơn bởi vì có đến 90-95% các dòng lao kháng R đều chỉ đột biến trong một vùng nhỏ RRDR
(81 cặp base) của gene rpoB và kháng R chính là dấu chỉ của LĐKT. Đối với các loại thuốc
kháng lao khác, độ nhạy trong việc phát hiện lao kháng thuốc thay đổi rất lớn do số lượng
locus gen bị đột biến lớn và số đột biến cũng khá nhiều [3].


16

4.1. Kỹ thuật PCR-RFLP
Trong sinh học phân tử, kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, hay còn gọi là
RFLP, là kỹ thuật khai thác những khác biệt trong trình tự DNA. Trong phân tích RFLP,

ADN mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn, và sau
đó các đoạn ADN nhỏ tạo thành được phân tách dựa theo kích thước bằng kỹ thuật điện di
trên gel. Mặc dù ngày nay kỹ thuật này đã trở nên lỗi thời do bị thay thế bởi công nghệ giải
trình tự, RFLP là công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên đủ rẻ để có thể được ứng
dụng một cách rộng rãi [2].
Quy trình thực hiện kỹ thuật này bao gồm các bước:
1) Tách chiết và tinh sạch ADN: Một khúm vi khuẩn từ mẫu cấy phân lập M. tuberculosis sẽ
được trộn vào hỗn hợp thích hợp, sau đó được quay ly tâm. 5 µl lớp bề mặt của hỗn hợp sẽ
được lấy để làm PCR.
2) Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR sẽ được thực hiện với mồi thích hợp trên một
vùng 519 cặp base của gen katG.
3) Cắt sản phẩm PCR trộn với mồi và ủ trong enzym giới hạn chịu nhiệt.
4) Điện di ADN trên gel agarose.
5) Áp dụng kỹ thuật Southern Blotting với các bước bao gồm chuyển ADN sang màng
nylon, chọn đoạn dò, đánh dấu đoạn dò, lai với mẫu dò được đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ, rửa màng lai, phát hiện phân tử lai nhờ phóng xạ tự ghi.


17

Hình 5. Các bước tiến hành kỹ thuật PCR-RFPL
Trong chẩn đoán lao kháng thuốc, phương pháp PCR-RFLP dùng để phát hiện sự
khác biệt về trình tự ADN tại một hoặc một vài codon bị đột biến ở dòng lao kháng thuốc.
Kỹ thuật PCRR-FLP được sử dụng chủ yếu để phát hiện đột biến tại codon 315 của gen katG
(katG315) gây kháng H và đột biến tại codon 306 của gen embB (embB306) gây kháng E.
4.2. Giải trình tự ADN
4.2.1. Giải trình tự cổ điển
Giải trình tự ADN của sản phẩm khuếch đại PCR là phương pháp trước đây được sử
dụng phổ biến nhất vì độ chính xác và độ tin cậy cao trong chẩn đoán các dạng đột biến.
Giải trình tự gen không những phát hiện các đột biến kháng R mà còn có thể xác định các

dạng đột biến của các thuốc kháng lao khác. Tuy nhiên hiện nay giải trình tự ADN ít được sử
dụng vì mắc tiền, đòi hỏi chuyên môn cao và tốn thời gian. Mặc dù vậy, giải trình tự ADN
vẫn còn được sử dụng trong các nghiên cứu và các phòng xét nghiệm y tế công cộng.
Cách tiến hành
Phương pháp giải trình tự gen trải qua nhiều bước như sau:


ADN từ mẫu bệnh phẩm phân lập được M. tuberculosis sẽ được tách bằng cách sử dụng
phương pháp DNAPRE-BOOM. Mẫu ADN tách sẽ được giữ trong hỗn dịch MGIT tại
nhiệt độ 80˚C trong vòng 10 phút. Sau 10 phút quay ly tâm với tốc 3000 rpm, phần nổi



lên sẽ được dùng làm ADN mẫu cho khuếch đại PCR.
ADN đã tách chiết được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR có chiều dài 528 cặp base,
khuếch đại trên vùng kháng R của gen rpoB cùng với cặp mồi đặc hiệu VSF1: 5’-



