PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Shigella là tác nhân gây nên bệnh shigellosis, là một bệnh nguy hiểm lây lan rất
nhanh trong cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm và đường
nước uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu là từ nguyên liệu, từ
nước,…Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể đạt mức
10 tế bào/g sản phẩm, do vậy shigella được kiểm soát rất nghiêm ngặt trong thực
phẩm, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, quy trình kiểm soát chặt
chẽ. Các loại thực phẩm thường xuyên được phân lập Shigella là các món xà
lách, thịt băm, thủy sản,…Vậy quy trình đi định tính và phân lập Shigella như
thế nào xin mời cô và các bạn cùng tìm hiểu với nhóm thông qua đề tài :

“ Định tính Shigella trong thực phẩm”

CHƯƠNG 1: TỔNG

QUAN VỀ SHIGELLA
1


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Hình ảnh: Shigella có dạng hình que thẳng dài 1 - 3, không có lông, không di
động
Shigella là tác nhân gây ra bệnh lỵ trực khuẩn. Đây là một bệnh rất hay gặp ở
nước ta, có thể rải rác thường xuyên hoặc gây thành các vụ dịch địa phương.
Shigella đã được Chantemesse mô tả từ năm 1888 và Shiga phân lập lần

đầu tiên năm 1898 (vi khuẩn này về sau mang tên Shigella shiga). Năm 1900,
Flexner và Strong đã phân lập được một tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn có
những tính chất khác với vi khuẩn do Shiga phân lập
1. Đặc điểm sinh học
1.1. Hình thái
Shigella là trực khuẩn mảnh, bắt màu Gram
(-), dài từ 1-3 µm, khi mới nuôi cấy có dạng cầu trực khuẩn. Shigella không có
lông, không có vỏ và không sinh nha bào.
1.2. Tính chất nuôi cấy
Như các vi khuẩn đường ruột khác, Shigella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy
tiện nhưng phát triển rất tốt trong điều kiện hiếu khí.
Trên môi trường đặc, chúng tạo thành khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, trong và
có đường kính khoảng 2mm sau 24h. Trên môi trường phân lập có lactose,
khuẩn lạc vẫn không màu.

2


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

1.3. Tính chất sinh hóa
- Tất cả các Shigella đều lên men đường glucose, hầu hết không sinh hơi, một
-

số trường hợp có sinh hơi nhưng rất yếu.
Các Shigella không lên men lactose, trừ S. sonnei có khả năng lên men

-


lactose chậm sau từ 2 ngày đến 2 tuần.
Các Shigella flexneri, Shigella boydii và Shigella sonnei có khả năng lên men

-

monnitol; S. dysenteriae không có khả năng này.
Shigella không sinh H2S, không sử dụng được citrat trong môi trường
Simmons, không sinh indol.

1.4. Độc tố
Các Shigella đều có nội độc tố và một số Shigella có ngoại độc tố.
- Nội độc tố: Nội độc tố có tính độc mạnh, cấu tạo như kháng nguyên
thân, là loại kháng nguyên yếu. Tác dụng chủ yếu là gây phản ứng trong ruột.
- Ngoại độc tố: Độc tố này rất độc, mạnh như độc tố của trực khuẩn uốn
ván, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh.
1.5. Cấu trúc kháng nguyên
Tất cả các Shigella đều có kháng nguyên thân O, một số có kháng nguyên
K và tất cả đều không có kháng nguyên H.