ACCGACGACATCGACCACTT-3’ và VSR1: 5’- GGCGGTCAGGTACACGATCT-3
Tách dòng gen rpoB: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được tạo vector tái tổ hợp bằng kit



A1360- Promega.
Giải trình tự ADN: Các chủng đa kháng, siêu đa kháng tách dòng thành công và sản
phẩm PCR của chủng đơn kháng, chủng nhạy thuốc được giải trình tự ADN, trên hệ
thống ABI Prism® 3130Xl Genetic analyzer (Applied Biosystems, USA), cùng với các
bộ sinh phẩm BigDye@ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; Applied Biosystems;
DyeExTM 2.0 Spin kit; QIAGEN



18



Phân tích kết quả giải trình tự, xác định được đột biến liên quan kháng R của các chủng
vi khuẩn lao kháng thuốc

Hình 7. Các bước tiến hành giải trình tự ADN

Giá trị xét nghiệm
Phương pháp giải trình tự ADN là một phương pháp có độ chính xác cao (độ nhạy
97% và độ đặc hiệu là 100%) và cho kết quả nhanh hơn hẳn so với cấy kháng sinh đồ. Xét
nghiệm giải trình tự ADN có thể phát hiện các đột biến tại codon 315 và/hoặc codon 463 của
gen katG gây kháng H. Xét nghiệm còn có thể phát hiện đột biến tại codon 507/511/ 513/
514/ 516/ 518/ 522/ 526/ 531/ 533 của gen rpoB gây kháng R.
Phương pháp giải trình tự ADN có thể đọc được một số lượng lớn các mẫu ADN. Nó
là phương pháp nền tảng dựa trên đó nhiều xét nghiệm phân tử nhanh (ví dụ xét nghiệm lai
đầu dò, RT-PCR, và giải trình tự bằng nhiệt) được phát triển. Lợi điểm khác của giải trình tự
ADN chính là có thể vừa phát hiện được các đột biến mới và các đột biến đã biết.


19

4.2.2. Giải trình tự bằng nhiệt (Pyrosequencing)
Giải trình tự bằng nhiệt là phương pháp giải trình tự ADN nhanh, tự động được sử
dụng gần đây để phát hiện đột biến lao kháng thuốc. Pyrosequencing là một phương pháp
tạo ra nhiều đoạn ADN có sự tương đồng cao với các bước như sau:



Đầu tiên ADN được cắt thành các đoạn đầu bằng (blunt end), và được gắn các
oligonucleotide adaptor vào cả hai đầu.



Từng đoạn này sau đó gắn với một hạt thủy tinh, và sẽ được khuếch đại bằng PCR trong
các giọt nhũ dầu-nước, tạo ra nhiều bản sao đoạn DNA trên mỗi hạt thủy tinh.



Sau đó các hạt thủy tinh được giữ trong các giếng picotiter trên một cơ chất dạng sợi, và
giải trình tự. Quá trình giải trình tự diễn ra qua 5 bước: 1) Đầu tiên, sợi khuôn, một sản
phẩm PCR sợi đơn, được lai với một mồi giải trình tự và sau đó được ủ với các enzyme
DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase cũng như các cơ chất adenosine
5’ phosphosulfate (APS) và luciferin. 2) Khi dNTP đầu tiên được bắt cặp bổ sung, nó
được gắn với sợi DNA khuôn nhờ DNA polymerase và kèm theo sẽ giải phóng một PPi.
3) PPi được biến đổi thành ATP nhờ enzyme ATP sulfyrelase cùng với sự tham gia của
APS, sau đó một phản ứng được xúc tác bởi luciferase sẽ biến đổi luciferin thành
oxyluciferin-tạo ra ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành.
Ánh sáng này được nhận biết bởi một camera và phân tích bởi một chương trình phần
mềm. 4) Apyrase làm suy biến các nucleotide không bắt cặp và ATP. Sau quá trình làm
suy biến, phản ứng bắt đầu lại với nucleotide khác được gắn vào. Sau một quá trình liên
tục, sợi DNA bổ sung được tổng hợp xong và việc giải trình tự nucleotide được xác định
từ các đỉnh tín hiệu dựa trên "dấu vết của pyrogram (pyrogram trace)"