1.6. Phân loại
1.6.1. Phân loại khoa học:
Về phân loại khoa học Shigella được xếp vào:
- Giới : Bacteria
- Ngành: Proteobacteria
- Lớp: Gramma Proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Giống: Shigella Castellani & Chalmers 1919
3



PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

- Loài (có 4 loài): S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, S. sonnei
1.6.2. Phân loại theo kháng nguyên:
Dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên thân O và một số tính chất sinh
vật hóa học, người ta chia các Shigella thành 4 nhóm: Nhóm A (S. dysenteriae),
nhóm B (S.flexneri), nhóm C (S. boydii) và nhóm D (S. sonnei).
S. dysenteriae
Không lên men mannitol, có 10 typ huyết thanh, các typ huyết thanh
không có quan hệ về kháng nguyên với các nhóm khác và không có quan hệ về
kháng nguyên với nhau. Typ 1 (S. dysenteriae) còn có tên là trực khuẩn
Shiga. S.shiga ngoài độc tố còn sinh ra một ngoại độc tố mạnh.
S. flexneri
Có khả năng lên men mannitol trừ một vài ngoại lệ. Có 6 typ huyết thanh,
các typ huyết thanh này có cả thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ và thành
phần kháng nguyên chung cho cả 6 typ.
S. boydii
Có khả năng lên men mannitol trừ một vài ngoại lệ. Được chia thành 15
typ huyết thanh.
S. sonnei
Có khả năng lên men mannitol, là nhóm duy nhất có khả năng lên men
lactose nhưng chậm, chỉ có 1typ huyết thanh.
2. Khả năng và cơ chế gây bệnh
Shigella là tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn. Chỉ có người và khỉ mắc
bệnh này. Trực khuẩn lỵ theo thức ăn nước uống vào đường tiêu hóa, cũng có
trường hợp do tay bẩn, thường gặp ở trẻ em. Chỉ cần số lượng từ 10 đến 100 tế

bào vi khuẩn đã có thể gây bệnh. Tại đường tiêu hóa, Shigella gây tổn thương
đại tràng. Trực khuẩn lỵ gây bệnh nhờ khả năng xâm nhập và nội độc tố, S.
shiga và S. smitzii còn có thêm ngoại độc tố. Vi khuẩn bám rồi xâm nhập vào
niêm mạc đại tràng. Chúng nhân lên nhanh chóng trong lớp niêm mạc. Vi khuẩn
4


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

chết giải phóng ra nội độc tố gây xung huyết, xuất tiết, tạo những ổ loét và mảng
hoại tử. Nội độc tố còn tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt và tăng nhu
động ruột. Những tác động đó làm bệnh nhân đau bụng quặn, buồn đi ngoài và
đi ngoài nhiều lần, phân có nhầy lẫn máu.

Ngoại độc tố của S.shiga và S.smitzii có độc tính với thần kinh trung
ương, có thể gây viêm màng não và hôn mê. Tuy nhiên, vi khuẩn chỉ sinh ra
ngoại độc tố sau khi đã xâm nhập vào niêm mạc đại tràng.
Bệnh lỵ trực khuẩn thường ở thể cấp tính. Một tỷ lệ nhỏ có thể trở thành
mãn tính, những bệnh nhân này thỉnh thoảng lại bị ỉa chảy và thường xuyên thải
vi khuẩn ra ngoài theo phân.
Ở nước ta, đa số trường hợp bị lỵ trực khuẩn do S. dysenteriae và S.
flexneri, chỉ có một tỷ lệ nhỏ do S. boydii và S. sonnei.
3. Miễn dịch
Sau khi có quá trình nhiễm khuẩn Shigella (mắc bệnh lỵ trực khuẩn hoặc
nhiễm trùng thể ẩn) trong máu xuất hiện các kháng thể đặc hiệu. Tuy nhiên hiệu
lực bảo vệ của các kháng thể này rất kém.
Vai trò bảo vệ chủ yếu là nhờ IgA tiết tại ruột. Nghiên cứu về miễn dịch
tiết trong bệnh lỵ trực khuẩn đã được tiến hành rất sớm, thuộc vào những nghiên

cứu đầu tiên trong lịch sử nghiên cứu miễn dịch nói chung.

5


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH SHIGELLA
1.Dụng cụ và thiết bị:
Dụng cụ:
Ống nghiệm
Đĩa petri ( 100mm)
Cốc thủy tinh (100ml, 250ml)
Đầu tip Pipetman (1000, 5000l)
Que trang, que cấy vòng
Kẹp inox
Đèn cồn
Pipette 1ml, 10ml
Thiết bị:
Tủ cấy vô trùng
Nồi hấp
Tủ ấm
Pipetman(1000, 5000l)
Máy dập mẫu (Stomacher)
Máy trộn mẫu (Vortex mixer)
Cân phân tích
Lò viba


6


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

2.Môi trường và hóa chất :
Môi trường
Dung dịch Trypton Soya (TSB)
Canh Gram Negative (GN)
Tergitol-7 Agar (T7A)
Thạch
XyloseLysine
Desoxycholate
(XLD)
Môi trường Heltoen Entric Agar (HE)
Deoxycholate Citrat Agar (DCA)
Thạch Mac Conkey (MAC)
Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA)
Môi trường Lysine Decacboxylase Broth
(LDC)
Môi trường KIA hoặc TSI
RSU

Hóa chất
Cồn 900 và 700
Dung dịch creatine 0.5%
Dung dịch –naphtol 5%
KOH 40%

HCl 10%
NaOH 10%
Thuốc thử catalase
Que thử oxydase

3. Các bước tiến hành phân tích:
Tăng sinh:
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml TSB, ủ 370C, trong 16-24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang 10ml môi trường chọn lọc GN, ủ 370C, trong 1624 giờ.
Phân lập nhận diện:
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt (T7A,
MAC, XLD, HE, DC,...), ủ 370C, trong 24-48 giờ.
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên môi trường TSA, ủ 370C, trong 2024 giờ.
Thử phản ứng sinh hóa:
Thử nghiệm sàng lọc trên TSI/KIA.
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định:
Thử nghiệm LCD.
Thử nghiệm urea.
7


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Thử nghiệm VP.
Kết luận:
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella
trong 25 g mẫu.

4.Thuyết minh quy trình phân tích:
4.1.Tăng sinh:
Chuẩn bị mẫu và đồng nhất mẫu. Nuôi cấy trong môi trường không chọn lọc
Trypton Soya (TSB), môi trường sẽ cung cấp chất dinh dưỡng giúp vi sinh
vật phát triển. Chuẩn bị cho bước tăng sinh chọn lọc.
4.2.Tăng sinh chọn lọc:
Lấy 0,1ml dịch tăng sinh chuyển sang canh tăng sinh Gram Negative (GN), ủ
370C, trong 16-24 giờ.
Mục đích vừa xác định được vi khuẩn gram âm khi trong môi trường GN sẽ
bị nhuộm thành màu đỏ, vừa tiếp tục nuôi cấy vi sinh vật.
4.3.Phân lập:
• Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc lên
•

đĩa petri chứa môi trường phân lập.
Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Ủ ở 370C, trong 24-48 giờ.
Nên sử dụng ít nhất 2 môi trường phân lập khác nhau, để định tính chính xác
trong quá trình phân tích.

+ Trên môi trường XLD, Shigella tạo khuẩn lạc đỏ, trong suốt.

8


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

+ Trên môi trường HE, Shigella tạo khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong suốt:


+ Trên môi trường MAC, Shigella tạo khuẩn lạc điển hình có màu đỏ nhạt,
môi trường có màu đỏ cam, hơi đục:

+ Trên môi trường T7A, Shigella tạo khuẩn lạc điển hình có màu xanh nhạt,
môi trường đục như sữa, có màu hơi vàng nhạt.

9


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
•

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA. Ủ ở 37 0C, trong 20-24 giờ.
Mục đích: môi trường TSA sẽ cung cấp các chất dinh dưỡng giúp các khuẩn
lạc nghi ngờ phát triển, để cấy sang các môi trường test sinh hóa.