20

Hình 8. Cách thức tiến hành giải trình tự nhiệt

Tương tự như phương pháp giải trình tự cổ điển, giải trình tự bằng nhiệt có thể cung
cấp chính xác trình tự ADN, vì vậy có thể phát hiện được cả các đột biến mới và đột biến cũ
trước đó. Điểm mạnh của phương pháp này so với phương pháp giải trình tự cổ điển chính là
chi phí thấp hơn, tốc độ và quá trình xử lý đơn giản, dễ đọc kết quả và đọc được nhiều mẫu
xét nghiệm cùng lúc. Một điểm hạn chế của phương pháp này chính là thiếu chính xác trong
việc đọc các trình tự dài liên tục (> 50 nucleotide). Nó được sử dụng nhiều trong việc phát
hiện đột biến kháng R (độ nhạy 92–100%, độ đặc hiệu 92–100% trên các mẫu bệnh phẩm và
mẫu thử nghiệm). Nó ít được sử dụng trong chẩn đoán kháng H (độ nhạy 64%–81%, độ đặc
hiệu 100% trên các mẫu bệnh phẩm và mẫu thử nghiệm) bởi vì có nhiều đột biến kháng H
vẫn chưa biết và nằm ngoài các vùng đã được phát hiện trên gen katG và gen inhA.

4.3. Kỹ thuật lai đầu dò
4.3.1. Kỹ thuật lai đầu dò trên pha rắn
Xét nghiệm lai đầu dò được WHO công bố chấp nhận vào năm 2008 dùng để phát
hiện lao kháng thuốc đối với mẫu bệnh phẩm soi dương tính nghi ngờ mắc LĐKT. Hiện nay
có 3 xét nghiệm lai đầu dò được lưu hành trên thị trường là INNO-LipA®Rif.TB


21

(Innogenetics, Belgium), Genotype® MTBDR và thế hệ thứ hai là Genotype® MTBDRplus
(Hain LifeScience GmbH, Germany).
Nguyên tắc hoạt động
Xét nghiệm lai đầu dò trên phá rắn sẽ được tiến hành với các bước sau:




Tách chiết ADN của M.Tuberculosis từ mẫu phân lập hoặc từ mẫu lâm sàng
Khuếch đại PCR vùng RRDR của gen rpoB với mồi biotynylate.

Sản phẩm PCR sau đó sẽ được lai với đầu dò oligonucleotide đặc hiệu (bao gồm đầu dò
nhận biến chủng M. tuberculosis, đầu dò nhạy cảm và đầu dò đột biến) được cố định trên



một dải nitrocellulose.
Phản ứng sau khi lai giữa đầu dò và sản phẩm PCR sẽ tạo ra các dải màu khác nhau tại vị




trí lai có thể nhìn thấy bằng mắt thường.
Đột biến trên vùng RRDR sẽ được phát hiện nếu:
Không thể lai sản phẩm PCR với đầu dò nhạy cảm (S1,S2,S3,S4,S5)
Sản phẩm PCR gắn với đầu dò đột biến (R2,R4a,R4b,R5).

Hình 9. Các bước thực hiện xét nghiệm lai đầu dò
Bộ kit INNO-LipA®Rif.TB
Bộ kit này có khả năng phát hiện M. tuberculosis và kháng R qua việc phát hiện các
đột biến ở gen rpoB. Dải nitrocellulose chứa 10 đầu dò trong đó 1 đầu dò oligonucleotide
dùng để nhận diện kiểu gen của nhóm M. tuberculosis, 5 đầu dò oligonucleotide dùng để
phát hiện các kiểu gen nhạy cảm (S1-S5) và 4 đầu dò oligonucleotide dùng để phát hiện kiểu
gen kháng R (R1,R2,R3,R4). Kháng R được thể hiện thông qua việc không thể lai một hoặc
nhiều đầu dò nhạy cảm và có thể đi kèm với việc lai một hoặc nhiều đầu dò kháng R.