4.4.Thử phản ứng sinh hóa:
 Thử nghiệm sàng lọc trên TSI/KIA.
Mục đích:
Phát hiện khả năng sử dụng các nguồn cacbonhydrate, sinh H2S, tạo hơi (gas).
Cơ sở sinh hóa cho thử nghiệm TSI/KIA:
- Sử dụng lactose:
Lactose + -Galactosidase Glucose + Glactose
- Sử dụng glucose ở điều kiện hiếu khí (mặt nghiêng):
Glucose hay Glactose theo chu trình Krebs (hiếu khí) sinh ra CO 2 + H2O +
-

năng lượng.

Sử dụng glucose ở điều kiện kỵ khí (phần đáy):
Glucose hay Galactose theo con đường Embden-Meyerhof (kỵ khí), sinh
ra các axit hữu cơ + các aldehyde + các loại rượu + CO 2 + H2 + năng

-

-

lượng.
Không lên men lactose và glucose:
Vi sinh vật sử dụng peptone trong môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí sinh ra
NH3 tạo môi trường kiềm.
Sinh hydrogen sulfide (H2S):
Vi khuẩn + Sodium thiosulfate H2S
H2S + ion sắt sắt sunfide (không tan tạo tủa màu đen).
4.4.1.Thử nghiệm KIA

10


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Thử nghiệm KIA


Nguyên tắc:
- Môi trường thạch Kligler Iron Agar được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp


cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong
phân loại bước đầu của các trực khuẩn gram âm. Môi trường này cũng đồng thời
thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình lên men carbohydrat và
sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực khuẩn gram
âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột.
- Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat),
phenol red (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen), muối sắt và thiosulfate
natri. Có 3 hình thái lên men carbohydrat có thể xảy ra là:
•

Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng của môi trường,
khi đó cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose nhưng không lên men

•

đường lactose.
Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng) phần nghiêng của môi
trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men cả đường glucose và đường

•

lactose.
Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi
đó cho thấy vi sinh vật không thể lên men đường glucose và đường
lactose. Các sản phẩm sinh ra không phải là sản phẩm acid.
11


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM


GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Nếu sinh hơi, có hơi ở phần gốc của ống môi trường, môi trường bị chia cắt
hoặc đẩy môi trường lên khỏi đáy ống. Nếu thấy màu đen ở phần gốc ống, vi
sinh vật đã sinh ra H2S từ thiosulfid.
Chú ý: Phản ứng được đọc sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu môi trường
được đọc quá sớm, vi sinh vật chỉ có thể lên men đường glucose. Nếu đọc quá
muộn, các chất gây men lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá
pepton, phần nghiêng của môi trường trở lại màu đỏ.


Cách tiến hành:
- Cấy đâm sâu phần cột thạch và cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ
những khuẩn lạc điển hình (nghi ngờ) lên ống thạch nghiêng chứa môi



trường KIA.
- Ủ ở 370C, trong 24 giờ.
Giải thích sự biến đổi của môi trường:
- Mẫu 1: mẫu đối chứng, không có vi sinh vật.
- Mẫu 2: lên men glucose và lactose tốt, tạo môi trường axit, làm chất chị
-

thị là phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng.
Mẫu 3: lên men glucose và lactose có sinh khí nên môi trường bị đẩy lên

-

và chất chỉ thị chuyển từ màu đỏ sang vàng.

Mẫu 4: chỉ lên men glucose, tạo môi trường axit ở cột thạch nên chất chỉ
thị chuyển sang màu vàng, không lên men lactose nên bề mặt thạch không

-

đổi màu, có màu đỏ.
Mẫu 5: tạo H2S, kết tủa màu đen ở đáy.

4.4.2.Thử nghiệm TSI:

12


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Thử nghiệm TSI
Nguyên tắc, cách tiến hành đều giống trong thử nghiệm KIA, chỉ khác là
trong môi trường TSI có chứa thêm đường Sucrose.
Giải thích sự biến đổi của môi trường:
-

Mẫu A: mẫu đối chứng, không có vi sinh vật.
Mẫu B: sinh khí H2S, tạo kết tủa màu đen.
Mẫu C: lên men glucose, nhưng không lên men sucrose và lactose, có
sinh hơi. Nên môi trường dưới đáy có màu vàng, thạch nghiêng có màu

-


đỏ của phenol red, cột thạch bị đẩy lên.
Mẫu D: không lên men cả 3 loại đường glucose, sucrose và lactose.
Mẫu E: lên men tốt cả 3 loại đường glucose, sucrose và lactose, đồng thời
có sinh khí.

4.5.Thử nghiệm sinh hóa khẳng định:
4.5.1 Thử nghiệm LDC (Lysine Decacboxylase):

13


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Phản ứng âm tính

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Phản ứng dương tính


-

Mục đích:
Xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm


-

carboxyl ở một số acid amin.
Cơ sở sinh hóa:

Các vi khuẩn sinh các ezyme decarboxylase, các enzyme này tương tác
với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo thành amine hay
diamine và carbon dioxide (CO2).

R-CH-CH2-COOH R-CH2-NH2 (amin) hoặc H2N-R-NH2 (diamin) + CO2
-

Các sản phẩm tạo thành làm tăng pH môi trường làm đổi màu chất chỉ


-

thị.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị môi trường : Decarboxylase Basal medium + chất chỉ thị pH

-

Bromocresol purple, điều chỉnh pH=6.0.
Lấy 1 que cấy đầy khuẩn lạc trên môi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt

-

của môi trường lỏng LCD .
Ủ ở 370 C, trong 24 giờ.


-

Kết quả:

Kiểm tra dương tính: màu tím đục tới màu tím nhạt (sinh cadaverine - 1
diamin).
14


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
-

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Kiểm tra âm tính: màu vàng (chỉ glucose được lên men).
Sau thời gian nuôi cấy, trên môi trường LCD, Shigella phát triển sẽ làm
đục môi trường và chuyển màu môi trường sang màu vàng, phản ứng
LCD âm tính.
4.5.2 Thử nghiệm Urea:

Christensen Urea (MT thạch nghiêng)


Urea Broth (Rustigian – Stuart)

Mục đích:

Phát hiện vi sinh vật có mang enzym urease hay không.


Cơ sở sinh hóa:

Khả năng phân cắt urea thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vật
làm môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra.

(NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2


Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường RSU + chỉ thị phenol red.
Lấy đầy 1 que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3-5ml
môi trường RSU vô trùng.
Lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn.
Ủ ở 370C trong 48 giờ.


Kết quả:

Dương tính: môi trường có màu hồng
Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)

15


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Shigella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường, phản ứng
âm tính, không đổi màu môi trường.
4.5.3 Thử nghiệm MR (Methyl Red):




Mục đích:

Xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men
glucose.


Cơ sở sinh hóa:

2 Glucose + H2O 2 Lactic acid + acetic acid + ethanol + 2 CO2 + 2H2
Acid + methyl red môi trường có màu đỏ


Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth).
Chất chỉ thị pH: methyl red.
Lấy đầy 1 que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3-5ml
môi trường Glucose Phosphate vô trùng.
Lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn.
Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC.



Kết quả:

–Dương tính: môi trường chuyển màu đỏ (pH=4.4), càng kéo dài thời gian nuôi
cấy – môi trường càng acid
16



PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

– Âm tính: môi trường không đổi màu (pH=6.0), càng kéo dài thời gian nuôi
cấy, các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính , môi
trường chuyển sang màu vàng.
4.5.4 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer):



Mục đích:

Phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men
glucose.


Cở sở sinh hóa:

Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn.
2 pyruvate

acetoin + 2 CO2

17


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ


Phức màu hồng


-

Cách tiến hành:
Chuần bị môi trường MR-VP Broth.
Naphtol (chất tăng cường màu).
KOH 40% (chất oxi hóa).
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống

-

môi trường MR-VP ủ ở 370C trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0.2ml dịch cấy vào một ống nghiệm, thêm 2 giọt
creatin + 6 giọt dung dịch 1-naphtol trong cồn, sau đó thêm 2 giọt KOH
40%, nếu xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong 15 phút là phản ứng
dương tính.



Kết quả:

18


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ


Shigella cho phản ứng âm tính với thí nghiệm VP, không đổi màu trên bề mặt
môi trường.
4.6.Kết luận:
Các đặc trưng sinh hóa của Shigella được tóm tắt theo bảng:
Thử nghiệm sinh hóa
Simmon citrate
Aarginine
decarboxylase
Lysine decarboxylase
Urea
Maloonate
MR
VP

Kết quả
-

Thử nghiệm sinh hóa
saciline
Xylose

Kết quả
-

+
-

Cellobiose
adonitol

Dulcitol
Inositol

-

Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella
được phát hiện trong 25g mẫu.

CHƯƠNG 3: ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CỤ THỂ
XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG CEFTRIAXONE Ở VI KHUẨN
SHIGELLA SONNEI PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
TÁC GIẢ: NGUYỄN THỊ KHÁNH NHƯ
Sơ đồ định danh Shigella sonnei

Mẫu bệnh phẩm (mẫu phân)
19


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Cấy tăng sinh trên môi trường
SB

Cấy trên môi trường chọn lọc
MC và XLD

Chọn khuẩn lạc trong, không

màu (không lên men lactose)

Thử nghiệm các phản ứng
sinh hóa

Shigelle spp

Định danh bằng bộ kit
API20E
shigella sonnei

shigella spp

Phân lập và định danh S. sonnei :
Ngày 1: mẫu phân lập được lấy trực tiếp từ bệnh nhân, giữ trong lọ vô
trùng. Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm lên môi trường chọn lọc MC, XLD, và
cho khoảng 2g phân tươi vào môi trường tăng sinh SB. Ủ vi khuẩn ở 37 0C trong
18 đến 24 giờ.
Ngày 2: chọn những khuẩn lạc trong, không màu (do không lên men
laclose) trên môi trường MC, XLD để tiến hành các phản ứng sinh hóa định
danh Shigella. Song song đó, các khuẩn lạc này cũng được cấy lên môi trường
20


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

NA để kiểm tra độ thuần. Trong khi đó, bệnh phẩm sau khi tăng sinh trong môi
trường SB cũng dược cấy trên môi trường MC, XLD để tìm Shigella spp.

- Thử nghiệm KIA (Kliger’s iron agar): đây là môi trường thạch nghiêng có
chứa dextrose và lactose, và chất chỉ thị được dùng là phenol đỏ. Vi khuẩn được
cấy thẳng xuống gần đáy ống thạch, cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng, ủ ở 37 0C
trong 18 đến 24 giờ. Kết quả được thể hiện như sau:
•

Vi khuẩn không lên men: vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch nghiêng nhờ
phân hủy các thành phần protein trong môi trường thành các sản phẩm

•

kiềm. Bề mặt và phần đáy thạch nghiêng vẫn có màu đỏ.
Vi khuẩn lên men dextrose và không lên len lactose: trong vòng 12 giờ sau
khi ủ, vi khuẩn lên men dextrose và tạo các sản phẩm có tính acid, làm
môi trường và mặt thạch có màu vàng. Tuy nhiên, sau 12 giờ, dextrose sử
dụng hết, vi khuẩn trên bề mặt thạch tiếp tục tăng trưởng bằng phân hủy
các thành phần protein trong môi trường. Khoảng từ 18 đến 24 giờ sau,

•

sản phẩm kiềm tạo ra làm môi trường trên bề mặt thạch lại trở nên đỏ.
Vi khuẩn lên men cả dextrose và lactose: bề mặt thạch nghiêng và phần

•

đáy môi trường có màu vàng.
Môi trường KIA cũng chứa Natri thiosulfate (Na 2S2O3) và sắt sulfate
(FeSO4) làm chất chỉ thị cho việc tạo H2S. Kết quả dương tính khi xung
quanh môi trường xuất hiện tủa màu đen.


- Thử nghiệm Urease: xác định khả năng phân giải Urea của vi sinh vật do tác
dụng của enzyme urease:
(NH2)2CO+ 2 H2O urease CO2+ H2O + 2 NH3

(NH4)2CO3

- Thử nghiệm citrate: nhằm xác định khả năng sử dụng citrate và muối
ammonium như nguồn carbon và Nito duy nhất của vi khuẩn. Vi khuẩn biến
dưỡng citrate dùng muối ammonium tạo ammonia và làm kiềm hóa môi trường.
Chất chỉ thị sử dụng trong thử nghiệm này là bromthymol blue (trung tính: màu
xanh lá cây, pH > 7,6: màu xanh thẫm).
21


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

- Thử nghiệm indole: nhằm xác định khả năng thủy giải tryptophan nhờ
emzyme tryptophanase thành indole của vi sinh vật. Indole tạo thành được phát
hiện bằng phản ứng với dung dịch Kovac (para-dimethylaminobenzaldehyde
trong cồn) tạo thành phức chất dạng quinine màu đỏ tía.
-Thử nghiệm đỏ methyl: đây là thử nghiệm định tính về khả năng một vi khuẩn
lên men glucose thành những sản phẩm có tính acid cao hay thành những sản
phẩm ít tính acid như ethanol hay butanediol. Thử nghiệm này dùng đỏ methyl
làm chất chỉ thị pH (có màu đỏ khi độ pH môi trường thấp hơn 4,4).
Ngày 3: đọc kết quả các phản ứng sinh hóa. Vi khuẩn được xác định là
Shigella spp khi có kết quả sinh hóa như sau: có thể phân giải glucose nhưng
không phân giải lactose, không sinh hơi, không sinh H 2S, không di động, không
sinh indole, không phân giải urea, không phân gải nitrate, có phản ứng đỏ

methyl dương tính.
Thực hiện phản ứng ngưng kết kháng nguyên để xác định typ thuyết
thanh cho từng loại vi khuẩn.
Trong trường hợp kết quả thử nghiệm bằng một số phản ứng sinh hóa và
kết quả phản ứng huyết thanh như trên không rõ ràng, vi khuẩn được định danh
bằng bộ Kít API20E. Bộ kít này là hệ thống định danh được chuẩn hóa đối với
nhóm Enterobacteriaceae sử dụng 21phản ứng sinh hóa và phân tích kết quả dựa
trên phần mềm vi tính. Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản
xuất và kết quả thu nhận được sẽ được tra với cơ sở dữ liệu để định danh vi
khuẩn. Tuy nhiên bộ kít chỉ định danh chính xác được Shigella sonnei, những
Shigella khác được ghi nhận với kết quả Shigella spp. Vì vậy khi có kết quả
API20E là Shigella spp.,thử nghiệm lại bằng phản ứng huyết thanh để định danh
những loài khác thuộc họ Shigella.

22


PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

Qua bài báo cáo trên, chúng em mong giới thiệu rõ được các đặc tính của
vi khuẩn Shigella nhằm xác định được chính xác loại vi khuẩn này. Qua đó,
thông qua việc nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật đã góp phần đáng kể trong
thực tiễn, góp phần đẩy mạnh việc sản xuất nhiều sản phẩm sinh học có giá
trị như: chất kháng sinh, vitamin, enzyme, các acid amin.
Bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót, mong cô hướng dẫn thêm.
Chúng em chân thành cảm ơn cô.

23



PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

/>
2.

area=58&cat=1101&ID=2761
/>
3.

khuan-gay-benh.vhtm
/>
4.

len-men-carbohydrate-1-1-nguyen-tac-xac-dinh-kha-nang-l.1400665.html
Bài giảng “Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm”- Nguyễn Thúy Hương.

24